JPH06311896A - カリウムイオンの定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 水性媒体中、試料中のカリウムイオンをピル
ビン酸キナーゼを用いた酵素反応により定量する方法に
おいて、８０〜２８０ｍＭのリチウムイオンの存在下に
酵素反応を行うことを特徴とするカリウムイオンの定量
方法。 【効果】 定量性及び再現性がよく、簡便にかつ迅速に
カリウムイオンを測定できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リチウムイオンの存在
下、酵素反応を用いたカリウムイオンの定量方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】生体試料中のカリウムイオンを化学的に
定量する方法として、カリウムイオン量と比例して活性
が増加するピルビン酸キナーゼを用いた酵素反応による
定量方法においては、ナトリウムイオンの干渉作用によ
り正確な定量ができない。ナトリウムイオンの干渉を防
止するため、リチウムイオンの存在下に酵素反応を行う
方法が知られている〔クリニカルケミストリー，３５
巻，８１７〜８２０頁，１９８９年、特表平１−５０３
５９６号公報〕。この方法では、共存する試料中のナト
リウムイオン濃度が１０ｍＭ違うと、試料中のカリウム
イオンの測定値の誤差が最低０．１ｍＭあること〔クリ
ニカルケミストリー，３５巻，８１９頁図１，１９８９
年〕、このため試料中の共存ナトリウムイオン濃度を別
に求め、共存ナトリウムイオン濃度の影響により生じる
カリウムイオン測定値の誤差を補正する必要があること
〔特表平１−５０３５９６号公報〕が知られている。

【０００３】リチウムイオンはナトリウムイオンの干渉
を抑制する作用を有すると同時にカリウムイオンにも干
渉するため、ピルビン酸キナーゼを用いたカリウムイオ
ンの定量にリチウムイオンを単独で用いても正確な定量
はできないと報告されている（ディクソン・ウエブ著、
“酵素”、３９６頁、１９７０年、白水社刊）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】前記のように、ピルビ
ン酸キナーゼを用いた酵素反応によるカリウムイオンの
定量方法において、ナトリウムイオンの影響により生じ
る誤差をリチウムイオンを単独で用いて防ぐ方法では、
誤差が解消しきれずその補正に手間がかかるため、より
簡便な定量方法が望まれている。

【０００５】また、該方法を改良した、ナトリウムイオ
ンを除去するためのナトリウム結合剤としてクリプトフ
ィクス２２１等の二環式クラウンエーテルをリチウムイ
オンに共存させる方法は、クラウンエーテルの解離速度
が小さく測定までの予備反応に時間がかかり、測定操作
の迅速性に欠けること等の問題があるため、より優れた
方法の開発が望まれている。

【０００６】本発明は、ピルビン酸キナーゼ反応におい
て、高濃度のリチウムイオンを用いるとナトリウムイオ
ンに対する抑制作用が強いと同時にカリウムイオンに対
する抑制作用が極めて弱いという知見のもとになされた
ものであり、高濃度のリチウムイオンを単独で用いた、
測定誤差が少なく補正操作もいらないカリウムイオンの
定量方法を提供することを目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明のカリウムイオン
の定量方法は、水性媒体中、試料中のカリウムイオンを
ピルビン酸キナーゼを用いた酵素反応により定量する方
法において、８０〜２８０ｍＭのリチウムイオンの存在
下に酵素反応を行うことを特徴とするものである。

【０００８】本発明方法によれば、ナトリウムイオンの
干渉を十分に抑制し、試料中のカリウムイオンを正確に
定量することができる。本発明において、水性媒体と
は、緩衝液、生理食塩水等、水を含有する液体を表し、
緩衝液としては、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン−塩酸緩衝液（以下「トリス塩酸緩衝液」とい
う。）、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、
シュウ酸緩衝液、フタル酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリ
シン緩衝液、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン
酸〔ＭＯＰＳ〕緩衝液、バルビタ−ル緩衝液又はグッド
（ＧＯＯＤ）の緩衝液等を単独又は混合したものがあげ
られる。該緩衝液は５〜５００ｍＭの濃度でｐＨが６．
５〜８．５、好ましくは６．５〜７．５に調整されたも
のが用いられる。酸性を示す緩衝剤を用いるときは水酸
化リチウム等を用いてｐＨを調整することが好ましい。
また、水性媒体中に、不純物として存在するナトリウム
イオン、カリウムイオン等はイオン交換法等によりでき
る限り取り除くことが好ましい。

【０００９】カリウムイオンを含む試料とは、水性媒体
に混和する試料であればどのようなものでもよく、血
液、血清、尿、細胞等、原子吸光法では測定しにくい生
体中の試料についても測定できる。リチウムイオンの供
給源としては、塩化リチウム、硝酸リチウム、硫酸リチ
ウム、過塩素酸リチウム、炭酸リチウム、炭酸水素リチ
ウム、水酸化リチウム、水素化ホウ素リチウム等があげ
られ、反応液中のリチウムイオン濃度が８０〜２８０ｍ
Ｍになるように調整する。

【００１０】ピルビン酸キナーゼとしては、酵素番号
〔ＥＣ．２．７．１．４０〕に属する、高等動物由来の
酵素、微生物由来の酵素又はこれらを遺伝子工学により
改変した酵素を用いればよいが、好ましくはバチルス・
ステロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)
由来の酵素を用いる。ピルビン酸キナーゼの酵素反応に
用いる基質及び補酵素は、ホスホエノールピルビン酸と
アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を用いる。バチルス・ス
テロサーモフィルス等、微生物由来のピルビン酸キナー
ゼ反応の補助因子としては二価のマンガンがあげられる
ので、微生物由来のピルビン酸キナーゼ反応には二価の
マンガンを添加することが好ましい。また、ウサギ筋肉
等、高等動物由来のピルビン酸キナーゼ反応の補助因子
としては二価のマグネシウムがあげられるので、高等動
物由来のピルビン酸キナーゼ反応には二価のマグネシウ
ムを添加することが好ましい。

【００１１】本発明において、ピルビン酸キナーゼを用
いた酵素反応の活性測定法はどのような方法を用いても
よいが、該酵素反応により生成するピルビン酸を定量す
る方法等を用いることが好ましい。ピルビン酸を定量す
る方法としては、水性媒体中、ピルビン酸とピルビン酸
オキシダーゼとを反応させて生成する過酸化水素を定量
する方法、２，４−ジニトロフェニルヒドラジンがピル
ビン酸によりヒドラゾンに変換される際の吸光度変化を
測定する方法等を用いることもできるが、ピルビン酸を
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ
Ｈ）の存在下、ラクテートデヒドロゲナーゼ〔ＥＣ．
１．１．１．２７〕と反応させ、減少するＮＡＤＨ量又
は増加するニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤ）量を吸光光度法又は蛍光光度法等により定量する
方法を用いることが好ましい。

【００１２】ここで用いるラクテートデヒドロゲナーゼ
はどのようなものでもよく、動物、植物、微生物由来の
酵素又はこれらを遺伝子工学により改変した酵素があげ
られる。以下に本発明のカリウムイオンの定量方法の好
ましい態様について説明する。リチウムイオン（反応液
中の最終濃度８０〜２８０ｍＭ）、ホスホエノールピル
ビン酸（反応液中の最終濃度０．３〜３０ｍＭ）、ＡＤ
Ｐ（反応液中の最終濃度０．５〜１０ｍＭ）及びＮＡＤ
Ｈ（反応液中の最終濃度０．１〜１ｍＭ）を含む水性媒
体にカリウムイオンを含む試料を加え、４〜５０℃で３
０秒以上混合させ前処理液とする。

【００１３】ピルビン酸キナーゼ（反応液中の最終濃度
２００〜１００００Ｕ／Ｌ）、ラクテートデヒドロゲナ
ーゼ（反応液中の最終濃度５０００〜１０００００Ｕ／
Ｌ）、ピルビン酸キナーゼの補助因子（反応液中の最終
濃度１〜１００ｍＭ）を含む水性媒体を４〜５０℃に加
温した後、前記の前処理液に加え４〜５０℃で３０秒以
上反応させる。このとき反応液のｐＨは好ましくは２５
℃において７．５以下になるように調整する。反応後の
ＮＡＤＨの減少量を吸光光度法又は蛍光光度法により測
定して、これに対応するカリウム量を算出する。

【００１４】なお、ピルビン酸キナーゼ反応において
は、必要によりアンモニアを除去するためのグルタミン
酸デヒドロゲナーゼ（２５００〜２００００Ｕ／Ｌ）及
びα−ケトグルタル酸、白濁防止のためのポリエチレン
グリコールモノトリニトロフェニルメチル（トリトン
Ｘ）等の界面活性剤、安定化のためのウシ血清アルブミ
ン、ヒト血清アルブミン、卵白アルブミン等のタンパク
質、可溶化のための塩化カルシウム、塩化マグネシウ
ム、塩化ナトリウム等の塩等、試薬の保存安定化のため
のグリセロール等を反応液中に加えてもよい。

【００１５】リチウムイオンを用いた本発明は、測定ま
での予備反応に時間がかからず、グルタミン酸デヒドロ
ゲナーゼ、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キ
ナーゼの安定性を損なうこともない。従って、本発明に
より、定量性がよく、簡便で試薬の保存安定性に優れた
生体試料中のカリウムイオンの新規な定量方法が提供さ
れる。

【００１６】

【実施例】以下、実施例により本発明を更に具体的に説
明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定される
ものではない。 （実施例１） （１）カリウムイオン検量線用標準液の調製 塩化カリウム（和光純薬工業製）を蒸留水で希釈し、反
応液中の最終濃度が２、４、６ｍＭになるようにカリウ
ム検量線用標準液を調製した。この標準液に塩化ナトリ
ウム（反応液中１４０ｍＭ）を共存させた。 （２）カリウムイオン定量用試薬の調製 （ａ）以下の組成の第１試薬を調製した。

【００１７】３００ｍＭトリス塩酸緩衝液（２５℃、ｐ
Ｈ７．８）１００ｍＬ中、ホスホエノールピルビン酸−
ナトリウム塩（ベーリンガーマンハイム社製）８０ｍｇ
〔反応液中３．８ｍＭ〕、β−ＮＡＤＨ（オリエンタル
酵母社製）３２ｍｇ〔反応液中０．４５ｍＭ〕及びＡＤ
Ｐ（オリエンタル酵母社製）１６０ｍｇ〔反応液中３．
４ｍＭ〕を溶解させ、更に塩化リチウムを（イオン交換
法により調製）反応液中１２０ｍＭになるように溶解さ
せた。 （ｂ）以下の組成の第２試薬を調製した。

【００１８】水酸化リチウムによりｐＨを６．６とした
１０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液５０ｍＬ中、バチルス・ステロ
サーモフィルス由来のピルビン酸キナーゼ（ユニチカ社
製）〔反応液中４２０Ｕ／Ｌ〕、ラクテートデヒドロゲ
ナーゼ（ベーリンガーマンハイム社製グリセロール液）
１．２ｍＬ〔反応液中１００００Ｕ／Ｌ〕、２５０ｍＭ
塩化マンガン水溶液２．０ｍＬ〔反応液中１０ｍＭ〕及
びグリセロール３ｇ〔反応液中６６０ｍＭ〕を溶解させ
た。 （３）カリウムイオンの定量 試験管に（１）で調製したカリウムイオン検量線用標準
液０．０５ｍＬをとり、これに第１試薬２ｍＬを加えか
き混ぜた後、３分間インキュベートした。更に、あらか
じめ３７℃にインキュベートした第２試薬１ｍＬを加え
てかき混ぜ、混合後１〜２分目の３４０ｎｍにおける１
分当たりの吸光度変化を測定した。得られた検量線を図
１に示した。

【００１９】（実施例２） （１）バチルス・ステロサーモフィルス由来の酵素を用
いた場合のリチウム濃度依存性 塩化リチウム濃度を３０〜４２０ｍＭ（反応液中２０〜
２８０ｍＭ）及び塩化ナトリウム濃度を反応液中１３
０、１４０又は１５０ｍＭになるように調製した第１試
薬を用いる以外は、実施例１と同様の方法によりカリウ
ムイオンを定量し、ナトリウムイオン１０ｍＭの差によ
るカリウムイオンの測定値の誤差を図２に示した。 （２）ラット心筋由来の酵素を用いた場合のリチウム濃
度依存性 バチルス・ステロサーモフィルス由来のピルビン酸キナ
ーゼの代わりにラット心筋由来のピルビン酸キナーゼ
（ベーリンガーマンハイム社製）を用い、塩化マンガン
の代わりに塩化マグネシウムを用いる以外は、実施例２
の（１）と同様の方法によりカリウムイオンを定量し、
ナトリウムイオン１０ｍＭの差によるカリウムイオンの
測定値の誤差を図２に示した。

【００２０】図２によれば、バチルス・ステロサーモフ
ィルス由来の酵素を用いた場合、特表平１−５０３５９
６号公報に示された２０ｍＭのリチウムイオン濃度で
は、０．１ｍＭ程度の誤差があるのに対し、８０〜２８
０ｍＭのリチウムイオン濃度においては誤差が０．０６
ｍＭ以下であった。またラット心筋由来の酵素を用いた
場合、全ての濃度範囲で誤差が０．１ｍＭ以上であっ
た。

【００２１】

【発明の効果】本発明により、定量性及び再現性がよ
く、簡便にかつ迅速にカリウムイオンを測定することが
できる方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】１２０ｍＭのリチウムイオンによるカリウムイ
オンの検量線。

【図２】リチウムイオン濃度に対するカリウムイオンの
測定誤差。

【符号の説明】

─●─ バチルス・ステロサーモフィルス由来の酵素を
用いた場合 ─○─ ラット心筋由来の酵素を用いた場合

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 水性媒体中、試料中のカリウムイオンを
   ピルビン酸キナーゼを用いた酵素反応により定量する方
   法において、８０〜２８０ｍＭのリチウムイオンの存在
   下に酵素反応を行うことを特徴とするカリウムイオンの
   定量方法。