JPH07291993A - 環状ペプチド類、その製造法、その用途及びこれを生産する微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 一般式（１） 【化１】 〔Ｒ¹ はイソプロピル、ｓｅｃ−ブチル又はイソブチル
基〕で表わされる環状ペプチド類又はその塩、その製造
法、これを有効成分とするエンドセリン拮抗剤及びこれ
を生産する微生物。 【効果】 ＥＴ_AＲ及びＥＴ_BＲの両者とエンドセリンと
の結合を阻害し、血管拡張剤、抗高血圧剤、抗心筋梗塞
剤、抗狭心症剤、抗喘息剤、抗急性腎不全剤及び抗脳血
管攣縮剤等として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は医薬として有用な新規環
状ペプチド類又はその塩、その製造法、その医薬への用
途及びこれを生産する微生物に関する。より詳しくはバ
チルス属に属する微生物の培養物から分離された新規環
状ペプチド類であって、エンドセリン拮抗作用を有し、
血管拡張剤、抗高血圧剤、抗心筋梗塞剤、抗狭心症剤、
抗喘息剤、抗急性腎不全剤及び抗脳血管攣縮剤等として
有用な化合物に関する。

【０００２】

【従来の技術】エンドセリン−１（ＥＴ−１）は、柳沢
等によりブタ大動脈血管内皮細胞由来の培養細胞の培養
上清から強力な血管平滑筋収縮作用と血圧上昇作用を有
する物質として発見された〔Ｎａｔｕｒｅ，３３２，４
１１（１９８８）〕。その後、ヒトゲノムの解析でブタ
エンドセリン−１と同じペプチド及びこれと類似するペ
プチド、エンドセリン−１、エンドセリン−２（ＥＴ−
２）及びエンドセリン−３（ＥＴ−３）が発見された
〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，
８６，２８６３（１９８９）〕。

【０００３】エンドセリン（ＥＴ）は（１）虚血性心筋
梗塞、鬱血性心不全、不整脈、不安定狭心症及び高血圧
等を含む心疾患、（２）肺高血圧及び喘息等気道疾患、
（３）クモ膜下出血及び脳の血管攣縮等の神経疾患、
（４）妊娠中毒症、（５）急性及び慢性の腎不全等の腎
疾患、（６）アテローム性動脈硬化及び他の血管障害
（Ｂｕｅｒｇｅｒｓ病、Ｔａｋａｙａｓｕ奇形性動脈
炎、Ｒａｙｎａｕｄ症候群及び糖尿病合併症）等の血管
機能異常、（７）肺癌等の癌、胃腸障害を伴う胃粘膜障
害、（８）前立腺肥大症、（９）動脈硬化症、（１０）
その他（エンドトキシンショック、敗血症）の原因物質
と考えられており、これらの病態モデルとしての急性の
虚血性腎疾患、シクロスポリン腎疾患及び胃癌に対して
抗ＥＴ抗体が効果を発揮すること等も報告されている
〔Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３５，１４９３（１９９
２）、日本泌尿器学会（１９９３）、月刊薬事，３５，
１１１１（１９９３）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓ
ｔ．，８３，１７６２（１９８９）、Ｊａｐａｎｅｓｅ
Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｇａｓｔｒｉｃ Ｕｌｃｅｒ，５０（１９９１）、Ｋｉ
ｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，３７，１４８７（１９９０）〕。

【０００４】このようなエンドセリンの種々の作用は、
エンドセリンが体内の種々の臓器に存在するレセプター
に結合する事によって惹起されること〔Ａｍ．Ｊ．Ｐｈ
ｙｓｉｏｌ．，２５６，Ｒ８５６（１９８９）〕、更に
エンドセリンによる血管収縮は少なくとも２種類のレセ
プターによって引き起こされること〔Ｊ．Ｃａｒｄｉｏ
ｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１７（Ｓｕｐｐ１．
７），Ｓ１１９（１９８９）〕が明らかにされてきた。
これらのレセプターの一方は、ＥＴ−１とＥＴ−２に選
択的なレセプター（ＥＴ_AＲ）であり、他方はＥＴ−
１、ＥＴ−２及びＥＴ−３の全てに結合するレセプター
（ＥＴ_BＲ）である。これらの二つのレセプターは多く
の臓器に分布しており、ＥＴ_AＲは主に血管系に存在す
るのに対し、ＥＴ_BＲは例えば、脳、腎臓、肺、心臓及
び血管系等、種々の臓器に広く存在している〔Ｎａｔｕ
ｒｅ，３４８，７３０（１９９０）、Ｎａｔｕｒｅ，３
４８，７３２（１９９０）〕。

