JPH0638766A - ウリカーゼ遺伝子およびウリカーゼの製造法 - Google Patents
ウリカーゼ遺伝子およびウリカーゼの製造法Info
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- JPH0638766A JPH0638766A JP3320525A JP32052591A JPH0638766A JP H0638766 A JPH0638766 A JP H0638766A JP 3320525 A JP3320525 A JP 3320525A JP 32052591 A JP32052591 A JP 32052591A JP H0638766 A JPH0638766 A JP H0638766A
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- C12N9/0046—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7) with oxygen as acceptor (1.7.3)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 血中あるいは尿中の尿酸の測定、染毛用キッ
ト等に使用されるウリカーゼを安価に、かつ大量に供給
する。 【構成】 セルロモナス属に属する微生物由来のウリカ
ーゼをコードする遺伝子をクローニングし、該ウリカー
ゼ遺伝子を含有する組換え体プラスミドを構築後、該プ
ラスミドを含む形質転換体を造成して、該形質転換体を
培養することによりウリカーゼを収率よく製造する方
法。
ト等に使用されるウリカーゼを安価に、かつ大量に供給
する。 【構成】 セルロモナス属に属する微生物由来のウリカ
ーゼをコードする遺伝子をクローニングし、該ウリカー
ゼ遺伝子を含有する組換え体プラスミドを構築後、該プ
ラスミドを含む形質転換体を造成して、該形質転換体を
培養することによりウリカーゼを収率よく製造する方
法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はウリカーゼ遺伝子および
ウリカーゼの製造法に関する。さらに詳しくは本発明は
ウリカーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換え体プラスミ
ド、該組換え体プラスミドを含む形質転換体及び該形質
転換体を用いるウリカーゼの製造法並びにセルロモナス
属に属する微生物を用いるウリカーゼの製造法に関す
る。
ウリカーゼの製造法に関する。さらに詳しくは本発明は
ウリカーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換え体プラスミ
ド、該組換え体プラスミドを含む形質転換体及び該形質
転換体を用いるウリカーゼの製造法並びにセルロモナス
属に属する微生物を用いるウリカーゼの製造法に関す
る。
【０００２】ウリカーゼ(EC 1.7.3.3)は尿酸を酸化して
アラントインと過酸化水素および二酸化炭素を生成する
反応を触媒する酵素であり、血中あるいは尿中の尿酸の
測定、染毛用キット等に使用される。
アラントインと過酸化水素および二酸化炭素を生成する
反応を触媒する酵素であり、血中あるいは尿中の尿酸の
測定、染毛用キット等に使用される。
【０００３】
【従来の技術】ウリカーゼを得る方法としては、例え
ば、キャンディダ属（特公昭４２−５１９２号公報）、
ミクロコッカス属、ブレビバクテリウム属（特公昭４４
−１４７８３号公報）、ストレプトミセス属〔Agric. B
iol. Chem. 33、 1282、 (1969)〕、エンテロバクター属
〔特公昭６０−１９９９０号公報；Agric. Biol. Che
m.,44、 2811、 (1980)〕、バチルス属（特開昭６１−２
８０２７２号公報；特開平２−５３４８８号公報）に属
する微生物を用いる方法等が知られている。
ば、キャンディダ属（特公昭４２−５１９２号公報）、
ミクロコッカス属、ブレビバクテリウム属（特公昭４４
−１４７８３号公報）、ストレプトミセス属〔Agric. B
iol. Chem. 33、 1282、 (1969)〕、エンテロバクター属
〔特公昭６０−１９９９０号公報；Agric. Biol. Che
m.,44、 2811、 (1980)〕、バチルス属（特開昭６１−２
８０２７２号公報；特開平２−５３４８８号公報）に属
する微生物を用いる方法等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ウリカーゼを収率良く
安価に製造する方法が求められている。
安価に製造する方法が求められている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、セルロ
モナス属に属し、ウリカーゼ生産能を有する微生物を培
地に培養することによってウリカーゼを生成させること
ができる。また、セルロモナス属に属する微生物由来の
ウリカーゼをコードする遺伝子をクローニングし、該ウ
リカーゼ遺伝子を含有する組換え体プラスミドを構築
後、該プラスミドを含む形質転換体を造成して該形質転
換体を培養することによりウリカーゼを大量発現させる
ことができる。
モナス属に属し、ウリカーゼ生産能を有する微生物を培
地に培養することによってウリカーゼを生成させること
ができる。また、セルロモナス属に属する微生物由来の
ウリカーゼをコードする遺伝子をクローニングし、該ウ
リカーゼ遺伝子を含有する組換え体プラスミドを構築
後、該プラスミドを含む形質転換体を造成して該形質転
換体を培養することによりウリカーゼを大量発現させる
ことができる。
【０００６】使用される微生物としては、セルロモナス
属に属し、ウリカーゼを生産する能力を有するものであ
ればいずれの微生物でもよい。好適な微生物の例として
はセルロモナス・フラビジェナ（ Cellulomonas flav
igena ) ＳＫ−４があげられる。本菌株は昭和６２年１
１月２１日付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工
研）にブタペスト条約の条件でＦＥＲＭ ＢＰ−１５７
５として寄託されている。セルロモナス・フラビジェナ
の菌学的性質についてはBergey's Manual ofSystemati
c Bacteriology 第２巻 1325〜1329頁(1986)に記載が
ある。また、形質転換体に用いられる微生物としては、
従来知られている宿主・ベクター系の宿主であれば、い
ずれの微生物でもよい。好適な例としては大腸菌（Esch
erichia coli) の宿主・ベクター系があげられる。
属に属し、ウリカーゼを生産する能力を有するものであ
ればいずれの微生物でもよい。好適な微生物の例として
はセルロモナス・フラビジェナ（ Cellulomonas flav
igena ) ＳＫ−４があげられる。本菌株は昭和６２年１
１月２１日付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工
研）にブタペスト条約の条件でＦＥＲＭ ＢＰ−１５７
５として寄託されている。セルロモナス・フラビジェナ
の菌学的性質についてはBergey's Manual ofSystemati
c Bacteriology 第２巻 1325〜1329頁(1986)に記載が
ある。また、形質転換体に用いられる微生物としては、
従来知られている宿主・ベクター系の宿主であれば、い
ずれの微生物でもよい。好適な例としては大腸菌（Esch
erichia coli) の宿主・ベクター系があげられる。
【０００７】セルロモナス属に属するウリカーゼ生産菌
の培養は以下のごとく行う。すなわち該微生物を、炭素
源、窒素源、無機物などを含有する培地において、好気
的条件下にて温度、ｐＨなどを調整しつつ培養を行えば
よい。培地に用いる炭素源としては、例えばグルコー
ス、フラクトース、シュークロース、糖蜜、廃糖蜜、澱
粉加水分解物などの炭水化物、エタノール、グリセリ
ン、ソルビトールなどのアルコール類、ピルビン酸、乳
酸、酢酸などの有機酸、グリシン、アラニン、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸などのアミノ酸など該微生物が資
化可能なものであればいずれでも使用できる。
の培養は以下のごとく行う。すなわち該微生物を、炭素
源、窒素源、無機物などを含有する培地において、好気
的条件下にて温度、ｐＨなどを調整しつつ培養を行えば
よい。培地に用いる炭素源としては、例えばグルコー
ス、フラクトース、シュークロース、糖蜜、廃糖蜜、澱
粉加水分解物などの炭水化物、エタノール、グリセリ
ン、ソルビトールなどのアルコール類、ピルビン酸、乳
酸、酢酸などの有機酸、グリシン、アラニン、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸などのアミノ酸など該微生物が資
化可能なものであればいずれでも使用できる。
【０００８】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムな
どの無機および有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、
ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープ
リカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたは
その消化物などの窒素含有有機物、グリシン、グルタミ
ン酸などのアミノ酸などが使用できる。
ニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムな
どの無機および有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、
ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープ
リカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたは
その消化物などの窒素含有有機物、グリシン、グルタミ
ン酸などのアミノ酸などが使用できる。
【０００９】無機物としては、リン酸１カリウム、リン
酸２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、炭酸カルシウムなどが使用できる。さらに、ウリ
カーゼ生産の誘導物質としてよく用いられる核酸混合
物、尿酸などを適量添加することが望ましい。用いる微
生物がアミノ酸、核酸、ビタミンなど特定の栄養物質を
生育に要求する場合には、培地にこれらの物質を適量添
加する。
酸２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、炭酸カルシウムなどが使用できる。さらに、ウリ
カーゼ生産の誘導物質としてよく用いられる核酸混合
物、尿酸などを適量添加することが望ましい。用いる微
生物がアミノ酸、核酸、ビタミンなど特定の栄養物質を
生育に要求する場合には、培地にこれらの物質を適量添
加する。
【００１０】培養は振盪培養、通気攪拌培養などの好気
的条件下、２５〜３７℃で１〜２４時間行う。培地のｐ
Ｈはアンモニア、尿素、水酸化ナトリウム溶液などで中
性付近に保つことが望ましい。培養終了後、培養物より
ウリカーゼを採取するには一般の酵素採取法、例えば次
のようにして単離することができる。まず得られた菌体
を充分洗浄した後、超音波処理などにて無細胞抽出液を
得る。遠沈後の上清を陰イオン交換クロマトグラフィー
処理、疎水性クロマトグラフィー処理などを行い、精製
標品を得る。
的条件下、２５〜３７℃で１〜２４時間行う。培地のｐ
Ｈはアンモニア、尿素、水酸化ナトリウム溶液などで中
性付近に保つことが望ましい。培養終了後、培養物より
ウリカーゼを採取するには一般の酵素採取法、例えば次
のようにして単離することができる。まず得られた菌体
を充分洗浄した後、超音波処理などにて無細胞抽出液を
得る。遠沈後の上清を陰イオン交換クロマトグラフィー
処理、疎水性クロマトグラフィー処理などを行い、精製
標品を得る。
【００１１】本発明におけるウリカーゼの活性は次の方
法で測定する。ウリカーゼの活性測定は、基質となる尿
酸の紫外部吸収（２９３ｎｍ）の吸光度の減少を測定す
ることにより行う。すなわち５０ｍＭ ほう酸緩衝液
（ｐＨ８．５）、１２５μＭ 尿酸の組成からなる反応
液（以下、反応液ａという）３ｍｌ中にウリカーゼを１
５０ｎｇ蛋白／ｍｌ程度の濃度で接触させ、２５℃で３
分間反応させる。本反応中の２９３ｎｍの吸光度の変化
（△ＯＤ）を測定し、次式によりウリカーゼの単位
（Ｕ）を算出する。上記条件下で、１分間に１μｍｏｌ
ｅの尿酸を分解する酵素量を１Ｕとする。
法で測定する。ウリカーゼの活性測定は、基質となる尿
酸の紫外部吸収（２９３ｎｍ）の吸光度の減少を測定す
ることにより行う。すなわち５０ｍＭ ほう酸緩衝液
（ｐＨ８．５）、１２５μＭ 尿酸の組成からなる反応
液（以下、反応液ａという）３ｍｌ中にウリカーゼを１
５０ｎｇ蛋白／ｍｌ程度の濃度で接触させ、２５℃で３
分間反応させる。本反応中の２９３ｎｍの吸光度の変化
（△ＯＤ）を測定し、次式によりウリカーゼの単位
（Ｕ）を算出する。上記条件下で、１分間に１μｍｏｌ
ｅの尿酸を分解する酵素量を１Ｕとする。
【００１２】
【数１】
【００１３】本手法により得られたウリカーゼの生産性
を向上させるために、本発明者らは当該酵素の遺伝子を
取得し、該遺伝子を含有する組換え体プラスミドを構築
後、該プラスミドを含む形質転換体を造成して該形質転
換体を培養することによりウリカーゼを大量発現するこ
とを検討した。該遺伝子のクローニングは、polymerase
chain reaction (PCR) 法により特異性の高いプローブ
DNAを取得し、それを用いE . coliで作成したウリカー
ゼ生産菌のジーン・バンクからコロニー・ハイブリダイ
ゼイション法により行った。
を向上させるために、本発明者らは当該酵素の遺伝子を
取得し、該遺伝子を含有する組換え体プラスミドを構築
後、該プラスミドを含む形質転換体を造成して該形質転
換体を培養することによりウリカーゼを大量発現するこ
とを検討した。該遺伝子のクローニングは、polymerase
chain reaction (PCR) 法により特異性の高いプローブ
DNAを取得し、それを用いE . coliで作成したウリカー
ゼ生産菌のジーン・バンクからコロニー・ハイブリダイ
ゼイション法により行った。
【００１４】上述の様にして得られた精製ウリカーゼの
Ｎ末アミノ酸の配列、数種のリジルペプチダーゼ切断断
片のＮ末アミノ酸の配列を分析し、その配列に対応する
DNAオリゴマーを作成する。通常のＤＮＡ単離法〔フェ
ノール法；バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ
(Biochim.Biophys.Acta)72、619 〜629(1963）〕によ
り、セルロモナス属に属するウリカーゼ生産菌の染色体
ＤＮＡを精製し、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として P
CR法により当該遺伝子の一部と考えられる DNA断片を増
幅し、この増幅 DNA断片をプラスミドベクター（ｐＵＣ
１９等）につなぎ、適当な宿主E. coli ＤＨ５α〔フ
ォーカス(Focus), 8, 9 (1986)〕等をコーエンらの方法
〔Cohen et.al.; プロシーヂング・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.) 、69、2110(1972)〕に従い形質転換し、得ら
れた形質転換体から組換え体プラスミドを常法に従い抽
出する。ジデオキシ法〔サイエンス(Science) 、 214 、
1205〜1210(1981)，ジーン(Gene)、 19、 269 〜276(198
2) 〕により挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が
上述の精製ウリカーゼのアミノ酸配列に相当することを
確認した後、適当な制限酵素で挿入断片を切り出し、こ
の DNA断片をウリカーゼ遺伝子クローン化用プローブと
して使用する。尚、プラスミド作成等の遺伝子工学的手
法は、Maniatisらの著書〔モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning)(1982) コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー(Cold Spring Habor Lab.)〕に従
って行った。
Ｎ末アミノ酸の配列、数種のリジルペプチダーゼ切断断
片のＮ末アミノ酸の配列を分析し、その配列に対応する
DNAオリゴマーを作成する。通常のＤＮＡ単離法〔フェ
ノール法；バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ
(Biochim.Biophys.Acta)72、619 〜629(1963）〕によ
り、セルロモナス属に属するウリカーゼ生産菌の染色体
ＤＮＡを精製し、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として P
CR法により当該遺伝子の一部と考えられる DNA断片を増
幅し、この増幅 DNA断片をプラスミドベクター（ｐＵＣ
１９等）につなぎ、適当な宿主E. coli ＤＨ５α〔フ
ォーカス(Focus), 8, 9 (1986)〕等をコーエンらの方法
〔Cohen et.al.; プロシーヂング・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.) 、69、2110(1972)〕に従い形質転換し、得ら
れた形質転換体から組換え体プラスミドを常法に従い抽
出する。ジデオキシ法〔サイエンス(Science) 、 214 、
1205〜1210(1981)，ジーン(Gene)、 19、 269 〜276(198
2) 〕により挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が
上述の精製ウリカーゼのアミノ酸配列に相当することを
確認した後、適当な制限酵素で挿入断片を切り出し、こ
の DNA断片をウリカーゼ遺伝子クローン化用プローブと
して使用する。尚、プラスミド作成等の遺伝子工学的手
法は、Maniatisらの著書〔モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning)(1982) コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー(Cold Spring Habor Lab.)〕に従
って行った。
【００１５】セルロモナス属に属するウリカーゼ生産菌
の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばScaIにより消
化し、該制限酵素断片をベクターＤＮＡに組み込む。こ
の様にして作成したウリカーゼ生産菌のウリカーゼをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をつなぎこんだ組換え
体ＤＮＡを含む種々の組換え体混成物を用いて、コーエ
ンらの方法に従い、E. coliＤＨ５αを形質転換し、ジ
ーン・バンクを作成した。これらのジーン・バンクと上
述のプローブを用い、コロニー・ハイブリダイゼイショ
ン法により数個の陽性クローン得る。
の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばScaIにより消
化し、該制限酵素断片をベクターＤＮＡに組み込む。こ
の様にして作成したウリカーゼ生産菌のウリカーゼをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をつなぎこんだ組換え
体ＤＮＡを含む種々の組換え体混成物を用いて、コーエ
ンらの方法に従い、E. coliＤＨ５αを形質転換し、ジ
ーン・バンクを作成した。これらのジーン・バンクと上
述のプローブを用い、コロニー・ハイブリダイゼイショ
ン法により数個の陽性クローン得る。
【００１６】これらの陽性クローンをＬＢ培地〔１％ト
リプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム
（ｐＨ７．５）〕に培養後、遠心分離により菌体を集菌
し、充分に洗浄する。得られた菌体懸濁液を超音波処理
などにより処理し無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出
液を用い、上述のウリカーゼ活性測定法でウリカーゼ活
性の有無を調べ、ウリカーゼ活性を持つクローンを選択
する。この様にして得られた形質転換体からウリカーゼ
遺伝子を含有する組換え体プラスミドを抽出し、挿入Ｄ
ＮＡ断片の塩基配列を決定し、その配列中に上述の精製
ウリカーゼのアミノ酸配列の情報と矛盾しないオープン
リーディングフレームが存在することを確認する。かく
して、目的のウリカーゼ遺伝子がクローン化されたこと
になる。
リプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム
（ｐＨ７．５）〕に培養後、遠心分離により菌体を集菌
し、充分に洗浄する。得られた菌体懸濁液を超音波処理
などにより処理し無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出
液を用い、上述のウリカーゼ活性測定法でウリカーゼ活
性の有無を調べ、ウリカーゼ活性を持つクローンを選択
する。この様にして得られた形質転換体からウリカーゼ
遺伝子を含有する組換え体プラスミドを抽出し、挿入Ｄ
ＮＡ断片の塩基配列を決定し、その配列中に上述の精製
ウリカーゼのアミノ酸配列の情報と矛盾しないオープン
リーディングフレームが存在することを確認する。かく
して、目的のウリカーゼ遺伝子がクローン化されたこと
になる。
【００１７】該遺伝子を含有するＤＮＡ断片を担持する
ベクターとしては、エシェリヒア属菌種中で自律複製で
きるものであればファージ・ベクター、プラスミド・ベ
クターなどいずれでも使用できる。好適にはｐＢＲ３２
２〔ジーン(GENE)、２、95(1977)〕、ｐＵＣ１９〔ジー
ン(GENE)、33、103(1985）〕、ｐＴｒＳ３３（特開平2-
227075号公報〕などが例示される。
ベクターとしては、エシェリヒア属菌種中で自律複製で
きるものであればファージ・ベクター、プラスミド・ベ
クターなどいずれでも使用できる。好適にはｐＢＲ３２
２〔ジーン(GENE)、２、95(1977)〕、ｐＵＣ１９〔ジー
ン(GENE)、33、103(1985）〕、ｐＴｒＳ３３（特開平2-
227075号公報〕などが例示される。
【００１８】さらに、該遺伝子を多菌種の宿主・ベクタ
ー系を用いてサブクローニングすることにより、該遺伝
子を他菌種に導入することも可能である。宿主・ベクタ
ー系としては、従来知られているものは全て用いること
ができる。例として、セラチア属、コリネバクテリウム
属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチル
ス属などの宿主ベクター系があげられる。
ー系を用いてサブクローニングすることにより、該遺伝
子を他菌種に導入することも可能である。宿主・ベクタ
ー系としては、従来知られているものは全て用いること
ができる。例として、セラチア属、コリネバクテリウム
属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチル
ス属などの宿主ベクター系があげられる。
【００１９】上記のようにしてクローン化したウリカー
ゼ遺伝子を含むプラスミドpUSC3-5の制限酵素地図を第
３図に示す。第３図中、白抜きの太線で示した部分がウ
リカーゼ遺伝子であり、遺伝子の転写は図中HindIII 部
位から BamHI部位方向に行われる。構造遺伝子の塩基配
列は配列番号２に示す通りであり、配列はジデオキシ法
にて決定された。
ゼ遺伝子を含むプラスミドpUSC3-5の制限酵素地図を第
３図に示す。第３図中、白抜きの太線で示した部分がウ
リカーゼ遺伝子であり、遺伝子の転写は図中HindIII 部
位から BamHI部位方向に行われる。構造遺伝子の塩基配
列は配列番号２に示す通りであり、配列はジデオキシ法
にて決定された。
【００２０】本発明者らは、ウリカーゼを高発現するた
めに種々検討した結果、コードするアミノ酸を変化させ
ることなくウリカーゼ遺伝子の塩基を数カ所変化させた
遺伝子（第５図参照）をE. coliトリプトファンプロモ
ーターの下流に接続することにより、ウリカーゼの高発
現化に成功した。高発現型プラスミドｐＵＴ１１８の概
要を第５図に示す。
めに種々検討した結果、コードするアミノ酸を変化させ
ることなくウリカーゼ遺伝子の塩基を数カ所変化させた
遺伝子（第５図参照）をE. coliトリプトファンプロモ
ーターの下流に接続することにより、ウリカーゼの高発
現化に成功した。高発現型プラスミドｐＵＴ１１８の概
要を第５図に示す。
【００２１】ｐＵＴ１１８を適当な宿主細菌に導入し、
その組換え菌を通常の細菌の培養方法に従い培養し、ウ
リカーゼ高含有菌体を取得する。この菌体から一般の酵
素採取法に従い精製ウリカーゼを取得する。宿主に用い
る細菌としては、E. coliＤＨ５αなどが適している。
ウリカーゼ高発現化株の例として、エシェリヒア・コリ
（ Escherichia coli )ＤＨＵＴ１１８があげられる。
本菌株は平成３年１１月５日付で微工研にブダペスト条
約の条件でＦＥＲＭ ＢＰ−３６４２として寄託されて
いる。エシェリヒア・コリＤＨＵＴ１１８の培養および
培養物からのウリカーゼの単離は前記セルロモナス属に
属する微生物を用いる場合と同様である。
その組換え菌を通常の細菌の培養方法に従い培養し、ウ
リカーゼ高含有菌体を取得する。この菌体から一般の酵
素採取法に従い精製ウリカーゼを取得する。宿主に用い
る細菌としては、E. coliＤＨ５αなどが適している。
ウリカーゼ高発現化株の例として、エシェリヒア・コリ
（ Escherichia coli )ＤＨＵＴ１１８があげられる。
本菌株は平成３年１１月５日付で微工研にブダペスト条
約の条件でＦＥＲＭ ＢＰ−３６４２として寄託されて
いる。エシェリヒア・コリＤＨＵＴ１１８の培養および
培養物からのウリカーゼの単離は前記セルロモナス属に
属する微生物を用いる場合と同様である。
【００２２】得られた精製酵素のアミノ酸配列は次の様
にして求められる。本酵素標品を、逆相HPLC（YMC-AM31
2, 0.1%TFA−アセトニトリルのグラジエント溶出）で脱
塩した後、アミノ酸シークエンサー４７０Ａ型（アプラ
イドバイオシステム社）を用い、Ｎ末アミノ酸２２残基
の配列を決定したところ、配列番号２の塩基配列より予
想されるアミノ酸配列（配列番号１）と一致した。本酵
素の第一アミノ酸のメチオニンは切除されていた。また
リジルエンドペプチダーゼにて本酵素を分解したペプチ
ド群から２種類のペプチドを分離取得し、アミノ酸配列
を先と同様の方法で決定したところ、一方は、配列番号
１に示したアミノ酸配列の１６９番目のSer から１８３
番目のThr までの配列と、他方は、２４３番目のAla か
ら２５４番目のIle までの配列（アミノ酸配列Ａ）と一
致した。
にして求められる。本酵素標品を、逆相HPLC（YMC-AM31
2, 0.1%TFA−アセトニトリルのグラジエント溶出）で脱
塩した後、アミノ酸シークエンサー４７０Ａ型（アプラ
イドバイオシステム社）を用い、Ｎ末アミノ酸２２残基
の配列を決定したところ、配列番号２の塩基配列より予
想されるアミノ酸配列（配列番号１）と一致した。本酵
素の第一アミノ酸のメチオニンは切除されていた。また
リジルエンドペプチダーゼにて本酵素を分解したペプチ
ド群から２種類のペプチドを分離取得し、アミノ酸配列
を先と同様の方法で決定したところ、一方は、配列番号
１に示したアミノ酸配列の１６９番目のSer から１８３
番目のThr までの配列と、他方は、２４３番目のAla か
ら２５４番目のIle までの配列（アミノ酸配列Ａ）と一
致した。
【００２３】さらに、上記の脱塩標品(1 nmol)を過蟻酸
酸化（−４℃、２時間）し、減圧乾固後、Hydraclub S-
204 （ホーネン製）を用いて９５℃で２時間ヒドラジン
分解した。その後、減圧にてヒドラジンを除去し、分解
物中のヒドラジットをベンズアルデヒドと反応させ遠心
分離して除いた。上清をアミノ酸分析（OPA・プレカラ
ム法）したところ約３００pmolのシステイン酸が検出さ
れた。この結果から、本酵素標品のＣ末アミノ酸残基が
システインであることが同定された。以上のことから本
酵素のアミノ酸配列は、配列番号２に示した塩基配列か
ら予想されるアミノ酸配列（配列番号１）と一致してい
ると予想できる。ウリカーゼの高発現化のために遺伝子
工学的手法による変異導入を検討したところ、配列番号
２において、ウリカーゼのＮ末に相当する配列番号３の
塩基配列を、コードするアミノ酸に変化が生じないよう
に配列番号４の塩基配列のごとく変化して生産した酵素
においても、アミノ酸配列には変化はなく、ウリカーゼ
を高発現することがわかった。
酸化（−４℃、２時間）し、減圧乾固後、Hydraclub S-
204 （ホーネン製）を用いて９５℃で２時間ヒドラジン
分解した。その後、減圧にてヒドラジンを除去し、分解
物中のヒドラジットをベンズアルデヒドと反応させ遠心
分離して除いた。上清をアミノ酸分析（OPA・プレカラ
ム法）したところ約３００pmolのシステイン酸が検出さ
れた。この結果から、本酵素標品のＣ末アミノ酸残基が
システインであることが同定された。以上のことから本
酵素のアミノ酸配列は、配列番号２に示した塩基配列か
ら予想されるアミノ酸配列（配列番号１）と一致してい
ると予想できる。ウリカーゼの高発現化のために遺伝子
工学的手法による変異導入を検討したところ、配列番号
２において、ウリカーゼのＮ末に相当する配列番号３の
塩基配列を、コードするアミノ酸に変化が生じないよう
に配列番号４の塩基配列のごとく変化して生産した酵素
においても、アミノ酸配列には変化はなく、ウリカーゼ
を高発現することがわかった。
【００２４】以下に実施例を示す。
【００２５】
実施例１ セルロモナス・フラビジェナＳＫ−４（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１５７５）を用いるウリカーゼの製造 セルロモナス・フラビジェナＳＫ−４を培地〔ペプトン
１．０％、コーンスティープリカー１．０％、サンヨー
核酸（山陽国策パルプ社製）０．５％、肉エキス０．５
％、酵母エキス０．３％、シュークロース０．７％、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
０．０５％（ｐＨ７．２）〕３００ｍｌを含む三角フ
ラスコに植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。得ら
れた培養物の一部を遠心分離し、湿菌体約１０ｇを得
た。これを１００ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭ ほう酸−炭
酸ナトリウム−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）；以
下、緩衝液ａという〕に懸濁し、超音波破砕機（ブラン
ソン社製）にて菌体を破砕した。破砕液を遠心分離し、
上清１００ｍｌを得た。得られた上清を予め緩衝液ａに
て平衡化したＨＰＡ−７５カラム（三菱化成社製；ハイ
ポーラス型強塩基性陰イオン交換樹脂）に通塔した後、
該樹脂量の５倍量の０．５Ｍ酢酸アンモニウムを含む緩
衝液ａで洗浄した。その後、該樹脂量の５倍量の０．３
Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液ａでウリカーゼ活性画
分を溶出した。このウリカーゼ活性画分を緩衝液ａで透
析後、終濃度１．１Ｍになるように硫酸アンモニウムを
添加し、水酸化カリウム溶液でｐＨ８．５に調整した。
この溶液を、予め１．１Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝
液ａ（開始緩衝液１）にて平衡化したＢｕｔｙｌトヨパ
ール６５０Ｃカラム（東ソー社製）に通塔後、充分量の
開始緩衝液１で洗浄した。次いで、１．１Ｍ→０Ｍの硫
酸アンモニウム直線濃度勾配を有す緩衝液ａでタンパク
を溶出し、ウリカーゼ活性画分を採取した。このウリカ
ーゼ活性画分を緩衝液ａで透析、脱塩し、最終的に、１
００Ｕのウリカーゼを取得した。
ＥＲＭ ＢＰ−１５７５）を用いるウリカーゼの製造 セルロモナス・フラビジェナＳＫ−４を培地〔ペプトン
１．０％、コーンスティープリカー１．０％、サンヨー
核酸（山陽国策パルプ社製）０．５％、肉エキス０．５
％、酵母エキス０．３％、シュークロース０．７％、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
０．０５％（ｐＨ７．２）〕３００ｍｌを含む三角フ
ラスコに植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。得ら
れた培養物の一部を遠心分離し、湿菌体約１０ｇを得
た。これを１００ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭ ほう酸−炭
酸ナトリウム−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）；以
下、緩衝液ａという〕に懸濁し、超音波破砕機（ブラン
ソン社製）にて菌体を破砕した。破砕液を遠心分離し、
上清１００ｍｌを得た。得られた上清を予め緩衝液ａに
て平衡化したＨＰＡ−７５カラム（三菱化成社製；ハイ
ポーラス型強塩基性陰イオン交換樹脂）に通塔した後、
該樹脂量の５倍量の０．５Ｍ酢酸アンモニウムを含む緩
衝液ａで洗浄した。その後、該樹脂量の５倍量の０．３
Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液ａでウリカーゼ活性画
分を溶出した。このウリカーゼ活性画分を緩衝液ａで透
析後、終濃度１．１Ｍになるように硫酸アンモニウムを
添加し、水酸化カリウム溶液でｐＨ８．５に調整した。
この溶液を、予め１．１Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝
液ａ（開始緩衝液１）にて平衡化したＢｕｔｙｌトヨパ
ール６５０Ｃカラム（東ソー社製）に通塔後、充分量の
開始緩衝液１で洗浄した。次いで、１．１Ｍ→０Ｍの硫
酸アンモニウム直線濃度勾配を有す緩衝液ａでタンパク
を溶出し、ウリカーゼ活性画分を採取した。このウリカ
ーゼ活性画分を緩衝液ａで透析、脱塩し、最終的に、１
００Ｕのウリカーゼを取得した。
【００２６】実施例２ セルロモナス・フラビジェナ
ＳＫ−４の染色体ＤＮＡの単離 実施例１で得られたセルロモナス・フラビジェナＳＫ−
４の培養菌体約１５ｇを２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１２０ｍｌに懸濁した。
この懸濁液にリゾチーム溶液〔リゾチームを２０ｍｇ／
ｍｌの割合で、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解したもの〕１５ｍｌを
加え、３０℃で１時間放置した。これに２０％ラウリル
硫酸ナトリウム溶液１５ｍｌを加え、ゆっくりと攪拌し
た。次にこの溶液に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．５）を飽和したフェノール１５０
ｍｌを加え、充分に攪拌した。この溶液を遠心分離にか
け、水層１５０ｍｌを分取した。ついで、このフェノー
ル抽出の操作を３回繰り返した。得られた水層１５０ｍ
ｌに２．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液１５ｍｌを加えた後、
さらにエタノール３００ｍｌを加えた。析出した染色体
ＤＮＡをガラス棒にて巻取り、乾燥した。次いで、これ
を１ｍｌＥＤＴＡを含む１０ｍｌトリス緩衝液（ｐＨ
７．５）３０ｍｌに溶解した。これにリボヌクレアーゼ
を５０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で３０分間
放置した。前述と同様のフェノール抽出操作を行なった
後、水層に２．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液３ｍｌおよびエ
タノール６０ｍｌを加えた後、−２０℃にて１６時間放
置した。遠心分離し、得られたペレットを７０％エタノ
ール溶液にて洗浄し、乾燥させ精製染色体ＤＮＡを得
た。これを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．５）に懸濁し、−２０℃で保存した。
ＳＫ−４の染色体ＤＮＡの単離 実施例１で得られたセルロモナス・フラビジェナＳＫ−
４の培養菌体約１５ｇを２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１２０ｍｌに懸濁した。
この懸濁液にリゾチーム溶液〔リゾチームを２０ｍｇ／
ｍｌの割合で、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解したもの〕１５ｍｌを
加え、３０℃で１時間放置した。これに２０％ラウリル
硫酸ナトリウム溶液１５ｍｌを加え、ゆっくりと攪拌し
た。次にこの溶液に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．５）を飽和したフェノール１５０
ｍｌを加え、充分に攪拌した。この溶液を遠心分離にか
け、水層１５０ｍｌを分取した。ついで、このフェノー
ル抽出の操作を３回繰り返した。得られた水層１５０ｍ
ｌに２．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液１５ｍｌを加えた後、
さらにエタノール３００ｍｌを加えた。析出した染色体
ＤＮＡをガラス棒にて巻取り、乾燥した。次いで、これ
を１ｍｌＥＤＴＡを含む１０ｍｌトリス緩衝液（ｐＨ
７．５）３０ｍｌに溶解した。これにリボヌクレアーゼ
を５０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で３０分間
放置した。前述と同様のフェノール抽出操作を行なった
後、水層に２．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液３ｍｌおよびエ
タノール６０ｍｌを加えた後、−２０℃にて１６時間放
置した。遠心分離し、得られたペレットを７０％エタノ
ール溶液にて洗浄し、乾燥させ精製染色体ＤＮＡを得
た。これを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．５）に懸濁し、−２０℃で保存した。
【００２７】実施例３ ウリカーゼ遺伝子クローニン
グ用のプローブの調製 １）プローブ用ＤＮＡ断片の増幅 上述のアミノ酸配列のデータをもとにそのアミノ酸配列
に対応する配列番号５のＰＣＲ用５’側プライマー（Ｎ
末付近の配列に対応）と配列番号６の３’側プライマー
を設計し（アミノ酸配列Ａ）、リン酸アミダイド法によ
る固相合成法［S.L.Beaucageら、テトラヘドロン・レタ
ー(Tetrahedron Lett.)、22, 1859 (1981）］に従い、
ＤＮＡ自動合成機３８０Ａ（アプライドバイオシステム
社製）を用いて合成した。ＰＣＲはジーンＡｍｐＤＮＡ
アンプリフィケーションリージェントキット（宝酒造社
製）を用い、前記で調製したセルロモナス・フラビジェ
ナの染色体ＤＮＡ １ng／１００μl を鋳型として、下
記の合成ＤＮＡ各１．０μM をプライマーとして、ｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰを各２００μＭ、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ／１００μｌにし
て９４℃で1.５分間、４０℃で２分間、７２℃で２分間
の反応を３０回繰り返し、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を
取得した。
グ用のプローブの調製 １）プローブ用ＤＮＡ断片の増幅 上述のアミノ酸配列のデータをもとにそのアミノ酸配列
に対応する配列番号５のＰＣＲ用５’側プライマー（Ｎ
末付近の配列に対応）と配列番号６の３’側プライマー
を設計し（アミノ酸配列Ａ）、リン酸アミダイド法によ
る固相合成法［S.L.Beaucageら、テトラヘドロン・レタ
ー(Tetrahedron Lett.)、22, 1859 (1981）］に従い、
ＤＮＡ自動合成機３８０Ａ（アプライドバイオシステム
社製）を用いて合成した。ＰＣＲはジーンＡｍｐＤＮＡ
アンプリフィケーションリージェントキット（宝酒造社
製）を用い、前記で調製したセルロモナス・フラビジェ
ナの染色体ＤＮＡ １ng／１００μl を鋳型として、下
記の合成ＤＮＡ各１．０μM をプライマーとして、ｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰを各２００μＭ、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ／１００μｌにし
て９４℃で1.５分間、４０℃で２分間、７２℃で２分間
の反応を３０回繰り返し、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を
取得した。
【００２８】２）プローブＤＮＡ断片のクローニング 上記のごとく反応して得られたＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片
１μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃ
ｏＲＩを加えて消化を行った。別にベクターｐＵＣ１９
１μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥ
ｃｏＲＩを加えて消化した。消化された上記ＤＮＡ断片
およびベクターＤＮＡをフェノール抽出およびエタノー
ル沈澱操作により精製した。精製ＤＮＡ１００ｎｇおよ
び精製ベクターＤＮＡ２０ｎｇを６６ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ
ＤＴＴおよび０．１ｍＭ ＡＴＰを含有する溶液に懸
濁した。これにＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を１
０Ｕ添加した後、１４℃で１６時間反応させ、両方のＤ
ＮＡを連結させ、組換えＤＮＡを得た。
１μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃ
ｏＲＩを加えて消化を行った。別にベクターｐＵＣ１９
１μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥ
ｃｏＲＩを加えて消化した。消化された上記ＤＮＡ断片
およびベクターＤＮＡをフェノール抽出およびエタノー
ル沈澱操作により精製した。精製ＤＮＡ１００ｎｇおよ
び精製ベクターＤＮＡ２０ｎｇを６６ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ
ＤＴＴおよび０．１ｍＭ ＡＴＰを含有する溶液に懸
濁した。これにＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を１
０Ｕ添加した後、１４℃で１６時間反応させ、両方のＤ
ＮＡを連結させ、組換えＤＮＡを得た。
【００２９】E. coliＤＨ５α株をＬＢ液体培地５０ｍ
ｌを含む三角フラスコに植菌し、３７℃で４時間振盪培
養した。ついで遠心分離（３０００rpm 、７分間）して
集めた菌体を０℃の５０ｍＭ塩化カルシウム溶液２０ｍ
ｌに懸濁し０℃にて２０分静置した後、上記と同様の遠
心分離にて集菌し、０℃、５０ｍＭの塩化カルシウム溶
液４０ｍｌに懸濁した。この懸濁液と上述の組換え体Ｄ
ＮＡを含む溶液を混ぜた後、０℃で１０分間静置した。
次いで４２℃で９０秒間熱処理した後、この混合液を１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２０μｇ／ｍｌの５−
ブロモ−４−クロロ−インドリル−β−ガラクトサイド
（Ｘｇａｌ）を含むＬＢ寒天平板培地に塗布した。この
平板培地を３７℃にて約２４時間保温した。
ｌを含む三角フラスコに植菌し、３７℃で４時間振盪培
養した。ついで遠心分離（３０００rpm 、７分間）して
集めた菌体を０℃の５０ｍＭ塩化カルシウム溶液２０ｍ
ｌに懸濁し０℃にて２０分静置した後、上記と同様の遠
心分離にて集菌し、０℃、５０ｍＭの塩化カルシウム溶
液４０ｍｌに懸濁した。この懸濁液と上述の組換え体Ｄ
ＮＡを含む溶液を混ぜた後、０℃で１０分間静置した。
次いで４２℃で９０秒間熱処理した後、この混合液を１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２０μｇ／ｍｌの５−
ブロモ−４−クロロ−インドリル−β−ガラクトサイド
（Ｘｇａｌ）を含むＬＢ寒天平板培地に塗布した。この
平板培地を３７℃にて約２４時間保温した。
【００３０】出現したコロニーのうちの白色コロニーを
別々にＬＢ液体培地で培養し、集菌した後、常法により
プラスミドＤＮＡを抽出し、クローン化されたＤＮＡ断
片の塩基配列をジデオキシ法にて決定した。その結果、
配列番号１に示したアミノ酸配列に対応する塩基配列が
存在し、クローン化されたＤＮＡ断片はウリカーゼ遺伝
子のクローニング用プローブとして適していることがわ
かった。
別々にＬＢ液体培地で培養し、集菌した後、常法により
プラスミドＤＮＡを抽出し、クローン化されたＤＮＡ断
片の塩基配列をジデオキシ法にて決定した。その結果、
配列番号１に示したアミノ酸配列に対応する塩基配列が
存在し、クローン化されたＤＮＡ断片はウリカーゼ遺伝
子のクローニング用プローブとして適していることがわ
かった。
【００３１】 実施例４ ウリカーゼ遺伝子のクローニング １）ジーン・バンクの調製 実施例２で調製した染色体ＤＮＡ １μｇを含む溶液に
ＳｃａＩを加えて消化を行った。別にベクターｐＵＣ１
９ １μｇを含む溶液にＳｍａＩを加えて消化を行った
後、消化液２０μｌに１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）
およびアルカリフォスファターゼ１０Ｕを加え、６５℃
で１時間処理した。消化された染色体ＤＮＡおよびベク
ターＤＮＡを常法によりフェノール抽出およびエタノー
ル沈澱操作を行い精製した。精製染色体ＤＮＡ１００ｎ
ｇおよび精製ベクターＤＮＡ２０ｎｇを６６ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１
０ｍＭ ＤＴＴおよび０．１ｍＭ ＡＴＰを含有する溶
液３０μｌに溶解した後、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）を１０Ｕ添加し、１４℃で１６時間反応
させ、両方のＤＮＡを連結させ組換えＤＮＡをえた。
ＳｃａＩを加えて消化を行った。別にベクターｐＵＣ１
９ １μｇを含む溶液にＳｍａＩを加えて消化を行った
後、消化液２０μｌに１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）
およびアルカリフォスファターゼ１０Ｕを加え、６５℃
で１時間処理した。消化された染色体ＤＮＡおよびベク
ターＤＮＡを常法によりフェノール抽出およびエタノー
ル沈澱操作を行い精製した。精製染色体ＤＮＡ１００ｎ
ｇおよび精製ベクターＤＮＡ２０ｎｇを６６ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１
０ｍＭ ＤＴＴおよび０．１ｍＭ ＡＴＰを含有する溶
液３０μｌに溶解した後、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）を１０Ｕ添加し、１４℃で１６時間反応
させ、両方のＤＮＡを連結させ組換えＤＮＡをえた。
【００３２】２）コロニーハイブリダイゼイション 実施例３の２）項で調製したプローブ用ＤＮＡ １μｇ
をノンラジオシステムＤＮＡ標識および検出キット（Ｄ
ＩＧ−ＥＬＩＳＡ法、カタログ番号１０９３６５７；ベ
ーリンガー・マンハイム社製）に従い標識し、これをウ
リカーゼ検出用プローブとした。
をノンラジオシステムＤＮＡ標識および検出キット（Ｄ
ＩＧ−ＥＬＩＳＡ法、カタログ番号１０９３６５７；ベ
ーリンガー・マンハイム社製）に従い標識し、これをウ
リカーゼ検出用プローブとした。
【００３３】次に、E. coliＤＨ５α株をＬＢ液体培地
５０ｍｌを含む三角フラスコに植菌し３７℃で４時間振
盪培養した。ついで遠心分離（３００rpm 、７分間）し
て集めた菌体を０℃の５０ｍＭ塩化カルシウム溶液２０
ｍｌに懸濁し、０℃にて２０分静置した後、前記と同様
に遠心分離にて集菌し、０℃、５０ｍＭの塩化カルシウ
ム溶液４０ｍｌに懸濁した。その懸濁液と上記の組換え
体ＤＮＡを含む溶液を混ぜ０℃で１０分間静置した。次
いで４２℃で９０秒間熱処理した後、この混合液を１０
０μｇ／ｍｌのアンピシリンと２０μｇ／ｍｌのＸｇａ
ｌを含むＬＢ寒天平板培地に塗布した。この平板培地を
３７℃にて約２４時間保温した。
５０ｍｌを含む三角フラスコに植菌し３７℃で４時間振
盪培養した。ついで遠心分離（３００rpm 、７分間）し
て集めた菌体を０℃の５０ｍＭ塩化カルシウム溶液２０
ｍｌに懸濁し、０℃にて２０分静置した後、前記と同様
に遠心分離にて集菌し、０℃、５０ｍＭの塩化カルシウ
ム溶液４０ｍｌに懸濁した。その懸濁液と上記の組換え
体ＤＮＡを含む溶液を混ぜ０℃で１０分間静置した。次
いで４２℃で９０秒間熱処理した後、この混合液を１０
０μｇ／ｍｌのアンピシリンと２０μｇ／ｍｌのＸｇａ
ｌを含むＬＢ寒天平板培地に塗布した。この平板培地を
３７℃にて約２４時間保温した。
【００３４】上記平板培地上にコロニーが形成された
後、この上にナイトラン膜などのメンブラン・フィルタ
ーＮＹ１３Ｎ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｅｕｌｌ
社製）をのせ、すぐに剥離した。これをうらがえして、
新しい１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天
平板培地に載せ、３７℃にて約１２時間保温した。上面
にコロニーが形成したメンブラン・フィルターを、平板
培地より剥離し、０．５Ｎ ＮａＯＨを含む濾紙上に１
０分間、０．５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．３）含む濾紙
上に５分間、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．５Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ７．３）含む濾紙上に５分間、２×ＳＳＣ
（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸三ナトリウ
ム、ｐＨ７．０）含む濾紙上に５分間、順次静置した
後、８０℃で約３時間加熱した。このメンブラン・フィ
ルターをノンラジオシステムＤＮＡ標識及び検出キット
（ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ法、カタログ番号 １０９３６５
７）に従い処理し、上記ウリカーゼ検出用プローブにて
検出した。この一連の操作により約１００００コロニー
から４株の陽性クローン（形質転換体）を得た。
後、この上にナイトラン膜などのメンブラン・フィルタ
ーＮＹ１３Ｎ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｅｕｌｌ
社製）をのせ、すぐに剥離した。これをうらがえして、
新しい１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天
平板培地に載せ、３７℃にて約１２時間保温した。上面
にコロニーが形成したメンブラン・フィルターを、平板
培地より剥離し、０．５Ｎ ＮａＯＨを含む濾紙上に１
０分間、０．５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．３）含む濾紙
上に５分間、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．５Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ７．３）含む濾紙上に５分間、２×ＳＳＣ
（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸三ナトリウ
ム、ｐＨ７．０）含む濾紙上に５分間、順次静置した
後、８０℃で約３時間加熱した。このメンブラン・フィ
ルターをノンラジオシステムＤＮＡ標識及び検出キット
（ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ法、カタログ番号 １０９３６５
７）に従い処理し、上記ウリカーゼ検出用プローブにて
検出した。この一連の操作により約１００００コロニー
から４株の陽性クローン（形質転換体）を得た。
【００３５】３）クローン化遺伝子の確認 上記検出で陽性であった形質転換体を、１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリン含むＬＢ培地１０ｍｌを入れた試験管
に植菌し、３７℃にて約２４時間振盪培養した。培養物
から、遠心分離により培養菌体を得、無細胞抽出液を調
製した。かくして得られた無細胞抽出液を用いウリカー
ゼ活性を測定したところ、２〜４Ｕ／ｍｇ蛋白の活性が
検出された。さらに、上記の集菌菌体から常法に従いプ
ラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミド１μｇを含
む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを加
えて消化を行った。この反応液を０．５μｇ/ｍｌエチ
ジウムブロマイドを含む０．８％アガロース・ゲルにて
電気泳動を行い、挿入断片の断片長を測定し、常法に従
いナイトラン膜などのメンブラン・フィルターに移し
た。このメンブラン・フィルターをノンラジオシステム
ＤＮＡ標識及び検出キット（ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ法、カ
タログ番号 １０９３６５７）に従い処理し、上記ウリ
カーゼ検出用プローブにて検出した結果、すべて陽性を
示した。
ｌのアンピシリン含むＬＢ培地１０ｍｌを入れた試験管
に植菌し、３７℃にて約２４時間振盪培養した。培養物
から、遠心分離により培養菌体を得、無細胞抽出液を調
製した。かくして得られた無細胞抽出液を用いウリカー
ゼ活性を測定したところ、２〜４Ｕ／ｍｇ蛋白の活性が
検出された。さらに、上記の集菌菌体から常法に従いプ
ラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミド１μｇを含
む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを加
えて消化を行った。この反応液を０．５μｇ/ｍｌエチ
ジウムブロマイドを含む０．８％アガロース・ゲルにて
電気泳動を行い、挿入断片の断片長を測定し、常法に従
いナイトラン膜などのメンブラン・フィルターに移し
た。このメンブラン・フィルターをノンラジオシステム
ＤＮＡ標識及び検出キット（ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ法、カ
タログ番号 １０９３６５７）に従い処理し、上記ウリ
カーゼ検出用プローブにて検出した結果、すべて陽性を
示した。
【００３６】これらの陽性であった形質転換体から１つ
を選び、常法に従いプラスミドを抽出後、クローン化さ
れたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その結果、陽性
形質転換体のプラスミド中にクローン化されたＤＮＡに
は上述のアミノ酸配列の結果と矛盾しないオープンリー
ディングフレームが存在し、ウリカーゼの構造遺伝子を
含んでいることを確認した。このプラスミド中のウリカ
ーゼ構造遺伝子は配列番号２に示す通りである。
を選び、常法に従いプラスミドを抽出後、クローン化さ
れたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その結果、陽性
形質転換体のプラスミド中にクローン化されたＤＮＡに
は上述のアミノ酸配列の結果と矛盾しないオープンリー
ディングフレームが存在し、ウリカーゼの構造遺伝子を
含んでいることを確認した。このプラスミド中のウリカ
ーゼ構造遺伝子は配列番号２に示す通りである。
【００３７】得られたウリカーゼをコードする遺伝子を
含む組換え体プラスミドをｐＵＳＣ３−５と命名した。
このｐＵＳＣ３−５の制限酵素地図を第３図に示す。
含む組換え体プラスミドをｐＵＳＣ３−５と命名した。
このｐＵＳＣ３−５の制限酵素地図を第３図に示す。
【００３８】実施例５ ウリカーゼ高発現プラスミド
の造成および微生物への導入 実施例４で得られたウリカーゼ構造遺伝子の上流にトリ
プトファンプロモーター配列およびｔｒｐＬのＳＤ配列
を導入するために、配列番号７のＰＣＲ用５’側プライ
マーと配列番号８の３’側プライマーを合成した。これ
らのプライマーを用い、ｐＵＳＣ３−５のＥｃｏＲＩ消
化物を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ
反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液２０μｌおよびベク
ターｐＴｒＳ３３ １μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎ
ｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを加えて消化を行った。消化
された上記ＤＮＡ断片およびベクターＤＮＡを連結さ
せ、プラスミドｐＵＴ２１を作成した。このプラスミド
ｐＵＴ２１をE. coliＤＨ５αに導入し、ウリカーゼ発
現株〔ＤＨ５α（ｐＵＴ２１）〕を得た。本株を後記実
施例６に記載されている方法で培養したが、ウリカーゼ
の発現量は５０Ｕ／ｍｌであり満足できるものではなか
った。
の造成および微生物への導入 実施例４で得られたウリカーゼ構造遺伝子の上流にトリ
プトファンプロモーター配列およびｔｒｐＬのＳＤ配列
を導入するために、配列番号７のＰＣＲ用５’側プライ
マーと配列番号８の３’側プライマーを合成した。これ
らのプライマーを用い、ｐＵＳＣ３−５のＥｃｏＲＩ消
化物を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ
反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液２０μｌおよびベク
ターｐＴｒＳ３３ １μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎ
ｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを加えて消化を行った。消化
された上記ＤＮＡ断片およびベクターＤＮＡを連結さ
せ、プラスミドｐＵＴ２１を作成した。このプラスミド
ｐＵＴ２１をE. coliＤＨ５αに導入し、ウリカーゼ発
現株〔ＤＨ５α（ｐＵＴ２１）〕を得た。本株を後記実
施例６に記載されている方法で培養したが、ウリカーゼ
の発現量は５０Ｕ／ｍｌであり満足できるものではなか
った。
【００３９】そこで、ベクターｐＴｒＳ３３のＳＤ配列
をＬａｃＺのＳＤ配列に変更するために、配列番号９の
ＰＣＲ用５’側プライマーと配列番号１０の３’側プラ
イマーを合成した。これらのプライマーを用いｐＴｒＳ
３３のＰｓｔＩ消化物を鋳型としてＰＣＲ反応を行っ
た。得られたＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液
２０μｌおよびベクターｐＴｒＳ３３ １μｇを含む溶
液２０μｌにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを加えて
消化を行った。消化された上記ＤＮＡ断片およびベクタ
ーＤＮＡを連結させ、プラスミドｐＴＬ３３を作成し
た。
をＬａｃＺのＳＤ配列に変更するために、配列番号９の
ＰＣＲ用５’側プライマーと配列番号１０の３’側プラ
イマーを合成した。これらのプライマーを用いｐＴｒＳ
３３のＰｓｔＩ消化物を鋳型としてＰＣＲ反応を行っ
た。得られたＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液
２０μｌおよびベクターｐＴｒＳ３３ １μｇを含む溶
液２０μｌにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを加えて
消化を行った。消化された上記ＤＮＡ断片およびベクタ
ーＤＮＡを連結させ、プラスミドｐＴＬ３３を作成し
た。
【００４０】さらに、ウリカーゼのＮ末に相当する配列
番号３の塩基配列を、コードするアミノ酸に変化が生じ
ないように配列番号４の塩基配列に変更し、また、スト
ップ・コドンをＴＧＡからＴＡＡＴＡＡ（二重ストップ
・コドン）に置換し、ウリカーゼの構造遺伝子以外のセ
ルロモナス・フラビジェナ由来のＤＮＡを削除したもの
を得るために、配列番号１１のＰＣＲ用５’側プライマ
ーと配列番号１２の３’側プライマーを合成した。
番号３の塩基配列を、コードするアミノ酸に変化が生じ
ないように配列番号４の塩基配列に変更し、また、スト
ップ・コドンをＴＧＡからＴＡＡＴＡＡ（二重ストップ
・コドン）に置換し、ウリカーゼの構造遺伝子以外のセ
ルロモナス・フラビジェナ由来のＤＮＡを削除したもの
を得るために、配列番号１１のＰＣＲ用５’側プライマ
ーと配列番号１２の３’側プライマーを合成した。
【００４１】このプライマーを用いｐＵＴ２１のＥｃｏ
ＲＩ消化物を鋳型として、ＰＣＲ反応を行った。得られ
たＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液２０μｌお
よびベクタープラスミドｐＴＬ３３ １μｇを含む溶液
２０μｌににＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを加えて
消化を行った。消化された上記ＤＮＡ断片およびベクタ
ーＤＮＡを連結させ、プラスミドｐＵＴ１１８を作成し
た。このプラスミドｐＵＴ１１８をE. coliＤＨ５αに
導入し、ウリカーゼ高発現株〔ＤＨ５α（ｐＵＴ１１
８）〕（エシェリヒア・コリＤＨＵＴ１１８）を得た。
本株を後記実施例６に記載されている方法で培養した結
果、２００Ｕ／ｍｌのウリカーゼを生産した。
ＲＩ消化物を鋳型として、ＰＣＲ反応を行った。得られ
たＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液２０μｌお
よびベクタープラスミドｐＴＬ３３ １μｇを含む溶液
２０μｌににＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを加えて
消化を行った。消化された上記ＤＮＡ断片およびベクタ
ーＤＮＡを連結させ、プラスミドｐＵＴ１１８を作成し
た。このプラスミドｐＵＴ１１８をE. coliＤＨ５αに
導入し、ウリカーゼ高発現株〔ＤＨ５α（ｐＵＴ１１
８）〕（エシェリヒア・コリＤＨＵＴ１１８）を得た。
本株を後記実施例６に記載されている方法で培養した結
果、２００Ｕ／ｍｌのウリカーゼを生産した。
【００４２】 実施例６ ウリカーゼ高発現微生物の培養 実施例５で得られたエシェリヒア・コリＤＨＵＴ１１８
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６４２）を培養する場合には、高
密度培養法〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエン
ジニアリング(Biotechnol.Bioeng. ) 17、227〜239、(1
975)〕が好適であり、以下の様に行った。エシェリヒア
・コリＤＨＵＴ１１８を下記組成からなる種培地５００
ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間培養した。 種培地組成：ＫＨ2 ＰＯ4 ３．５ｇ／ｌ、（ＮＨ4 ）
2 ＨＰＯ4 ３．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
１．０ｇ／ｌ、グルコース ５．０ｇ／ｌ、酵母エキス
５．０ｇ／ｌ、微量元素液 ３ｍｌ／ｌ（１２０℃、
３０分間蒸煮滅菌）。微量元素液組成：ＦｅＣｌ3 ・６
Ｈ2 Ｏ ２７ｇ／ｌ、ＺｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ２ｇ／ｌ、
ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２
Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ、
ＣｕＣｌ2 １ｇ／ｌ、Ｈ3 ＢＯ3 ０．５ｇ／ｌ、濃Ｈ
Ｃｌ １００ｍｌ／ｌ。
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６４２）を培養する場合には、高
密度培養法〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエン
ジニアリング(Biotechnol.Bioeng. ) 17、227〜239、(1
975)〕が好適であり、以下の様に行った。エシェリヒア
・コリＤＨＵＴ１１８を下記組成からなる種培地５００
ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間培養した。 種培地組成：ＫＨ2 ＰＯ4 ３．５ｇ／ｌ、（ＮＨ4 ）
2 ＨＰＯ4 ３．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
１．０ｇ／ｌ、グルコース ５．０ｇ／ｌ、酵母エキス
５．０ｇ／ｌ、微量元素液 ３ｍｌ／ｌ（１２０℃、
３０分間蒸煮滅菌）。微量元素液組成：ＦｅＣｌ3 ・６
Ｈ2 Ｏ ２７ｇ／ｌ、ＺｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ２ｇ／ｌ、
ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２
Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ、
ＣｕＣｌ2 １ｇ／ｌ、Ｈ3 ＢＯ3 ０．５ｇ／ｌ、濃Ｈ
Ｃｌ １００ｍｌ／ｌ。
【００４３】次に、７．５リットル容量の発酵槽に３リ
ットルの発酵培地（上記組成からなる種培地３リットル
にさらにＫＨ2 ＰＯ4 ・３Ｈ2 Ｏ １０ｇおよびＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2 Ｏ ５ｇを加えて調製した培地）を封入
し、１２０℃で３０分間蒸煮滅菌した。５０％（Ｗ／
Ｖ）グルコース溶液１５０ｍｌを滅菌し、発酵槽に添加
した後、ＤＨＵＴ１１８株を培養した前記種培地５００
ｍｌを添加した。
ットルの発酵培地（上記組成からなる種培地３リットル
にさらにＫＨ2 ＰＯ4 ・３Ｈ2 Ｏ １０ｇおよびＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2 Ｏ ５ｇを加えて調製した培地）を封入
し、１２０℃で３０分間蒸煮滅菌した。５０％（Ｗ／
Ｖ）グルコース溶液１５０ｍｌを滅菌し、発酵槽に添加
した後、ＤＨＵＴ１１８株を培養した前記種培地５００
ｍｌを添加した。
【００４４】５．５Ｍアンモニア水を用いてｐＨ６．８
に調整しつつ、攪拌（６００ｒｐｍ）、通気（３ｌ／ｍ
ｉｎ）し、３３℃で２４時間培養を行った。培養開始後
４〜６時間で培養液中のグルコース濃度は２．５％以下
に低下した。この時点から５０％（Ｗ／Ｖ）グルコース
溶液を少量づつ連続的に発酵槽に添加し、培養液中のグ
ルコース濃度が２〜３％であるように保つた。
に調整しつつ、攪拌（６００ｒｐｍ）、通気（３ｌ／ｍ
ｉｎ）し、３３℃で２４時間培養を行った。培養開始後
４〜６時間で培養液中のグルコース濃度は２．５％以下
に低下した。この時点から５０％（Ｗ／Ｖ）グルコース
溶液を少量づつ連続的に発酵槽に添加し、培養液中のグ
ルコース濃度が２〜３％であるように保つた。
【００４５】本培養物中には、２００Ｕ／ｍｌのウリカ
ーゼが生産されていた。前記培養物の一部を遠心分離
し、湿菌体約１０ｇを得た。該湿菌体を緩衝液ａの１０
０ｍｌに懸濁し、超音波破砕機（ブランソン社製）にて
菌体を破砕した。破砕液を遠心分離し、上清１００ｍｌ
を得た。得られた上清に終濃度５０ｍＭとなるように硫
酸マグネシウムを添加し、水酸化カリウム溶液でｐＨ
８．５に調整した後、６０℃で３０分間保温した。この
液を遠心分離し、夾雑蛋白などを沈澱として除去した。
得られた上清を予め緩衝液ａにて平衡化したＤＥＡＥト
ヨパール６５０Ｓカラム（東ソー社製）（直径２．２ｃ
ｍ、長さ２０ｃｍ）に通塔した後、充分量の緩衝液ａで
洗浄した。その後、０Ｍ→０．４ＭのＮａＣｌ直線濃度
勾配を有す緩衝液ａ８００ｍｌで溶出しウリカーゼ活性
画分１００ｍｌを得た。このウリカーゼ活性画分を緩衝
液ａで透析後、終濃度１．５Ｍになるように硫酸アンモ
ニウムを添加し、水酸化カリウム溶液でｐＨ８．５に調
整した。この溶液を、予め１．５Ｍ硫酸アンモニウムを
含む緩衝液ａ（開始緩衝液２）にて平衡化したＢｕｔｙ
ｌトヨパール６５０Ｓカラム（直径２．２ｃｍ、長さ２
０ｃｍ）に通塔後、充分量の開始緩衝液２で洗浄した。
次いで、１．５Ｍ→０Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾
配を有す緩衝液ａ８００ｍｌでタンパクを溶出し、ウリ
カーゼ活性画分６０ｍｌを採取した。このウリカーゼ活
性画分を緩衝液ａで透析、脱塩し、最終的に、１５４０
０Ｕのウリカーゼを取得した。
ーゼが生産されていた。前記培養物の一部を遠心分離
し、湿菌体約１０ｇを得た。該湿菌体を緩衝液ａの１０
０ｍｌに懸濁し、超音波破砕機（ブランソン社製）にて
菌体を破砕した。破砕液を遠心分離し、上清１００ｍｌ
を得た。得られた上清に終濃度５０ｍＭとなるように硫
酸マグネシウムを添加し、水酸化カリウム溶液でｐＨ
８．５に調整した後、６０℃で３０分間保温した。この
液を遠心分離し、夾雑蛋白などを沈澱として除去した。
得られた上清を予め緩衝液ａにて平衡化したＤＥＡＥト
ヨパール６５０Ｓカラム（東ソー社製）（直径２．２ｃ
ｍ、長さ２０ｃｍ）に通塔した後、充分量の緩衝液ａで
洗浄した。その後、０Ｍ→０．４ＭのＮａＣｌ直線濃度
勾配を有す緩衝液ａ８００ｍｌで溶出しウリカーゼ活性
画分１００ｍｌを得た。このウリカーゼ活性画分を緩衝
液ａで透析後、終濃度１．５Ｍになるように硫酸アンモ
ニウムを添加し、水酸化カリウム溶液でｐＨ８．５に調
整した。この溶液を、予め１．５Ｍ硫酸アンモニウムを
含む緩衝液ａ（開始緩衝液２）にて平衡化したＢｕｔｙ
ｌトヨパール６５０Ｓカラム（直径２．２ｃｍ、長さ２
０ｃｍ）に通塔後、充分量の開始緩衝液２で洗浄した。
次いで、１．５Ｍ→０Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾
配を有す緩衝液ａ８００ｍｌでタンパクを溶出し、ウリ
カーゼ活性画分６０ｍｌを採取した。このウリカーゼ活
性画分を緩衝液ａで透析、脱塩し、最終的に、１５４０
０Ｕのウリカーゼを取得した。
【００４６】
【発明の効果】本発明により収率よくウリカーゼを得る
ことができる。
ことができる。
【００４７】
配列番号：１ 配列の長さ：３１３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物名：セルロモナス・フラビジェナ（Cellulomonas f
lavigena) 株名：ＳＫ−４ 起源 生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli) 株名：ＤＨＵＴ１１８ Met Ser Thr Thr Thr Pro Thr Ala Glu Gln Pro Ala Ala Thr Gln 15 Ser Ser Gly Ala Ile Val Leu Gly Asp Asn Gln Trp Gly Lys Ala 30 Glu Val Arg Leu Val Arg Val Asp Arg Ala Thr Pro Arg His Glu 45 Ile Thr Asp Val Asn Val Ser Ser Gln Leu Arg Gly Gly Gln Glu 60 Ala Thr His Leu Glu Gly Asp Asn Ser Arg Cys Val Ala Thr Asp 75 Thr Gln Lys Asn Thr Ile Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Val Gly 90 Ala Ile Glu Asp Phe Ala Ile Arg Leu Gly Gln His Phe Val Glu 105 Asp Phe Glu Trp Ile Glu Gly Gly Arg Trp Glu Ile Glu Gln Tyr 120 Thr Trp Asn Arg Ile Glu Thr Ala Asp Gly Glu His Asp His Ala 135 Phe Val Arg Asn Asn Gln Glu Thr Arg Thr Thr Val Val Gln Arg 150 Asp Gly Asp Glu Val Phe Val Val Ser Gly Leu Thr Asp Leu Val 165 Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp 180 Arg Tyr Thr Thr Leu Val Glu Thr Asn Asp Arg Ile Leu Ala Thr 195 Ser Val Thr Ser Arg Trp Arg Tyr Thr Thr Thr Asp Val Asp Phe 210 Asp Ala Val Tyr Ala Lys Val Arg Ala Ile Gln Leu Glu Ala Phe 225 Ala Thr Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Leu Phe Ala Met 240 Gly Lys Ala Val Leu Glu Ala Ile Pro Glu Ile Ala Glu Ile Lys 255 Phe Ser Met Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Ala Pro 270 Phe Gly Leu Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg 285 Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Val Gln Arg Glu Gly Glu Pro 300 Ala Glu Pro Arg Ala Trp Ala Thr Val Thr Gly Phe Cys 313
lavigena) 株名：ＳＫ−４ 起源 生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli) 株名：ＤＨＵＴ１１８ Met Ser Thr Thr Thr Pro Thr Ala Glu Gln Pro Ala Ala Thr Gln 15 Ser Ser Gly Ala Ile Val Leu Gly Asp Asn Gln Trp Gly Lys Ala 30 Glu Val Arg Leu Val Arg Val Asp Arg Ala Thr Pro Arg His Glu 45 Ile Thr Asp Val Asn Val Ser Ser Gln Leu Arg Gly Gly Gln Glu 60 Ala Thr His Leu Glu Gly Asp Asn Ser Arg Cys Val Ala Thr Asp 75 Thr Gln Lys Asn Thr Ile Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Val Gly 90 Ala Ile Glu Asp Phe Ala Ile Arg Leu Gly Gln His Phe Val Glu 105 Asp Phe Glu Trp Ile Glu Gly Gly Arg Trp Glu Ile Glu Gln Tyr 120 Thr Trp Asn Arg Ile Glu Thr Ala Asp Gly Glu His Asp His Ala 135 Phe Val Arg Asn Asn Gln Glu Thr Arg Thr Thr Val Val Gln Arg 150 Asp Gly Asp Glu Val Phe Val Val Ser Gly Leu Thr Asp Leu Val 165 Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp 180 Arg Tyr Thr Thr Leu Val Glu Thr Asn Asp Arg Ile Leu Ala Thr 195 Ser Val Thr Ser Arg Trp Arg Tyr Thr Thr Thr Asp Val Asp Phe 210 Asp Ala Val Tyr Ala Lys Val Arg Ala Ile Gln Leu Glu Ala Phe 225 Ala Thr Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Leu Phe Ala Met 240 Gly Lys Ala Val Leu Glu Ala Ile Pro Glu Ile Ala Glu Ile Lys 255 Phe Ser Met Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Ala Pro 270 Phe Gly Leu Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg 285 Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Val Gln Arg Glu Gly Glu Pro 300 Ala Glu Pro Arg Ala Trp Ala Thr Val Thr Gly Phe Cys 313
【００４８】配列番号：２ 配列の長さ：９４２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：セルロモナス・フラビシェナ（Cellulomonas f
lavigena) 株名：ＳＫ−４ ATGAGCACGA CCACCCCGAC CGCCGAGCAG CCGGCGGCCA CGCAGAGCAG CGGGGCCATC 60 GTCCTGGGCG ACAACCAGTG GGGCAAGGCG GAGGTGCGCC TCGTGCGCGT CGACCGCGCC 120 ACGCCTCGCC ACGAGATCAC GGACGTCAAC GTCTCCTCGC AGCTGCGGGG CGGGCAGGAG 180 GCCACGCACC TGGAGGGCGA CAACTCCCGG TGCGTCGCCA CCGACACCCA GAAGAACACG 240 ATCTACGCCT TCGCCCGCGA CGGCGTCGGC GCGATCGAGG ACTTCGCGAT CCGCCTCGGT 300 CAGCACTTCG TCGAGGACTT CGAGTGGATC GAGGGCGGCC GCTGGGAGAT CGAGCAGTAC 360 ACCTGGAACC GCATCGAGAC CGCCGACGGC GAGCACGACC ACGCGTTCGT CCGGAACAAC 420 CAGGAGACGC GCACGACGGT CGTCCAGCGC GACGGCGACG AGGTCTTCGT CGTCTCGGGA 480 CTCACGGACC TCGTCGTGCT CAAGTCCACC GGCTCGGAGT TCCACGGGTT CCCGCGCGAC 540 CGCTACACGA CGCTCGTGGA GACCAACGAC CGCATCCTCG CGACGTCGGT CACCTCGCGG 600 TGGCGCTACA CGACCACCGA CGTCGACTTC GACGCCGTGT ACGCGAAGGT CCGCGCGATC 660 CAGCTCGAGG CGTTCGCGAC GACCCACTCC CTCGCGCTCC AGCAGACGCT GTTCGCGATG 720 GGCAAGGCGG TCCTCGAGGC GATCCCGGAG ATCGCCGAGA TCAAGTTCTC GATGCCGAAC 780 AAGCACCACT TCCTCGTGGA CCTCGCGCCG TTCGGCCTCG ACAACCCGAA CGAGGTCTTC 840 TACGCGGCCG ACCGCCCGTA CGGCCTCATC GAGGCGACGG TCCAGCGCGA GGGCGAGCCG 900 GCCGAGCCGC GCGCCTGGGC GACCGTCACC GGGTTCTGCT GA 942
lavigena) 株名：ＳＫ−４ ATGAGCACGA CCACCCCGAC CGCCGAGCAG CCGGCGGCCA CGCAGAGCAG CGGGGCCATC 60 GTCCTGGGCG ACAACCAGTG GGGCAAGGCG GAGGTGCGCC TCGTGCGCGT CGACCGCGCC 120 ACGCCTCGCC ACGAGATCAC GGACGTCAAC GTCTCCTCGC AGCTGCGGGG CGGGCAGGAG 180 GCCACGCACC TGGAGGGCGA CAACTCCCGG TGCGTCGCCA CCGACACCCA GAAGAACACG 240 ATCTACGCCT TCGCCCGCGA CGGCGTCGGC GCGATCGAGG ACTTCGCGAT CCGCCTCGGT 300 CAGCACTTCG TCGAGGACTT CGAGTGGATC GAGGGCGGCC GCTGGGAGAT CGAGCAGTAC 360 ACCTGGAACC GCATCGAGAC CGCCGACGGC GAGCACGACC ACGCGTTCGT CCGGAACAAC 420 CAGGAGACGC GCACGACGGT CGTCCAGCGC GACGGCGACG AGGTCTTCGT CGTCTCGGGA 480 CTCACGGACC TCGTCGTGCT CAAGTCCACC GGCTCGGAGT TCCACGGGTT CCCGCGCGAC 540 CGCTACACGA CGCTCGTGGA GACCAACGAC CGCATCCTCG CGACGTCGGT CACCTCGCGG 600 TGGCGCTACA CGACCACCGA CGTCGACTTC GACGCCGTGT ACGCGAAGGT CCGCGCGATC 660 CAGCTCGAGG CGTTCGCGAC GACCCACTCC CTCGCGCTCC AGCAGACGCT GTTCGCGATG 720 GGCAAGGCGG TCCTCGAGGC GATCCCGGAG ATCGCCGAGA TCAAGTTCTC GATGCCGAAC 780 AAGCACCACT TCCTCGTGGA CCTCGCGCCG TTCGGCCTCG ACAACCCGAA CGAGGTCTTC 840 TACGCGGCCG ACCGCCCGTA CGGCCTCATC GAGGCGACGG TCCAGCGCGA GGGCGAGCCG 900 GCCGAGCCGC GCGCCTGGGC GACCGTCACC GGGTTCTGCT GA 942
【００４９】配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴：Ｎ末６アミノ酸をコードするＤＮＡ 配列 ATGAGCACGACCACCCCG
【００５０】配列番号：４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGTCTACTACTACTCCG
【００５１】配列番号：５ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
【００５２】配列番号：６ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
【００５３】配列番号：７ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGAAAGCTTATGACGACGACCACCCCGACCGCCGA GCAG
【００５４】配列番号：８ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGACTCTAGAGGATCCTCCGCGGTCGGGCAGGGCGC
【００５５】配列番号：９ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTCAAGAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCG
【００５６】配列番号：１０ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTCATAAGCTTTTCCTGTATAGGTCGAGTTGCGTAC
【００５７】配列番号：１１ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGAAAGCTTATGTCTACTACTACTCCGACCGCCGA GCAG
【００５８】配列番号：１２ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTCGGATCCTTATTAGCAGAACCCGGTGAC
【００５９】
【００６０】
【図１】第１図はベクタープラスミドｐＴｒＳ３３の制
限酵素地図を示す。
限酵素地図を示す。
【００６１】
【図２】第２図はベクタープラスミドｐＴＬ３３の制限
酵素地図を示す。
酵素地図を示す。
【００６２】
【図３】第３図はセルロモナス・フラビジェナＳＫ−４
由来のウリカーゼをコードする遺伝子を含むプラスミド
ｐＵＳＣ３−５の制限酵素地図を示す。
由来のウリカーゼをコードする遺伝子を含むプラスミド
ｐＵＳＣ３−５の制限酵素地図を示す。
【００６３】
【図４】第４図は天然型ウリカーゼ構造遺伝子をトリプ
トファンプロモーターの支配下に組み込んだウリカーゼ
発現ベクターｐＵＴ２１の制限酵素地図を示す。
トファンプロモーターの支配下に組み込んだウリカーゼ
発現ベクターｐＵＴ２１の制限酵素地図を示す。
【００６４】
【図５】第５図はウリカーゼ構造遺伝子の５’−末端の
上流部分、Ｎ−末部分およびストップ・コドンの塩基配
列を変化させたウリカーゼ高発現プラスミドｐＵＴ１１
８の制限酵素地図を示す。
上流部分、Ｎ−末部分およびストップ・コドンの塩基配
列を変化させたウリカーゼ高発現プラスミドｐＵＴ１１
８の制限酵素地図を示す。
【００６５】
＊ Ｎ末４アミノ酸のコドンの３番目の塩基をＴに置換
した。 ＊＊ストップ・コドンをＴＡＡＴＡＡ（２重ストップ・
コドン）に置換した。
した。 ＊＊ストップ・コドンをＴＡＡＴＡＡ（２重ストップ・
コドン）に置換した。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１月２６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はウリカーゼ遺伝子および
ウリカーゼの製造法に関する。さらに詳しくは本発明は
ウリカーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換え体プラスミ
ド、該組換え体プラスミドを含む形質転換体及び該形質
転換体を用いるウリカーゼの製造法並びにセルロモナス
属に属する微生物を用いるウリカーゼの製造法に関す
る。
ウリカーゼの製造法に関する。さらに詳しくは本発明は
ウリカーゼ遺伝子、該遺伝子を含む組換え体プラスミ
ド、該組換え体プラスミドを含む形質転換体及び該形質
転換体を用いるウリカーゼの製造法並びにセルロモナス
属に属する微生物を用いるウリカーゼの製造法に関す
る。
【０００２】ウリカーゼ(EC 1.7.3.3)は尿酸を酸化して
アラントインと過酸化水素および二酸化炭素を生成する
反応を触媒する酵素であり、血中あるいは尿中の尿酸の
測定、染毛用キット等に使用される。
アラントインと過酸化水素および二酸化炭素を生成する
反応を触媒する酵素であり、血中あるいは尿中の尿酸の
測定、染毛用キット等に使用される。
【０００３】
【従来の技術】ウリカーゼを得る方法としては、例え
ば、キャンディダ属（特公昭４２−５１９２号公報）、
ミクロコッカス属、ブレビバクテリウム属（特公昭４４
−１４７８３号公報）、ストレプトミセス属〔Agric. B
iol. Chem. 33、 1282、 (1969)〕、エンテロバクター属
〔特公昭６０−１９９９０号公報；Agric. Biol. Che
m.,44、 2811、 (1980)〕、バチルス属（特開昭６１−２
８０２７２号公報；特開平２−５３４８８号公報）に属
する微生物を用いる方法等が知られている。
ば、キャンディダ属（特公昭４２−５１９２号公報）、
ミクロコッカス属、ブレビバクテリウム属（特公昭４４
−１４７８３号公報）、ストレプトミセス属〔Agric. B
iol. Chem. 33、 1282、 (1969)〕、エンテロバクター属
〔特公昭６０−１９９９０号公報；Agric. Biol. Che
m.,44、 2811、 (1980)〕、バチルス属（特開昭６１−２
８０２７２号公報；特開平２−５３４８８号公報）に属
する微生物を用いる方法等が知られている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ウリカーゼを収率良く
安価に製造する方法が求められている。
安価に製造する方法が求められている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、セルロ
モナス属に属し、ウリカーゼ生産能を有する微生物を培
地に培養することによってウリカーゼを生成させること
ができる。また、セルロモナス属に属する微生物由来の
ウリカーゼをコードする遺伝子をクローニングし、該ウ
リカーゼ遺伝子を含有する組換え体プラスミドを構築
後、該プラスミドを含む形質転換体を造成して該形質転
換体を培養することによりウリカーゼを大量発現させる
ことができる。
モナス属に属し、ウリカーゼ生産能を有する微生物を培
地に培養することによってウリカーゼを生成させること
ができる。また、セルロモナス属に属する微生物由来の
ウリカーゼをコードする遺伝子をクローニングし、該ウ
リカーゼ遺伝子を含有する組換え体プラスミドを構築
後、該プラスミドを含む形質転換体を造成して該形質転
換体を培養することによりウリカーゼを大量発現させる
ことができる。
【０００６】使用される微生物としては、セルロモナス
属に属し、ウリカーゼを生産する能力を有するものであ
ればいずれの微生物でもよい。好適な微生物の例として
はセルロモナス・フラビジェナ（ Cellulomonas flav
igena ) ＳＫ−４があげられる。本菌株は昭和６２年１
１月２１日付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工
研）にブタペスト条約の条件でＦＥＲＭ ＢＰ−１５７
５として寄託されている。セルロモナス・フラビジェナ
の菌学的性質についてはBergey's Manual ofSystemati
c Bacteriology 第２巻 1325〜1329頁(1986)に記載が
ある。また、形質転換体に用いられる微生物としては、
従来知られている宿主・ベクター系の宿主であれば、い
ずれの微生物でもよい。好適な例としては大腸菌（Esch
erichia coli) の宿主・ベクター系があげられる。
属に属し、ウリカーゼを生産する能力を有するものであ
ればいずれの微生物でもよい。好適な微生物の例として
はセルロモナス・フラビジェナ（ Cellulomonas flav
igena ) ＳＫ−４があげられる。本菌株は昭和６２年１
１月２１日付で工業技術院微生物工業技術研究所（微工
研）にブタペスト条約の条件でＦＥＲＭ ＢＰ−１５７
５として寄託されている。セルロモナス・フラビジェナ
の菌学的性質についてはBergey's Manual ofSystemati
c Bacteriology 第２巻 1325〜1329頁(1986)に記載が
ある。また、形質転換体に用いられる微生物としては、
従来知られている宿主・ベクター系の宿主であれば、い
ずれの微生物でもよい。好適な例としては大腸菌（Esch
erichia coli) の宿主・ベクター系があげられる。
【０００７】セルロモナス属に属するウリカーゼ生産菌
の培養は以下のごとく行う。すなわち該微生物を、炭素
源、窒素源、無機物などを含有する培地において、好気
的条件下にて温度、ｐＨなどを調整しつつ培養を行えば
よい。培地に用いる炭素源としては、例えばグルコー
ス、フラクトース、シュークロース、糖蜜、廃糖蜜、澱
粉加水分解物などの炭水化物、エタノール、グリセリ
ン、ソルビトールなどのアルコール類、ピルビン酸、乳
酸、酢酸などの有機酸、グリシン、アラニン、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸などのアミノ酸など該微生物が資
化可能なものであればいずれでも使用できる。
の培養は以下のごとく行う。すなわち該微生物を、炭素
源、窒素源、無機物などを含有する培地において、好気
的条件下にて温度、ｐＨなどを調整しつつ培養を行えば
よい。培地に用いる炭素源としては、例えばグルコー
ス、フラクトース、シュークロース、糖蜜、廃糖蜜、澱
粉加水分解物などの炭水化物、エタノール、グリセリ
ン、ソルビトールなどのアルコール類、ピルビン酸、乳
酸、酢酸などの有機酸、グリシン、アラニン、グルタミ
ン酸、アスパラギン酸などのアミノ酸など該微生物が資
化可能なものであればいずれでも使用できる。
【０００８】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムな
どの無機および有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、
ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープ
リカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたは
その消化物などの窒素含有有機物、グリシン、グルタミ
ン酸などのアミノ酸などが使用できる。
ニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、炭酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムな
どの無機および有機アンモニウム塩、尿素、ペプトン、
ＮＺアミン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープ
リカー、カゼイン加水分解物、フィッシュミールまたは
その消化物などの窒素含有有機物、グリシン、グルタミ
ン酸などのアミノ酸などが使用できる。
【０００９】無機物としては、リン酸１カリウム、リン
酸２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、炭酸カルシウムなどが使用できる。さらに、ウリ
カーゼ生産の誘導物質としてよく用いられる核酸混合
物、尿酸などを適量添加することが望ましい。用いる微
生物がアミノ酸、核酸、ビタミンなど特定の栄養物質を
生育に要求する場合には、培地にこれらの物質を適量添
加する。
酸２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、炭酸カルシウムなどが使用できる。さらに、ウリ
カーゼ生産の誘導物質としてよく用いられる核酸混合
物、尿酸などを適量添加することが望ましい。用いる微
生物がアミノ酸、核酸、ビタミンなど特定の栄養物質を
生育に要求する場合には、培地にこれらの物質を適量添
加する。
【００１０】培養は振盪培養、通気攪拌培養などの好気
的条件下、２５〜３７℃で１〜２４時間行う。培地のｐ
Ｈはアンモニア、尿素、水酸化ナトリウム溶液などで中
性付近に保つことが望ましい。培養終了後、培養物より
ウリカーゼを採取するには一般の酵素採取法、例えば次
のようにして単離することができる。まず得られた菌体
を充分洗浄した後、超音波処理などにて無細胞抽出液を
得る。遠沈後の上清を陰イオン交換クロマトグラフィー
処理、疎水性クロマトグラフィー処理などを行い、精製
標品を得る。
的条件下、２５〜３７℃で１〜２４時間行う。培地のｐ
Ｈはアンモニア、尿素、水酸化ナトリウム溶液などで中
性付近に保つことが望ましい。培養終了後、培養物より
ウリカーゼを採取するには一般の酵素採取法、例えば次
のようにして単離することができる。まず得られた菌体
を充分洗浄した後、超音波処理などにて無細胞抽出液を
得る。遠沈後の上清を陰イオン交換クロマトグラフィー
処理、疎水性クロマトグラフィー処理などを行い、精製
標品を得る。
【００１１】本発明におけるウリカーゼの活性は次の方
法で測定する。ウリカーゼの活性測定は、基質となる尿
酸の紫外部吸収（２９３ｎｍ）の吸光度の減少を測定す
ることにより行う。すなわち５０ｍＭ ほう酸緩衝液
（ｐＨ８．５）、１２５μＭ 尿酸の組成からなる反応
液（以下、反応液ａという）３ｍｌ中にウリカーゼを１
５０ｎｇ蛋白／ｍｌ程度の濃度で接触させ、２５℃で３
分間反応させる。本反応中の２９３ｎｍの吸光度の変化
（△ＯＤ）を測定し、次式によりウリカーゼの単位
（Ｕ）を算出する。上記条件下で、１分間に１μｍｏｌ
ｅの尿酸を分解する酵素量を１Ｕとする。
法で測定する。ウリカーゼの活性測定は、基質となる尿
酸の紫外部吸収（２９３ｎｍ）の吸光度の減少を測定す
ることにより行う。すなわち５０ｍＭ ほう酸緩衝液
（ｐＨ８．５）、１２５μＭ 尿酸の組成からなる反応
液（以下、反応液ａという）３ｍｌ中にウリカーゼを１
５０ｎｇ蛋白／ｍｌ程度の濃度で接触させ、２５℃で３
分間反応させる。本反応中の２９３ｎｍの吸光度の変化
（△ＯＤ）を測定し、次式によりウリカーゼの単位
（Ｕ）を算出する。上記条件下で、１分間に１μｍｏｌ
ｅの尿酸を分解する酵素量を１Ｕとする。
【００１２】
【数１】
【００１３】本手法により得られたウリカーゼの生産性
を向上させるために、本発明者らは当該酵素の遺伝子を
取得し、該遺伝子を含有する組換え体プラスミドを構築
後、該プラスミドを含む形質転換体を造成して該形質転
換体を培養することによりウリカーゼを大量発現するこ
とを検討した。該遺伝子のクローニングは、polymerase
chain reaction (PCR) 法により特異性の高いプローブ
DNAを取得し、それを用いE . coliで作成したウリカー
ゼ生産菌のジーン・バンクからコロニー・ハイブリダイ
ゼイション法により行った。
を向上させるために、本発明者らは当該酵素の遺伝子を
取得し、該遺伝子を含有する組換え体プラスミドを構築
後、該プラスミドを含む形質転換体を造成して該形質転
換体を培養することによりウリカーゼを大量発現するこ
とを検討した。該遺伝子のクローニングは、polymerase
chain reaction (PCR) 法により特異性の高いプローブ
DNAを取得し、それを用いE . coliで作成したウリカー
ゼ生産菌のジーン・バンクからコロニー・ハイブリダイ
ゼイション法により行った。
【００１４】上述の様にして得られた精製ウリカーゼの
Ｎ末アミノ酸の配列、数種のリジルペプチダーゼ切断断
片のＮ末アミノ酸の配列を分析し、その配列に対応する
DNAオリゴマーを作成する。通常のＤＮＡ単離法〔フェ
ノール法；バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ
(Biochim.Biophys.Acta)72、619 〜629(1963）〕によ
り、セルロモナス属に属するウリカーゼ生産菌の染色体
ＤＮＡを精製し、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として P
CR法により当該遺伝子の一部と考えられる DNA断片を増
幅し、この増幅 DNA断片をプラスミドベクター（ｐＵＣ
１９等）につなぎ、適当な宿主E. coli ＤＨ５α〔フ
ォーカス(Focus), 8, 9 (1986)〕等をコーエンらの方法
〔Cohen et.al.; プロシーヂング・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.) 、69、2110(1972)〕に従い形質転換し、得ら
れた形質転換体から組換え体プラスミドを常法に従い抽
出する。ジデオキシ法〔サイエンス(Science) 、 214 、
1205〜1210(1981)，ジーン(Gene)、 19、 269 〜276(198
2) 〕により挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が
上述の精製ウリカーゼのアミノ酸配列に相当することを
確認した後、適当な制限酵素で挿入断片を切り出し、こ
の DNA断片をウリカーゼ遺伝子クローン化用プローブと
して使用する。尚、プラスミド作成等の遺伝子工学的手
法は、Maniatisらの著書〔モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning)(1982) コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー(Cold Spring Habor Lab.)〕に従
って行った。
Ｎ末アミノ酸の配列、数種のリジルペプチダーゼ切断断
片のＮ末アミノ酸の配列を分析し、その配列に対応する
DNAオリゴマーを作成する。通常のＤＮＡ単離法〔フェ
ノール法；バイオキミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ
(Biochim.Biophys.Acta)72、619 〜629(1963）〕によ
り、セルロモナス属に属するウリカーゼ生産菌の染色体
ＤＮＡを精製し、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として P
CR法により当該遺伝子の一部と考えられる DNA断片を増
幅し、この増幅 DNA断片をプラスミドベクター（ｐＵＣ
１９等）につなぎ、適当な宿主E. coli ＤＨ５α〔フ
ォーカス(Focus), 8, 9 (1986)〕等をコーエンらの方法
〔Cohen et.al.; プロシーヂング・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミイ・オブ・サイエンス(Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.A.) 、69、2110(1972)〕に従い形質転換し、得ら
れた形質転換体から組換え体プラスミドを常法に従い抽
出する。ジデオキシ法〔サイエンス(Science) 、 214 、
1205〜1210(1981)，ジーン(Gene)、 19、 269 〜276(198
2) 〕により挿入断片の塩基配列を決定し、その配列が
上述の精製ウリカーゼのアミノ酸配列に相当することを
確認した後、適当な制限酵素で挿入断片を切り出し、こ
の DNA断片をウリカーゼ遺伝子クローン化用プローブと
して使用する。尚、プラスミド作成等の遺伝子工学的手
法は、Maniatisらの著書〔モレキュラー・クローニング
(Molecular Cloning)(1982) コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー(Cold Spring Habor Lab.)〕に従
って行った。
【００１５】セルロモナス属に属するウリカーゼ生産菌
の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばScaIにより消
化し、該制限酵素断片をベクターＤＮＡに組み込む。こ
の様にして作成したウリカーゼ生産菌のウリカーゼをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をつなぎこんだ組換え
体ＤＮＡを含む種々の組換え体混成物を用いて、コーエ
ンらの方法に従い、E. coliＤＨ５αを形質転換し、ジ
ーン・バンクを作成した。これらのジーン・バンクと上
述のプローブを用い、コロニー・ハイブリダイゼイショ
ン法により数個の陽性クローン得る。
の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素、例えばScaIにより消
化し、該制限酵素断片をベクターＤＮＡに組み込む。こ
の様にして作成したウリカーゼ生産菌のウリカーゼをコ
ードする遺伝子を含むＤＮＡ断片をつなぎこんだ組換え
体ＤＮＡを含む種々の組換え体混成物を用いて、コーエ
ンらの方法に従い、E. coliＤＨ５αを形質転換し、ジ
ーン・バンクを作成した。これらのジーン・バンクと上
述のプローブを用い、コロニー・ハイブリダイゼイショ
ン法により数個の陽性クローン得る。
【００１６】これらの陽性クローンをＬＢ培地〔１％ト
リプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム
（ｐＨ７．５）〕に培養後、遠心分離により菌体を集菌
し、充分に洗浄する。得られた菌体懸濁液を超音波処理
などにより処理し無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出
液を用い、上述のウリカーゼ活性測定法でウリカーゼ活
性の有無を調べ、ウリカーゼ活性を持つクローンを選択
する。この様にして得られた形質転換体からウリカーゼ
遺伝子を含有する組換え体プラスミドを抽出し、挿入Ｄ
ＮＡ断片の塩基配列を決定し、その配列中に上述の精製
ウリカーゼのアミノ酸配列の情報と矛盾しないオープン
リーディングフレームが存在することを確認する。かく
して、目的のウリカーゼ遺伝子がクローン化されたこと
になる。
リプトン、０．５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム
（ｐＨ７．５）〕に培養後、遠心分離により菌体を集菌
し、充分に洗浄する。得られた菌体懸濁液を超音波処理
などにより処理し無細胞抽出液を得る。この無細胞抽出
液を用い、上述のウリカーゼ活性測定法でウリカーゼ活
性の有無を調べ、ウリカーゼ活性を持つクローンを選択
する。この様にして得られた形質転換体からウリカーゼ
遺伝子を含有する組換え体プラスミドを抽出し、挿入Ｄ
ＮＡ断片の塩基配列を決定し、その配列中に上述の精製
ウリカーゼのアミノ酸配列の情報と矛盾しないオープン
リーディングフレームが存在することを確認する。かく
して、目的のウリカーゼ遺伝子がクローン化されたこと
になる。
【００１７】該遺伝子を含有するＤＮＡ断片を担持する
ベクターとしては、エシェリヒア属菌種中で自律複製で
きるものであればファージ・ベクター、プラスミド・ベ
クターなどいずれでも使用できる。好適にはｐＢＲ３２
２〔ジーン(GENE)、２、95(1977)〕、ｐＵＣ１９〔ジー
ン(GENE)、33、103(1985）〕、ｐＴｒＳ３３（特開平2-
227075号公報〕などが例示される。
ベクターとしては、エシェリヒア属菌種中で自律複製で
きるものであればファージ・ベクター、プラスミド・ベ
クターなどいずれでも使用できる。好適にはｐＢＲ３２
２〔ジーン(GENE)、２、95(1977)〕、ｐＵＣ１９〔ジー
ン(GENE)、33、103(1985）〕、ｐＴｒＳ３３（特開平2-
227075号公報〕などが例示される。
【００１８】さらに、該遺伝子を多菌種の宿主・ベクタ
ー系を用いてサブクローニングすることにより、該遺伝
子を他菌種に導入することも可能である。宿主・ベクタ
ー系としては、従来知られているものは全て用いること
ができる。例として、セラチア属、コリネバクテリウム
属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチル
ス属などの宿主ベクター系があげられる。
ー系を用いてサブクローニングすることにより、該遺伝
子を他菌種に導入することも可能である。宿主・ベクタ
ー系としては、従来知られているものは全て用いること
ができる。例として、セラチア属、コリネバクテリウム
属、ブレビバクテリウム属、シュードモナス属、バチル
ス属などの宿主ベクター系があげられる。
【００１９】上記のようにしてクローン化したウリカー
ゼ遺伝子を含むプラスミドpUSC3-5の制限酵素地図を第
３図に示す。第３図中、白抜きの太線で示した部分がウ
リカーゼ遺伝子であり、遺伝子の転写は図中HindIII 部
位から BamHI部位方向に行われる。構造遺伝子の塩基配
列は配列番号２に示す通りであり、配列はジデオキシ法
にて決定された。
ゼ遺伝子を含むプラスミドpUSC3-5の制限酵素地図を第
３図に示す。第３図中、白抜きの太線で示した部分がウ
リカーゼ遺伝子であり、遺伝子の転写は図中HindIII 部
位から BamHI部位方向に行われる。構造遺伝子の塩基配
列は配列番号２に示す通りであり、配列はジデオキシ法
にて決定された。
【００２０】本発明者らは、ウリカーゼを高発現するた
めに種々検討した結果、コードするアミノ酸を変化させ
ることなくウリカーゼ遺伝子の塩基を数カ所変化させた
遺伝子（第５図参照）をE. coliトリプトファンプロモ
ーターの下流に接続することにより、ウリカーゼの高発
現化に成功した。高発現型プラスミドｐＵＴ１１８の概
要を第５図に示す。
めに種々検討した結果、コードするアミノ酸を変化させ
ることなくウリカーゼ遺伝子の塩基を数カ所変化させた
遺伝子（第５図参照）をE. coliトリプトファンプロモ
ーターの下流に接続することにより、ウリカーゼの高発
現化に成功した。高発現型プラスミドｐＵＴ１１８の概
要を第５図に示す。
【００２１】ｐＵＴ１１８を適当な宿主細菌に導入し、
その組換え菌を通常の細菌の培養方法に従い培養し、ウ
リカーゼ高含有菌体を取得する。この菌体から一般の酵
素採取法に従い精製ウリカーゼを取得する。宿主に用い
る細菌としては、E. coliＤＨ５αなどが適している。
ウリカーゼ高発現化株の例として、エシェリヒア・コリ
（ Escherichia coli )ＤＨＵＴ１１８があげられる。
本菌株は平成３年１１月５日付で微工研にブダペスト条
約の条件でＦＥＲＭ ＢＰ−３６４２として寄託されて
いる。エシェリヒア・コリＤＨＵＴ１１８の培養および
培養物からのウリカーゼの単離は前記セルロモナス属に
属する微生物を用いる場合と同様である。
その組換え菌を通常の細菌の培養方法に従い培養し、ウ
リカーゼ高含有菌体を取得する。この菌体から一般の酵
素採取法に従い精製ウリカーゼを取得する。宿主に用い
る細菌としては、E. coliＤＨ５αなどが適している。
ウリカーゼ高発現化株の例として、エシェリヒア・コリ
（ Escherichia coli )ＤＨＵＴ１１８があげられる。
本菌株は平成３年１１月５日付で微工研にブダペスト条
約の条件でＦＥＲＭ ＢＰ−３６４２として寄託されて
いる。エシェリヒア・コリＤＨＵＴ１１８の培養および
培養物からのウリカーゼの単離は前記セルロモナス属に
属する微生物を用いる場合と同様である。
【００２２】得られた精製酵素のアミノ酸配列は次の様
にして求められる。本酵素標品を、逆相HPLC（YMC-AM31
2, 0.1%TFA−アセトニトリルのグラジエント溶出）で脱
塩した後、アミノ酸シークエンサー４７０Ａ型（アプラ
イドバイオシステム社）を用い、Ｎ末アミノ酸２２残基
の配列を決定したところ、配列番号２の塩基配列より予
想されるアミノ酸配列（配列番号１）と一致した。本酵
素の第一アミノ酸のメチオニンは切除されていた。また
リジルエンドペプチダーゼにて本酵素を分解したペプチ
ド群から２種類のペプチドを分離取得し、アミノ酸配列
を先と同様の方法で決定したところ、一方は、配列番号
１に示したアミノ酸配列の１６９番目のSer から１８３
番目のThr までの配列と、他方は、２４３番目のAla か
ら２５４番目のIle までの配列（アミノ酸配列Ａ）と一
致した。
にして求められる。本酵素標品を、逆相HPLC（YMC-AM31
2, 0.1%TFA−アセトニトリルのグラジエント溶出）で脱
塩した後、アミノ酸シークエンサー４７０Ａ型（アプラ
イドバイオシステム社）を用い、Ｎ末アミノ酸２２残基
の配列を決定したところ、配列番号２の塩基配列より予
想されるアミノ酸配列（配列番号１）と一致した。本酵
素の第一アミノ酸のメチオニンは切除されていた。また
リジルエンドペプチダーゼにて本酵素を分解したペプチ
ド群から２種類のペプチドを分離取得し、アミノ酸配列
を先と同様の方法で決定したところ、一方は、配列番号
１に示したアミノ酸配列の１６９番目のSer から１８３
番目のThr までの配列と、他方は、２４３番目のAla か
ら２５４番目のIle までの配列（アミノ酸配列Ａ）と一
致した。
【００２３】さらに、上記の脱塩標品(1 nmol)を過蟻酸
酸化（−４℃、２時間）し、減圧乾固後、Hydraclub S-
204 （ホーネン製）を用いて９５℃で２時間ヒドラジン
分解した。その後、減圧にてヒドラジンを除去し、分解
物中のヒドラジットをベンズアルデヒドと反応させ遠心
分離して除いた。上清をアミノ酸分析（OPA・プレカラ
ム法）したところ約３００pmolのシステイン酸が検出さ
れた。この結果から、本酵素標品のＣ末アミノ酸残基が
システインであることが同定された。以上のことから本
酵素のアミノ酸配列は、配列番号２に示した塩基配列か
ら予想されるアミノ酸配列（配列番号１）と一致してい
ると予想できる。ウリカーゼの高発現化のために遺伝子
工学的手法による変異導入を検討したところ、配列番号
２において、ウリカーゼのＮ末に相当する配列番号３の
塩基配列を、コードするアミノ酸に変化が生じないよう
に配列番号４の塩基配列のごとく変化して生産した酵素
においても、アミノ酸配列には変化はなく、ウリカーゼ
を高発現することがわかった。
酸化（−４℃、２時間）し、減圧乾固後、Hydraclub S-
204 （ホーネン製）を用いて９５℃で２時間ヒドラジン
分解した。その後、減圧にてヒドラジンを除去し、分解
物中のヒドラジットをベンズアルデヒドと反応させ遠心
分離して除いた。上清をアミノ酸分析（OPA・プレカラ
ム法）したところ約３００pmolのシステイン酸が検出さ
れた。この結果から、本酵素標品のＣ末アミノ酸残基が
システインであることが同定された。以上のことから本
酵素のアミノ酸配列は、配列番号２に示した塩基配列か
ら予想されるアミノ酸配列（配列番号１）と一致してい
ると予想できる。ウリカーゼの高発現化のために遺伝子
工学的手法による変異導入を検討したところ、配列番号
２において、ウリカーゼのＮ末に相当する配列番号３の
塩基配列を、コードするアミノ酸に変化が生じないよう
に配列番号４の塩基配列のごとく変化して生産した酵素
においても、アミノ酸配列には変化はなく、ウリカーゼ
を高発現することがわかった。
【００２４】以下に実施例を示す。
【００２５】
【実施例】 実施例１ セルロモナス・フラビジェナＳＫ−４（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１５７５）を用いるウリカーゼの製造 セルロモナス・フラビジェナＳＫ−４を培地〔ペプトン
１．０％、コーンスティープリカー１．０％、サンヨー
核酸（山陽国策パルプ社製）０．５％、肉エキス０．５
％、酵母エキス０．３％、シュークロース０．７％、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
０．０５％（ｐＨ７．２）〕３００ｍｌを含む三角フ
ラスコに植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。得ら
れた培養物の一部を遠心分離し、湿菌体約１０ｇを得
た。これを１００ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭ ほう酸−炭
酸ナトリウム−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）；以
下、緩衝液ａという〕に懸濁し、超音波破砕機（ブラン
ソン社製）にて菌体を破砕した。破砕液を遠心分離し、
上清１００ｍｌを得た。得られた上清を予め緩衝液ａに
て平衡化したＨＰＡ−７５カラム（三菱化成社製；ハイ
ポーラス型強塩基性陰イオン交換樹脂）に通塔した後、
該樹脂量の５倍量の０．５Ｍ酢酸アンモニウムを含む緩
衝液ａで洗浄した。その後、該樹脂量の５倍量の０．３
Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液ａでウリカーゼ活性画
分を溶出した。このウリカーゼ活性画分を緩衝液ａで透
析後、終濃度１．１Ｍになるように硫酸アンモニウムを
添加し、水酸化カリウム溶液でｐＨ８．５に調整した。
この溶液を、予め１．１Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝
液ａ（開始緩衝液１）にて平衡化したＢｕｔｙｌトヨパ
ール６５０Ｃカラム（東ソー社製）に通塔後、充分量の
開始緩衝液１で洗浄した。次いで、１．１Ｍ→０Ｍの硫
酸アンモニウム直線濃度勾配を有す緩衝液ａでタンパク
を溶出し、ウリカーゼ活性画分を採取した。このウリカ
ーゼ活性画分を緩衝液ａで透析、脱塩し、最終的に、１
００Ｕのウリカーゼを取得した。
ＥＲＭ ＢＰ−１５７５）を用いるウリカーゼの製造 セルロモナス・フラビジェナＳＫ−４を培地〔ペプトン
１．０％、コーンスティープリカー１．０％、サンヨー
核酸（山陽国策パルプ社製）０．５％、肉エキス０．５
％、酵母エキス０．３％、シュークロース０．７％、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
０．０５％（ｐＨ７．２）〕３００ｍｌを含む三角フ
ラスコに植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。得ら
れた培養物の一部を遠心分離し、湿菌体約１０ｇを得
た。これを１００ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭ ほう酸−炭
酸ナトリウム−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）；以
下、緩衝液ａという〕に懸濁し、超音波破砕機（ブラン
ソン社製）にて菌体を破砕した。破砕液を遠心分離し、
上清１００ｍｌを得た。得られた上清を予め緩衝液ａに
て平衡化したＨＰＡ−７５カラム（三菱化成社製；ハイ
ポーラス型強塩基性陰イオン交換樹脂）に通塔した後、
該樹脂量の５倍量の０．５Ｍ酢酸アンモニウムを含む緩
衝液ａで洗浄した。その後、該樹脂量の５倍量の０．３
Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液ａでウリカーゼ活性画
分を溶出した。このウリカーゼ活性画分を緩衝液ａで透
析後、終濃度１．１Ｍになるように硫酸アンモニウムを
添加し、水酸化カリウム溶液でｐＨ８．５に調整した。
この溶液を、予め１．１Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝
液ａ（開始緩衝液１）にて平衡化したＢｕｔｙｌトヨパ
ール６５０Ｃカラム（東ソー社製）に通塔後、充分量の
開始緩衝液１で洗浄した。次いで、１．１Ｍ→０Ｍの硫
酸アンモニウム直線濃度勾配を有す緩衝液ａでタンパク
を溶出し、ウリカーゼ活性画分を採取した。このウリカ
ーゼ活性画分を緩衝液ａで透析、脱塩し、最終的に、１
００Ｕのウリカーゼを取得した。
【００２６】実施例２ セルロモナス・フラビジェナ
ＳＫ−４の染色体ＤＮＡの単離 実施例１で得られたセルロモナス・フラビジェナＳＫ−
４の培養菌体約１５ｇを２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１２０ｍｌに懸濁した。
この懸濁液にリゾチーム溶液〔リゾチームを２０ｍｇ／
ｍｌの割合で、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解したもの〕１５ｍｌを
加え、３０℃で１時間放置した。これに２０％ラウリル
硫酸ナトリウム溶液１５ｍｌを加え、ゆっくりと攪拌し
た。次にこの溶液に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．５）を飽和したフェノール１５０
ｍｌを加え、充分に攪拌した。この溶液を遠心分離にか
け、水層１５０ｍｌを分取した。ついで、このフェノー
ル抽出の操作を３回繰り返した。得られた水層１５０ｍ
ｌに２．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液１５ｍｌを加えた後、
さらにエタノール３００ｍｌを加えた。析出した染色体
ＤＮＡをガラス棒にて巻取り、乾燥した。次いで、これ
を１ｍｌＥＤＴＡを含む１０ｍｌトリス緩衝液（ｐＨ
７．５）３０ｍｌに溶解した。これにリボヌクレアーゼ
を５０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で３０分間
放置した。前述と同様のフェノール抽出操作を行なった
後、水層に２．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液３ｍｌおよびエ
タノール６０ｍｌを加えた後、−２０℃にて１６時間放
置した。遠心分離し、得られたペレットを７０％エタノ
ール溶液にて洗浄し、乾燥させ精製染色体ＤＮＡを得
た。これを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．５）に懸濁し、−２０℃で保存した。
ＳＫ−４の染色体ＤＮＡの単離 実施例１で得られたセルロモナス・フラビジェナＳＫ−
４の培養菌体約１５ｇを２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１２０ｍｌに懸濁した。
この懸濁液にリゾチーム溶液〔リゾチームを２０ｍｇ／
ｍｌの割合で、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解したもの〕１５ｍｌを
加え、３０℃で１時間放置した。これに２０％ラウリル
硫酸ナトリウム溶液１５ｍｌを加え、ゆっくりと攪拌し
た。次にこの溶液に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．５）を飽和したフェノール１５０
ｍｌを加え、充分に攪拌した。この溶液を遠心分離にか
け、水層１５０ｍｌを分取した。ついで、このフェノー
ル抽出の操作を３回繰り返した。得られた水層１５０ｍ
ｌに２．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液１５ｍｌを加えた後、
さらにエタノール３００ｍｌを加えた。析出した染色体
ＤＮＡをガラス棒にて巻取り、乾燥した。次いで、これ
を１ｍｌＥＤＴＡを含む１０ｍｌトリス緩衝液（ｐＨ
７．５）３０ｍｌに溶解した。これにリボヌクレアーゼ
を５０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で３０分間
放置した。前述と同様のフェノール抽出操作を行なった
後、水層に２．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液３ｍｌおよびエ
タノール６０ｍｌを加えた後、−２０℃にて１６時間放
置した。遠心分離し、得られたペレットを７０％エタノ
ール溶液にて洗浄し、乾燥させ精製染色体ＤＮＡを得
た。これを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．５）に懸濁し、−２０℃で保存した。
【００２７】実施例３ ウリカーゼ遺伝子クローニン
グ用のプローブの調製 １）プローブ用ＤＮＡ断片の増幅 上述のアミノ酸配列のデータをもとにそのアミノ酸配列
に対応する配列番号５のＰＣＲ用５’側プライマー（Ｎ
末付近の配列に対応）と配列番号６の３’側プライマー
を設計し（アミノ酸配列Ａ）、リン酸アミダイド法によ
る固相合成法［S.L.Beaucageら、テトラヘドロン・レタ
ー(Tetrahedron Lett.)、22, 1859 (1981）］に従い、
ＤＮＡ自動合成機３８０Ａ（アプライドバイオシステム
社製）を用いて合成した。ＰＣＲはジーンＡｍｐＤＮＡ
アンプリフィケーションリージェントキット（宝酒造社
製）を用い、前記で調製したセルロモナス・フラビジェ
ナの染色体ＤＮＡ １ng／１００μl を鋳型として、下
記の合成ＤＮＡ各１．０μM をプライマーとして、ｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰを各２００μＭ、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ／１００μｌにし
て９４℃で1.５分間、４０℃で２分間、７２℃で２分間
の反応を３０回繰り返し、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を
取得した。
グ用のプローブの調製 １）プローブ用ＤＮＡ断片の増幅 上述のアミノ酸配列のデータをもとにそのアミノ酸配列
に対応する配列番号５のＰＣＲ用５’側プライマー（Ｎ
末付近の配列に対応）と配列番号６の３’側プライマー
を設計し（アミノ酸配列Ａ）、リン酸アミダイド法によ
る固相合成法［S.L.Beaucageら、テトラヘドロン・レタ
ー(Tetrahedron Lett.)、22, 1859 (1981）］に従い、
ＤＮＡ自動合成機３８０Ａ（アプライドバイオシステム
社製）を用いて合成した。ＰＣＲはジーンＡｍｐＤＮＡ
アンプリフィケーションリージェントキット（宝酒造社
製）を用い、前記で調製したセルロモナス・フラビジェ
ナの染色体ＤＮＡ １ng／１００μl を鋳型として、下
記の合成ＤＮＡ各１．０μM をプライマーとして、ｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰを各２００μＭ、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ／１００μｌにし
て９４℃で1.５分間、４０℃で２分間、７２℃で２分間
の反応を３０回繰り返し、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を
取得した。
【００２８】２）プローブＤＮＡ断片のクローニング 上記のごとく反応して得られたＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片
１μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃ
ｏＲＩを加えて消化を行った。別にベクターｐＵＣ１９
１μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥ
ｃｏＲＩを加えて消化した。消化された上記ＤＮＡ断片
およびベクターＤＮＡをフェノール抽出およびエタノー
ル沈澱操作により精製した。精製ＤＮＡ１００ｎｇおよ
び精製ベクターＤＮＡ２０ｎｇを６６ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ
ＤＴＴおよび０．１ｍＭ ＡＴＰを含有する溶液に懸
濁した。これにＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を１
０Ｕ添加した後、１４℃で１６時間反応させ、両方のＤ
ＮＡを連結させ、組換えＤＮＡを得た。
１μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃ
ｏＲＩを加えて消化を行った。別にベクターｐＵＣ１９
１μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥ
ｃｏＲＩを加えて消化した。消化された上記ＤＮＡ断片
およびベクターＤＮＡをフェノール抽出およびエタノー
ル沈澱操作により精製した。精製ＤＮＡ１００ｎｇおよ
び精製ベクターＤＮＡ２０ｎｇを６６ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ
ＤＴＴおよび０．１ｍＭ ＡＴＰを含有する溶液に懸
濁した。これにＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を１
０Ｕ添加した後、１４℃で１６時間反応させ、両方のＤ
ＮＡを連結させ、組換えＤＮＡを得た。
【００２９】E. coliＤＨ５α株をＬＢ液体培地５０ｍ
ｌを含む三角フラスコに植菌し、３７℃で４時間振盪培
養した。ついで遠心分離（３０００rpm 、７分間）して
集めた菌体を０℃の５０ｍＭ塩化カルシウム溶液２０ｍ
ｌに懸濁し０℃にて２０分静置した後、上記と同様の遠
心分離にて集菌し、０℃、５０ｍＭの塩化カルシウム溶
液４０ｍｌに懸濁した。この懸濁液と上述の組換え体Ｄ
ＮＡを含む溶液を混ぜた後、０℃で１０分間静置した。
次いで４２℃で９０秒間熱処理した後、この混合液を１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２０μｇ／ｍｌの５−
ブロモ−４−クロロ−インドリル−β−ガラクトサイド
（Ｘｇａｌ）を含むＬＢ寒天平板培地に塗布した。この
平板培地を３７℃にて約２４時間保温した。
ｌを含む三角フラスコに植菌し、３７℃で４時間振盪培
養した。ついで遠心分離（３０００rpm 、７分間）して
集めた菌体を０℃の５０ｍＭ塩化カルシウム溶液２０ｍ
ｌに懸濁し０℃にて２０分静置した後、上記と同様の遠
心分離にて集菌し、０℃、５０ｍＭの塩化カルシウム溶
液４０ｍｌに懸濁した。この懸濁液と上述の組換え体Ｄ
ＮＡを含む溶液を混ぜた後、０℃で１０分間静置した。
次いで４２℃で９０秒間熱処理した後、この混合液を１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２０μｇ／ｍｌの５−
ブロモ−４−クロロ−インドリル−β−ガラクトサイド
（Ｘｇａｌ）を含むＬＢ寒天平板培地に塗布した。この
平板培地を３７℃にて約２４時間保温した。
【００３０】出現したコロニーのうちの白色コロニーを
別々にＬＢ液体培地で培養し、集菌した後、常法により
プラスミドＤＮＡを抽出し、クローン化されたＤＮＡ断
片の塩基配列をジデオキシ法にて決定した。その結果、
配列番号１に示したアミノ酸配列に対応する塩基配列が
存在し、クローン化されたＤＮＡ断片はウリカーゼ遺伝
子のクローニング用プローブとして適していることがわ
かった。
別々にＬＢ液体培地で培養し、集菌した後、常法により
プラスミドＤＮＡを抽出し、クローン化されたＤＮＡ断
片の塩基配列をジデオキシ法にて決定した。その結果、
配列番号１に示したアミノ酸配列に対応する塩基配列が
存在し、クローン化されたＤＮＡ断片はウリカーゼ遺伝
子のクローニング用プローブとして適していることがわ
かった。
【００３１】実施例４ ウリカーゼ遺伝子のクローニ
ング １）ジーン・バンクの調製 実施例２で調製した染色体ＤＮＡ １μｇを含む溶液に
ＳｃａＩを加えて消化を行った。別にベクターｐＵＣ１
９ １μｇを含む溶液にＳｍａＩを加えて消化を行った
後、消化液２０μｌに１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）
およびアルカリフォスファターゼ１０Ｕを加え、６５℃
で１時間処理した。消化された染色体ＤＮＡおよびベク
ターＤＮＡを常法によりフェノール抽出およびエタノー
ル沈澱操作を行い精製した。精製染色体ＤＮＡ１００ｎ
ｇおよび精製ベクターＤＮＡ２０ｎｇを６６ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１
０ｍＭ ＤＴＴおよび０．１ｍＭ ＡＴＰを含有する溶
液３０μｌに溶解した後、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）を１０Ｕ添加し、１４℃で１６時間反応
させ、両方のＤＮＡを連結させ組換えＤＮＡをえた。
ング １）ジーン・バンクの調製 実施例２で調製した染色体ＤＮＡ １μｇを含む溶液に
ＳｃａＩを加えて消化を行った。別にベクターｐＵＣ１
９ １μｇを含む溶液にＳｍａＩを加えて消化を行った
後、消化液２０μｌに１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）
およびアルカリフォスファターゼ１０Ｕを加え、６５℃
で１時間処理した。消化された染色体ＤＮＡおよびベク
ターＤＮＡを常法によりフェノール抽出およびエタノー
ル沈澱操作を行い精製した。精製染色体ＤＮＡ１００ｎ
ｇおよび精製ベクターＤＮＡ２０ｎｇを６６ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１
０ｍＭ ＤＴＴおよび０．１ｍＭ ＡＴＰを含有する溶
液３０μｌに溶解した後、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）を１０Ｕ添加し、１４℃で１６時間反応
させ、両方のＤＮＡを連結させ組換えＤＮＡをえた。
【００３２】２）コロニーハイブリダイゼイション 実施例３の２）項で調製したプローブ用ＤＮＡ １μｇ
をノンラジオシステムＤＮＡ標識および検出キット（Ｄ
ＩＧ−ＥＬＩＳＡ法、カタログ番号１０９３６５７；ベ
ーリンガー・マンハイム社製）に従い標識し、これをウ
リカーゼ検出用プローブとした。
をノンラジオシステムＤＮＡ標識および検出キット（Ｄ
ＩＧ−ＥＬＩＳＡ法、カタログ番号１０９３６５７；ベ
ーリンガー・マンハイム社製）に従い標識し、これをウ
リカーゼ検出用プローブとした。
【００３３】次に、E. coliＤＨ５α株をＬＢ液体培地
５０ｍｌを含む三角フラスコに植菌し３７℃で４時間振
盪培養した。ついで遠心分離（３００rpm 、７分間）し
て集めた菌体を０℃の５０ｍＭ塩化カルシウム溶液２０
ｍｌに懸濁し、０℃にて２０分静置した後、前記と同様
に遠心分離にて集菌し、０℃、５０ｍＭの塩化カルシウ
ム溶液４０ｍｌに懸濁した。その懸濁液と上記の組換え
体ＤＮＡを含む溶液を混ぜ０℃で１０分間静置した。次
いで４２℃で９０秒間熱処理した後、この混合液を１０
０μｇ／ｍｌのアンピシリンと２０μｇ／ｍｌのＸｇａ
ｌを含むＬＢ寒天平板培地に塗布した。この平板培地を
３７℃にて約２４時間保温した。
５０ｍｌを含む三角フラスコに植菌し３７℃で４時間振
盪培養した。ついで遠心分離（３００rpm 、７分間）し
て集めた菌体を０℃の５０ｍＭ塩化カルシウム溶液２０
ｍｌに懸濁し、０℃にて２０分静置した後、前記と同様
に遠心分離にて集菌し、０℃、５０ｍＭの塩化カルシウ
ム溶液４０ｍｌに懸濁した。その懸濁液と上記の組換え
体ＤＮＡを含む溶液を混ぜ０℃で１０分間静置した。次
いで４２℃で９０秒間熱処理した後、この混合液を１０
０μｇ／ｍｌのアンピシリンと２０μｇ／ｍｌのＸｇａ
ｌを含むＬＢ寒天平板培地に塗布した。この平板培地を
３７℃にて約２４時間保温した。
【００３４】上記平板培地上にコロニーが形成された
後、この上にナイトラン膜などのメンブラン・フィルタ
ーＮＹ１３Ｎ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｅｕｌｌ
社製）をのせ、すぐに剥離した。これをうらがえして、
新しい１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天
平板培地に載せ、３７℃にて約１２時間保温した。上面
にコロニーが形成したメンブラン・フィルターを、平板
培地より剥離し、０．５Ｎ ＮａＯＨを含む濾紙上に１
０分間、０．５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．３）含む濾紙
上に５分間、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．５Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ７．３）含む濾紙上に５分間、２×ＳＳＣ
（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸三ナトリウ
ム、ｐＨ７．０）含む濾紙上に５分間、順次静置した
後、８０℃で約３時間加熱した。このメンブラン・フィ
ルターをノンラジオシステムＤＮＡ標識及び検出キット
（ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ法、カタログ番号 １０９３６５
７）に従い処理し、上記ウリカーゼ検出用プローブにて
検出した。この一連の操作により約１００００コロニー
から４株の陽性クローン（形質転換体）を得た。
後、この上にナイトラン膜などのメンブラン・フィルタ
ーＮＹ１３Ｎ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｅｕｌｌ
社製）をのせ、すぐに剥離した。これをうらがえして、
新しい１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天
平板培地に載せ、３７℃にて約１２時間保温した。上面
にコロニーが形成したメンブラン・フィルターを、平板
培地より剥離し、０．５Ｎ ＮａＯＨを含む濾紙上に１
０分間、０．５Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．３）含む濾紙
上に５分間、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む０．５Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ７．３）含む濾紙上に５分間、２×ＳＳＣ
（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸三ナトリウ
ム、ｐＨ７．０）含む濾紙上に５分間、順次静置した
後、８０℃で約３時間加熱した。このメンブラン・フィ
ルターをノンラジオシステムＤＮＡ標識及び検出キット
（ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ法、カタログ番号 １０９３６５
７）に従い処理し、上記ウリカーゼ検出用プローブにて
検出した。この一連の操作により約１００００コロニー
から４株の陽性クローン（形質転換体）を得た。
【００３５】３）クローン化遺伝子の確認 上記検出で陽性であった形質転換体を、１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリン含むＬＢ培地１０ｍｌを入れた試験管
に植菌し、３７℃にて約２４時間振盪培養した。培養物
から、遠心分離により培養菌体を得、無細胞抽出液を調
製した。かくして得られた無細胞抽出液を用いウリカー
ゼ活性を測定したところ、２〜４Ｕ／ｍｇ蛋白の活性が
検出された。さらに、上記の集菌菌体から常法に従いプ
ラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミド１μｇを含
む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを加
えて消化を行った。この反応液を０．５μｇ/ｍｌエチ
ジウムブロマイドを含む０．８％アガロース・ゲルにて
電気泳動を行い、挿入断片の断片長を測定し、常法に従
いナイトラン膜などのメンブラン・フィルターに移し
た。このメンブラン・フィルターをノンラジオシステム
ＤＮＡ標識及び検出キット（ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ法、カ
タログ番号 １０９３６５７）に従い処理し、上記ウリ
カーゼ検出用プローブにて検出した結果、すべて陽性を
示した。
ｌのアンピシリン含むＬＢ培地１０ｍｌを入れた試験管
に植菌し、３７℃にて約２４時間振盪培養した。培養物
から、遠心分離により培養菌体を得、無細胞抽出液を調
製した。かくして得られた無細胞抽出液を用いウリカー
ゼ活性を測定したところ、２〜４Ｕ／ｍｇ蛋白の活性が
検出された。さらに、上記の集菌菌体から常法に従いプ
ラスミドＤＮＡを調製した。このプラスミド１μｇを含
む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを加
えて消化を行った。この反応液を０．５μｇ/ｍｌエチ
ジウムブロマイドを含む０．８％アガロース・ゲルにて
電気泳動を行い、挿入断片の断片長を測定し、常法に従
いナイトラン膜などのメンブラン・フィルターに移し
た。このメンブラン・フィルターをノンラジオシステム
ＤＮＡ標識及び検出キット（ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ法、カ
タログ番号 １０９３６５７）に従い処理し、上記ウリ
カーゼ検出用プローブにて検出した結果、すべて陽性を
示した。
【００３６】これらの陽性であった形質転換体から１つ
を選び、常法に従いプラスミドを抽出後、クローン化さ
れたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その結果、陽性
形質転換体のプラスミド中にクローン化されたＤＮＡに
は上述のアミノ酸配列の結果と矛盾しないオープンリー
ディングフレームが存在し、ウリカーゼの構造遺伝子を
含んでいることを確認した。このプラスミド中のウリカ
ーゼ構造遺伝子は配列番号２に示す通りである。
を選び、常法に従いプラスミドを抽出後、クローン化さ
れたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その結果、陽性
形質転換体のプラスミド中にクローン化されたＤＮＡに
は上述のアミノ酸配列の結果と矛盾しないオープンリー
ディングフレームが存在し、ウリカーゼの構造遺伝子を
含んでいることを確認した。このプラスミド中のウリカ
ーゼ構造遺伝子は配列番号２に示す通りである。
【００３７】得られたウリカーゼをコードする遺伝子を
含む組換え体プラスミドをｐＵＳＣ３−５と命名した。
このｐＵＳＣ３−５の制限酵素地図を第３図に示す。
含む組換え体プラスミドをｐＵＳＣ３−５と命名した。
このｐＵＳＣ３−５の制限酵素地図を第３図に示す。
【００３８】実施例５ ウリカーゼ高発現プラスミド
の造成および微生物への導入 実施例４で得られたウリカーゼ構造遺伝子の上流にトリ
プトファンプロモーター配列およびｔｒｐＬのＳＤ配列
を導入するために、配列番号７のＰＣＲ用５’側プライ
マーと配列番号８の３’側プライマーを合成した。これ
らのプライマーを用い、ｐＵＳＣ３−５のＥｃｏＲＩ消
化物を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ
反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液２０μｌおよびベク
ターｐＴｒＳ３３ １μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎ
ｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを加えて消化を行った。消化
された上記ＤＮＡ断片およびベクターＤＮＡを連結さ
せ、プラスミドｐＵＴ２１を作成した。このプラスミド
ｐＵＴ２１をE. coliＤＨ５αに導入し、ウリカーゼ発
現株〔ＤＨ５α（ｐＵＴ２１）〕を得た。本株を後記実
施例６に記載されている方法で培養したが、ウリカーゼ
の発現量は５０Ｕ／ｍｌであり満足できるものではなか
った。
の造成および微生物への導入 実施例４で得られたウリカーゼ構造遺伝子の上流にトリ
プトファンプロモーター配列およびｔｒｐＬのＳＤ配列
を導入するために、配列番号７のＰＣＲ用５’側プライ
マーと配列番号８の３’側プライマーを合成した。これ
らのプライマーを用い、ｐＵＳＣ３−５のＥｃｏＲＩ消
化物を鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られたＰＣＲ
反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液２０μｌおよびベク
ターｐＴｒＳ３３ １μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎ
ｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを加えて消化を行った。消化
された上記ＤＮＡ断片およびベクターＤＮＡを連結さ
せ、プラスミドｐＵＴ２１を作成した。このプラスミド
ｐＵＴ２１をE. coliＤＨ５αに導入し、ウリカーゼ発
現株〔ＤＨ５α（ｐＵＴ２１）〕を得た。本株を後記実
施例６に記載されている方法で培養したが、ウリカーゼ
の発現量は５０Ｕ／ｍｌであり満足できるものではなか
った。
【００３９】そこで、ベクターｐＴｒＳ３３のＳＤ配列
をＬａｃＺのＳＤ配列に変更するために、配列番号９の
ＰＣＲ用５’側プライマーと配列番号１０の３’側プラ
イマーを合成した。これらのプライマーを用いｐＴｒＳ
３３のＰｓｔＩ消化物を鋳型としてＰＣＲ反応を行っ
た。得られたＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液
２０μｌおよびベクターｐＴｒＳ３３ １μｇを含む溶
液２０μｌにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを加えて
消化を行った。消化された上記ＤＮＡ断片およびベクタ
ーＤＮＡを連結させ、プラスミドｐＴＬ３３を作成し
た。
をＬａｃＺのＳＤ配列に変更するために、配列番号９の
ＰＣＲ用５’側プライマーと配列番号１０の３’側プラ
イマーを合成した。これらのプライマーを用いｐＴｒＳ
３３のＰｓｔＩ消化物を鋳型としてＰＣＲ反応を行っ
た。得られたＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液
２０μｌおよびベクターｐＴｒＳ３３ １μｇを含む溶
液２０μｌにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを加えて
消化を行った。消化された上記ＤＮＡ断片およびベクタ
ーＤＮＡを連結させ、プラスミドｐＴＬ３３を作成し
た。
【００４０】さらに、ウリカーゼのＮ末に相当する配列
番号３の塩基配列を、コードするアミノ酸に変化が生じ
ないように配列番号４の塩基配列に変更し、また、スト
ップ・コドンをＴＧＡからＴＡＡＴＡＡ（二重ストップ
・コドン）に置換し、ウリカーゼの構造遺伝子以外のセ
ルロモナス・フラビジェナ由来のＤＮＡを削除したもの
を得るために、配列番号１１のＰＣＲ用５’側プライマ
ーと配列番号１２の３’側プライマーを合成した。
番号３の塩基配列を、コードするアミノ酸に変化が生じ
ないように配列番号４の塩基配列に変更し、また、スト
ップ・コドンをＴＧＡからＴＡＡＴＡＡ（二重ストップ
・コドン）に置換し、ウリカーゼの構造遺伝子以外のセ
ルロモナス・フラビジェナ由来のＤＮＡを削除したもの
を得るために、配列番号１１のＰＣＲ用５’側プライマ
ーと配列番号１２の３’側プライマーを合成した。
【００４１】このプライマーを用いｐＵＴ２１のＥｃｏ
ＲＩ消化物を鋳型として、ＰＣＲ反応を行った。得られ
たＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液２０μｌお
よびベクタープラスミドｐＴＬ３３ １μｇを含む溶液
２０μｌににＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを加えて
消化を行った。消化された上記ＤＮＡ断片およびベクタ
ーＤＮＡを連結させ、プラスミドｐＵＴ１１８を作成し
た。このプラスミドｐＵＴ１１８をE. coliＤＨ５αに
導入し、ウリカーゼ高発現株〔ＤＨ５α（ｐＵＴ１１
８）〕（エシェリヒア・コリＤＨＵＴ１１８）を得た。
本株を後記実施例６に記載されている方法で培養した結
果、２００Ｕ／ｍｌのウリカーゼを生産した。
ＲＩ消化物を鋳型として、ＰＣＲ反応を行った。得られ
たＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液２０μｌお
よびベクタープラスミドｐＴＬ３３ １μｇを含む溶液
２０μｌににＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩを加えて
消化を行った。消化された上記ＤＮＡ断片およびベクタ
ーＤＮＡを連結させ、プラスミドｐＵＴ１１８を作成し
た。このプラスミドｐＵＴ１１８をE. coliＤＨ５αに
導入し、ウリカーゼ高発現株〔ＤＨ５α（ｐＵＴ１１
８）〕（エシェリヒア・コリＤＨＵＴ１１８）を得た。
本株を後記実施例６に記載されている方法で培養した結
果、２００Ｕ／ｍｌのウリカーゼを生産した。
【００４２】 実施例６ ウリカーゼ高発現微生物の培養 実施例５で得られたエシェリヒア・コリＤＨＵＴ１１８
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６４２）を培養する場合には、高
密度培養法〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエン
ジニアリング(Biotechnol.Bioeng. ) 17、227〜239、(1
975)〕が好適であり、以下の様に行った。エシェリヒア
・コリＤＨＵＴ１１８を下記組成からなる種培地５００
ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間培養した。 種培地組成：ＫＨ2 ＰＯ4 ３．５ｇ／ｌ、（ＮＨ4 ）
2 ＨＰＯ4 ３．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
１．０ｇ／ｌ、グルコース ５．０ｇ／ｌ、酵母エキス
５．０ｇ／ｌ、微量元素液 ３ｍｌ／ｌ（１２０℃、
３０分間蒸煮滅菌）。微量元素液組成：ＦｅＣｌ3 ・６
Ｈ2 Ｏ ２７ｇ／ｌ、ＺｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ２ｇ／ｌ、
ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２
Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ、
ＣｕＣｌ2 １ｇ／ｌ、Ｈ3 ＢＯ3 ０．５ｇ／ｌ、濃Ｈ
Ｃｌ １００ｍｌ／ｌ。
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６４２）を培養する場合には、高
密度培養法〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエン
ジニアリング(Biotechnol.Bioeng. ) 17、227〜239、(1
975)〕が好適であり、以下の様に行った。エシェリヒア
・コリＤＨＵＴ１１８を下記組成からなる種培地５００
ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間培養した。 種培地組成：ＫＨ2 ＰＯ4 ３．５ｇ／ｌ、（ＮＨ4 ）
2 ＨＰＯ4 ３．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
１．０ｇ／ｌ、グルコース ５．０ｇ／ｌ、酵母エキス
５．０ｇ／ｌ、微量元素液 ３ｍｌ／ｌ（１２０℃、
３０分間蒸煮滅菌）。微量元素液組成：ＦｅＣｌ3 ・６
Ｈ2 Ｏ ２７ｇ／ｌ、ＺｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ２ｇ／ｌ、
ＣｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２
Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ、
ＣｕＣｌ2 １ｇ／ｌ、Ｈ3 ＢＯ3 ０．５ｇ／ｌ、濃Ｈ
Ｃｌ １００ｍｌ／ｌ。
【００４３】次に、７．５リットル容量の発酵槽に３リ
ットルの発酵培地（上記組成からなる種培地３リットル
にさらにＫＨ2 ＰＯ4 ・３Ｈ2 Ｏ １０ｇおよびＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2 Ｏ ５ｇを加えて調製した培地）を封入
し、１２０℃で３０分間蒸煮滅菌した。５０％（Ｗ／
Ｖ）グルコース溶液１５０ｍｌを滅菌し、発酵槽に添加
した後、ＤＨＵＴ１１８株を培養した前記種培地５００
ｍｌを添加した。
ットルの発酵培地（上記組成からなる種培地３リットル
にさらにＫＨ2 ＰＯ4 ・３Ｈ2 Ｏ １０ｇおよびＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2 Ｏ ５ｇを加えて調製した培地）を封入
し、１２０℃で３０分間蒸煮滅菌した。５０％（Ｗ／
Ｖ）グルコース溶液１５０ｍｌを滅菌し、発酵槽に添加
した後、ＤＨＵＴ１１８株を培養した前記種培地５００
ｍｌを添加した。
【００４４】５．５Ｍアンモニア水を用いてｐＨ６．８
に調整しつつ、攪拌（６００ｒｐｍ）、通気（３ｌ／ｍ
ｉｎ）し、３３℃で２４時間培養を行った。培養開始後
４〜６時間で培養液中のグルコース濃度は２．５％以下
に低下した。この時点から５０％（Ｗ／Ｖ）グルコース
溶液を少量づつ連続的に発酵槽に添加し、培養液中のグ
ルコース濃度が２〜３％であるように保つた。
に調整しつつ、攪拌（６００ｒｐｍ）、通気（３ｌ／ｍ
ｉｎ）し、３３℃で２４時間培養を行った。培養開始後
４〜６時間で培養液中のグルコース濃度は２．５％以下
に低下した。この時点から５０％（Ｗ／Ｖ）グルコース
溶液を少量づつ連続的に発酵槽に添加し、培養液中のグ
ルコース濃度が２〜３％であるように保つた。
【００４５】本培養物中には、２００Ｕ／ｍｌのウリカ
ーゼが生産されていた。前記培養物の一部を遠心分離
し、湿菌体約１０ｇを得た。該湿菌体を緩衝液ａの１０
０ｍｌに懸濁し、超音波破砕機（ブランソン社製）にて
菌体を破砕した。破砕液を遠心分離し、上清１００ｍｌ
を得た。得られた上清に終濃度５０ｍＭとなるように硫
酸マグネシウムを添加し、水酸化カリウム溶液でｐＨ
８．５に調整した後、６０℃で３０分間保温した。この
液を遠心分離し、夾雑蛋白などを沈澱として除去した。
得られた上清を予め緩衝液ａにて平衡化したＤＥＡＥト
ヨパール６５０Ｓカラム（東ソー社製）（直径２．２ｃ
ｍ、長さ２０ｃｍ）に通塔した後、充分量の緩衝液ａで
洗浄した。その後、０Ｍ→０．４ＭのＮａＣｌ直線濃度
勾配を有す緩衝液ａ８００ｍｌで溶出しウリカーゼ活性
画分１００ｍｌを得た。このウリカーゼ活性画分を緩衝
液ａで透析後、終濃度１．５Ｍになるように硫酸アンモ
ニウムを添加し、水酸化カリウム溶液でｐＨ８．５に調
整した。この溶液を、予め１．５Ｍ硫酸アンモニウムを
含む緩衝液ａ（開始緩衝液２）にて平衡化したＢｕｔｙ
ｌトヨパール６５０Ｓカラム（直径２．２ｃｍ、長さ２
０ｃｍ）に通塔後、充分量の開始緩衝液２で洗浄した。
次いで、１．５Ｍ→０Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾
配を有す緩衝液ａ８００ｍｌでタンパクを溶出し、ウリ
カーゼ活性画分６０ｍｌを採取した。このウリカーゼ活
性画分を緩衝液ａで透析、脱塩し、最終的に、１５４０
０Ｕのウリカーゼを取得した。
ーゼが生産されていた。前記培養物の一部を遠心分離
し、湿菌体約１０ｇを得た。該湿菌体を緩衝液ａの１０
０ｍｌに懸濁し、超音波破砕機（ブランソン社製）にて
菌体を破砕した。破砕液を遠心分離し、上清１００ｍｌ
を得た。得られた上清に終濃度５０ｍＭとなるように硫
酸マグネシウムを添加し、水酸化カリウム溶液でｐＨ
８．５に調整した後、６０℃で３０分間保温した。この
液を遠心分離し、夾雑蛋白などを沈澱として除去した。
得られた上清を予め緩衝液ａにて平衡化したＤＥＡＥト
ヨパール６５０Ｓカラム（東ソー社製）（直径２．２ｃ
ｍ、長さ２０ｃｍ）に通塔した後、充分量の緩衝液ａで
洗浄した。その後、０Ｍ→０．４ＭのＮａＣｌ直線濃度
勾配を有す緩衝液ａ８００ｍｌで溶出しウリカーゼ活性
画分１００ｍｌを得た。このウリカーゼ活性画分を緩衝
液ａで透析後、終濃度１．５Ｍになるように硫酸アンモ
ニウムを添加し、水酸化カリウム溶液でｐＨ８．５に調
整した。この溶液を、予め１．５Ｍ硫酸アンモニウムを
含む緩衝液ａ（開始緩衝液２）にて平衡化したＢｕｔｙ
ｌトヨパール６５０Ｓカラム（直径２．２ｃｍ、長さ２
０ｃｍ）に通塔後、充分量の開始緩衝液２で洗浄した。
次いで、１．５Ｍ→０Ｍの硫酸アンモニウム直線濃度勾
配を有す緩衝液ａ８００ｍｌでタンパクを溶出し、ウリ
カーゼ活性画分６０ｍｌを採取した。このウリカーゼ活
性画分を緩衝液ａで透析、脱塩し、最終的に、１５４０
０Ｕのウリカーゼを取得した。
【００４６】
【発明の効果】本発明により収率よくウリカーゼを得る
ことができる。
ことができる。
【００４７】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：３１３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 起源 生物名：セルロモナス・フラビジェナ（Cellulomonas f
lavigena) 株名：ＳＫ−４ 起源 生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli) 株名：ＤＨＵＴ１１８ Met Ser Thr Thr Thr Pro Thr Ala Glu Gln Pro Ala Ala Thr Gln 15 Ser Ser Gly Ala Ile Val Leu Gly Asp Asn Gln Trp Gly Lys Ala 30 Glu Val Arg Leu Val Arg Val Asp Arg Ala Thr Pro Arg His Glu 45 Ile Thr Asp Val Asn Val Ser Ser Gln Leu Arg Gly Gly Gln Glu 60 Ala Thr His Leu Glu Gly Asp Asn Ser Arg Cys Val Ala Thr Asp 75 Thr Gln Lys Asn Thr Ile Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Val Gly 90 Ala Ile Glu Asp Phe Ala Ile Arg Leu Gly Gln His Phe Val Glu 105 Asp Phe Glu Trp Ile Glu Gly Gly Arg Trp Glu Ile Glu Gln Tyr 120 Thr Trp Asn Arg Ile Glu Thr Ala Asp Gly Glu His Asp His Ala 135 Phe Val Arg Asn Asn Gln Glu Thr Arg Thr Thr Val Val Gln Arg 150 Asp Gly Asp Glu Val Phe Val Val Ser Gly Leu Thr Asp Leu Val 165 Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp 180 Arg Tyr Thr Thr Leu Val Glu Thr Asn Asp Arg Ile Leu Ala Thr 195 Ser Val Thr Ser Arg Trp Arg Tyr Thr Thr Thr Asp Val Asp Phe 210 Asp Ala Val Tyr Ala Lys Val Arg Ala Ile Gln Leu Glu Ala Phe 225 Ala Thr Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Leu Phe Ala Met 240 Gly Lys Ala Val Leu Glu Ala Ile Pro Glu Ile Ala Glu Ile Lys 255 Phe Ser Met Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Ala Pro 270 Phe Gly Leu Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg 285 Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Val Gln Arg Glu Gly Glu Pro 300 Ala Glu Pro Arg Ala Trp Ala Thr Val Thr Gly Phe Cys 313
lavigena) 株名：ＳＫ−４ 起源 生物名：エシェリヒア・コリ（Escherichia coli) 株名：ＤＨＵＴ１１８ Met Ser Thr Thr Thr Pro Thr Ala Glu Gln Pro Ala Ala Thr Gln 15 Ser Ser Gly Ala Ile Val Leu Gly Asp Asn Gln Trp Gly Lys Ala 30 Glu Val Arg Leu Val Arg Val Asp Arg Ala Thr Pro Arg His Glu 45 Ile Thr Asp Val Asn Val Ser Ser Gln Leu Arg Gly Gly Gln Glu 60 Ala Thr His Leu Glu Gly Asp Asn Ser Arg Cys Val Ala Thr Asp 75 Thr Gln Lys Asn Thr Ile Tyr Ala Phe Ala Arg Asp Gly Val Gly 90 Ala Ile Glu Asp Phe Ala Ile Arg Leu Gly Gln His Phe Val Glu 105 Asp Phe Glu Trp Ile Glu Gly Gly Arg Trp Glu Ile Glu Gln Tyr 120 Thr Trp Asn Arg Ile Glu Thr Ala Asp Gly Glu His Asp His Ala 135 Phe Val Arg Asn Asn Gln Glu Thr Arg Thr Thr Val Val Gln Arg 150 Asp Gly Asp Glu Val Phe Val Val Ser Gly Leu Thr Asp Leu Val 165 Val Leu Lys Ser Thr Gly Ser Glu Phe His Gly Phe Pro Arg Asp 180 Arg Tyr Thr Thr Leu Val Glu Thr Asn Asp Arg Ile Leu Ala Thr 195 Ser Val Thr Ser Arg Trp Arg Tyr Thr Thr Thr Asp Val Asp Phe 210 Asp Ala Val Tyr Ala Lys Val Arg Ala Ile Gln Leu Glu Ala Phe 225 Ala Thr Thr His Ser Leu Ala Leu Gln Gln Thr Leu Phe Ala Met 240 Gly Lys Ala Val Leu Glu Ala Ile Pro Glu Ile Ala Glu Ile Lys 255 Phe Ser Met Pro Asn Lys His His Phe Leu Val Asp Leu Ala Pro 270 Phe Gly Leu Asp Asn Pro Asn Glu Val Phe Tyr Ala Ala Asp Arg 285 Pro Tyr Gly Leu Ile Glu Ala Thr Val Gln Arg Glu Gly Glu Pro 300 Ala Glu Pro Arg Ala Trp Ala Thr Val Thr Gly Phe Cys 313
【００４８】配列番号：２ 配列の長さ：９４２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：セルロモナス・フラビシェナ（Cellulomonas f
lavigena) 株名：ＳＫ−４ ATGAGCACGA CCACCCCGAC CGCCGAGCAG CCGGCGGCCA CGCAGAGCAG CGGGGCCATC 60 GTCCTGGGCG ACAACCAGTG GGGCAAGGCG GAGGTGCGCC TCGTGCGCGT CGACCGCGCC 120 ACGCCTCGCC ACGAGATCAC GGACGTCAAC GTCTCCTCGC AGCTGCGGGG CGGGCAGGAG 180 GCCACGCACC TGGAGGGCGA CAACTCCCGG TGCGTCGCCA CCGACACCCA GAAGAACACG 240 ATCTACGCCT TCGCCCGCGA CGGCGTCGGC GCGATCGAGG ACTTCGCGAT CCGCCTCGGT 300 CAGCACTTCG TCGAGGACTT CGAGTGGATC GAGGGCGGCC GCTGGGAGAT CGAGCAGTAC 360 ACCTGGAACC GCATCGAGAC CGCCGACGGC GAGCACGACC ACGCGTTCGT CCGGAACAAC 420 CAGGAGACGC GCACGACGGT CGTCCAGCGC GACGGCGACG AGGTCTTCGT CGTCTCGGGA 480 CTCACGGACC TCGTCGTGCT CAAGTCCACC GGCTCGGAGT TCCACGGGTT CCCGCGCGAC 540 CGCTACACGA CGCTCGTGGA GACCAACGAC CGCATCCTCG CGACGTCGGT CACCTCGCGG 600 TGGCGCTACA CGACCACCGA CGTCGACTTC GACGCCGTGT ACGCGAAGGT CCGCGCGATC 660 CAGCTCGAGG CGTTCGCGAC GACCCACTCC CTCGCGCTCC AGCAGACGCT GTTCGCGATG 720 GGCAAGGCGG TCCTCGAGGC GATCCCGGAG ATCGCCGAGA TCAAGTTCTC GATGCCGAAC 780 AAGCACCACT TCCTCGTGGA CCTCGCGCCG TTCGGCCTCG ACAACCCGAA CGAGGTCTTC 840 TACGCGGCCG ACCGCCCGTA CGGCCTCATC GAGGCGACGG TCCAGCGCGA GGGCGAGCCG 900 GCCGAGCCGC GCGCCTGGGC GACCGTCACC GGGTTCTGCT GA 942
lavigena) 株名：ＳＫ−４ ATGAGCACGA CCACCCCGAC CGCCGAGCAG CCGGCGGCCA CGCAGAGCAG CGGGGCCATC 60 GTCCTGGGCG ACAACCAGTG GGGCAAGGCG GAGGTGCGCC TCGTGCGCGT CGACCGCGCC 120 ACGCCTCGCC ACGAGATCAC GGACGTCAAC GTCTCCTCGC AGCTGCGGGG CGGGCAGGAG 180 GCCACGCACC TGGAGGGCGA CAACTCCCGG TGCGTCGCCA CCGACACCCA GAAGAACACG 240 ATCTACGCCT TCGCCCGCGA CGGCGTCGGC GCGATCGAGG ACTTCGCGAT CCGCCTCGGT 300 CAGCACTTCG TCGAGGACTT CGAGTGGATC GAGGGCGGCC GCTGGGAGAT CGAGCAGTAC 360 ACCTGGAACC GCATCGAGAC CGCCGACGGC GAGCACGACC ACGCGTTCGT CCGGAACAAC 420 CAGGAGACGC GCACGACGGT CGTCCAGCGC GACGGCGACG AGGTCTTCGT CGTCTCGGGA 480 CTCACGGACC TCGTCGTGCT CAAGTCCACC GGCTCGGAGT TCCACGGGTT CCCGCGCGAC 540 CGCTACACGA CGCTCGTGGA GACCAACGAC CGCATCCTCG CGACGTCGGT CACCTCGCGG 600 TGGCGCTACA CGACCACCGA CGTCGACTTC GACGCCGTGT ACGCGAAGGT CCGCGCGATC 660 CAGCTCGAGG CGTTCGCGAC GACCCACTCC CTCGCGCTCC AGCAGACGCT GTTCGCGATG 720 GGCAAGGCGG TCCTCGAGGC GATCCCGGAG ATCGCCGAGA TCAAGTTCTC GATGCCGAAC 780 AAGCACCACT TCCTCGTGGA CCTCGCGCCG TTCGGCCTCG ACAACCCGAA CGAGGTCTTC 840 TACGCGGCCG ACCGCCCGTA CGGCCTCATC GAGGCGACGG TCCAGCGCGA GGGCGAGCCG 900 GCCGAGCCGC GCGCCTGGGC GACCGTCACC GGGTTCTGCT GA 942
【００４９】配列番号：３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴：Ｎ末６アミノ酸をコードするＤＮＡ 配列 ATGAGCACGACCACCCCG
【００５０】配列番号：４ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ATGTCTACTACTACTCCG
【００５１】配列番号：５ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
【００５２】配列番号：６ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ
【００５３】配列番号：７ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGAAAGCTTATGACGACGACCACCCCGACCGCCGA GCAG
【００５４】配列番号：８ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGACTCTAGAGGATCCTCCGCGGTCGGGCAGGGCGC
【００５５】配列番号：９ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTCAAGAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCG
【００５６】配列番号：１０ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTCATAAGCTTTTCCTGTATAGGTCGAGTTGCGTAC
【００５７】配列番号：１１ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGAAAGCTTATGTCTACTACTACTCCGACCGCCGA GCAG
【００５８】配列番号：１２ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTCGGATCCTTATTAGCAGAACCCGGTGAC
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】第１図はベクタープラスミドｐＴｒＳ３３の制
限酵素地図を示す。
限酵素地図を示す。
【図２】第２図はベクタープラスミドｐＴＬ３３の制限
酵素地図を示す。
酵素地図を示す。
【図３】第３図はセルロモナス・フラビジェナＳＫ−４
由来のウリカーゼをコードする遺伝子を含むプラスミド
ｐＵＳＣ３−５の制限酵素地図を示す。
由来のウリカーゼをコードする遺伝子を含むプラスミド
ｐＵＳＣ３−５の制限酵素地図を示す。
【図４】第４図は天然型ウリカーゼ構造遺伝子をトリプ
トファンプロモーターの支配下に組み込んだウリカーゼ
発現ベクターｐＵＴ２１の制限酵素地図を示す。
トファンプロモーターの支配下に組み込んだウリカーゼ
発現ベクターｐＵＴ２１の制限酵素地図を示す。
【図５】第５図はウリカーゼ構造遺伝子の５’−末端の
上流部分、Ｎ−末部分およびストップ・コドンの塩基配
列を変化させたウリカーゼ高発現プラスミドｐＵＴ１１
８の制限酵素地図を示す。
上流部分、Ｎ−末部分およびストップ・コドンの塩基配
列を変化させたウリカーゼ高発現プラスミドｐＵＴ１１
８の制限酵素地図を示す。
【符号の説明】 ＊ Ｎ末４アミノ酸のコドンの３番目の塩基をＴに置換
した。 ＊＊ストップ・コドンをＴＡＡＴＡＡ（２重ストップ・
コドン）に置換した。 ─────────────────────────────────────────────────────
した。 ＊＊ストップ・コドンをＴＡＡＴＡＡ（２重ストップ・
コドン）に置換した。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年１月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２７】実施例３ ウリカーゼ遺伝子クローニン
グ用のプローブの調製 １）プローブ用ＤＮＡ断片の増幅 上述のアミノ酸配列のデータをもとにそのアミノ酸配列
に対応する配列番号５のＰＣＲ用５’側プライマー（Ｎ
末付近の配列に対応）と配列番号６の３’側プライマー
を設計し（アミノ酸配列Ａ）、リン酸アミダイド法によ
る固相合成法［S.L.Beaucageら、テトラヘドロン・レタ
ー(Tetrahedron Lett.)、22, 1859 (1981）］に従い、
ＤＮＡ自動合成機３８０Ａ（アプライドバイオシステム
社製）を用いて合成した。ＰＣＲはジーンＡｍｐＤＮＡ
アンプリフィケーションリージェントキット（宝酒造社
製）を用い、前記で調製したセルロモナス・フラビジェ
ナの染色体ＤＮＡ １ng／１００μl を鋳型として、上
記の合成ＤＮＡ各１．０μM をプライマーとして、ｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰを各２００μＭ、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ／１００μｌにし
て９４℃で1.５分間、４０℃で２分間、７２℃で２分間
の反応を３０回繰り返し、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を
取得した。
グ用のプローブの調製 １）プローブ用ＤＮＡ断片の増幅 上述のアミノ酸配列のデータをもとにそのアミノ酸配列
に対応する配列番号５のＰＣＲ用５’側プライマー（Ｎ
末付近の配列に対応）と配列番号６の３’側プライマー
を設計し（アミノ酸配列Ａ）、リン酸アミダイド法によ
る固相合成法［S.L.Beaucageら、テトラヘドロン・レタ
ー(Tetrahedron Lett.)、22, 1859 (1981）］に従い、
ＤＮＡ自動合成機３８０Ａ（アプライドバイオシステム
社製）を用いて合成した。ＰＣＲはジーンＡｍｐＤＮＡ
アンプリフィケーションリージェントキット（宝酒造社
製）を用い、前記で調製したセルロモナス・フラビジェ
ナの染色体ＤＮＡ １ng／１００μl を鋳型として、上
記の合成ＤＮＡ各１．０μM をプライマーとして、ｄＡ
ＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰを各２００μＭ、
ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを２．５Ｕ／１００μｌにし
て９４℃で1.５分間、４０℃で２分間、７２℃で２分間
の反応を３０回繰り返し、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を
取得した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３３】次に、E. coliＤＨ５α株をＬＢ液体培地
５０ｍｌを含む三角フラスコに植菌し３７℃で４時間振
盪培養した。ついで遠心分離（３０００rpm 、７分間）
して集めた菌体を０℃の５０ｍＭ塩化カルシウム溶液２
０ｍｌに懸濁し、０℃にて２０分静置した後、前記と同
様に遠心分離にて集菌し、０℃、５０ｍＭの塩化カルシ
ウム溶液４０ｍｌに懸濁した。その懸濁液と上記の組換
え体ＤＮＡを含む溶液を混ぜ０℃で１０分間静置した。
次いで４２℃で９０秒間熱処理した後、この混合液を１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２０μｇ／ｍｌのＸｇ
ａｌを含むＬＢ寒天平板培地に塗布した。この平板培地
を３７℃にて約２４時間保温した。
５０ｍｌを含む三角フラスコに植菌し３７℃で４時間振
盪培養した。ついで遠心分離（３０００rpm 、７分間）
して集めた菌体を０℃の５０ｍＭ塩化カルシウム溶液２
０ｍｌに懸濁し、０℃にて２０分静置した後、前記と同
様に遠心分離にて集菌し、０℃、５０ｍＭの塩化カルシ
ウム溶液４０ｍｌに懸濁した。その懸濁液と上記の組換
え体ＤＮＡを含む溶液を混ぜ０℃で１０分間静置した。
次いで４２℃で９０秒間熱処理した後、この混合液を１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２０μｇ／ｍｌのＸｇ
ａｌを含むＬＢ寒天平板培地に塗布した。この平板培地
を３７℃にて約２４時間保温した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３９】そこで、ベクターｐＴｒＳ３３のＳＤ配列
をｌａｃＺのＳＤ配列に変更するために、配列番号９の
ＰＣＲ用５’側プライマーと配列番号１０の３’側プラ
イマーを合成した。これらのプライマーを用いｐＴｒＳ
３３のＰｓｔＩ消化物を鋳型としてＰＣＲ反応を行っ
た。得られたＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液
２０μｌおよびベクターｐＴｒＳ３３ １μｇを含む溶
液２０μｌにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを加えて
消化を行った。消化された上記ＤＮＡ断片およびベクタ
ーＤＮＡを連結させ、プラスミドｐＴＬ３３を作成し
た。
をｌａｃＺのＳＤ配列に変更するために、配列番号９の
ＰＣＲ用５’側プライマーと配列番号１０の３’側プラ
イマーを合成した。これらのプライマーを用いｐＴｒＳ
３３のＰｓｔＩ消化物を鋳型としてＰＣＲ反応を行っ
た。得られたＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片１μｇを含む溶液
２０μｌおよびベクターｐＴｒＳ３３ １μｇを含む溶
液２０μｌにＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを加えて
消化を行った。消化された上記ＤＮＡ断片およびベクタ
ーＤＮＡを連結させ、プラスミドｐＴＬ３３を作成し
た。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】第４図は天然型ウリカーゼ構造遺伝子をトリプ
トファンプロモーターの支配下に組み込んだウリカーゼ
発現プラスミドｐＵＴ２１の制限酵素地図を示す。
トファンプロモーターの支配下に組み込んだウリカーゼ
発現プラスミドｐＵＴ２１の制限酵素地図を示す。
【手続補正書】
【提出日】平成５年２月２６日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２５】
【実施例】 実施例１ セルロモナス・フラビジェナＳＫ−４（Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−１５７５）を用いるウリカーゼの製造 セルロモナス・フラビジェナＳＫ−４を培地〔ペプトン
１．０％、コーンスティープリカー１．０％、サンヨー
核酸（山陽国策パルプ社製）０．５％、肉エキス０．５
％、酵母エキス０．３％、シュークロース０．７％、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
０．０５％（ｐＨ７．２）〕３００ｍｌを含む三角フ
ラスコに植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。得ら
れた培養物の一部を遠心分離し、湿菌体約１０ｇを得
た。これを１００ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭ ほう酸−炭
酸ナトリウム−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）；以
下、緩衝液ａという〕に懸濁し、超音波破砕機（ブラン
ソン社製）にて菌体を破砕した。破砕液を遠心分離し、
上清１００ｍｌを得た。得られた上清を予め緩衝液ａに
て平衡化したＨＰＡ−７５カラム（三菱化成社製；ハイ
ポーラス型強塩基性陰イオン交換樹脂）に通塔した後、
該樹脂量の５倍量の０．５Ｍ酢酸アンモニウムを含む緩
衝液ａで洗浄した。その後、該樹脂量の５倍量の０．３
Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液ａでウリカーゼ活性画
分を溶出した。このウリカーゼ活性画分を緩衝液ａで透
析後、終濃度１．１Ｍになるように硫酸アンモニウムを
添加し、水酸化カリウム溶液でｐＨ８．５に調整した。
この溶液を、予め１．１Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝
液ａ（開始緩衝液１）にて平衡化したＢｕｔｙｌトヨパ
ール６５０Ｃカラム（東ソー社製）に通塔後、充分量の
開始緩衝液１で洗浄した。次いで、１．１Ｍ→０Ｍの硫
酸アンモニウム直線濃度勾配を有す緩衝液ａでタンパク
を溶出し、ウリカーゼ活性画分を採取した。このウリカ
ーゼ活性画分を緩衝液ａで透析、脱塩し、最終的に、１
００Ｕのウリカーゼを取得した。本酵素標品を、逆相HP
LC（YMC-AM312, 0.1%TFA−アセトニトリルのグラジェン
ト溶出）で脱塩した後、アミノ酸シークエンサー４７０
Ａ方（アプライドバイオシステム社）を用いて、Ｎ末ア
ミノ酸２２残基の配列を決定したところ、配列番号１に
示したアミノ酸配列と一致した。本酵素の第一アミノ酸
のメチオニンは切除されていた。またリジルエンドペプ
チダーゼにて本酵素を分解したぺプチド群から２種類の
ペプチドを分離取得し、アミノ酸配列の１６９番目のSe
r から１８３番目のThr までの配列と、他方は、２４３
番目のAla から２５４番目のIle までの配列（アミノ酸
配列Ａ）と一致した。
ＥＲＭ ＢＰ−１５７５）を用いるウリカーゼの製造 セルロモナス・フラビジェナＳＫ−４を培地〔ペプトン
１．０％、コーンスティープリカー１．０％、サンヨー
核酸（山陽国策パルプ社製）０．５％、肉エキス０．５
％、酵母エキス０．３％、シュークロース０．７％、Ｍ
ｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０５％、ＦｅＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
０．０５％（ｐＨ７．２）〕３００ｍｌを含む三角フ
ラスコに植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。得ら
れた培養物の一部を遠心分離し、湿菌体約１０ｇを得
た。これを１００ｍｌの緩衝液〔５０ｍＭ ほう酸−炭
酸ナトリウム−塩化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）；以
下、緩衝液ａという〕に懸濁し、超音波破砕機（ブラン
ソン社製）にて菌体を破砕した。破砕液を遠心分離し、
上清１００ｍｌを得た。得られた上清を予め緩衝液ａに
て平衡化したＨＰＡ−７５カラム（三菱化成社製；ハイ
ポーラス型強塩基性陰イオン交換樹脂）に通塔した後、
該樹脂量の５倍量の０．５Ｍ酢酸アンモニウムを含む緩
衝液ａで洗浄した。その後、該樹脂量の５倍量の０．３
Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝液ａでウリカーゼ活性画
分を溶出した。このウリカーゼ活性画分を緩衝液ａで透
析後、終濃度１．１Ｍになるように硫酸アンモニウムを
添加し、水酸化カリウム溶液でｐＨ８．５に調整した。
この溶液を、予め１．１Ｍ硫酸アンモニウムを含む緩衝
液ａ（開始緩衝液１）にて平衡化したＢｕｔｙｌトヨパ
ール６５０Ｃカラム（東ソー社製）に通塔後、充分量の
開始緩衝液１で洗浄した。次いで、１．１Ｍ→０Ｍの硫
酸アンモニウム直線濃度勾配を有す緩衝液ａでタンパク
を溶出し、ウリカーゼ活性画分を採取した。このウリカ
ーