JPH06181782A

JPH06181782A - 酵素反応方法

Info

Publication number: JPH06181782A
Application number: JP34071092A
Authority: JP
Inventors: Miki Ikuta; ミキ生田; Hisashi Yamagata; 恒山縣; Masato Terasawa; 真人寺沢; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1992-12-21
Filing date: 1992-12-21
Publication date: 1994-07-05

Abstract

(57)【要約】【目的】希薄微生物菌体濃度条件下における酵素反応
安定性および目的産物収量の向上。【構成】例えばオクタデシルトリアルコキシシランま
たはジメチルジクロロシラン等により、予め該容器をシ
リコン処理されたガラス容器を用い、希薄濃度の微生物
菌体存在下で、例えばアスパルターゼを用いたＬ−アス
パラギン酸産生反応等の酵素反応法を行う、酵素反応法
である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素の反応方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】酵素反応を工業的規模で行うにあたっ
て、菌体当たりの酵素活性の強い、即ち比活性の高い菌
体を用いることは重要な要素である。近年では、遺伝子
操作技術の進歩により、目的酵素遺伝子を高発現化して
比活性の高い菌体が容易に得られるようになった。それ
に伴い、反応液中の高活性菌体の濃度も、低活性菌の濃
度の数十分の一から数百分の一にまで低減することが可
能となった。また、従来から蛋白質、核酸等の生体高分
子がガラス容器の界面に吸着し、それにより不活性化し
てしまう現象が見られることは広く知られていた。この
ような物理的吸着現象はガラス容器表面をシリコン処理
することにより防ぎ得ることも、[例えばジェイ・サム
ブルック、イー・エフ・フリッチ、ティー・マニアチス
著：モルキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・
マニュアル第２版第３巻付録Ｅ.１、コールド・スプリ
ング・ハーバープレス社１９８９年刊（J.Sambrook,
E.F.Fritsch and T.Maniatis, Molecular Cloning: A L
aboratory Mannual 2^nd Ed. Vol 3 app.E.1, Cold Spri
ng Harbor Press, 1989）等により］公知である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】これに対し、菌体の懸
濁反応についてはこのような現象は知られていなかった
が、前述の如く高比活性菌体が調製可能となるに従い菌
体濃度が低下したことから、特にガラス容器を用いた際
に、希薄菌体濃度における酵素反応の安定性の低下が認
められるようになった。本発明者らはこの問題を解決す
べく鋭意研究を重ね、反応容器のシリコン処理が酵素反
応の安定性の向上に関し有効であることを見いだし、本
発明を完成するに至った。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は、予めシリコン
処理されたガラス容器を用い、希薄濃度の微生物菌体存
在下で酵素反応を行うことにより酵素反応の安定性を向
上させる酵素反応方法を提供する。本発明で言う、“希
薄菌体濃度”とは、０.０１〜０．５％（Ｗｔ／Ｖ）の
菌体濃度を意味する。本発明で言う“ガラス容器”と
は、反応液に接する部分が実質的にガラス製であるよう
な反応容器を意味し、例えば反応容器が完全にガラス製
であるもの、ステンレスの外壁の内部をガラスで被覆し
たいわゆるグラスライニング容器、ステンレスとガラス
とを接ぎ合わせたもの等が含まれる。

【０００５】本発明によるシリコン処理は、シリコン処
理剤、例えばオクタデシルトリアルコキシシラン(octad
ecyltrialkoxysilane)、ジクロロオクタメチルテトラシ
ロキサン(dichlorooctamethyltetrasiloxane)、ジメチ
ルジクロロシラン（dimethyl-dichlorosilane)、ジメチ
ルクロロシラン（dimethylchlorosilane)、ヘキサメチ
ルジシラザン(hexamethyldisilazane)、トリメチルクロ
ロシラン（trimethyl-chlorosilane）等を用いて行うこ
とができる。具体的には、これらのシリコン処理剤を水
または有機溶媒に０.１〜１０％溶解した溶液を調製
し、該溶液に容器を浸漬する、該溶液を容器表面に布等
で塗布する、もしくは容器内に該溶液の蒸気を充満させ
る等の種々の手段により行うことができる。実際の処理
に当たっては、対象容器の形状および容積等に応じて好
適な手法を用いることができる。