【０００５】エンドセリン拮抗作用を持つ天然物として
は、特開平３−４７１６３号公報、特開平３−９４６９
２号公報、特開平４−１３４０４８号公報等に記載の化
合物が知られている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、これら
の化合物はＥＴ_AＲだけにのみ拮抗作用を有し、ＥＴ_BＲ
に対しては拮抗作用を有していない。従って、ＥＴ_AＲ
及びＥＴ_BＲに拮抗する薬物は、上記疾患治療の更に有
効な手段となりうるため、両レセプターに対するエンド
セリン拮抗物質の開発が望まれている。

【０００７】

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者らは微
生物の発酵生産物に着目し、各種微生物をスクリーニン
グした結果、東京都大田区中馬込の土壌より分離採取さ
れた微生物の培養物中に上記拮抗作用を有する物質群を
見出し、それらを精製、単離して分析した結果、新規環
状ペプチド類であることを確認した。そして更なる研究
の結果、この工業的製造法を確立し、併せてその環状ペ
プチド類がＥＴ_AＲ及びＥＴ_BＲの両者に拮抗し、医薬と
して有用であることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。

【０００８】すなわち、本発明は一般式（１）

【０００９】

【化２】

【００１０】〔式中、Ｒ¹ はイソプロピル、ｓｅｃ−ブ
チル又はイソブチル基を示す〕で表わされる環状ペプチ
ド類又はその塩を提供するものである。

【００１１】また本発明はバチルス属に属する環状ペプ
チド類生産菌を培養し、その培養物より環状ペプチド類
を採取することを特徴とする上記一般式（１）で表わさ
れる環状ペプチド類又はその塩の製造法を提供するもの
である。更に本発明は、上記一般式（１）で表わされる
環状ペプチド類又はその塩を有効成分とするエンドセリ
ン拮抗剤を提供するものである。更にまた、本発明はバ
チルス属に属し、上記一般式（１）で表わされる環状ペ
プチド類の生産菌を提供するものである。

【００１２】本発明の環状ペプチド類は上記式（１）で
表わされる構造を有するものであるが、これに類似する
環状ペプチドとしては、Ｓｕｒｆａｃｔｉｎ〔Ａｇｒｉ
ｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，３３，１６６９（１９６
９）〕、Ｅｓｐｅｒｉｎ〔Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２
５，１９８５（１９６９）〕、Ａｃｙｌｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ〔Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，３６，６７４（１９
８３）〕、Ｐｕｍｉｌａｃｉｄｉｎ〔Ｊ．Ａｎｔｉｂｉ
ｏｔｉｃｓ，４３，２６７（１９９０）〕、Ｓｕｒｆａ
ｃｅ−ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ〔Ｐｒｏｃ．Ｉｎ
ｔ．Ｓｙｍｐ．，２ｎｄ Ｍｅｅｔｉｎｇ Ｄａｔｅ
２０４（１９９０）〕等が知られているが、これらの化
合物がエンドセリン拮抗作用を示すという報告はない。

【００１３】本発明の環状ペプチド類（１）は、例え
ば、本発明者らが東京都大田区中馬込で採取した土壌サ
ンプルから新たに分離した微生物ＢＭＪ６８５−ｍ３株
によって生産される。以下に、本菌株の菌学的性状を示
す。

【００１４】＜形態＞ （１）細胞は桿菌、大きさは０．５×１．０−１．２ミ
クロンである。 （２）細胞の多形性は、特に認められない。 （３）周鞭毛を有し、運動性を示す。 （４）胞子を有する。その形は卵円形、大きさは０．５
×１．０−１．２ミクロン、位置は中立（ｃｅｎｔｒａ
ｌ）、菌体の膨隆は認められない。 （５）非抗酸性である。

【００１５】＜各種培地における生育状態＞肉汁ゼラチ
ン穿刺培養以外は、すべて３７℃で試験した。 （１）肉汁寒天平板培養 コロニーは、やや光沢のある不透明な円形で、辺縁は不
規則、色はうす茶（ｐａｌｅｂｒｏｗｎ）を示す。培養
後２日目頃より、コロニーの表面はしわ状を呈する。拡
散性色素は認められない。 （２）肉汁液体培養 培養後１日で培地表面にうすい菌膜をつくり、２日目に
はそれが培地表面を覆う。培養後１４日目においても、
培地の濁度にさほど変化は見られない。 （３）肉汁ゼラチン穿刺培養 ２０℃培養では、培地表面及び穿刺線に沿って菌の生育
が認められ、培養後３日目頃より液化が始まり、１４日
目においても液化は完了せず、その作用は中程度であ
る。３０℃培養では特に培地表面に良好な菌の生育が見
られ、培養後１日で菌膜を形成する。液化は培養後２日
目頃より始まり、４日目頃には完了した。その作用は強
いほうである。 （４）ミルク ミルク及びＢＣＰミルクのいずれの培地においても、培
養後２日目頃より培地表面にうすい菌膜を形成する。培
養後３日目頃より凝固が観察されると同時にペプトン化
が始まり、１４日後にはほぼ完了した。反応は弱酸性で
ある。

