JPH06181783A - 酵素反応方法 - Google Patents
酵素反応方法Info
- Publication number
- JPH06181783A JPH06181783A JP34071192A JP34071192A JPH06181783A JP H06181783 A JPH06181783 A JP H06181783A JP 34071192 A JP34071192 A JP 34071192A JP 34071192 A JP34071192 A JP 34071192A JP H06181783 A JPH06181783 A JP H06181783A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reaction
- acid
- concentration
- enzymatic reaction
- salt
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 希薄微生物菌体濃度条件下における酵素反応
安定性および目的収量の向上。 【構成】 ガラス容器を用い、希薄濃度の微生物菌体お
よび低濃度の界面活性剤例えばポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレート等を存在させて、例えばアスパル
ギン酸を用いたＬ−アスパラギン酸産生反応等の酵素反
応を行わせる、酵素反応法である。
安定性および目的収量の向上。 【構成】 ガラス容器を用い、希薄濃度の微生物菌体お
よび低濃度の界面活性剤例えばポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレート等を存在させて、例えばアスパル
ギン酸を用いたＬ−アスパラギン酸産生反応等の酵素反
応を行わせる、酵素反応法である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、酵素の反応方法に関す
る。
る。
【０００２】
【従来の技術】酵素反応を工業的規模で行うにあたっ
て、菌体当たりの酵素活性の強い、即ち比活性の高い菌
体を用いることは重要な要素である。近年では、遺伝子
操作技術の進歩により、目的酵素遺伝子を高発現化して
比活性の高い菌体が容易に得られるようになった。それ
に伴い、反応液中の高活性菌体の濃度も、低活性菌の濃
度の数十分の一から数百分の一にまで低減することが可
能となった。
て、菌体当たりの酵素活性の強い、即ち比活性の高い菌
体を用いることは重要な要素である。近年では、遺伝子
操作技術の進歩により、目的酵素遺伝子を高発現化して
比活性の高い菌体が容易に得られるようになった。それ
に伴い、反応液中の高活性菌体の濃度も、低活性菌の濃
度の数十分の一から数百分の一にまで低減することが可
能となった。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかし、高い比活性を
有する菌体の希薄な菌体濃度における反応安定性が、特
にガラス容器を用いた場合に、低活性菌よりも劣る現象
が観察される。本発明者らはこの問題を解決すべく鋭意
研究を重ね、反応液中に界面活性剤を存在させることに
より、希薄な菌体濃度における酵素反応の安定性を向上
し得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。従
来から、界面活性剤を反応液に添加することは行われて
いるが、これは菌体の細胞壁および細胞膜の透過性を向
上させる目的で、通常０.０１〜２％の高い添加濃度に
より行われるものである。これに対し本発明は、希薄な
菌体濃度における酵素反応の安定性を向上させる目的
で、従来よりも低濃度の界面活性剤を存在させる酵素反
応方法である。
有する菌体の希薄な菌体濃度における反応安定性が、特
にガラス容器を用いた場合に、低活性菌よりも劣る現象
が観察される。本発明者らはこの問題を解決すべく鋭意
研究を重ね、反応液中に界面活性剤を存在させることに
より、希薄な菌体濃度における酵素反応の安定性を向上
し得ることを見いだし、本発明を完成するに至った。従
来から、界面活性剤を反応液に添加することは行われて
いるが、これは菌体の細胞壁および細胞膜の透過性を向
上させる目的で、通常０.０１〜２％の高い添加濃度に
より行われるものである。これに対し本発明は、希薄な
菌体濃度における酵素反応の安定性を向上させる目的
で、従来よりも低濃度の界面活性剤を存在させる酵素反
応方法である。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、ガラス容器を
用い、希薄濃度の微生物菌体および低濃度の界面活性剤
を存在させて酵素反応を行うことにより反応の安定性を
向上させる酵素反応方法を提供する。本発明で言う“希
薄菌体濃度”とは、０.０１〜０.５％（Ｗt／Ｖ）の濃
度を意味する。本発明で言う“ガラス容器”とは、反応
液に接する部分が実質的にガラス製であるような反応容
器を意味し、例えば反応容器が完全にガラス製であるも
の、ステンレスの外壁の内部をガラスで被覆したいわゆ
るグラスライニング容器、ステンレスとガラスとを接ぎ
合わせたもの等が含まれる。
用い、希薄濃度の微生物菌体および低濃度の界面活性剤
を存在させて酵素反応を行うことにより反応の安定性を