【０００６】本発明に用いることのできる酵素反応とし
ては、以下の反応が例示できる。１．Ｌ−アスパラギン酸を産生する反応アスパルターゼを用いてフマル酸またはその塩、および
アンモニアまたはその塩よりＬ−アスパラギン酸を産生
することができる。アスパルターゼ(EC 4.3.1.1)を産生
する微生物としては、アスパルターゼ活性を有する限り
特に制限はないが、エシェリヒア（Escherichia）属に
属する微生物、例えばエシェリヒア・コリ（E. Coli）
Ｋ−１２系菌株 ATCC27325、同Ｂ系菌株 ATCC11303、同
Ｗ系菌株 ATCC 9637；ブレビバクテリウム(Brevibacter
ium)属に属する微生物、例えばブレビバクテリウム・フ
ラバム（B. flavum）MJ-233-AB-41（FERM BP-1498）、
同 MJ-233-AspB（FERM P-12228）等が好適に用いられ
る。該菌株またはその処理物の存在下での上記酵素反応
は、フマル酸またはその塩とアンモニアまたはその塩と
を反応させて行うことができる。該酵素反応は水性溶媒
中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、反応温度
約０〜６０℃、好ましくは約２０〜５０℃で、通常約３
〜４８時間行われる。酵素反応液の組成には、例えばフ
マル酸を０.５〜２モル/１０００ｍｌ、好ましくは１〜
１.５モル/１０００ｍｌ、並びにアンモニアを１〜１０
モル/１０００ｍｌ、好ましくは２〜６モル/１０００ｍ
ｌ含有することができる。その際、該反応液に添加され
るこれら２成分のモル比は、１：１〜５の範囲内である
ことが好ましい。本反応液には、さらに塩化カルシウ
ム、炭酸カルシウム等のカルシウム塩を１〜５０ミリモ
ル/１０００ｍｌ、好ましくは５〜３０ミリモル/１００
０ｍｌの濃度で用いることができる。

【０００７】２．Ｌ−リンゴ酸を産生する反応フマラーゼを用いてフマル酸またはその塩に水を付加
し、Ｌ−リンゴ酸を産生することができる。フマラーゼ
(EC 4.2.1.2)を産生する微生物としては、例えば、ブレ
ビバクテリウム属（Brevibacterium）、エシェリヒア属
（Escherichia）、ラクトバチルス（Lactobacillus）
属、プロテウス（Proteus）属等に属する微生物が知ら
れており、ブレビバクテリウム属に属する微生物、例え
ば、ブレビバクテリウム・フラバム（B. flavum）MJ-23
3（FERM BP-1497）、同 MJ-233-AB-41（FERM BP-1498）
が好適に用いられる。該菌体またはその処理物の存在下
での上記酵素反応は、フマル酸またはその塩を水溶液中
で反応させることにより行うことができる。該酵素反応
は水性溶媒中、ｐＨ４〜１０、反応温度約１５〜６０
℃、好ましくは約２０〜５０℃で通常約０.５〜４８時
間行われる。本酵素反応は水溶媒中で行われるが、水の
他にリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の溶媒を１０〜
５００ｍＭの濃度で用いることもできる。また、反応液
のｐＨを４〜１０に調節するために、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム等のアルカリ類、および／または塩
酸、硫酸等の無機酸を添加することもできる。酵素反応
液中のフマル酸またはその塩の反応時の使用量には特に
制限はないが、一般には０.５〜３０％（Wt/V）の範囲
で使用するのが好ましい。

【０００８】３．Ｌ−トリプトファンを産生する反応トリプトファナーゼを用いてインドール、ピルビン酸ま
たはその塩、およびアンモニアおよびその塩からＬ−ト
リプトファンを産生することができる。トリプトファナ
ーゼ(EC 4.1.99.1)を産生する微生物としては、例え
ば、エシェリヒア（Escherichia）属に属するエシェリ
ヒア・コリ（E. Coli）、プロテウス（Proteus）属に属
するプロテウス・レットゲリ（P. rettgeri）、アエロモ
ナス（Aeromonas）属に属するアエロモナス・リケファ
シエンス(A. liquefaciens)が知られており、好適には
エシェリヒア・コリ（E. Coli）が挙げられる。該菌体
またはその処理物の存在下での上記酵素反応は、インド
ール、ピルビン酸またはその塩、およびアンモニアまた
はその塩とを反応させることで行うことができる。該酵
素反応は、０.１Ｍリン酸緩衝液あるいは水溶媒中、ｐ
Ｈ７.５〜１０、反応温度約２０〜５０℃、好ましくは
３０〜４０℃で通常２〜７２時間行われる。反応液中の
インドール；ピルビン酸またはその塩、例えば、ピルビ
ン酸ナトリウム等；およびアンモニアまたはアンモニウ
ムイオン、例えば、塩化アンモニウム等の添加量は特に
制限されないが、通常０.１〜２０％（Wt/V）、好まし
くは０.５〜１０％（Wt/V）である。本反応液中に添加
するインドール/ピルビン酸またはその塩／アンモニア
またはその塩のモル比も、特に制限されないが、通常
１：１〜１００：１〜３００の範囲、好ましくは１：５
〜５０：５〜１００の範囲で使用される。

【０００９】４．Ｌ−チロシンを産生する反応 β−チロシナーゼを用いてフェノールとＬ−セリンまた
はＤＬ−セリンから、あるいはフェノールとピルビン酸
またはその塩とアンモニアまたはその塩からＬ−チロシ
ン産生することができる。β−チロシナーゼ（EC 4.1.9
9.2）を産生する微生物としては、例えば、エシェヒリ
ア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）
属、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、エアロ
バクター（Aerobacter）属、エルビニア（Erwinia）
属、プロテウス（Proteus）属、シトロバクター（Citor
obacter）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、
サルモネラ（Salmonella）属等に属する微生物が知られ
ており、エシェヒリア（Escherichia）属に属する微生
物が好適に用いられる。該菌体またはその処理物の存在
下での上記酵素反応は、フェノールとＬ−セリンとの反
応、あるいはフェノールとピルビン酸またはその塩とア
ンモニアまたはその塩との反応により行うことができ
る。該酵素反応は、通常の酵素反応と同様に、例えば、
０.１Ｍリン酸緩衝液あるいは水性溶媒中、ｐＨ６.０〜
１０.０、反応温度約２０〜５０℃、好ましくは３０〜
４０℃で通常２〜７２時間行われる。反応中は、撹拌し
続けることが望ましい。本反応液中のフェノール濃度は
特に厳密に限定されるものではないが、反応液における
濃度が常に１.０％（Wt/V）に維持されるように、連続
的または断続的に培地に添加して反応させることが特に
望ましい。また、その総添加量も特に限定されないが、
通常０.１〜１０％（Wt/V）、好ましくは０.５〜５％
（Wt/V）である。基質のＬ−またはＤＬ−セリンあるい
はピルビン酸またはその塩とアンモニアまたはその塩
は、一般には各々０.１〜２０％（Wt/V）の濃度範囲で
使用するのが適当である。

【００１０】５．Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニンを
産生する反応 β−チロシナーゼを用いてカテコールとＬ−セリンから
Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニンを産生することがで
きる。β−チロシナーゼ（EC 4.1.99.2）を産生する微
生物としては、上記４の反応と同様の微生物を挙げるこ
とができ、エシェヒリア（Escherichia）属に属する微
生物が好適に用いられる。該菌体またはその処理物の存
在下での上記酵素反応は、カテコールとＬ−セリンとの
反応により行うことができる。また、該酵素反応の反応
条件も、上記４の反応と同様である。基質のＬ−または
ＤＬ−セリンの添加濃度は、一般には各々０.１〜２０
％（Wt/V）が好ましい。また、カテコールの添加濃度
は、特に限定されないが、反応液における濃度が常に
１.０％（Wt/V）に維持されるように、連続的または断
続的に培地に添加して反応させることが特に望ましい。

【００１１】６．Ｌ−アラニンを産生する反応アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を用いて、Ｌ−アスパラ
ギン酸またはその塩よりＬ−アラニンを生成することが
できる。アスパラギン酸脱炭酸酵素（EC 4.1.1.12）を
産生する微生物としては、例えば、シュードモナス（Ps
eudomonas）属に属するシュードモナス・ダクネー（P. d
acunhae）IAM1152、同 ATCC21192、シュードモナス・プ
チダ（P. putida）IAM1506、同 ATCC21812、シュードモ
ナス・フルオレッセンス(P. fluorescens）IF03081、シ
ュードモナス・アエルギノーサ（P. aeruginosa）IAM10
54 等が知られており、好適にはシュードモナス・ダク
ネー（P. dacunhae）が用いられる。該菌体またはその
処理物の存在下での上記酵素反応は、少なくともＬ−ア
スパラギン酸またはその塩を含有する水性溶媒中、ｐＨ
４.３〜５.０、好ましくは４.５〜４.８、反応温度約２
０〜５０℃、好ましくは４０〜４７℃で通常３〜４８時
間行われる。本反応液に添加されるＬ−アスパラギン酸
またはその塩の添加濃度は０.５〜５０％（Wt/V）、好
ましくは３〜３０％（Wt/V）である。なお、Ｌ−アスパ
ラギン酸は、溶解して存在（溶解状態）しても、粉末で
存在（不溶解状態）していてもよい。本水性溶媒には、
さらにピリドキサール５'−リン酸を０.０００５〜０.
０５％（Wt/V）、好ましくは０.００１〜０.０１％（Wt
/V）添加して用いることができる。さらに必要に応じ
て、ピルビン酸、α−ケト酪酸等のα−ケト酸を０.０
０１〜０.５％（Wt/V）、好ましくは０.０１〜０.１％
（Wt/V）添加することができる。また、本反応液のｐＨ
を調整するためにアルカリ溶液、例えばアンモニア水、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることがで
きる。以上の例示は本発明に従い希薄濃度の微生物菌体
の存在下、予めシリコン処理されたガラス容器を用いて
行う酵素反応について具体的な認識を得る一助に過ぎ
ず、本発明の範囲を些かも限定するものではない。

【００１２】

【実施例】以下実施例により本発明を具体的に説明す
る。実施例におけるＬ−アスパラギン酸の定量は高速液
体クロマトグラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）を用いて行っ
た。参考例−１アスパルターゼ含有菌体の調整培地（尿素０.４％、硫酸アンモニウム１.４％、リン酸
一カリウム０.０５％、リン酸二カリウム０.０５％、硫
酸マグネシウム・７水塩０.０５％、塩化カルシウム２
水塩２ppm、硫酸第一鉄・７水塩２ppm、硫酸マンガン
・４〜６水塩２ppm、硫酸亜鉛・７水塩２ppm、塩化ナ
トリウム２ppm、ビオチン２００μg/l、チアミン塩酸
１００μg/l、カザミノ酸０.１％、酵母エキス０.１
％）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、
滅菌（滅菌後ｐＨ７.０）した後、ブレビバクテリウム
・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３−
ＡＢ−４１（FERM BP-1498）ならびにアスパルターゼ高
活性菌であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３−ＡｓｐＢ（FERM P-12228）をそれぞれ植菌し、無菌
的に５０％（Wt/V）グルコースを４ｍｌ添加して、３０
℃にて２日間振盪培養を行った。

【００１３】次に、本培養培地（硫酸アンモニウム２.
３％、リン酸一カリウム０.０５％、リン酸二カリウム
０.０５％、硫酸マグネシウム・７水塩０.０５％、硫酸
第一鉄・７水塩２０ppm、硫酸マンガン・４〜６水塩２
０ppm、ビオチン２００μg/l、チアミン塩酸１００μg/
l、カザミノ酸０.３％、酵母エキス０.３％）１０００
ｍｌを、２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、
２０分）後、５０％（Wt/V）グルコース４０ｍｌと前記
培養物２０ｍｌを添加して、回転数１０００rpm、通気
量１vvm、温度３３℃、ｐＨ７.６にて４８時間培養を行
った。なお、グルコースは培養中培地の濃度が１％（Wt
/V）を越えないように注意しつつ、約１〜２時間ごと断
続的に５０％（Wt/V）グルコースを添加した。培養終了
後、培養物１０００ｍｌから遠心分離して集菌した。

【００１４】参考例−２アスパルターゼ含有菌体の前
処理アスパルターゼ含有菌体内にはアスパルターゼの他に副
反応酵素フマラーゼが共存するため、原料のフマル酸が
一部リンゴ酸に変換される問題が生じるので、下記のと
おりフマラーゼ活性の除去処理を行った。上記参考例１
で調製した菌体５０ｇを処理液〔Ｌ−アスパラギン酸１
００ｇ、アンモニア水（２８％アンモニア含有水溶液）
８０ｍｌ、塩化カルシウム２水塩５.５ｇ、ポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレート０.８ｇに蒸留水を
添加して全量１ｌとして調製〕１ｌに懸濁後、５０℃に
て２時間加熱処理を行った。処理物を遠心分離して集菌
し、これをアスパルターゼ含有菌体として使用した。

【００１５】実施例−１＜ガラス容器のシリコン処理方法＞アスパルターゼ反応
を行うに際し、使用するガラス製５０ｍｌ容共栓付三角
フラスコ容器に対して、予め以下に述べる幾つかの方法
によりシリコン処理を行った。Ａ．オクタデシルアルコキシシラン処理前記三角フラスコをオクタデシルアルコキシシラン処理
溶液［１９８ｍｌの滅菌水に２ｍｌの２０％オクタデシ
ルアルコキシシラン溶液を添加］中に浸漬し、室温にて
２４時間放置した後に取り出し、１００℃の乾燥器を用
いて容器を乾燥させた。Ｂ．ジクロロオクタメチルテトラシロキサン処理前記三角フラスコを、ジクロロオクタメチルテトラシロ
キサン処理溶液［１８０ｍｌのアセトンに２０ｍｌのジ
クロロオクタメチルテトラシロキサンを添加］中に浸漬
し、室温にて２４時間放置した後に取り出し、該容器を
ドラフト内に設置してアセトンを完全に蒸発させた。

【００１６】Ｃ．ジメチルジクロロシラン処理前記三角フラスコをジメチルジクロロシラン処理溶液
［１９０ｍｌのトルエンに１０ｍｌのジメチルジクロロ
シランを添加］中に浸漬し、室温にて２４時間放置した
後に取り出し、メタノールにて洗浄した後、該容器をド
ラフト内に設置してメタノールを完全に蒸発させた。Ｄ．ジメチルクロロシラン処理前記三角フラスコを、ジメチルクロロシラン処理溶液
［１８０ｍｌのトルエンに２０ｍｌのジメチルジクロロ
シランを添加］中に浸漬し、室温にて２４時間放置した
後に取り出し、該容器をドラフト内に設置してトルエン
を完全に蒸発させた。Ｅ．ヘキサメチルジシラザン処理前記三角フラスコをヘキサメチルジシラザン処理溶液
［１８０ｍｌのトルエンに２０ｍｌのヘキサメチルジシ
ラザンを添加］中に浸漬し、室温にて２４時間放置した
後に取り出し、該容器をドラフト内に設置してトルエン
を完全に蒸発させた。Ｆ．トリメチルクロロシラン処理前記三角フラスコをトリメチルクロロシラン処理溶液
［１８０ｍｌのトルエンに２０ｍｌのトリメチルクロロ
シランを添加］中に浸漬し、室温にて２４時間放置した
後に取り出し、該容器をドラフト内に設置してトルエン
を完全に蒸発させた。

【００１７】＜酵素反応＞参考例−２で調製した菌体
０.２５ｇを、０.１Ｍのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９.
０）に懸濁させて全量を１００ｍｌとした。該菌体懸濁
液２ｍｌと１８ｍｌの酵素反応液［フマル酸１５０ｇ、
アンモニア水（２８％アンモニア含有水溶液）２２０ｍ
ｌ、塩化カルシウム２水塩２.２ｇに蒸留水を添加して
全量９００ｍｌとして調製］を、表１に示した処理剤を
用いて上記方法によりシリコン処理を行った前記三角フ
ラスコ内で、４５℃で３０時間振とうしながら反応させ
た。反応終了後、遠心分離にて菌体を除去し、上清中の
Ｌ−アスパラギン酸を定量した。その結果を表１に示
す。結果は、シリコン処理を行わない５０ｍｌ容共栓付
三角フラスコを用いて同様条件で反応を行った際の生成
Ｌ−アスパラギン酸量を１００とする相対値で示した。
なお、反応液中には、菌体からの蛋白質の漏洩は認めら
れなかった。

【００１８】

【表１】

【００１９】実施例−２反応液中の菌体濃度を表２に示した各濃度に設定し、且
つ表２に記載した処理剤を用いてシリコン処理を行った
５０ｍｌ容共栓付三角フラスコを用いた以外は実施例−
１と同様の条件で酵素反応を行い、同様にＬ−アスパラ
ギン酸を定量した。その結果を表２に示す。結果は、非
イオン性界面活性剤を存在させずに同様の条件で反応を
行った際の生成Ｌ−アスパラギン酸量を１００とする相
対値で示した。なお、反応液中には菌体からの蛋白質の
漏洩は認められなかった。

【００２０】

【表２】

【００２１】

【発明の効果】上記の結果から明らかな如く、本発明に
従い予めシリコン処理されたガラス容器を用い、酵素反
応を行うことにより、Ｌ−アスパラギン酸生成量が顕著
に増加する。この結果は、菌体濃度が希薄な場合に、予
めシリコン処理されたガラス容器を用いることにより酵
素反応の安定性が向上したことによってもたらされたも
のと考えられる。

フロントページの続き (72)発明者湯川英明茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号三菱油化株式会社筑波総合研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】予めシリコン処理されたガラス容器を用
い、希薄濃度の微生物菌体存在下で酵素反応を行うこと
を特徴とする、酵素反応方法。
【請求項２】反応液中の微生物菌体の濃度が０.０１
〜０.５％（Ｗｔ/Ｖ）である、請求項１に記載の酵素反
応方法。