【００１６】＜生理的性質＞特に記さない限り、培養温
度はすべて３７℃である。 （１）グラム染色性：陽性 （２）硝酸塩の還元：陽性 （３）脱窒反応〔駒形らの方法：長谷川武治編著；微生
物の分類と同定，２２３頁，東京大学出版会，１９７５
年〕：陰性 （４）ＭＲテスト：陰性 （５）Ｖ−Ｐテスト：陽性 （６）インドールの生成：陰性 （７）硫化水素の生成：陰性 （８）デンプンの加水分解：陽性 （９）クエン酸の利用：Ｋｏｓｅｒの培地，Ｃｈｒｉｓ
ｔｅｎｓｅｎの培地ともに陽性 （10）色素の生成：キングＡ培地、キングＢ培地、いず
れも溶解性色素は認められない。 （11）無機窒素源の利用：硝酸ナトリウム、硫酸アンモ
ニウムいずれも陽性 （12）ウレアーゼ（尿素培地，栄研化学）：陽性 （13）オキシダーゼ：陽性 （14）カタラーゼ：陽性 （15）生育の範囲：pH５．０−９．０の範囲で生育を認
め、最適pHは６．０−８．０である。又、２０℃−５０
℃の範囲で生育を認め、最適温度は３０℃−３７℃であ
る。 （16）酸素に対する態度：好気性 （17）Ｏ−Ｆテスト（Ｈｕｇｈ Ｌｅｉｆｓｏｎ法によ
る）：発酵型 （18）糖類からの酸及びガスの生成（糖加ペプトン水培
地）

【００１７】

【表１】

【００１８】（19）カゼインの加水分解：陽性 （20）リゾチーム感受性（０．００１％リゾチームを含
む肉汁液体培地）：抵抗性

【００１９】以上の性状を要約すると、ＢＭＪ６８５−
ｍ３株は、グラム陽性で好気性の有芽胞桿菌である。ま
た、周鞭毛を有し、運動性を示す。芽胞は卵円形で中立
（ｃｅｎｔｒａｌ）、菌体の膨隆は認められず、非抗酸
性である。寒天培地での生育は不透明で、辺縁は不規
則、コロニーの表面はしわ状を呈する。ゼラチンを液化
し、ミルクを凝固、ペプトン化する。硝酸塩を還元し、
脱窒反応は陰性、ＭＲテスト陰性、Ｖ−Ｐテスト陽性で
ある。インドールは検出されず、硫化水素を生成しな
い。デンプンを分解し、クエン酸を利用する。ウレアー
ゼ反応、オキシダーゼ反応及びカタラーゼ反応いずれも
陽性である。pH５．０−９．０の範囲で生育し、最適pH
は６．０−８．０である。また、２０℃−５０℃の範囲
で生育を認め、最適温度は３０℃−３７℃である。グル
コースを発酵的に分解し、酸を生成するが、ガスは生成
しない。尚、前記に示した通り、その他の糖類からも酸
を生成するが、ガスは生成しない。リゾチームは抵抗性
であり、カゼインを分解する。

【００２０】以上の性状をもとに、ＢＭＪ６８５−ｍ３
株をＢｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔ
ｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌｕｍ
ｅ２（１９８６）で検索すると、バチルス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ）属に属すると考えられる。更に、種を検索する
と、細胞の形態、硝酸塩の還元、Ｖ−Ｐテスト、糖類か
らの酸生成、カゼイン、ゼラチン、スターチの加水分
解、クエン酸の利用性等の結果から、バチルス・ズブチ
リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びバチ
ルス・リケニホルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅ
ｎｉｆｏｒｍｉｓ）が近縁の種として挙げられる。ＢＭ
Ｊ６８５−ｍ３株と上記２種の性状を文献上で比較する
と、次表のようになる。

【００２１】

【表２】

【００２２】表２から明らかなように、ＢＭＪ６８５−
ｍ３株は、嫌気性下での生育、グルコースからのガスの
生成、プロピオン酸の利用性等の性状から、バチルス・
リケニホルミスと区別され、一方バチルス・ズブチリス
と極めて類似した性状を示した。これらの結果に基づい
て、ＢＭＪ６８５−ｍ３株はバチルス・ズブチリスの一
菌株と同定し、通産省工業技術院生命工学工業技術研究
所に寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７８，
受託日：平成５年１１月２２日）。

【００２３】本発明環状ペプチド類の生産菌は、バチル
ス属に属し、環状ペプチド類（１）を生産する能力を有
するものであれば、上記菌株に限定されるものではな
い。例えば、上記菌株からＸ線照射、紫外線照射、Ｎ−
メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、２−
アミノプリン等の変異処理により取得できる人工変異株
並びに自然変異株が含まれる。

【００２４】本発明の環状ペプチド類は、バチルス属に
属する該ペプチド類生産菌（例えばＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＢＭＪ６８５−ｍ３）を資化しうる
炭素源及び窒素源を含む栄養培地中に接種し、好気条件
下で培養することにより（例えば振盪培養、通気攪拌培
養等）、生産せしめることができる。

【００２５】炭素源としては、グルコース、シュークロ
ース、澱粉、変性澱粉、フラクトース、グリセリンその
他の炭水化物を使用するのが好ましい。窒素源として
は、オートミール、酵母エキス、ペプトン、グルテンミ
ール、綿実粉、綿実油粕、大豆粉、コーンスティープリ
カー、乾燥酵母、小麦胚芽、落花生粉、チキン骨肉ミー
ル等を使用するのが好ましいが、アンモニウム塩（例え
ば硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモ
ニウム等）、尿素、アミノ酸等の無機及び窒素化合物も
有利に使用することができる。これらの炭素源及び窒素
源は、併用するのが有利であるが、純粋なものを必ずし
も使用する必要はない。不純なものには、生長因子や微
量要素が含まれている場合などもあり、有利な場合があ
るからである。

【００２６】また必要に応じて、例えば炭酸ナトリウ
ム、炭酸カリウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウ
ム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、ヨウ化ナトリウ
ム、ヨウ化カリウム、マグネシウム塩、銅塩、コバルト
塩等の無機塩類を培地に添加してもよい。特に、培地が
強く発泡する場合には必要に応じて液体パラフィン、動
物油、植物油、鉱物油、シリコン等を添加してもよい。

【００２７】本発明環状ペプチド類を大量に工業生産す
るには、他の発酵生産物の場合と同様に、通気攪拌培養
するのが好ましい。少量生産の場合は、フラスコを用い
る振盪培養が好ましい。

【００２８】また、培養を大きなタンクで行う場合、本
発明物質の生産工程において菌の生育遅延を防止するた
め、はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した
後、次に培養物を大きな生産タンクに移してそこで生産
培養するのが好ましい。この場合、前培養に使用する培
地及び生産培養に使用する培地の組成は、両者ともに同
一であってもよいし、必要であれば両者を変えてもよ
い。

【００２９】培養は通気攪拌条件で行うのが好ましく、
例えばプロペラやその他機械による攪拌、ファーメンタ
ーの回転又は振盪、ポンプ処理、空気の吹き込み等既知
の方法が適宜使用される。通気用の空気は滅菌したもの
を用いる。

【００３０】培養温度は、本発明物質生産菌が本発明物
質を生産する範囲内で適宜変更しうるが、通常は２０℃
−５０℃、好ましくは３０℃−３７℃で培養するのがよ
い。

【００３１】発酵終了後、培養物から目的とする環状ペ
プチド類を回収する。すなわち、菌体を、直接水及び／
又は有機溶媒による抽出、あるいは、これを機械的に又
は超音波等既知の手段を用いて破壊し、水及び／又は有
機溶媒で抽出した後、常法に従って回収、精製する。培
養液の場合、直接、常法に従って回収、精製する。

【００３２】回収、精製方法としては、例えば、水、有
機溶媒（例えばメタノール、酢酸エチル、クロロホルム
等）、これらの混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグラ
フィー；単一溶媒又は混合溶媒からの再結晶等の常法が
適宜単独あるいは組み合わせて使用できる。

【００３３】本発明の環状ペプチド類の単離、精製は、
例えば次のようにして行うことができる。先ず培養物を
遠心分離して得た菌体部分をメタノールで抽出する。得
た抽出液を濃縮した後、酸性条件下酢酸エチルで抽出
し、減圧下濃縮乾固したものをシリカゲルカラム（メル
ク社製、Ａｒｔ．９３８５）処理し、更に逆相系高速液
体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ社製、μＢｏｎｄ
ａｓｐｈｅｒｅ，１９×１５０mm）で分画精製し、各々
再結晶することにより、目的の環状ペプチド類粉末を得
ることができる。

【００３４】かくして得られた本発明環状ペプチド類は
機器分析により前記一般式（１）の化学構造を有するこ
とが明らかとなった。またその塩としては、医学的に許
容される塩であれば特に制限されず、例えばナトリウ
ム、カリウム等のアルカリ金属塩、アンモニウム塩、有
機塩基による塩等が挙げられる。

【００３５】本発明の環状ペプチド類又はその塩は、Ｅ
Ｔ_AＲ及びＥＴ_BＲの両者に対して優れた拮抗作用を有
し、エンドセリン拮抗剤として前記（１）〜（１０）の
各種疾患の治療剤として、特に血管拡張剤、抗高血圧
剤、抗心筋梗塞剤、抗狭心症剤、抗喘息剤、抗急性腎不
全剤及び抗脳血管攣縮剤として有用である。

【００３６】本発明環状ペプチド類又はその塩は、その
まま直接医薬として使用することもできるが、医薬とし
て許容される担体を加えて医薬組成物として使用するこ
ともできる。

【００３７】かかる医薬組成物は、環状ペプチド類
（１）及び／又はそれらの塩を有効成分とし、これらに
常用される無機又は有機の担体を加えて、固体、半固体
又は液体の形で、経口投与剤のほか、外用剤等の非経口
投与剤に製剤化する。

【００３８】経口投与のための製剤としては、錠剤、丸
剤、顆粒剤、軟・硬カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、
乳濁剤、シロップ剤、ペレット剤、エリキシル等が挙げ
られる。非経口投与のための製剤としては、注射剤、点
滴剤、輸液、軟膏、ローション、トニック、スプレー、
懸濁剤、油剤、乳剤、坐剤等が挙げられる。本発明の有
効成分を製剤化するには、常法に従えばよく、界面活性
剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝
剤、懸濁剤、等張剤その他を適宜使用することができ
る。

【００３９】本発明にかかる医薬の投与量は、その種
類、治療ないし予防対象疾病の種類、投与方法、患者の
年令、患者の症状、処理時間等によって相違するが、静
脈投与の場合は成人ひとり当たり１日に有効成分（本発
明物質）を０．１−１００mg／kg／日、好ましくは０．
５−５０mg／kg／日投与し、筋肉投与の場合は同じく
０．１−１００mg／kg／日、好ましくは０．５−５０mg
／kg／日投与し、経口投与の場合も同じく０．１−４０
０mg／kg／日、好ましくは０．５−２００mg／kg／日の
範囲内で投与する。

【００４０】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説
明する。しかしながら、本発明は実施例に限定されるも
のではない。

【００４１】実施例１ バチルス・ズブチリスＢＭＪ６８５−ｍ３菌株をマンニ
トール２％、酵母エキス０．２５％、硫酸アンモニウム
０．５％、塩化カリウム０．４％、リン酸一カリウム
０．０２％及び炭酸カルシウム０．４％からなる培地
（pH７．４）１１０mlを含む５００ml容の三角フラスコ
２本に接種し、２７℃で２４時間、回転振盪機で培養し
た。この培養液を２mlずつ、上記の培地を１１０ml含む
５００ml容の三角フラスコ１００本に接種し２７℃で４
８時間、回転振盪機で培養した。

【００４２】実施例２ 実施例１で得られた培養液１１ｌを遠心分離機（４００
０rpm ）に１０分間かけ菌体を採取した後、メタノール
３００mlを加え、３０分間攪拌し濾過した。この抽出操
作を３回繰り返し、濾液１２００mlを合わせこれを５０
mlまで減圧濃縮した。これに０．２Ｎ塩酸５０mlを加え
pH２とした後、酢酸エチル１００mlで３回抽出し、この
抽出液を減圧濃縮して粗製物１．１ｇを得た。これをシ
リカゲルカラム（５０ｇメルク社製、Ａｒｔ．９３８
５）に吸着後、クロロホルム−メタノール（１０：１）
で溶出して粗活性物質５５０mgを得た。更にこのものを
３０回に分けて、逆相系高速液体クロマトグラフィー
（Ｗａｔｅｒｓ社製、μＢｏｎｄａｓｐｈｅｒｅ，１９
×１５０mm）にかけ、０．１％トリフルオロ酢酸を含む
９０％アセトニトリルで溶出（流速：５ml／分、保持時
間：１６分、２１分）し、それぞれ活性画分を３０mlま
で濃縮後クロロホルム５０mlで抽出し、減圧濃縮すると
無色粉末が得られた。このものを酢酸エチル−ｎ−ヘキ
サン系で再結晶することによりＢＫ−１０１Ａが４０mg
及びＢＫ−１０１Ｂ，Ｃの混合物が１２０mg得られた。
これらの物理化学的性状は以下の通りであった。

【００４３】＜ＢＫ−１０１Ａの物理化学的性状＞ （１）融点 ｍｐ：２３６−２３８℃ （２）比旋光度 〔α〕_D：−１４．４°（Ｃ １．０，メタノール） （３）元素分析 Ｃ₅₂Ｈ₉₂Ｎ₈Ｏ₁₂・Ｈ₂Ｏ 理論値（％）：Ｃ，６０．０５；Ｈ，８．８７；Ｎ，１
０．９７ 実測値（％）：Ｃ，６０．０９；Ｈ，９．１２；Ｎ，１
０．７８ （４）ＦＡＢ−ＭＳスペクトル ｍ／ｚ：１０２１（ＭＨ⁺）、１０４３（〔Ｍ＋Ｎ
ａ〕⁺） （５）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ） ν_max：３３３０，２９３０，１７３０，１６５０，１
５２０，１４７０，１３９０，１２９０，１２００cm^-1 （６）紫外線吸収スペクトル（メタノール） λ_max：２０２nm （７）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ｄ₆−ＤＭＳＯ） チャートを図１に示す。 （８）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ｄ₆−ＤＭＳＯ） チャートを図２に示す。 （９）薄層クロマトグラフィー Ｒｆ値 ０．３０（クロロホルム／メタノール＝５／
１） メルク社製キーゼルゲル６０Ｆ₂₅₄を使用 （10）溶剤に対する溶解性 易溶：メタノール、酢酸エチル、クロロホルム 難溶：エーテル 不溶：水、ヘキサン （11）酸性、中性、塩基性の区別 酸性物質 （12）呈色反応 陽性：Ｃｈｌｏｒｉｎｅ−Ｔｏｌｉｄｉｎｅ反応〔Ｊ．
Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１２，５４１（１９６３）〕 陰性：ニンヒドリン反応 （13）物質の色及び状態 白色粉末 （14）アミノ酸分析 Ａｓｐ（１），Ｇｌｕ（１），Ｖａｌ（１），Ｉｌｅ
（１），Ｌｅｕ（３）（６Ｎ ＨＣｌ，１１０℃，２４
時間加水分解）

【００４４】＜ＢＫ−１０１Ｂ及びＣ混合物（４：１）
の物理化学的性状＞ （１）比旋光度 〔α〕_D：−１２．０°（Ｃ １．０，メタノール） （２）元素分析 Ｃ₅₃Ｈ₉₄Ｎ₈Ｏ₁₂・Ｈ₂Ｏ 理論値（％）：Ｃ，６０．４６；Ｈ，９．１３；Ｎ，１
０．５３ 実測値（％）：Ｃ，６０．４３；Ｈ，９．１９；Ｎ，１
０．６４ （３）ＦＡＢ−ＭＳスペクトル ｍ／ｚ：１０３５（ＭＨ⁺）、１０５７（〔Ｍ＋Ｎ
ａ〕⁺） （４）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ） ν_max：３３３０，２９３０，１７３０，１６５０，１
５２０，１４７０，１３９０，１２９０，１２００cm^-1 （５）紫外線吸収スペクトル（メタノール） λ_max：２０２nm （６）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ｄ₆−ＤＭＳＯ） チャートを図３に示す。 （７）¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ｄ₆−ＤＭＳＯ） チャートを図４に示す。 （８）薄層クロマトグラフィー Ｒｆ値 ０．３０（クロロホルム／メタノール＝５／
１） メルク社製キーゼルゲル６０Ｆ₂₅₄を使用 （９）溶剤に対する溶解性 易溶：メタノール、酢酸エチル、クロロホルム 難溶：エーテル 不溶：水、ヘキサン （10) 酸性、中性、塩基性の区別 酸性物質 （11）呈色反応 陽性：Ｃｈｌｏｒｉｎｅ−Ｔｏｌｉｄｉｎｅ反応 陰性：ニンヒドリン反応 （12）物質の色及び状態 白色粉末 （13）アミノ酸分析 Ａｓｐ（１），Ｇｌｕ（１），Ｖａｌ（１），Ｉｌｅ
（１），Ｌｅｕ（３）（６Ｎ ＨＣｌ，１１０℃，２４
時間加水分解）

【００４５】実施例３ ＢＫ−１０１Ａの構造決定 （１）脂肪酸部分の構造決定 ＢＫ−１０１Ａ １５mgを濃塩酸−メタノール（３：
７）に溶かし、封管中、９０℃で１６時間加熱した後、
溶媒を減圧濃縮し、酢酸エチルで抽出した。抽出物を薄
層クロマトグラフィーで分離精製し、１．２mgの脂肪酸
メチルエステルを得た。¹³Ｃ−ＮＭＲにおいて１５個の
シグナル（１級炭素３個、２級炭素９個、３級炭素２
個、４級炭素１個）が観測されたこと、¹Ｈ−ＮＭＲに
おいて、０．８６ppm にダブレットピーク（６水素）が
観測されたこと、マススペクトルにおいて、β−ヒドロ
キシ脂肪酸メチルエステルに特徴的なベースピーク（ｍ
／ｚ：１０３）が観測されたことから、脂肪酸部分は３
−ヒドロキシ−１２−メチルトリデカン酸と決定した。 （２）ペプチド部分の決定 アミノ酸分析から、構成アミノ酸として２種の酸性アミ
ノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）が確認された
が、ジアゾメタンによるメチル化においてモノメチル体
が得られること並びに元素分析の結果よりいずれかがア
ミド（グルタミンあるいはアスパラギン）となっている
と推定され、このモノメチル体をリチウムボロヒドリド
還元した後、アミノ酸分析を行った結果、アスパラギン
酸が消失したのに対し、グルタミン酸が検出されたこと
から構成アミノ酸としてグルタミンの存在が明らかにな
った。アミノ酸シーケンスは、ＢＫ−１０１Ａのメチル
エステル体を用いＲＯＥＳＹ（ｒｏｔａｔｉｎｇｆｒａ
ｍｅ ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ
ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）スペクトルの解析により
行った。すなわち、イソロイシンのアミドプロトンとロ
イシンのαプロトン、ロイシンのアミドプロトンとアス
パラギン酸のαプロトン、アスパラギン酸のアミドプロ
トンとバリンのαプロトン、バリンのアミドプロトンと
ロイシンのαプロトン、ロイシンのアミドプロトンとロ
イシンのαプロトン、ロイシンのアミドプロトンとグル
タミンのαプロトン、グルタミンのアミドプロトンと脂
肪酸の２位のメチレンプロトンとの間にそれぞれＮＯＥ
が観測されたことから、アミノ酸シーケンスは、脂肪酸
−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−
Ｉｌｅであると決定した。その結果、ＢＫ−１０１Ａの
構造は下記のように決定された。

【００４６】

【化３】

【００４７】実施例４ ＢＫ−１０１Ｂ，Ｃの構造決定 （１）脂肪酸部分の構造決定 ＢＫ−１０１Ｂ，Ｃ ４０mgを濃塩酸−メタノール
（３：７）に溶かし、封管中、９０℃で１６時間加熱し
た後、溶媒を減圧濃縮し、酢酸エチルで抽出した。抽出
物を薄層クロマトグラフィーで分離精製し、４．５mgの
脂肪酸メチルエステルを得た。実施例３との¹Ｈ−ＮＭ
Ｒの比較において０．８４ppm のトリプレットピーク
（３水素）及び０．８５ppm のダブレットピーク（３水
素）を除いて一致すること、¹³Ｃ−ＮＭＲにおいて１
１．４ppm 及び１９．２ppm に１級炭素が観測されるこ
と、マススペクトルにおいてｍ／ｚ２５４に脱水ピーク
が観測されたことから、１成分の脂肪酸部分は３−ヒド
ロキシ−１２−メチルテトラデカン酸と決定した。更に
¹³Ｃ−ＮＭＲより２２．７ppm に１級炭素シグナル及び
２８．０ppm に２級炭素シグナルが観測されることか
ら、もう１成分の脂肪酸部分は３−ヒドロキシ−１３−
メチルテトラデカン酸であると決定し、その混合比はシ
グナルの積分強度から４：１であった。 （２）ペプチド部分の決定 実施例３と同様に行い、ＢＫ−１０１Ｂ，Ｃのアミノ酸
シーケンスは、どちらも脂肪酸−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｌｅ
ｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅであると決定し
た。その結果、ＢＫ−１０１Ｂ及びＢＫ−１０１Ｃの構
造は下記のように決定された。

【００４８】

【化４】

【００４９】実施例５ エンドセリン結合阻害試験 （１）ＥＴ_A受容体の調製と環状ペプチド類によるエン
ドセリン結合阻害 ブタ胸部大動脈を摘出して細かく裁断後、２倍量の０．
２５Ｍシュークロース、３mMのエチレンジアミンテトラ
アセティックアシド（ＥＤＴＡ）、５μg ／mlアプロチ
ニン、１０μg ／mlペプスタチンＡ、１０μg ／mlロイ
ペプチン及び０．１mMパラアミジノフェニルメタンスル
ホニルフルオライド（ｐ−ＡＰＭＳＦ）を含むトリス−
塩酸緩衝液（pH7.4 ）を加えてホモジネートした。１０
００×ｇで２０分間遠心後、更に上清は１０００００×
ｇで３０分間遠心した。その沈殿は最終蛋白濃度５mg／
mlとなるように５μg ／mlアプロチニン、１０μg ／ml
ペプスタチンＡ、１０μg ／mlロイペプチン及び０．１
mM ｐ−ＡＰＭＳＦを含む５０mMトリス−塩酸緩衝液Ａ
（pH７．４）を調製し（ＥＴ_AＲ）、−８０℃に保存し
た。７．５μl の膜画分は５．５×１０^-11Ｍ ¹²⁵Ｉ−
ＥＴ−１及び種々の濃度の環状ペプチド類と共に全量２
００μl の０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含
む５０mMトリス−塩酸緩衝液（pH７．４）の中、２５℃
で９０分間インキュベートし、ＨＡ濾紙（ポアーサイズ
０．４５μm ：ミリポアー）で濾過し、冷却した緩衝液
Ａで３回洗浄した後、その放射能をガンマ−カウンター
（アロカオートウエルガンマ−システム ＡＲＣ−２５
１）でカウントした。その結果、ＢＫ−１０１Ａ、ＢＫ
−１０１Ｂ，Ｃ（４：１）混合物がＥＴ_AＲに対するエ
ンドセリン−１の結合を５０％抑制する濃度（ＩＣ₅₀）
はそれぞれ７．５μM，６．７μM であった。 （２）ＥＴ_B受容体の調製と環状ペプチド類によるエン
ドセリン結合阻害 ラット脳より上記ブタ胸部大動脈の場合と同様の操作に
より、受容体の調製と結合阻害実験を行った。その結
果、ＢＫ−１０１Ａ、ＢＫ−１０１Ｂ，Ｃ（４：１）混
合物がＥＴ_BＲへのエンドセリン−１の結合を５０％抑
制する濃度（ＩＣ_{5 0}）はそれぞれ６．０μM 、６．８μ
M であった。

【００５０】実施例６ （１）実施例１又は２で製造した本発明物質５ｇ、
（２）食塩９ｇ、（３）炭酸水素ナトリウム１ｇを蒸留
水１０００mlに溶解した後、アンプルに１mlずつ分注し
て、注射剤１０００本を製造した。

【００５１】

【発明の効果】本発明の環状ペプチド類は、エンドセリ
ンとＥＴ_AＲ及びＥＴ_BＲとの結合に対して強い阻害活性
を有する。よって、エンドセリンの関与する種々の疾
患、即ち、（１）虚血性心筋梗塞、鬱血性心不全、不整
脈、不安定狭心症及び高血圧等を含む心疾患、（２）肺
高血圧及び喘息等気道疾患、（３）クモ膜下出血及び脳
の血管攣縮等の神経疾患、（４）妊娠中毒症、（５）急
性及び慢性の腎不全等の腎疾患、（６）アテローム性動
脈効果及び他の血管障害（Ｂｕｅｒｇｅｒｓ病、Ｔａｋ
ａｙａｓｕ奇形性動脈炎、Ｒａｙｎａｕｄ症候群及び糖
尿病合併症）等の血管機能異常、（７）肺癌等の癌、胃
腸障害を伴う胃粘膜障害、（８）前立腺肥大症、（９）
動脈硬化症、（１０）その他（エンドトキシンショッ
ク、敗血症）に対する治療薬として有効である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ｄ₆−ＤＭＳＯ中で測定したＢＫ−１０１Ａの¹
Ｈ−ＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨｚ）を示す。

【図２】ｄ₆−ＤＭＳＯ中で測定したＢＫ−１０１Ａの
¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（６７．５ＭＨｚ）を示す。

【図３】ｄ₆−ＤＭＳＯ中で測定したＢＫ−１０１Ｂ及
びＣの混合物の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（２７０ＭＨ
ｚ）を示す。

【図４】ｄ₆−ＤＭＳＯ中で測定したＢＫ−１０１Ｂ及
びＣの混合物の¹³Ｃ−ＮＭＲスペクトル（６７．５ＭＨ
ｚ）を示す。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 21/04 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 蘇木 宏之 埼玉県東松山市市ノ川199−165 (72)発明者 白土 正三 東京都武蔵村山市残掘４−43−２ (72)発明者 浜田 雅 東京都新宿区内藤町１−26 (72)発明者 前田 謙二 東京都目黒区五本木２−46−11 (72)発明者 竹内 富雄 東京都品川区東五反田１−11 ニューフジ マンション701Ａ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一般式（１） 【化１】 〔式中、Ｒ¹ はイソプロピル、ｓｅｃ−ブチル又はイソ
   ブチル基を示す〕で表わされる環状ペプチド類又はその
   塩。
2. 【請求項２】 請求項１記載の環状ペプチド類又はその
   塩を有効成分とするエンドセリン拮抗剤。
3. 【請求項３】 バチルス属に属する環状ペプチド類生産
   菌を培養し、その培養物より環状ペプチド類を採取する
   ことを特徴とする請求項１記載の環状ペプチド類又はそ
   の塩の製造法。
4. 【請求項４】 バチルス属に属する請求項１記載の環状
   ペプチド類の生産菌。
5. 【請求項５】 ＦＥＲＭ Ｐ−１３９７８として工業技
   術院生命工学工業技術研究所に寄託されている請求項４
   記載の生産菌。