JPH06298802A - 新規な変性ヘモグロビン - Google Patents
新規な変性ヘモグロビンInfo
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- JPH06298802A JPH06298802A JP5254619A JP25461993A JPH06298802A JP H06298802 A JPH06298802 A JP H06298802A JP 5254619 A JP5254619 A JP 5254619A JP 25461993 A JP25461993 A JP 25461993A JP H06298802 A JPH06298802 A JP H06298802A
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- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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- C08H1/00—Macromolecular products derived from proteins
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
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- C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
- C07F9/09—Esters of phosphoric acids
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 式（ＨＢ）−Ｚａ（式中、ＨＢはヘモグロビ
ン残基を表わし、そしてＺａはイノシトールホスフェー
トから誘導される基である）で表わされる変性ヘモグロ
ビン並びにその重合された（ＨＢ）−Ｚａおよびその製
造方法。 【効果】 約７０,０００〜約２,０００,０００の分子
量を有しそして式Ｉ （ＰＳ）−Ｘ−（ＨＢ）−Ｚ Ｉ （式中ＰＳは、約２,０００〜約２,０００,０００の分
子量を有する生理学的に許容し得るポリサッカライドを
表わし、Ｘは共有結合した化学的架橋基を表わし、ＨＢ
はヘモグロビン残基を表わし、そしてＺは２個またはそ
れ以上のヒドロキシ基がりん酸でエステル化されている
ポリオールである）を有する水溶性化合物の製造におけ
る中間体として有用であり、さらにまた血液代替物とし
ても有用である。
ン残基を表わし、そしてＺａはイノシトールホスフェー
トから誘導される基である）で表わされる変性ヘモグロ
ビン並びにその重合された（ＨＢ）−Ｚａおよびその製
造方法。 【効果】 約７０,０００〜約２,０００,０００の分子
量を有しそして式Ｉ （ＰＳ）−Ｘ−（ＨＢ）−Ｚ Ｉ （式中ＰＳは、約２,０００〜約２,０００,０００の分
子量を有する生理学的に許容し得るポリサッカライドを
表わし、Ｘは共有結合した化学的架橋基を表わし、ＨＢ
はヘモグロビン残基を表わし、そしてＺは２個またはそ
れ以上のヒドロキシ基がりん酸でエステル化されている
ポリオールである）を有する水溶性化合物の製造におけ
る中間体として有用であり、さらにまた血液代替物とし
ても有用である。
Description
【０００１】本発明は血液代替物およびその製造方法に
関する。本発明は後記式Ｉを有する化合物の製造におい
て有用な式（ＨＢ）−Ｚａ（式中、ＨＢはヘモグロビン
残基を表わしそしてＺａはイノシトールホスフェートか
ら誘導される基である）で表わされる変性ヘモグロビン
並びにその重合された（ＨＢ）−Ｚａおよびその製造方
法に関する。
関する。本発明は後記式Ｉを有する化合物の製造におい
て有用な式（ＨＢ）−Ｚａ（式中、ＨＢはヘモグロビン
残基を表わしそしてＺａはイノシトールホスフェートか
ら誘導される基である）で表わされる変性ヘモグロビン
並びにその重合された（ＨＢ）−Ｚａおよびその製造方
法に関する。
【０００２】米国特許第４,０６４,１１８号明細書は約
５,０００〜約２,０００,０００の分子量を有するヒド
ロキシエチル殿粉またはデキストランと共有結合したヘ
モグロビンの水溶性生成物より成る血液代替物または血
液増量剤組成物として有用な組成物を記載している。こ
の米国特許明細書はまたかかる組成物の製造方法にも記
載しているが、これはヘモグロビンを約５,０００〜約
２,０００,０００の分子量を有するヒドロキシエチル殿
粉またはデキストランと化学的に結合させることより成
る。
５,０００〜約２,０００,０００の分子量を有するヒド
ロキシエチル殿粉またはデキストランと共有結合したヘ
モグロビンの水溶性生成物より成る血液代替物または血
液増量剤組成物として有用な組成物を記載している。こ
の米国特許明細書はまたかかる組成物の製造方法にも記
載しているが、これはヘモグロビンを約５,０００〜約
２,０００,０００の分子量を有するヒドロキシエチル殿
粉またはデキストランと化学的に結合させることより成
る。
【０００３】しかしながら、ヘモグロビンと比較する
と、米国特許第４,０６４,１１８号明細書に記載の生成
物は幾分より大きな酸素親和性を示す傾向にあるがヘモ
グロビンの本質的な酸素輸送および放出能を保持してい
ることがわかる。半飽和酸素圧力（tension）により測
定した場合、米国特許第４,０６４,１１８号明細書の方
法Ｉにより製造されたデキストラン−ヘモグロビンコン
プレックスは遊離ヘモグロビンよりも約２.５倍大きい
酸素親和性を示す。
と、米国特許第４,０６４,１１８号明細書に記載の生成
物は幾分より大きな酸素親和性を示す傾向にあるがヘモ
グロビンの本質的な酸素輸送および放出能を保持してい
ることがわかる。半飽和酸素圧力（tension）により測
定した場合、米国特許第４,０６４,１１８号明細書の方
法Ｉにより製造されたデキストラン−ヘモグロビンコン
プレックスは遊離ヘモグロビンよりも約２.５倍大きい
酸素親和性を示す。
【０００４】ピリドキサール−５′−ホスフェートは、
ヘモグロビンに可逆的に結合することが知られており、
またこの結合は還元により不可逆的にすることができ、
可逆的に結合した生成物および不可逆的に結合した生成
物のいずれもがヘモグロビンそれ自体よりも低強度の酸
素結合特性を有することも知られている。しかしなが
ら、ピリドキサール−５′−ホスフェートで共有結合誘
導体化してもデキストラン−ヘモグロビンの酸素親和性
を低めてピリドキサール−５′−ホスフェートで誘導体
化したヘモグロビン（ＰＬＰ−Ｈｂ）のそれに近づける
ことができないことがわかった。ＰＬＰ−Ｈｂの酸素親
和性に近いまたはそれよりも低い酸素親和性が満足のい
くヘモグロビン基血液代替物にとって望ましいと考えら
れる。
ヘモグロビンに可逆的に結合することが知られており、
またこの結合は還元により不可逆的にすることができ、
可逆的に結合した生成物および不可逆的に結合した生成
物のいずれもがヘモグロビンそれ自体よりも低強度の酸
素結合特性を有することも知られている。しかしなが
ら、ピリドキサール−５′−ホスフェートで共有結合誘
導体化してもデキストラン−ヘモグロビンの酸素親和性
を低めてピリドキサール−５′−ホスフェートで誘導体
化したヘモグロビン（ＰＬＰ−Ｈｂ）のそれに近づける
ことができないことがわかった。ＰＬＰ−Ｈｂの酸素親
和性に近いまたはそれよりも低い酸素親和性が満足のい
くヘモグロビン基血液代替物にとって望ましいと考えら
れる。
【０００５】本発明者らは今般、例えば米国特許第４,
０６４,１１８号明細書に記載されているような生理学
的に許容し得るポリサッカライドヘモグロビンコンプレ
ックスをこれまでよりも低い酸素親和性を有する改変さ
れた形態で製造できることを見出した。すなわち、約７
０,０００〜約２,０００,０００の分子量を有しそして
式Ｉ （ＰＳ）−Ｘ−（ＨＢ）−Ｚ Ｉ （式中、ＰＳは約２,０００〜約２,０００,０００の分
子量を有する生理学的に許容し得るポリサッカライドを
表わし、Ｘは共有結合した化学的架橋基を表わし、ＨＢ
はヘモグロビン残基を表わし、そしてＺは酸素親和性低
下配位子であり２個またはそれ以上のホスフェート基を
含む）を有する水溶性化合物が提供される。
０６４,１１８号明細書に記載されているような生理学
的に許容し得るポリサッカライドヘモグロビンコンプレ
ックスをこれまでよりも低い酸素親和性を有する改変さ
れた形態で製造できることを見出した。すなわち、約７
０,０００〜約２,０００,０００の分子量を有しそして
式Ｉ （ＰＳ）−Ｘ−（ＨＢ）−Ｚ Ｉ （式中、ＰＳは約２,０００〜約２,０００,０００の分
子量を有する生理学的に許容し得るポリサッカライドを
表わし、Ｘは共有結合した化学的架橋基を表わし、ＨＢ
はヘモグロビン残基を表わし、そしてＺは酸素親和性低
下配位子であり２個またはそれ以上のホスフェート基を
含む）を有する水溶性化合物が提供される。
【０００６】Ｚとしては２個またはそれ以上のヒドロキ
シ基がりん酸でエステル化されているポリオールが好ま
しい。特に好ましいＺは２〜６個、より好ましくは２〜
４個のホスフェート基を含む。Ｚがポリオールのホスフ
ェートエステルである場合には、少なくとも２個、好ま
しくはすべてのヒドロキシ基がりん酸でエステル化され
ている。４〜８個の炭素原子を有しそして直鎖基である
Ｚも好ましい。更に、各々の炭素原子（少なくとも１個
の末端炭素原子以外のもの）が場合によりりん酸でエス
テル化されたヒドロキシ基を有するポリオールより成る
Ｚも好ましい。Ｚ基はヘモグロビンに対し当業者により
容易に認識されるであろう広範にわたる様々な方法で結
合することができる。
シ基がりん酸でエステル化されているポリオールが好ま
しい。特に好ましいＺは２〜６個、より好ましくは２〜
４個のホスフェート基を含む。Ｚがポリオールのホスフ
ェートエステルである場合には、少なくとも２個、好ま
しくはすべてのヒドロキシ基がりん酸でエステル化され
ている。４〜８個の炭素原子を有しそして直鎖基である
Ｚも好ましい。更に、各々の炭素原子（少なくとも１個
の末端炭素原子以外のもの）が場合によりりん酸でエス
テル化されたヒドロキシ基を有するポリオールより成る
Ｚも好ましい。Ｚ基はヘモグロビンに対し当業者により
容易に認識されるであろう広範にわたる様々な方法で結
合することができる。
【０００７】前記式Ｉの化合物は、（ａ） 式II （ＰＳ）−Ｘ−（ＨＢ） II （式中ＰＳ、ＸおよびＨＢは前記定義のとおりである）
で表わされる化合物を、Ｚ配位子を供与し得る化合物と
結合させるか、（ｂ） 式III （ＨＢ）−Ｚ III （式中ＨＢおよびＺは前記定義のとおりである）で表わ
される化合物をポリサッカライドＰＳと結合させるか、
または（ｃ） 還元されうる二重結合を有する相当する
式Ｉの化合物の還元により式Ｉの化合物の還元型を製造
することにより製造される。
で表わされる化合物を、Ｚ配位子を供与し得る化合物と
結合させるか、（ｂ） 式III （ＨＢ）−Ｚ III （式中ＨＢおよびＺは前記定義のとおりである）で表わ
される化合物をポリサッカライドＰＳと結合させるか、
または（ｃ） 還元されうる二重結合を有する相当する
式Ｉの化合物の還元により式Ｉの化合物の還元型を製造
することにより製造される。
【０００８】すなわち、例えば、Ｚ基を次のとおりアミ
ド結合によりヘモグロビン上のアミノ基に結合させるこ
とができる。すなわち ＲＣＯＮＨ（ＨＢｘ）−Ｘ−（ＰＳ） （式中ＸおよびＰＳは前記定義のとおりであり、（ＨＢ
ｘ）ＮＨはヘモグロビン残基であり、そしてＲＣＯはＺ
基である）。
ド結合によりヘモグロビン上のアミノ基に結合させるこ
とができる。すなわち ＲＣＯＮＨ（ＨＢｘ）−Ｘ−（ＰＳ） （式中ＸおよびＰＳは前記定義のとおりであり、（ＨＢ
ｘ）ＮＨはヘモグロビン残基であり、そしてＲＣＯはＺ
基である）。
【０００９】このような結合は慣用のアシル化技術によ
り、例えば化合物ＲＣＯＯＨをその活性エステル、例え
ばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに転化し、そ
して生成エステルを予め形成されたポリサッカライド−
ヘモグロビンコンプレックスと反応させることにより作
ることができる。しかしながら、このようなアシル化反
応は幾分非特異的であり、Ｚ基がヘモグロビン上のあま
り好ましくない位置に結合してしまう可能がある。
り、例えば化合物ＲＣＯＯＨをその活性エステル、例え
ばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルに転化し、そ
して生成エステルを予め形成されたポリサッカライド−
ヘモグロビンコンプレックスと反応させることにより作
ることができる。しかしながら、このようなアシル化反
応は幾分非特異的であり、Ｚ基がヘモグロビン上のあま
り好ましくない位置に結合してしまう可能がある。
【００１０】従ってＺ基は次のとおり、シッフ塩基結
合、好ましくは還元シッフ塩基結合を通してヘモグロビ
ンに結合させるのが好ましい。すなわち Ｒ−ＣＨ＝Ｎ−（ＨＢｘ）−Ｘ−（ＰＳ） Ｒ−ＣＨ2−ＮＨ−（ＨＢｘ）−Ｘ−（ＰＳ） 〔式中ＸおよびＰＳは前記定義のとおりであり、（ＨＢ
ｘ）−Ｎ＝および（ＨＢｘ）−ＮＨ−はヘモグロビン残
基であり、そしてＲ−ＣＨ＝またはＲ−ＣＨ2−はＺ基
である〕。
合、好ましくは還元シッフ塩基結合を通してヘモグロビ
ンに結合させるのが好ましい。すなわち Ｒ−ＣＨ＝Ｎ−（ＨＢｘ）−Ｘ−（ＰＳ） Ｒ−ＣＨ2−ＮＨ−（ＨＢｘ）−Ｘ−（ＰＳ） 〔式中ＸおよびＰＳは前記定義のとおりであり、（ＨＢ
ｘ）−Ｎ＝および（ＨＢｘ）−ＮＨ−はヘモグロビン残
基であり、そしてＲ−ＣＨ＝またはＲ−ＣＨ2−はＺ基
である〕。
【００１１】このような結合は、慣用の技術により、例
えばアルデヒドＲＣＨＯを予め形成されたポリサッカラ
イド−ヘモグロビンコンプレックスと反応させ、次いで
必要に応じて、生成シッフ塩基を選択的還元を行なうこ
とにより作ることができる。適当な還元剤としてはジエ
チルアミンボランまたはナトリウムシアノボロハイドラ
イド、あるいはより好ましくはジメチルアミンボランま
たはナトリウムボロハイドライドなどが挙げられる。
えばアルデヒドＲＣＨＯを予め形成されたポリサッカラ
イド−ヘモグロビンコンプレックスと反応させ、次いで
必要に応じて、生成シッフ塩基を選択的還元を行なうこ
とにより作ることができる。適当な還元剤としてはジエ
チルアミンボランまたはナトリウムシアノボロハイドラ
イド、あるいはより好ましくはジメチルアミンボランま
たはナトリウムボロハイドライドなどが挙げられる。
【００１２】Ｚ基の（ＰＳ）−Ｘ−（ＨＢ）部分への結
合は（ＰＳ）−Ｘ−（ＨＢ）部の大きさに影響されない
方法により行なわれる。すなわち、様々な範囲のポリサ
ッカライド対ヘモグロビン比を用いて広範囲にわたる大
きさの生成物分子を作ることができる。Ｚ基をイノシト
ールホスフェートから誘導するのが好ましい。イノシト
ールホスフェートは既知化合物であり、またそれ自体知
られている方法により製造、単離することができる。特
に好ましいＺ基はイノシトールテトラホスフェート、例
えば大割合のイノシトールテトラホスフェートと小割合
の他のイノシトールホスフェートとを含有する混合物か
ら誘導される。
合は（ＰＳ）−Ｘ−（ＨＢ）部の大きさに影響されない
方法により行なわれる。すなわち、様々な範囲のポリサ
ッカライド対ヘモグロビン比を用いて広範囲にわたる大
きさの生成物分子を作ることができる。Ｚ基をイノシト
ールホスフェートから誘導するのが好ましい。イノシト
ールホスフェートは既知化合物であり、またそれ自体知
られている方法により製造、単離することができる。特
に好ましいＺ基はイノシトールテトラホスフェート、例
えば大割合のイノシトールテトラホスフェートと小割合
の他のイノシトールホスフェートとを含有する混合物か
ら誘導される。
【００１３】すなわち、化合物ＲＣＨＯは好ましくはイ
ノシトールホスフェートアルデヒド、より好ましくは式
IV ＯＨＣ−ＣＨＲｘ−ＣＨＲｘ−ＣＨＲｘ−ＣＨＲｘ−ＣＨＯ IV （式中少なくとも２個、好ましくは４個の基Ｒxはホス
フェート基であり、残りのものは−ＯＨ基である）で表
わされるイノシトールホスフェートジアルデヒドであ
る。４個よりも少ない個数の基Ｒｘがホスフェート基で
ある式IVを有する化合物は構造異性体として存在しまた
様々な立体異性体としても存在する。４個の基Ｒｘがす
べてホスフェート基である式IVを有する化合物は様々な
立体異性体として存在する。式IVを有する化合物は所望
により、それ自体知られた慣用の方法を用いてそれらの
様々な構造および／または光学異性体の形態に分割して
もよい。あるいはまた、そして好ましくは、式IVの化合
物は混合物として以後のヘモグロビンまたはヘモグロビ
ン−ポリサッカライドコンプレックスとの反応に用いて
もよい。
ノシトールホスフェートアルデヒド、より好ましくは式
IV ＯＨＣ−ＣＨＲｘ−ＣＨＲｘ−ＣＨＲｘ−ＣＨＲｘ−ＣＨＯ IV （式中少なくとも２個、好ましくは４個の基Ｒxはホス
フェート基であり、残りのものは−ＯＨ基である）で表
わされるイノシトールホスフェートジアルデヒドであ
る。４個よりも少ない個数の基Ｒｘがホスフェート基で
ある式IVを有する化合物は構造異性体として存在しまた
様々な立体異性体としても存在する。４個の基Ｒｘがす
べてホスフェート基である式IVを有する化合物は様々な
立体異性体として存在する。式IVを有する化合物は所望
により、それ自体知られた慣用の方法を用いてそれらの
様々な構造および／または光学異性体の形態に分割して
もよい。あるいはまた、そして好ましくは、式IVの化合
物は混合物として以後のヘモグロビンまたはヘモグロビ
ン−ポリサッカライドコンプレックスとの反応に用いて
もよい。
【００１４】式IVを有する化合物は２個の隣接遊離ヒド
ロキシ基を有する適宜のイノシトールホスフェートの選
択的酸化により製造することができる。適切には、その
酸化は緩和な酸化条件を用いて、例えばパーハロ酸、例
えば過沃素酸を用いることにより行うことができる。好
都合には、この反応は（特にイノシトールテトラホスフ
ェートを出発物質として用いる場合には）低pHまたは高
められた温度で行なうことができる。
ロキシ基を有する適宜のイノシトールホスフェートの選
択的酸化により製造することができる。適切には、その
酸化は緩和な酸化条件を用いて、例えばパーハロ酸、例
えば過沃素酸を用いることにより行うことができる。好
都合には、この反応は（特にイノシトールテトラホスフ
ェートを出発物質として用いる場合には）低pHまたは高
められた温度で行なうことができる。
【００１５】ポリサッカライド−ヘモグロビンコンプレ
ックスは広範囲にわたる様々なポリサッカライド、例え
ばヒドロキシアルキル殿粉（例えばヒドロキシエチル殿
粉）、イヌリンまたは好ましくはデキストランなどから
誘導してもよい。より詳細には、例えばTam. Blumenste
inおよびWong共著「Proc. Nat. Acad. Sci. (USA)第73
巻、第2128−2131頁（1976）、または英国特許第1,549,
246号明細書の実施例１に記載されているような方法で
ヘモグロビンをＮ−ブロモアセチルアミノエチルアミノ
デキストランと反応させることにより製造したコンプレ
ックスが好ましい。好ましいポリサッカライドは約５,
０００〜２,０００,０００の分子量を有するもの、例え
ば１０,０００〜１００,０００の平均分子量を有するも
のである。好ましいポリサッカライドは７０,０００、
４０,０００、または２０,０００の平均分子量を有する
デキストランである。
ックスは広範囲にわたる様々なポリサッカライド、例え
ばヒドロキシアルキル殿粉（例えばヒドロキシエチル殿
粉）、イヌリンまたは好ましくはデキストランなどから
誘導してもよい。より詳細には、例えばTam. Blumenste
inおよびWong共著「Proc. Nat. Acad. Sci. (USA)第73
巻、第2128−2131頁（1976）、または英国特許第1,549,
246号明細書の実施例１に記載されているような方法で
ヘモグロビンをＮ−ブロモアセチルアミノエチルアミノ
デキストランと反応させることにより製造したコンプレ
ックスが好ましい。好ましいポリサッカライドは約５,
０００〜２,０００,０００の分子量を有するもの、例え
ば１０,０００〜１００,０００の平均分子量を有するも
のである。好ましいポリサッカライドは７０,０００、
４０,０００、または２０,０００の平均分子量を有する
デキストランである。
【００１６】使用できる特定のデキストラン−ヘモグロ
ビンコンプレックス例は約２０,０００の分子量を有す
るデキストランとヒトヘモグロビンとの間の１：１コン
プレックスである〔J.E. ChangおよびJ.T. Wong共著、
「Canadian Journal of Biochemistry、」第55巻、第39
8-403頁、（1977）参照〕。ポリサッカライドコンプレ
ックス中（または式IIIの化合物中）のＺ基の割合はホ
スフェート：ヘモグロビン比が実施例１に記載の方法に
より測定した場合に２〜16：１、好ましくは４〜16：１
の範囲となるようにするのが好ましい。基Ｚの生成にジ
アルデヒドを用いる場合には、ヘモグロビン部分同志間
で一部架橋が生起する可能性があり、あるいは、２個の
アルデヒド基が同じヘモグロビン分子上の異なるアミノ
基と反応する可能性がある。
ビンコンプレックス例は約２０,０００の分子量を有す
るデキストランとヒトヘモグロビンとの間の１：１コン
プレックスである〔J.E. ChangおよびJ.T. Wong共著、
「Canadian Journal of Biochemistry、」第55巻、第39
8-403頁、（1977）参照〕。ポリサッカライドコンプレ
ックス中（または式IIIの化合物中）のＺ基の割合はホ
スフェート：ヘモグロビン比が実施例１に記載の方法に
より測定した場合に２〜16：１、好ましくは４〜16：１
の範囲となるようにするのが好ましい。基Ｚの生成にジ
アルデヒドを用いる場合には、ヘモグロビン部分同志間
で一部架橋が生起する可能性があり、あるいは、２個の
アルデヒド基が同じヘモグロビン分子上の異なるアミノ
基と反応する可能性がある。
【００１７】本発明によれば、式（ＨＢ）−Ｚａ（式中
Ｚａはイノシトールホスフェートから誘導される基であ
り、特にＺａは前述の如くイノシトールホスフェートア
ルデヒドから誘導される）で表わされる変性ヘモグロビ
ンは新規化合物であって本発明の一特徴を形成する。こ
れら新規変性ヘモグロビンは酸素輸送能を有し、またポ
リサッカライドへの結合に有用であるばかりでなく、そ
れ自体で、あるいは重合された形態で、酸素輸送体能と
して有用である。
Ｚａはイノシトールホスフェートから誘導される基であ
り、特にＺａは前述の如くイノシトールホスフェートア
ルデヒドから誘導される）で表わされる変性ヘモグロビ
ンは新規化合物であって本発明の一特徴を形成する。こ
れら新規変性ヘモグロビンは酸素輸送能を有し、またポ
リサッカライドへの結合に有用であるばかりでなく、そ
れ自体で、あるいは重合された形態で、酸素輸送体能と
して有用である。
【００１８】すなわち、本発明によれば更に、重合され
た（ＨＢ）−Ｚａおよび（ＨＢ）−Ｚａを重合すること
より成る重合された（ＨＢ）−Ｚａの製造方法が提供さ
れる。
た（ＨＢ）−Ｚａおよび（ＨＢ）−Ｚａを重合すること
より成る重合された（ＨＢ）−Ｚａの製造方法が提供さ
れる。
【００１９】（ＨＢ）−Ｚａの重合は、ヘモグロビンの
重合についてそれ自体知られた方法を用いて、例えばヘ
モグロビンとグルタールアルデヒドとを例えば水性溶液
中０°〜１０℃の温度で反応させることにより行なうこ
とができる。その反応は略中性のpHを維持するための緩
衝剤中で行なうことができる。その（ＨＢ）−Ｚａは重
合前に脱酸素する必要はない。重合生成物は既知の重合
ヘモグロビンや変性重合ヘモグロビンに比べその酸素解
離曲線が右にシフトするので有利である。重合度は生成
物に所望される個々の目的に従って変えることができ
る。しかしながら、一般に重合度が高すぎるとその重合
体の溶液が粘稠になりすぎ、一方、重合度が低すぎると
腎臓に対し障害を与える原因となり得る多くの遊離ヘモ
グロビン分子を残すことになる。
重合についてそれ自体知られた方法を用いて、例えばヘ
モグロビンとグルタールアルデヒドとを例えば水性溶液
中０°〜１０℃の温度で反応させることにより行なうこ
とができる。その反応は略中性のpHを維持するための緩
衝剤中で行なうことができる。その（ＨＢ）−Ｚａは重
合前に脱酸素する必要はない。重合生成物は既知の重合
ヘモグロビンや変性重合ヘモグロビンに比べその酸素解
離曲線が右にシフトするので有利である。重合度は生成
物に所望される個々の目的に従って変えることができ
る。しかしながら、一般に重合度が高すぎるとその重合
体の溶液が粘稠になりすぎ、一方、重合度が低すぎると
腎臓に対し障害を与える原因となり得る多くの遊離ヘモ
グロビン分子を残すことになる。
【００２０】Ｚ基を予め形成されたヘモグロビンポリサ
ッカライドコンプレックスに結合する方法〔前記方法
ａ）〕に対する別法として、Ｚ基をまず、例えば前述の
技術または他の慣用の結合技術を用いて、ヘモグロビン
に結合させてもよい。その変性ヘモグロビンを次に所望
により、例えば米国特許第４,０６４,１１８号明細書に
記載の技術を用いるなどして更にポリサッカライドに結
合させてもよい〔前記方法ｂ）〕。
ッカライドコンプレックスに結合する方法〔前記方法
ａ）〕に対する別法として、Ｚ基をまず、例えば前述の
技術または他の慣用の結合技術を用いて、ヘモグロビン
に結合させてもよい。その変性ヘモグロビンを次に所望
により、例えば米国特許第４,０６４,１１８号明細書に
記載の技術を用いるなどして更にポリサッカライドに結
合させてもよい〔前記方法ｂ）〕。
【００２１】本明細書において言及されるヘモグロビン
は任意の適当な動物、例えばウシ科動物に由来するもの
であってもよいが、ヒトヘモグロビンであるのが好まし
い。前記式Ｉを有する化合物並びに本発明の化合物であ
るＨｂ−Ｚａおよび重合Ｈｂ−Ｚａは、酸素輸送能を有
し有用である。すなわちそれら化合物は例えば米国特許
第４,３４３,７１５号明細書に記載された系における固
定化酸素抽出物として有用である。それら化合物はまた
血液代替物または血液増量剤組成物への用途を有する。
すなわち、それら化合物は難灌流組織の酸素飽和度を高
めるのに用いることができる。このような難灌流組織は
癌増殖部、心筋梗塞症、脳内出血の場合に存在する可能
性がある。それら化合物はまた、血液代替物として、例
えば事故や暴力の犠牲者に対し、血液型および適合性を
調べることが不可能あるいは与えられた時間内で不可能
な場合に、患者が通常の輸血では危険またはそれを拒否
する場合に、保存すべき組織および器官に酸素を供与す
る目的で、体外循環系をプライミングするために、ある
いは赤血球が通常指示されるその他の状態に用いること
ができる。
は任意の適当な動物、例えばウシ科動物に由来するもの
であってもよいが、ヒトヘモグロビンであるのが好まし
い。前記式Ｉを有する化合物並びに本発明の化合物であ
るＨｂ−Ｚａおよび重合Ｈｂ−Ｚａは、酸素輸送能を有
し有用である。すなわちそれら化合物は例えば米国特許
第４,３４３,７１５号明細書に記載された系における固
定化酸素抽出物として有用である。それら化合物はまた
血液代替物または血液増量剤組成物への用途を有する。
すなわち、それら化合物は難灌流組織の酸素飽和度を高
めるのに用いることができる。このような難灌流組織は
癌増殖部、心筋梗塞症、脳内出血の場合に存在する可能
性がある。それら化合物はまた、血液代替物として、例
えば事故や暴力の犠牲者に対し、血液型および適合性を
調べることが不可能あるいは与えられた時間内で不可能
な場合に、患者が通常の輸血では危険またはそれを拒否
する場合に、保存すべき組織および器官に酸素を供与す
る目的で、体外循環系をプライミングするために、ある
いは赤血球が通常指示されるその他の状態に用いること
ができる。
【００２２】それら化合物は、当該患者に対し、薬学的
に許容し得る賦形剤、希釈剤または担体と混合して、例
えば水性溶液（これは緩衝され平衡した塩溶液であって
もよい）として投与してもよい。一般にそれら化合物は
血漿増量剤の投与について慣用的に用いられる様々なタ
イプの製剤、包装および投与形態を用いて投与されるこ
とになる。それら化合物はまた、場合により寒冷保護剤
と共に凍結乾燥し後に使用のために再生してもよい。化
合物の投与量は患者の背格好、状態および所望の処置に
応じて変わることになる。しかしながら、重篤な場合に
は実質的にすべての患者の血液を本発明の化合物を含有
する組成物により置換してもよい。
に許容し得る賦形剤、希釈剤または担体と混合して、例
えば水性溶液（これは緩衝され平衡した塩溶液であって
もよい）として投与してもよい。一般にそれら化合物は
血漿増量剤の投与について慣用的に用いられる様々なタ
イプの製剤、包装および投与形態を用いて投与されるこ
とになる。それら化合物はまた、場合により寒冷保護剤
と共に凍結乾燥し後に使用のために再生してもよい。化
合物の投与量は患者の背格好、状態および所望の処置に
応じて変わることになる。しかしながら、重篤な場合に
は実質的にすべての患者の血液を本発明の化合物を含有
する組成物により置換してもよい。
【００２３】式Ｉを有する化合物および本発明のその他
の化合物は類似の既知化合物よりも望ましい酸素吸収お
よび放出特性を有し有利である。すなわち、本発明のあ
る種の化合物はホスホピリドキシル化ヘモグロビンより
も右にシフトした酸素解離曲線（実施例３参照）を有す
る。本発明の化合物はまた容易にかつ比較的高収率で製
造でき有利である。本明細書中の分子量はＭｎではなく
むしろＭｗとして表わされる。本発明を説明したが、次
の実施例によって全く制限されるものではない。
の化合物は類似の既知化合物よりも望ましい酸素吸収お
よび放出特性を有し有利である。すなわち、本発明のあ
る種の化合物はホスホピリドキシル化ヘモグロビンより
も右にシフトした酸素解離曲線（実施例３参照）を有す
る。本発明の化合物はまた容易にかつ比較的高収率で製
造でき有利である。本明細書中の分子量はＭｎではなく
むしろＭｗとして表わされる。本発明を説明したが、次
の実施例によって全く制限されるものではない。
【００２４】実施例１ （ａ） イノシトールテトラキスホスフェートの製造 フイチン酸ナトリウム（イノシトールヘキサホスフェー
ト）を、可溶性小麦フイターゼを用いて脱ホスホリル化
した〔R.V. TomlinsonおよびC.E. Ballou共著「Biochem
istry」第１巻、第１６６〜１７１頁（１９６２）参
照〕。あるいは５０％エタノールで２回および９５％エ
タノールで１回洗浄したふすま（wheat bran）をフイタ
ーゼ源として用いてもよい。脱ホスホリル化は有意量の
イノシトールヘキサホスフェートまたはイノシトールペ
ンタホスフェートが溶液中に残らなくなるまで進行させ
た。フイターゼの使用量はこの手順に約７２時間を要す
るように選択した。その反応混合物を濾過し次いで遠心
分離することにより清澄化した。ＩＭ ＦｅＣｌ3を生成
溶液に添加してＦｅＣｌ3：もとのフイテートのモル比
を３：１とした。黄色沈殿を遠心分離により集めそして
蒸留水に再懸濁した。固体ＮａＯＨをその懸濁液に添加
してpH１２とし、そしてその混合物を撹拌しそしてpH１
２に３時間維持した。濾過後、濾液を酢酸を用いてpH
５.２となるまで中和した。（最初に５０mMのイノシト
ールヘキサホスフェートを含有する）５リットルの消化
物（digest）から得られる濾液を蒸留水で平衡した１リ
ットルカラムのDowex−１樹脂に負荷した。負荷後にカ
ラムを１リットルの蒸留水で洗浄しそして７リットルの
０.３Ｎ ＨＣｌ、次いで４リットルの１Ｎ ＨＣｌで溶
出した。イノシトールテトラホスフェート含有画分を３
容量の９５％エタノールで沈殿させた。４°で一夜放置
後、上清を注ぎ出し粘稠沈殿を残した。無水エタノール
を沈殿が白色粉末となるまで添加した。その粉末を無水
エタノール、１：１エタノール：エーテル、最後にエー
テルを用いて洗浄して所望の生成物を得た。
ト）を、可溶性小麦フイターゼを用いて脱ホスホリル化
した〔R.V. TomlinsonおよびC.E. Ballou共著「Biochem
istry」第１巻、第１６６〜１７１頁（１９６２）参
照〕。あるいは５０％エタノールで２回および９５％エ
タノールで１回洗浄したふすま（wheat bran）をフイタ
ーゼ源として用いてもよい。脱ホスホリル化は有意量の
イノシトールヘキサホスフェートまたはイノシトールペ
ンタホスフェートが溶液中に残らなくなるまで進行させ
た。フイターゼの使用量はこの手順に約７２時間を要す
るように選択した。その反応混合物を濾過し次いで遠心
分離することにより清澄化した。ＩＭ ＦｅＣｌ3を生成
溶液に添加してＦｅＣｌ3：もとのフイテートのモル比
を３：１とした。黄色沈殿を遠心分離により集めそして
蒸留水に再懸濁した。固体ＮａＯＨをその懸濁液に添加
してpH１２とし、そしてその混合物を撹拌しそしてpH１
２に３時間維持した。濾過後、濾液を酢酸を用いてpH
５.２となるまで中和した。（最初に５０mMのイノシト
ールヘキサホスフェートを含有する）５リットルの消化
物（digest）から得られる濾液を蒸留水で平衡した１リ
ットルカラムのDowex−１樹脂に負荷した。負荷後にカ
ラムを１リットルの蒸留水で洗浄しそして７リットルの
０.３Ｎ ＨＣｌ、次いで４リットルの１Ｎ ＨＣｌで溶
出した。イノシトールテトラホスフェート含有画分を３
容量の９５％エタノールで沈殿させた。４°で一夜放置
後、上清を注ぎ出し粘稠沈殿を残した。無水エタノール
を沈殿が白色粉末となるまで添加した。その粉末を無水
エタノール、１：１エタノール：エーテル、最後にエー
テルを用いて洗浄して所望の生成物を得た。
【００２５】（ｂ） イノシトールテトラキスホスフェ
ートの酸化 １１ｇのイノシトールテトラキスホスフェート（工程
ａ）と同様にして製造）の０.６Ｍ ＨＩＯ4・２Ｈ2Ｏ
３２２ml中の溶液を２２℃で暗所に８時間インキュベー
トした。その反応混合物を５Ｎ ＫＯＨでpH５.２となる
まで中和し、０℃に１０分間保ち、次いで遠心分離して
ＫＩＯ4を除去した。その上清にアスコルビン酸（５６.
７ｇ）を添加した。１０分後３容量のエタノールを添加
しそしてその混合物を４℃に１時間保った。透明粘稠沈
殿を遠心分離により集めた。その沈殿を１００mlの無水
エタノールに添加した。磨砕するとその沈殿はより固化
しそしてそのエタノール性上清を各５０mlの無水エタノ
ールで４回置換すると最終的に粉末となった。生成白色
粉末をエタノール、１：１エタノール：エーテルおよび
エーテルで順次洗浄しそして空気乾燥した。イノシトー
ルテトラキスホスフェートのジアルデヒド誘導体（ＦＰ
Ａ）を７.７ｇの収量で得た。
ートの酸化 １１ｇのイノシトールテトラキスホスフェート（工程
ａ）と同様にして製造）の０.６Ｍ ＨＩＯ4・２Ｈ2Ｏ
３２２ml中の溶液を２２℃で暗所に８時間インキュベー
トした。その反応混合物を５Ｎ ＫＯＨでpH５.２となる
まで中和し、０℃に１０分間保ち、次いで遠心分離して
ＫＩＯ4を除去した。その上清にアスコルビン酸（５６.
７ｇ）を添加した。１０分後３容量のエタノールを添加
しそしてその混合物を４℃に１時間保った。透明粘稠沈
殿を遠心分離により集めた。その沈殿を１００mlの無水
エタノールに添加した。磨砕するとその沈殿はより固化
しそしてそのエタノール性上清を各５０mlの無水エタノ
ールで４回置換すると最終的に粉末となった。生成白色
粉末をエタノール、１：１エタノール：エーテルおよび
エーテルで順次洗浄しそして空気乾燥した。イノシトー
ルテトラキスホスフェートのジアルデヒド誘導体（ＦＰ
Ａ）を７.７ｇの収量で得た。
【００２６】（ｃ） ジメチルアミン−ボラン（ＤＭＡ
Ｂ）を用いた ＦＰＡのデキストランヘモグロビンの共有結合分子量２
０,０００を有するデキストランを用いるほかは英国特
許（ＢＰ）第１,５４９,２４６号明細書の実施例１の方
法により製造された、pH７.４の０.０５Ｍ（ビス−〔２
−ヒドロキシエチル〕−アミノ−トリス−〔ヒドロキシ
メチル〕）メタン（ビス−トリス）中の６％ｗ／ｗ（ヘ
モグロビンのみについて測定）のデキストランヘモグロ
ビン（Ｄｘ−Ｈｂ）０.２５mlにpH５.２の０.０５Ｍ酢
酸ナトリウム緩衝液０.１７ml中のＦＰＡ １.２５mgを
添加した（約７.３ ＦＰＡ：１Ｄｘ−Ｈｂ）。その混合
物のpHを希ＮａＯＨで７.４に調節し、０.０２５mlの
０.５Ｍジメチルアミンボラン（ＤＭＡＢ）を添加し、
そしてその溶液を０℃で２時間インキュベートした。生
成混合物をpH８.５の０.１Ｍ２−アミノ−２−（ヒドロ
キシメチル）−１,３−プロパンジオール（トリス）１
Ｎ ＮａＣｌ緩衝液中で平衡した３０mlのSephadex Ｇ２
５カラムに適用しそして４℃で流した。ピークの最初の
２／３を集め、pH７.４の０.０５Ｍビス−トリス緩衝液
で一夜透析し、次いで酸素解離測定に用いた。前記Seph
adexカラムの使用は所望により省略してもよい。
Ｂ）を用いた ＦＰＡのデキストランヘモグロビンの共有結合分子量２
０,０００を有するデキストランを用いるほかは英国特
許（ＢＰ）第１,５４９,２４６号明細書の実施例１の方
法により製造された、pH７.４の０.０５Ｍ（ビス−〔２
−ヒドロキシエチル〕−アミノ−トリス−〔ヒドロキシ
メチル〕）メタン（ビス−トリス）中の６％ｗ／ｗ（ヘ
モグロビンのみについて測定）のデキストランヘモグロ
ビン（Ｄｘ−Ｈｂ）０.２５mlにpH５.２の０.０５Ｍ酢
酸ナトリウム緩衝液０.１７ml中のＦＰＡ １.２５mgを
添加した（約７.３ ＦＰＡ：１Ｄｘ−Ｈｂ）。その混合
物のpHを希ＮａＯＨで７.４に調節し、０.０２５mlの
０.５Ｍジメチルアミンボラン（ＤＭＡＢ）を添加し、
そしてその溶液を０℃で２時間インキュベートした。生
成混合物をpH８.５の０.１Ｍ２−アミノ−２−（ヒドロ
キシメチル）−１,３−プロパンジオール（トリス）１
Ｎ ＮａＣｌ緩衝液中で平衡した３０mlのSephadex Ｇ２
５カラムに適用しそして４℃で流した。ピークの最初の
２／３を集め、pH７.４の０.０５Ｍビス−トリス緩衝液
で一夜透析し、次いで酸素解離測定に用いた。前記Seph
adexカラムの使用は所望により省略してもよい。
【００２７】（ｄ） ＮａＢＨ4を用いたＦＰＡのＤｘ
−Ｈｂへの共有結合 pH７.４の０.０５Ｍビス−トリス中の６％Ｄｘ−Ｈｂ
（前記ｃ）において用いたものと同様のもの）０.２５m
lに２０mg／ml溶液中のＦＰＡ ３.４１mgを添加した
（２０ ＦＰＡ：１Ｄｘ−Ｈｂ）。その溶液の最終pHは
７.０であった。０℃で２０分間インキュベートした
後、０.０２５mlの０.８Ｍ ＮａＢＨ4を添加した。その
溶液を０℃で更に２時間インキュベートした。次にその
反応混合物をpH８.５の０.１Ｍトリス１Ｎ ＮａＣｌ中
で平衡した３０mlのSephadex Ｇ２５カラムにかけそし
て４℃で流した。ピークの最初の２／３を集め、前記
ｃ）におけると同様にして透析しそして酸素解離測定に
用いた。この場合も、Sephadexカラムの使用を所望によ
り省略してもよい。
−Ｈｂへの共有結合 pH７.４の０.０５Ｍビス−トリス中の６％Ｄｘ−Ｈｂ
（前記ｃ）において用いたものと同様のもの）０.２５m
lに２０mg／ml溶液中のＦＰＡ ３.４１mgを添加した
（２０ ＦＰＡ：１Ｄｘ−Ｈｂ）。その溶液の最終pHは
７.０であった。０℃で２０分間インキュベートした
後、０.０２５mlの０.８Ｍ ＮａＢＨ4を添加した。その
溶液を０℃で更に２時間インキュベートした。次にその
反応混合物をpH８.５の０.１Ｍトリス１Ｎ ＮａＣｌ中
で平衡した３０mlのSephadex Ｇ２５カラムにかけそし
て４℃で流した。ピークの最初の２／３を集め、前記
ｃ）におけると同様にして透析しそして酸素解離測定に
用いた。この場合も、Sephadexカラムの使用を所望によ
り省略してもよい。
【００２８】別法として、pH７.４の０.０５Ｍビス−ト
リス中の０.２mlの６％Ｄｘ−Ｈｂ（前記ｃ）で用いた
ものと同様のもの）に５mg／ml溶液としての０.６８mg
のＦＰＡを添加した（５ＦＰＡ：１Ｄｘ−Ｈｂ）。その
混合物を０℃で２０分間インキュベートし、そして０.
０２mlの０.５Ｍ ＮａＢＨ4を，０℃で常時撹拌しなが
ら２時間にわたって添加した。
リス中の０.２mlの６％Ｄｘ−Ｈｂ（前記ｃ）で用いた
ものと同様のもの）に５mg／ml溶液としての０.６８mg
のＦＰＡを添加した（５ＦＰＡ：１Ｄｘ−Ｈｂ）。その
混合物を０℃で２０分間インキュベートし、そして０.
０２mlの０.５Ｍ ＮａＢＨ4を，０℃で常時撹拌しなが
ら２時間にわたって添加した。
【００２９】（ｅ） ジメチルアミン−ボランまたはＮ
ａＢＨ4を用いたＦＰＡのＨｂへの共有結合 pH７.４の０.０５Ｍビス−トリスに溶解した０.２５ml
の６％ｗ／ｗヘモグロビンに、pH５.２の０.０５Ｍ酢酸
ナトリウム緩衝液０.１７ml中の１.２５mgのＦＰＡを添
加した。その混合物をpHを希ＮａＯＨで７.４に調節
し、０.０２５mlの０.５Ｍジメチルアミンボランを添加
し、そしてその溶液を０℃で２時間インキュベートし
た。その反応混合物を１Ｎ ＮａＣｌを含むpH８.５の
０.１Ｍトリス緩衝液中で平衡した３０mlのSephadexＧ
２５カラムにかけそして４℃で流した。ピークの最初の
２／３を集め、pH７.４の０.０５Ｍビス−トリス緩衝液
で一夜透析し、次いで酸素測定に用いた。（Sephadexカ
ラムの使用は省略してもよい。）そのようにして得られ
たＦＰＡ−Ｈｂは遊離Ｈｂよりも右にシフトした酸素解
離曲線を有し、それ故に、血液置換または固定化酸素抽
出物中への取込みのために低酸素親和性が重要である場
合に酸素運搬体として用いることができる。ＮａＢＨ4
をＤＭＡＢに代えて用いてもよい。そのようにして製造
されたＦＰＡ−Ｈｂはまた下記（ｆ）および（ｇ）にお
いても有用である。
ａＢＨ4を用いたＦＰＡのＨｂへの共有結合 pH７.４の０.０５Ｍビス−トリスに溶解した０.２５ml
の６％ｗ／ｗヘモグロビンに、pH５.２の０.０５Ｍ酢酸
ナトリウム緩衝液０.１７ml中の１.２５mgのＦＰＡを添
加した。その混合物をpHを希ＮａＯＨで７.４に調節
し、０.０２５mlの０.５Ｍジメチルアミンボランを添加
し、そしてその溶液を０℃で２時間インキュベートし
た。その反応混合物を１Ｎ ＮａＣｌを含むpH８.５の
０.１Ｍトリス緩衝液中で平衡した３０mlのSephadexＧ
２５カラムにかけそして４℃で流した。ピークの最初の
２／３を集め、pH７.４の０.０５Ｍビス−トリス緩衝液
で一夜透析し、次いで酸素測定に用いた。（Sephadexカ
ラムの使用は省略してもよい。）そのようにして得られ
たＦＰＡ−Ｈｂは遊離Ｈｂよりも右にシフトした酸素解
離曲線を有し、それ故に、血液置換または固定化酸素抽
出物中への取込みのために低酸素親和性が重要である場
合に酸素運搬体として用いることができる。ＮａＢＨ4
をＤＭＡＢに代えて用いてもよい。そのようにして製造
されたＦＰＡ−Ｈｂはまた下記（ｆ）および（ｇ）にお
いても有用である。
【００３０】（ｆ） 臭化シアン活性化デキストランの
ＦＰＡ−Ｈｂへの共有結合 ７０,０００の分子量を有するデキストラン２ｇを８０
％ホルムアミド−２０％水ｖ／ｖ混合物に溶解し、そし
てその溶液を−１５℃に冷却した。４℃の８０％ホルム
アミド−２０％水ｖ／ｖ３.２ml中の１.６ｇのＣＮＢｒ
を次いで撹拌しながら添加した。−１５℃のジメチルホ
ルムアミド中の１.５Ｍトリエチルアミン１５.１mlを更
に、撹拌しながら滴加した。−１５℃で１０分間インキ
ュベートした後、１容量のアセトン（−２０℃）をその
混合物に添加して活性化デキストランを沈殿させた。そ
の沈殿をアセトン（−２０℃）を用いて遠心分離により
２回、エーテルを用いて１回洗浄し、そして空気乾燥し
て活性化デキストランを得た。３５mgの活性化デキスト
ランをpH７.４の０.０５Ｍビス−トリス中の１mlのＦＰ
Ａ−Ｈｂ（Ｈｂに対して３％）に添加し、そしてその溶
液を０℃で１６時間保った。この方法により得られたＦ
ＰＡ−Ｄｘ−Ｈｂ（Ｈｂに対して８％）０.１５mlを１
１８mlのSephadexＧ１５０カラムでのクロマトグラフィ
ーにより未結合ＦＰＡ−Ｈｂから分離して第１図に示さ
れる５７６nmにおける光学濃度グラフを得た。図面中矢
印は未結合ＦＰＡ−Ｈｂの位置を示す。
ＦＰＡ−Ｈｂへの共有結合 ７０,０００の分子量を有するデキストラン２ｇを８０
％ホルムアミド−２０％水ｖ／ｖ混合物に溶解し、そし
てその溶液を−１５℃に冷却した。４℃の８０％ホルム
アミド−２０％水ｖ／ｖ３.２ml中の１.６ｇのＣＮＢｒ
を次いで撹拌しながら添加した。−１５℃のジメチルホ
ルムアミド中の１.５Ｍトリエチルアミン１５.１mlを更
に、撹拌しながら滴加した。−１５℃で１０分間インキ
ュベートした後、１容量のアセトン（−２０℃）をその
混合物に添加して活性化デキストランを沈殿させた。そ
の沈殿をアセトン（−２０℃）を用いて遠心分離により
２回、エーテルを用いて１回洗浄し、そして空気乾燥し
て活性化デキストランを得た。３５mgの活性化デキスト
ランをpH７.４の０.０５Ｍビス−トリス中の１mlのＦＰ
Ａ−Ｈｂ（Ｈｂに対して３％）に添加し、そしてその溶
液を０℃で１６時間保った。この方法により得られたＦ
ＰＡ−Ｄｘ−Ｈｂ（Ｈｂに対して８％）０.１５mlを１
１８mlのSephadexＧ１５０カラムでのクロマトグラフィ
ーにより未結合ＦＰＡ−Ｈｂから分離して第１図に示さ
れる５７６nmにおける光学濃度グラフを得た。図面中矢
印は未結合ＦＰＡ−Ｈｂの位置を示す。
【００３１】(ｇ） グルタールアルデヒドを重合剤と
して用いたポリ−ＦＰＡ−Ｈｂの製造 ４℃でpH７.５の０.１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液中のＦ
ＰＡ−Ｈｂ（Ｈｂに対して６％）６.５mlに同じ緩衝液
中の５％グルタールアルデヒド０.１９５mlを添加し
た。その混合物を４℃に１６時間保ち、そして０.１５m
lのその混合物を１１８mlのSephadexＧ１５０カラムに
おけるクロマトグラフィーにより分離して第２図に示さ
れた５７６nmにおける光学濃度グラフを得た。図面中矢
印は遊離Ｈｂの位置を示す。
して用いたポリ−ＦＰＡ−Ｈｂの製造 ４℃でpH７.５の０.１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液中のＦ
ＰＡ−Ｈｂ（Ｈｂに対して６％）６.５mlに同じ緩衝液
中の５％グルタールアルデヒド０.１９５mlを添加し
た。その混合物を４℃に１６時間保ち、そして０.１５m
lのその混合物を１１８mlのSephadexＧ１５０カラムに
おけるクロマトグラフィーにより分離して第２図に示さ
れた５７６nmにおける光学濃度グラフを得た。図面中矢
印は遊離Ｈｂの位置を示す。
【００３２】ホスフェート測定 ０.５mlまでの量のＦＰＡ−Ｄｘ−ＨｂまたはＦＰＡ−
Ｈｂ溶液を１.２mlの７０％ＨＣｌＯ4を添加し次いで透
明になるまで沸騰させることにより消化した。次いで、
８mlのＨ2Ｏ、０.０５mlの５％モリブデン酸アンモニウ
ムおよび０.０５mlの０.２５％１−アミノ−２−ナフト
ール−４−スルホン酸を添加した。得られた溶液を１０
分間沸騰させそして８２０nmにおける吸光度または光学
濃度を読取ってホスフェート濃度を測定した。ヘモグロ
ビン濃度はD.L. DrabkinおよびJ.H. Austin共著、「J.
Biological Chemistry」第１１２巻、第５１〜６５頁
（１９３５年）により測定した。
Ｈｂ溶液を１.２mlの７０％ＨＣｌＯ4を添加し次いで透
明になるまで沸騰させることにより消化した。次いで、
８mlのＨ2Ｏ、０.０５mlの５％モリブデン酸アンモニウ
ムおよび０.０５mlの０.２５％１−アミノ−２−ナフト
ール−４−スルホン酸を添加した。得られた溶液を１０
分間沸騰させそして８２０nmにおける吸光度または光学
濃度を読取ってホスフェート濃度を測定した。ヘモグロ
ビン濃度はD.L. DrabkinおよびJ.H. Austin共著、「J.
Biological Chemistry」第１１２巻、第５１〜６５頁
（１９３５年）により測定した。
【００３３】
【表１】
【００３４】実施例２ ａ） ０.５ミリモルの２,３−ジホスホグリセレートを
１０mlの水に溶解しそしてピリジン型のＤｏｗｅｘ（ま
たはＡＧ）−５０カラムに通した。流出液を集めそして
減圧濃縮した。無水ピリジンを添加しそして濃縮するこ
とにより水を除去した。残留する水およびピリジンをピ
リジン臭がなくなるまで（２回）無水ジメチルホルムア
ミドで洗浄することにより除去した。６ミリモルのアミ
ノアセトアルデヒドジエチルアセタールを無水ジメチル
スルホキシドを溶媒として用いて添加しそして振盪によ
り混合した。６ミリモルのジシクロヘキシルカルボジイ
ミドを添加しそしてその混合物を室温で３〜４時間撹拌
した。次に少量の水を添加しそして沈殿を濾去した。そ
の濾液を残留反応成分を除去するために無水エーテルで
抽出し（３×）、そしてその溶液を濃縮乾固して白色粉
末生成物を得た。
１０mlの水に溶解しそしてピリジン型のＤｏｗｅｘ（ま
たはＡＧ）−５０カラムに通した。流出液を集めそして
減圧濃縮した。無水ピリジンを添加しそして濃縮するこ
とにより水を除去した。残留する水およびピリジンをピ
リジン臭がなくなるまで（２回）無水ジメチルホルムア
ミドで洗浄することにより除去した。６ミリモルのアミ
ノアセトアルデヒドジエチルアセタールを無水ジメチル
スルホキシドを溶媒として用いて添加しそして振盪によ
り混合した。６ミリモルのジシクロヘキシルカルボジイ
ミドを添加しそしてその混合物を室温で３〜４時間撹拌
した。次に少量の水を添加しそして沈殿を濾去した。そ
の濾液を残留反応成分を除去するために無水エーテルで
抽出し（３×）、そしてその溶液を濃縮乾固して白色粉
末生成物を得た。
【００３５】ｂ） 工程ａ）の粗製生成物（もとの２,
３−ジホスホログリセレート約０.５ミリモルに等し
い）を少量の水に溶解した。その溶液をＤｏｗｅｘ−５
０−Ｈ+型に通して遊離アミンを除いた。流出液の酸性
部分を集め、約２mlに濃縮しそして０.５mlの１Ｎ ＨＣ
ｌを添加した。得られた溶液を４℃に３０〜６０分間放
置しそして等価量のＮＨ4ＨＣＯ3を添加してpHを約７に
調節した。
３−ジホスホログリセレート約０.５ミリモルに等し
い）を少量の水に溶解した。その溶液をＤｏｗｅｘ−５
０−Ｈ+型に通して遊離アミンを除いた。流出液の酸性
部分を集め、約２mlに濃縮しそして０.５mlの１Ｎ ＨＣ
ｌを添加した。得られた溶液を４℃に３０〜６０分間放
置しそして等価量のＮＨ4ＨＣＯ3を添加してpHを約７に
調節した。
【００３６】ｃ） 英国特許第１,５４９,２４６号明細
書の実施例１の方法により製造した３μモルの６％デキ
ストラン−ヘモグロビン（酸素化されているかまたは脱
酸素されているもの）をpH７.４の０.０５Ｍトリス中に
溶解した。工程ｂ）の生成物（１５μモル）およびナト
リウムシアノボロハイドライド（６０μモル）を添加
し、そしてその反応混合物を２時間室温に保持した。次
いで工程ｂ）の過剰生成物を、（ｉ）pH８.５の１Ｍ Ｎ
ａＣｌ／０.０５Ｍトリスで透析するかまた（ii)pH８.
５の１Ｍ ＮａＣｌ／０.０５Ｍトリスで平衡したSephad
ex Ｃ２５に通し先端ピークを集めることにより除去し
た。
書の実施例１の方法により製造した３μモルの６％デキ
ストラン−ヘモグロビン（酸素化されているかまたは脱
酸素されているもの）をpH７.４の０.０５Ｍトリス中に
溶解した。工程ｂ）の生成物（１５μモル）およびナト
リウムシアノボロハイドライド（６０μモル）を添加
し、そしてその反応混合物を２時間室温に保持した。次
いで工程ｂ）の過剰生成物を、（ｉ）pH８.５の１Ｍ Ｎ
ａＣｌ／０.０５Ｍトリスで透析するかまた（ii)pH８.
５の１Ｍ ＮａＣｌ／０.０５Ｍトリスで平衡したSephad
ex Ｃ２５に通し先端ピークを集めることにより除去し
た。
【００３７】実施例３ 実施例１の生成物および出発ヘモグロビンデキストラン
の酸素解離曲線をBenesch、MacDuffおよびBenesch共著
「Anal. Biochem.」第１１巻第８１〜８７頁（１９６
５）の方法を用いるが２４℃の温度およびpH７.４で０.
０５Ｍのビス−トリス緩衝液を用いて測定した。結果は
添付第３図および第４図に示す。
の酸素解離曲線をBenesch、MacDuffおよびBenesch共著
「Anal. Biochem.」第１１巻第８１〜８７頁（１９６
５）の方法を用いるが２４℃の温度およびpH７.４で０.
０５Ｍのビス−トリス緩衝液を用いて測定した。結果は
添付第３図および第４図に示す。
【図１】実施例１（ｆ）で得られたＦＰＡ−Ｄｘ−Ｈｂ
についての容量と５７６nmにおける光学濃度との関係を
示す図。
についての容量と５７６nmにおける光学濃度との関係を
示す図。
【図２】実施例１（ｇ）で得られたポリ−ＦＰＡ−Ｈｂ
についての容量と５７６nmにおける光学濃度との関係を
示す図。
についての容量と５７６nmにおける光学濃度との関係を
示す図。
【図３】Sephadexカラムで分離する前の実施例１ｇ）の
生成物についての酸素飽和とＬｏｇＰｏ2との関係を示
す図であり、１はヒトのポリ−ＦＰＡ−Ｈｂ、そして２
はウシのポリ−ＦＰＡ−Ｈｂのそれぞれの結果を示す。
生成物についての酸素飽和とＬｏｇＰｏ2との関係を示
す図であり、１はヒトのポリ−ＦＰＡ−Ｈｂ、そして２
はウシのポリ−ＦＰＡ−Ｈｂのそれぞれの結果を示す。
【図４】酸素飽和とＬｏｇＰｏ2との関係を示す図であ
り、１は実施例１ｃ）のデキストランヘモグロビン出発
物質についての結果、２は実施例１ｄ）の生成物につい
ての結果、３は実施例１ｃ）の生成物についての結果そ
して４は実施例（ｅ）のＤＭＡＢを用いた生成物につい
ての結果を示す。
り、１は実施例１ｃ）のデキストランヘモグロビン出発
物質についての結果、２は実施例１ｄ）の生成物につい
ての結果、３は実施例１ｃ）の生成物についての結果そ
して４は実施例（ｅ）のＤＭＡＢを用いた生成物につい
ての結果を示す。
Claims (3)
- 【請求項１】 式（ＨＢ）−Ｚａ（式中、ＨＢはヘモグ
ロビン残基を表わしそしてＺａはイノシトールホスフェ
ートから誘導される基である）で表わされる変性ヘモグ
ロビン。 - 【請求項２】 重合された（ＨＢ）−Ｚａ（式中、ＨＢ
はヘモグロビン残基を表わしそしてＺａはイノシトール
ホスフェートから誘導される基である）。 - 【請求項３】 （ＨＢ）−Ｚａ（ここでＨＢはヘモグロ
ビン残基を表わしそしてＺａはイノシトールホスフェー
トから誘導される基である）をグルタールアルデヒドと
反応させることからなる重合された（ＨＢ）−Ｚａの製
造方法。
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|---|---|---|---|
| GB8328917 | 1983-10-28 | ||
| GB838328917A GB8328917D0 (en) | 1983-10-28 | 1983-10-28 | Blood substitute |
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|---|---|---|---|
| JP59224269A Division JPH0643444B2 (ja) | 1983-10-28 | 1984-10-26 | 血液代替物用の新規化合物およびその製造方法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06298802A true JPH06298802A (ja) | 1994-10-25 |
| JPH0714961B2 JPH0714961B2 (ja) | 1995-02-22 |
Family
ID=10550912
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59224269A Expired - Lifetime JPH0643444B2 (ja) | 1983-10-28 | 1984-10-26 | 血液代替物用の新規化合物およびその製造方法 |
| JP5254619A Expired - Fee Related JPH0714961B2 (ja) | 1983-10-28 | 1993-10-13 | 新規な変性ヘモグロビン |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59224269A Expired - Lifetime JPH0643444B2 (ja) | 1983-10-28 | 1984-10-26 | 血液代替物用の新規化合物およびその製造方法 |
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|---|---|
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| EP (1) | EP0140640B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0643444B2 (ja) |
| AT (1) | ATE51629T1 (ja) |
| AU (1) | AU567593B2 (ja) |
| CA (1) | CA1236014A (ja) |
| DE (1) | DE3481844D1 (ja) |
| DK (1) | DK162395C (ja) |
| FI (1) | FI74979C (ja) |
| GB (1) | GB8328917D0 (ja) |
| IL (1) | IL73334A (ja) |
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-
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