向上させる酵素反応方法を提供する。本発明で言う“希
薄菌体濃度”とは、０.０１〜０.５％（Ｗt／Ｖ）の濃
度を意味する。本発明で言う“ガラス容器”とは、反応
液に接する部分が実質的にガラス製であるような反応容
器を意味し、例えば反応容器が完全にガラス製であるも
の、ステンレスの外壁の内部をガラスで被覆したいわゆ
るグラスライニング容器、ステンレスとガラスとを接ぎ
合わせたもの等が含まれる。
【０００５】本発明に用いることのできる非イオン性界
面活性剤としては、例えばプロピレングリコール脂肪酸
エステル、グリセリン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エス
テル、ソルビタンモノ脂肪酸エステル、ソルビタンジ脂
肪酸エステル、ソルビタントリ脂肪酸エステル（脂肪酸
部分がそれぞれ、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン
酸、ステアリン酸であるもの）、ポリオキシエチレンア
ルキルエーテル（アルキル鎖部分がデシル、ドデシル、
トリデシル、テトラデシル、セチル、ステアリル、オレ
イルのいずれかであり、エチレンオキサイド単位の数が
１０〜６０であるもの）、ポリオキシエチレンステアレ
ート（エチレンオキサイド単位の数が５〜５０であるも
の）、ポリオキシエチレン パラ−タ−シャリオクチル
フェニルエーテル（エチレンオキサイド単位の数が５〜
５０であるもの）、ポリオキシエチレンソルビタンモノ
脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンジ脂肪
酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタントリ脂肪酸
エステル（脂肪酸部分がそれぞれ、ラウリン酸、オレイ
ン酸、パルミチン酸、ステアリン酸であり、エチレンオ
キサイド単位の数がおおよそ２０であるもの）の中か
ら、酵素反応を阻害しない限り、単独もしくは組み合わ
せて使用することができる。これら界面活性剤の使用濃
度は、通常は０.０００１〜０.０１％(Wt/V)、好ましく
は０.０００５〜０.０１％(Wt/V)である。
面活性剤としては、例えばプロピレングリコール脂肪酸
エステル、グリセリン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エス
テル、ソルビタンモノ脂肪酸エステル、ソルビタンジ脂
肪酸エステル、ソルビタントリ脂肪酸エステル（脂肪酸
部分がそれぞれ、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン
酸、ステアリン酸であるもの）、ポリオキシエチレンア
ルキルエーテル（アルキル鎖部分がデシル、ドデシル、
トリデシル、テトラデシル、セチル、ステアリル、オレ
イルのいずれかであり、エチレンオキサイド単位の数が
１０〜６０であるもの）、ポリオキシエチレンステアレ
ート（エチレンオキサイド単位の数が５〜５０であるも
の）、ポリオキシエチレン パラ−タ−シャリオクチル
フェニルエーテル（エチレンオキサイド単位の数が５〜
５０であるもの）、ポリオキシエチレンソルビタンモノ
脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンジ脂肪
酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタントリ脂肪酸
エステル（脂肪酸部分がそれぞれ、ラウリン酸、オレイ
ン酸、パルミチン酸、ステアリン酸であり、エチレンオ
キサイド単位の数がおおよそ２０であるもの）の中か
ら、酵素反応を阻害しない限り、単独もしくは組み合わ
せて使用することができる。これら界面活性剤の使用濃
度は、通常は０.０００１〜０.０１％(Wt/V)、好ましく
は０.０００５〜０.０１％(Wt/V)である。
【０００６】本発明に用いることのできる酵素反応とし
ては、以下の反応が例示できる。１．Ｌ−アスパラギン酸を産生する反応 アスパルターゼを用いてフマル酸またはその塩、および
アンモニアまたはその塩よりＬ−アスパラギン酸を産生
することができる。アスパルターゼ(EC 4.3.1.1)を産生
する微生物としては、アスパルターゼ活性を有する限り
特に制限はないが、エシェリヒア（Escherichia）属に
属する微生物、例えばエシェリヒア・コリ（E. Coli）
Ｋ−１２系菌株 ATCC27325、同Ｂ系菌株 ATCC11303、同
Ｗ系菌株 ATCC 9637；ブレビバクテリウム(Brevibacter
ium)属に属する微生物、例えばブレビバクテリウム・フ
ラバム（B. flavum）MJ-233-AB-41（FERM BP-1498）、
同 MJ-233-AspB（FERM P-12228）等が好適に用いられ
る。該菌株またはその処理物の存在下での上記酵素反応
は、フマル酸またはその塩とアンモニアまたはその塩と
を反応させて行うことができる。該酵素反応は水性溶媒
中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、反応温度
約０〜６０℃、好ましくは約２０〜５０℃で、通常約３
〜４８時間行われる。酵素反応液の組成には、例えばフ
マル酸を０.５〜２モル/１０００ｍｌ、好ましくは１〜
１.５モル/１０００ｍｌ、並びにアンモニアを１〜１０
モル/１０００ｍｌ、好ましくは２〜６モル/１０００ｍ
ｌ含有することができる。その際、該反応液に添加され
るこれら２成分のモル比は、１：１〜５の範囲内である
ことが好ましい。本反応液には、さらに塩化カルシウ
ム、炭酸カルシウム等のカルシウム塩を１〜５０ミリモ
ル/１０００ｍｌ、好ましくは５〜３０ミリモル/１００
０ｍｌの濃度で用いることができる。
ては、以下の反応が例示できる。１．Ｌ−アスパラギン酸を産生する反応 アスパルターゼを用いてフマル酸またはその塩、および
アンモニアまたはその塩よりＬ−アスパラギン酸を産生
することができる。アスパルターゼ(EC 4.3.1.1)を産生
する微生物としては、アスパルターゼ活性を有する限り
特に制限はないが、エシェリヒア（Escherichia）属に
属する微生物、例えばエシェリヒア・コリ（E. Coli）
Ｋ−１２系菌株 ATCC27325、同Ｂ系菌株 ATCC11303、同
Ｗ系菌株 ATCC 9637；ブレビバクテリウム(Brevibacter
ium)属に属する微生物、例えばブレビバクテリウム・フ
ラバム（B. flavum）MJ-233-AB-41（FERM BP-1498）、
同 MJ-233-AspB（FERM P-12228）等が好適に用いられ
る。該菌株またはその処理物の存在下での上記酵素反応
は、フマル酸またはその塩とアンモニアまたはその塩と
を反応させて行うことができる。該酵素反応は水性溶媒
中、ｐＨ５〜１１、好ましくはｐＨ６〜１０、反応温度
約０〜６０℃、好ましくは約２０〜５０℃で、通常約３
〜４８時間行われる。酵素反応液の組成には、例えばフ
マル酸を０.５〜２モル/１０００ｍｌ、好ましくは１〜
１.５モル/１０００ｍｌ、並びにアンモニアを１〜１０
モル/１０００ｍｌ、好ましくは２〜６モル/１０００ｍ
ｌ含有することができる。その際、該反応液に添加され
るこれら２成分のモル比は、１：１〜５の範囲内である
ことが好ましい。本反応液には、さらに塩化カルシウ
ム、炭酸カルシウム等のカルシウム塩を１〜５０ミリモ
ル/１０００ｍｌ、好ましくは５〜３０ミリモル/１００
０ｍｌの濃度で用いることができる。
【０００７】２．Ｌ−リンゴ酸を産生する反応 フマラーゼを用いてフマル酸またはその塩に水を付加
し、Ｌ−リンゴ酸を産生することができる。フマラーゼ
(EC 4.2.1.2)を産生する微生物としては、例えば、ブレ
ビバクテリウム属（Brevibacterium）、エシェリヒア属
（Escherichia）、ラクトバチルス（Lactobacillus）
属、プロテウス（Proteus）属等に属する微生物が知ら
れており、ブレビバクテリウム属に属する微生物、例え
ば、ブレビバクテリウム・フラバム（B. flavum）MJ-23
3（FERM BP-1497）、同 MJ-233-AB-41（FERM BP-1498）
が好適に用いられる。該菌体またはその処理物の存在下
での上記酵素反応は、フマル酸またはその塩を水溶液中
で反応させることにより行うことができる。該酵素反応
は水性溶媒中、ｐＨ４〜１０、反応温度約１５〜６０
℃、好ましくは約２０〜５０℃で通常約０.５〜４８時
間行われる。本酵素反応は水溶媒中で行われるが、水の
他にリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の溶媒を１０〜
５００ｍＭの濃度で用いることもできる。また、反応液
のｐＨを４〜１０に調節するために、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム等のアルカリ類、および／または塩
酸、硫酸等の無機酸を添加することもできる。酵素反応
液中のフマル酸またはその塩の反応時の使用量には特に
制限はないが、一般には０.５〜３０％（Wt/V）の範囲
で使用するのが好ましい。
し、Ｌ−リンゴ酸を産生することができる。フマラーゼ
(EC 4.2.1.2)を産生する微生物としては、例えば、ブレ
ビバクテリウム属（Brevibacterium）、エシェリヒア属
（Escherichia）、ラクトバチルス（Lactobacillus）
属、プロテウス（Proteus）属等に属する微生物が知ら
れており、ブレビバクテリウム属に属する微生物、例え
ば、ブレビバクテリウム・フラバム（B. flavum）MJ-23
3（FERM BP-1497）、同 MJ-233-AB-41（FERM BP-1498）
が好適に用いられる。該菌体またはその処理物の存在下
での上記酵素反応は、フマル酸またはその塩を水溶液中
で反応させることにより行うことができる。該酵素反応
は水性溶媒中、ｐＨ４〜１０、反応温度約１５〜６０
℃、好ましくは約２０〜５０℃で通常約０.５〜４８時
間行われる。本酵素反応は水溶媒中で行われるが、水の
他にリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等の溶媒を１０〜
５００ｍＭの濃度で用いることもできる。また、反応液
のｐＨを４〜１０に調節するために、水酸化ナトリウ
ム、水酸化カリウム等のアルカリ類、および／または塩
酸、硫酸等の無機酸を添加することもできる。酵素反応
液中のフマル酸またはその塩の反応時の使用量には特に
制限はないが、一般には０.５〜３０％（Wt/V）の範囲
で使用するのが好ましい。
【０００８】３．Ｌ−トリプトファンを産生する反応 トリプトファナーゼを用いてインドール、ピルビン酸ま
たはその塩、およびアンモニアおよびその塩からＬ−ト
リプトファンを産生することができる。トリプトファナ
ーゼ(EC 4.1.99.1)を産生する微生物としては、例え
ば、エシェリヒア（Escherichia）属に属するエシェリ
ヒア・コリ（E. Coli）、プロテウス（Proteus）属に属
するプロテウス・レットゲリ（P. rettgeri）、アエロモ
ナス（Aeromonas）属に属するアエロモナス・リケファ
シエンス(A. liquefaciens)が知られており、好適には
エシェリヒア・コリ（E. Coli）が挙げられる。該菌体
またはその処理物の存在下での上記酵素反応は、インド
ール、ピルビン酸またはその塩、およびアンモニアまた
はその塩とを反応させることで行うことができる。該酵
素反応は、０.１Ｍリン酸緩衝液あるいは水溶媒中、ｐ
Ｈ７.５〜１０、反応温度約２０〜５０℃、好ましくは
３０〜４０℃で通常２〜７２時間行われる。反応液中の
インドール；ピルビン酸またはその塩、例えば、ピルビ
ン酸ナトリウム等；およびアンモニアまたはアンモニウ
ムイオン、例えば、塩化アンモニウム等の添加量は特に
制限されないが、通常０.１〜２０％（Wt/V）、好まし
くは０.５〜１０％（Wt/V）である。本反応液中に添加
するインドール/ピルビン酸またはその塩／アンモニア
またはその塩のモル比も、特に制限されないが、通常
１：１〜１００：１〜３００の範囲、好ましくは１：５
〜５０：５〜１００の範囲で使用される。
たはその塩、およびアンモニアおよびその塩からＬ−ト
リプトファンを産生することができる。トリプトファナ
ーゼ(EC 4.1.99.1)を産生する微生物としては、例え
ば、エシェリヒア（Escherichia）属に属するエシェリ
ヒア・コリ（E. Coli）、プロテウス（Proteus）属に属
するプロテウス・レットゲリ（P. rettgeri）、アエロモ
ナス（Aeromonas）属に属するアエロモナス・リケファ
シエンス(A. liquefaciens)が知られており、好適には
エシェリヒア・コリ（E. Coli）が挙げられる。該菌体
またはその処理物の存在下での上記酵素反応は、インド
ール、ピルビン酸またはその塩、およびアンモニアまた
はその塩とを反応させることで行うことができる。該酵
素反応は、０.１Ｍリン酸緩衝液あるいは水溶媒中、ｐ
Ｈ７.５〜１０、反応温度約２０〜５０℃、好ましくは
３０〜４０℃で通常２〜７２時間行われる。反応液中の
インドール；ピルビン酸またはその塩、例えば、ピルビ
ン酸ナトリウム等；およびアンモニアまたはアンモニウ
ムイオン、例えば、塩化アンモニウム等の添加量は特に
制限されないが、通常０.１〜２０％（Wt/V）、好まし
くは０.５〜１０％（Wt/V）である。本反応液中に添加
するインドール/ピルビン酸またはその塩／アンモニア
またはその塩のモル比も、特に制限されないが、通常
１：１〜１００：１〜３００の範囲、好ましくは１：５
〜５０：５〜１００の範囲で使用される。
【０００９】４．Ｌ−チロシンを産生する反応 β−チロシナーゼを用いてフェノールとＬ−セリンまた
はＤＬ−セリンから、あるいはフェノールとピルビン酸
またはその塩とアンモニアまたはその塩からＬ−チロシ
ン産生することができる。β−チロシナーゼ（EC 4.1.9
9.2）を産生する微生物としては、例えば、エシェヒリ
ア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）
属、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、エアロ
バクター（Aerobacter）属、エルビニア（Erwinia）
属、プロテウス（Proteus）属、シトロバクター（Citor
obacter）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、
サルモネラ（Salmonella）属等に属する微生物が知られ
ており、エシェヒリア（Escherichia）属に属する微生
物が好適に用いられる。該菌体またはその処理物の存在
下での上記酵素反応は、フェノールとＬ−セリンとの反
応、あるいはフェノールとピルビン酸またはその塩とア
ンモニアまたはその塩との反応により行うことができ
る。該酵素反応は、通常の酵素反応と同様に、例えば、
０.１Ｍリン酸緩衝液あるいは水性溶媒中、ｐＨ６.０〜
１０.０、反応温度約２０〜５０℃、好ましくは３０〜
４０℃で通常２〜７２時間行われる。反応中は、撹拌し
続けることが望ましい。本反応液中のフェノール濃度は
特に厳密に限定されるものではないが、反応液における
濃度が常に１.０％（Wt/V）に維持されるように、連続
的または断続的に培地に添加して反応させることが特に
望ましい。また、その総添加量も特に限定されないが、
通常０.１〜１０％（Wt/V）、好ましくは０.５〜５％
（Wt/V）である。基質のＬ−またはＤＬ−セリンあるい
はピルビン酸またはその塩とアンモニアまたはその塩
は、一般には各々０.１〜２０％（Wt/V）の濃度範囲で
使用するのが適当である。
はＤＬ−セリンから、あるいはフェノールとピルビン酸
またはその塩とアンモニアまたはその塩からＬ−チロシ
ン産生することができる。β−チロシナーゼ（EC 4.1.9
9.2）を産生する微生物としては、例えば、エシェヒリ
ア（Escherichia）属、シュードモナス（Pseudomonas）
属、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、エアロ
バクター（Aerobacter）属、エルビニア（Erwinia）
属、プロテウス（Proteus）属、シトロバクター（Citor
obacter）属、エンテロバクター（Enterobacter）属、
サルモネラ（Salmonella）属等に属する微生物が知られ
ており、エシェヒリア（Escherichia）属に属する微生
物が好適に用いられる。該菌体またはその処理物の存在
下での上記酵素反応は、フェノールとＬ−セリンとの反
応、あるいはフェノールとピルビン酸またはその塩とア
ンモニアまたはその塩との反応により行うことができ
る。該酵素反応は、通常の酵素反応と同様に、例えば、
０.１Ｍリン酸緩衝液あるいは水性溶媒中、ｐＨ６.０〜
１０.０、反応温度約２０〜５０℃、好ましくは３０〜
４０℃で通常２〜７２時間行われる。反応中は、撹拌し
続けることが望ましい。本反応液中のフェノール濃度は
特に厳密に限定されるものではないが、反応液における
濃度が常に１.０％（Wt/V）に維持されるように、連続
的または断続的に培地に添加して反応させることが特に
望ましい。また、その総添加量も特に限定されないが、
通常０.１〜１０％（Wt/V）、好ましくは０.５〜５％
（Wt/V）である。基質のＬ−またはＤＬ−セリンあるい
はピルビン酸またはその塩とアンモニアまたはその塩
は、一般には各々０.１〜２０％（Wt/V）の濃度範囲で
使用するのが適当である。
【００１０】５．Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニンを
産生する反応 β−チロシナーゼを用いてカテコールとＬ−セリンから
Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニンを産生することがで
きる。β−チロシナーゼ（EC 4.1.99.2）を産生する微
生物としては、上記４の反応と同様の微生物を挙げるこ
とができ、エシェヒリア（Escherichia）属に属する微
生物が好適に用いられる。該菌体またはその処理物の存
在下での上記酵素反応は、カテコールとＬ−セリンとの
反応により行うことができる。また、該酵素反応の反応
条件も、上記４の反応と同様である。基質のＬ−または
ＤＬ−セリンの添加濃度は、一般には各々０.１〜２０
％（Wt/V）が好ましい。また、カテコールの添加濃度
は、特に限定されないが、反応液における濃度が常に
１.０％（Wt/V）に維持されるように、連続的または断
続的に培地に添加して反応させることが特に望ましい。
産生する反応 β−チロシナーゼを用いてカテコールとＬ−セリンから
Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニンを産生することがで
きる。β−チロシナーゼ（EC 4.1.99.2）を産生する微
生物としては、上記４の反応と同様の微生物を挙げるこ
とができ、エシェヒリア（Escherichia）属に属する微
生物が好適に用いられる。該菌体またはその処理物の存
在下での上記酵素反応は、カテコールとＬ−セリンとの
反応により行うことができる。また、該酵素反応の反応
条件も、上記４の反応と同様である。基質のＬ−または
ＤＬ−セリンの添加濃度は、一般には各々０.１〜２０
％（Wt/V）が好ましい。また、カテコールの添加濃度
は、特に限定されないが、反応液における濃度が常に
１.０％（Wt/V）に維持されるように、連続的または断
続的に培地に添加して反応させることが特に望ましい。
【００１１】６．Ｌ−アラニンを産生する反応 アスパラギン酸β−脱炭酸酵素を用いて、Ｌ−アスパラ
ギン酸またはその塩よりＬ−アラニンを生成することが
できる。アスパラギン酸脱炭酸酵素（EC 4.1.1.12）を
産生する微生物としては、例えば、シュードモナス（Ps
eudomonas）属に属するシュードモナス・ダクネー（P. d
acunhae）IAM1152、同 ATCC21192、シュードモナス・プ
チダ（P. putida）IAM1506、同 ATCC21812、シュードモ
ナス・フルオレッセンス(P. fluorescens）IF03081、シ
ュードモナス・アエルギノーサ（P. aeruginosa）IAM10
54 等が知られており、好適にはシュードモナス・ダク
ネー（P. dacunhae）が用いられる。該菌体またはその
処理物の存在下での上記酵素反応は、少なくともＬ−ア
スパラギン酸またはその塩を含有する水性溶媒中、ｐＨ
４.３〜５.０、好ましくは４.５〜４.８、反応温度約２
０〜５０℃、好ましくは４０〜４７℃で通常３〜４８時
間行われる。本反応液に添加されるＬ−アスパラギン酸
またはその塩の添加濃度は０.５〜５０％（Wt/V）、好
ましくは３〜３０％（Wt/V）である。なお、Ｌ−アスパ
ラギン酸は、溶解して存在（溶解状態）しても、粉末で
存在（不溶解状態）していてもよい。本水性溶媒には、
さらにピリドキサール５'−リン酸を０.０００５〜０.
０５％（Wt/V）、好ましくは０.００１〜０.０１％（Wt
/V）添加して用いることができる。さらに必要に応じ
て、ピルビン酸、α−ケト酪酸等のα−ケト酸を０.０
０１〜０.５％（Wt/V）、好ましくは０.０１〜０.１％
（Wt/V）添加することができる。また、本反応液のｐＨ
を調整するためにアルカリ溶液、例えばアンモニア水、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることがで
きる。以上の例示は本発明に従い希薄濃度の微生物菌体
および低濃度の界面活性剤の存在下に行う酵素反応につ
いて具体的な認識を得る一助に過ぎず、本発明の範囲を
些かも限定するものではない。
ギン酸またはその塩よりＬ−アラニンを生成することが
できる。アスパラギン酸脱炭酸酵素（EC 4.1.1.12）を
産生する微生物としては、例えば、シュードモナス（Ps
eudomonas）属に属するシュードモナス・ダクネー（P. d
acunhae）IAM1152、同 ATCC21192、シュードモナス・プ
チダ（P. putida）IAM1506、同 ATCC21812、シュードモ
ナス・フルオレッセンス(P. fluorescens）IF03081、シ
ュードモナス・アエルギノーサ（P. aeruginosa）IAM10
54 等が知られており、好適にはシュードモナス・ダク
ネー（P. dacunhae）が用いられる。該菌体またはその
処理物の存在下での上記酵素反応は、少なくともＬ−ア
スパラギン酸またはその塩を含有する水性溶媒中、ｐＨ
４.３〜５.０、好ましくは４.５〜４.８、反応温度約２
０〜５０℃、好ましくは４０〜４７℃で通常３〜４８時
間行われる。本反応液に添加されるＬ−アスパラギン酸
またはその塩の添加濃度は０.５〜５０％（Wt/V）、好
ましくは３〜３０％（Wt/V）である。なお、Ｌ−アスパ
ラギン酸は、溶解して存在（溶解状態）しても、粉末で
存在（不溶解状態）していてもよい。本水性溶媒には、
さらにピリドキサール５'−リン酸を０.０００５〜０.
０５％（Wt/V）、好ましくは０.００１〜０.０１％（Wt
/V）添加して用いることができる。さらに必要に応じ
て、ピルビン酸、α−ケト酪酸等のα−ケト酸を０.０
０１〜０.５％（Wt/V）、好ましくは０.０１〜０.１％
（Wt/V）添加することができる。また、本反応液のｐＨ
を調整するためにアルカリ溶液、例えばアンモニア水、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等を用いることがで
きる。以上の例示は本発明に従い希薄濃度の微生物菌体
および低濃度の界面活性剤の存在下に行う酵素反応につ
いて具体的な認識を得る一助に過ぎず、本発明の範囲を
些かも限定するものではない。
【００１２】
【実施例】以下実施例により本発明を具体的に説明す
る。実施例におけるＬ−アスパラギン酸の定量は高速液
体クロマトグラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）を用いて行っ
た。参考例−１ アスパルターゼ含有菌体の調整 培地（尿素０.４％、硫酸アンモニウム１.４％、リン酸
一カリウム０.０５％、リン酸二カリウム０.０５％、硫
酸マグネシウム・７水塩０.０５％、塩化カルシウム２
水塩 ２ppm、硫酸第一鉄・７水塩 ２ppm、硫酸マンガン
・４〜６水塩２ppm、硫酸亜鉛・７水塩 ２ppm、塩化ナ
トリウム ２ppm、ビオチン２００μg/l、チアミン塩酸
１００μg/l、カザミノ酸０.１％、酵母エキス０.１
％）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、
滅菌（滅菌後ｐＨ７.０）した後、ブレビバクテリウム
・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３−
ＡＢ−４１（FERM BP-1498）ならびにアスパルターゼ高
活性菌であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３−ＡｓｐＢ（FERM P-12228）をそれぞれ植菌し、無菌
的に５０％（Wt/V）グルコースを４ｍｌ添加して、３０
℃にて２日間振盪培養を行った。
る。実施例におけるＬ−アスパラギン酸の定量は高速液
体クロマトグラフィー（島津ＬＣ−５Ａ）を用いて行っ
た。参考例−１ アスパルターゼ含有菌体の調整 培地（尿素０.４％、硫酸アンモニウム１.４％、リン酸
一カリウム０.０５％、リン酸二カリウム０.０５％、硫
酸マグネシウム・７水塩０.０５％、塩化カルシウム２
水塩 ２ppm、硫酸第一鉄・７水塩 ２ppm、硫酸マンガン
・４〜６水塩２ppm、硫酸亜鉛・７水塩 ２ppm、塩化ナ
トリウム ２ppm、ビオチン２００μg/l、チアミン塩酸
１００μg/l、カザミノ酸０.１％、酵母エキス０.１
％）１００ｍｌを５００ｍｌ容三角フラスコに分注し、
滅菌（滅菌後ｐＨ７.０）した後、ブレビバクテリウム
・フラバム（Brevibacterium flavum）ＭＪ−２３３−
ＡＢ−４１（FERM BP-1498）ならびにアスパルターゼ高
活性菌であるブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３
３−ＡｓｐＢ（FERM P-12228）をそれぞれ植菌し、無菌
的に５０％（Wt/V）グルコースを４ｍｌ添加して、３０
℃にて２日間振盪培養を行った。
【００１３】次に、本培養培地（硫酸アンモニウム２.
３％、リン酸一カリウム０.０５％、リン酸二カリウム
０.０５％、硫酸マグネシウム・７水塩０.０５％、硫酸
第一鉄・７水塩２０ppm、硫酸マンガン・４〜６水塩２
０ppm、ビオチン２００μg/l、チアミン塩酸１００μg/
l、カザミノ酸０.３％、酵母エキス０.３％）１０００
ｍｌを、２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、
２０分）後、５０％（Wt/V）グルコース４０ｍｌと前記
培養物２０ｍｌを添加して、回転数１０００rpm、通気
量１vvm、温度３３℃、ｐＨ７.６にて４８時間培養を行
った。なお、グルコースは培養中培地の濃度が１％（Wt
/V）を越えないように注意しつつ、約１〜２時間ごと断
続的に５０％（Wt/V）グルコースを添加した。培養終了
後、培養物１０００ｍｌから遠心分離して集菌した。
３％、リン酸一カリウム０.０５％、リン酸二カリウム
０.０５％、硫酸マグネシウム・７水塩０.０５％、硫酸
第一鉄・７水塩２０ppm、硫酸マンガン・４〜６水塩２
０ppm、ビオチン２００μg/l、チアミン塩酸１００μg/
l、カザミノ酸０.３％、酵母エキス０.３％）１０００
ｍｌを、２ｌ容通気撹拌槽に仕込み、滅菌（１２０℃、
２０分）後、５０％（Wt/V）グルコース４０ｍｌと前記
培養物２０ｍｌを添加して、回転数１０００rpm、通気
量１vvm、温度３３℃、ｐＨ７.６にて４８時間培養を行
った。なお、グルコースは培養中培地の濃度が１％（Wt
/V）を越えないように注意しつつ、約１〜２時間ごと断
続的に５０％（Wt/V）グルコースを添加した。培養終了
後、培養物１０００ｍｌから遠心分離して集菌した。
【００１４】参考例−２ アスパルターゼ含有菌体の前
処理 アスパルターゼ含有菌体内にはアスパルターゼの他に副
反応酵素フマラーゼが共存するため、原料のフマル酸が
一部リンゴ酸に変換される問題が生じるので、下記のと
おりフマラーゼ活性の除去処理を行った。上記参考例１
で調製した菌体５０ｇを処理液〔Ｌ−アスパラギン酸１
００ｇ、アンモニア水（２８％アンモニア含有水溶液）
８０ｍｌ、塩化カルシウム２水塩 ５.５ｇ、ポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレート０.８ｇに蒸留水を
添加して全量１ｌとして調製〕１ｌに懸濁後、５０℃に
て２時間加熱処理を行った。処理物を遠心分離して集菌
し、これをアスパルターゼ含有菌体として使用した。
処理 アスパルターゼ含有菌体内にはアスパルターゼの他に副
反応酵素フマラーゼが共存するため、原料のフマル酸が
一部リンゴ酸に変換される問題が生じるので、下記のと
おりフマラーゼ活性の除去処理を行った。上記参考例１
で調製した菌体５０ｇを処理液〔Ｌ−アスパラギン酸１
００ｇ、アンモニア水（２８％アンモニア含有水溶液）
８０ｍｌ、塩化カルシウム２水塩 ５.５ｇ、ポリオキシ
エチレンソルビタンモノラウレート０.８ｇに蒸留水を
添加して全量１ｌとして調製〕１ｌに懸濁後、５０℃に
て２時間加熱処理を行った。処理物を遠心分離して集菌
し、これをアスパルターゼ含有菌体として使用した。
【００１５】実施例−１ 上記参考例−２で調製した菌体０.２５ｇを０.１Ｍのト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ９.０）に懸濁させて全量を１０
０ｍｌとした。該菌体懸濁液２ｍｌと１８ｍｌの酵素反
応液［フマル酸１５０ｇ、アンモニア水（２８％アンモ
ニア含有水溶液）２２０ｍｌ、塩化カルシウム２水塩
２.２ｇおよび表１に示した非イオン性界面活性剤０.０
１ｇに蒸留水を添加して全量９００ｍｌとして調製］
を、５０ｍｌ容共栓付三角フラスコに加えて、４５℃で
３０時間振とうしながら反応を行った。反応終了後、遠
心分離にて菌体を除去し、上清中の生成Ｌ−アスパラギ
ン酸を定量した。その結果を表１に示す。結果は、非イ
オン性界面活性剤を存在させずに同様条件で反応を行っ
た際の生成Ｌ−アスパラギン酸量を１００とする相対値
で示した。なお、反応液中には菌体からの蛋白質の漏洩
は認められなかった。
リス塩酸緩衝液（ｐＨ９.０）に懸濁させて全量を１０
０ｍｌとした。該菌体懸濁液２ｍｌと１８ｍｌの酵素反
応液［フマル酸１５０ｇ、アンモニア水（２８％アンモ
ニア含有水溶液）２２０ｍｌ、塩化カルシウム２水塩
２.２ｇおよび表１に示した非イオン性界面活性剤０.０
１ｇに蒸留水を添加して全量９００ｍｌとして調製］
を、５０ｍｌ容共栓付三角フラスコに加えて、４５℃で
３０時間振とうしながら反応を行った。反応終了後、遠
心分離にて菌体を除去し、上清中の生成Ｌ−アスパラギ
ン酸を定量した。その結果を表１に示す。結果は、非イ
オン性界面活性剤を存在させずに同様条件で反応を行っ
た際の生成Ｌ−アスパラギン酸量を１００とする相対値
で示した。なお、反応液中には菌体からの蛋白質の漏洩
は認められなかった。
【００１６】
【表１】
【００１７】実施例−２ 反応液中の菌体濃度を表２に示した各濃度に設定し、且
つ非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレートを表２に示した各濃度に設定した
以外は実施例−１と同様の条件で反応を行い、同様に生
成Ｌ−アスパラギン酸を定量した。その結果を表２に示
す。結果は、非イオン性界面活性剤を存在させずに同様
の条件で反応を行った際の生成Ｌ−アスパラギン酸量を
１００とする相対値で示した。なお、反応液中には菌体
からの蛋白質の漏洩は認められなかった。
つ非イオン性界面活性剤としてポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレートを表２に示した各濃度に設定した
以外は実施例−１と同様の条件で反応を行い、同様に生
成Ｌ−アスパラギン酸を定量した。その結果を表２に示
す。結果は、非イオン性界面活性剤を存在させずに同様
の条件で反応を行った際の生成Ｌ−アスパラギン酸量を
１００とする相対値で示した。なお、反応液中には菌体
からの蛋白質の漏洩は認められなかった。
【００１８】
【表２】
【００１９】
【発明の効果】上記の試験結果から明らかな如く、本発
明に従い酵素反応液に低濃度の非イオン性界面活性剤を
存在させることにより、Ｌ−アスパラギン酸生成量が顕
著に増加する。この結果は、菌体濃度が希薄な場合に、
低濃度の非イオン界面活性剤の存在により酵素反応の安
定性が向上したことによってもたらされたものと考えら
れる。
明に従い酵素反応液に低濃度の非イオン性界面活性剤を
存在させることにより、Ｌ−アスパラギン酸生成量が顕
著に増加する。この結果は、菌体濃度が希薄な場合に、
低濃度の非イオン界面活性剤の存在により酵素反応の安
定性が向上したことによってもたらされたものと考えら
れる。
フロントページの続き (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社筑波総合研究所内
Claims (4)
- 【請求項１】 ガラス容器を用い、希薄濃度の微生物菌
体および低濃度の界面活性剤を存在させて酵素反応を行
うことを特徴とする、酵素反応方法。 - 【請求項２】 前記界面活性剤が非イオン性界面活性剤
である、請求項１に記載の酵素反応方法。 - 【請求項３】 前記界面活性剤の濃度が０.０００１〜
０.０１％（Ｗｔ／Ｖ)である、請求項１に記載の酵素反
応方法。 - 【請求項４】 反応液中の微生物菌体の濃度が０.０１
〜０.５％（Ｗｔ／Ｖ）である、請求項１に記載の酵素
反応方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34071192A JPH06181783A (ja) | 1992-12-21 | 1992-12-21 | 酵素反応方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34071192A JPH06181783A (ja) | 1992-12-21 | 1992-12-21 | 酵素反応方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06181783A true JPH06181783A (ja) | 1994-07-05 |
Family
ID=18339586
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34071192A Pending JPH06181783A (ja) | 1992-12-21 | 1992-12-21 | 酵素反応方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06181783A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001062951A1 (fr) * | 2000-02-23 | 2001-08-30 | Fuji Oil Co., Ltd. | Methode de production de farine de coprah modifiee |
-
1992
- 1992-12-21 JP JP34071192A patent/JPH06181783A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001062951A1 (fr) * | 2000-02-23 | 2001-08-30 | Fuji Oil Co., Ltd. | Methode de production de farine de coprah modifiee |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH0559709B2 (ja) | ||
| US4880739A (en) | Method of cultivation of pseudomonas bacteria | |
| HU209917B (en) | Single-fermentorous process for the preparation of 6-hydroxy-nicotic acid | |
| JPH06181783A (ja) | 酵素反応方法 | |
| US5116743A (en) | L-alanine production with two microorganisms having fumarase inactivity in a single reaction tank | |
| JPH06181782A (ja) | 酵素反応方法 | |
| JP3526443B2 (ja) | ［ｓ，ｓ］−エチレンジアミン−ｎ，ｎ’−ジコハク酸の製造法 | |
| KR940010020B1 (ko) | 슈도모나스속 미생물의 배양방법 및 그 미생물을 사용하는 l-알라닌의 제조방법 | |
| JP2832723B2 (ja) | Ｌ―アラニンの製造法 | |
| JPH06181781A (ja) | 酵素反応方法 | |
| EP0295622B1 (en) | Process for producing l-tryptophan | |
| JP3003966B2 (ja) | Ｄｌ−アラニンの製造法 | |
| JPS60120983A (ja) | ブレビバクテリウム属に属する菌体の培養法 | |
| JP2830029B2 (ja) | フマラーゼ活性の除去方法 | |
| JPH04365492A (ja) | Ｌ−アラニンの製造法 | |
| JP3165040B2 (ja) | 新規微生物及びｌ−アスパラギン酸、フマル酸及び／またはｌ−リンゴ酸の製造方法 | |
| JPH0822235B2 (ja) | 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 | |
| JPS6121077B2 (ja) | ||
| JPS63177797A (ja) | リボ−ス−１−リン酸及びリバビリンの製造法 | |
| JPH04197190A (ja) | Ｌ―アラニンの製造法 | |
| JP2899071B2 (ja) | Ｌ―α―アラニンの製造法 | |
| JPH0630572B2 (ja) | Ｌ−フエニルアラニン脱水素酵素 | |
| JPH0538292A (ja) | Ｌ−アラニンの製造法 | |
| JPH10511550A (ja) | 有機酸とアミノ酸の製造 | |
| JPS5928485A (ja) | Ｌ−システインの製造法 |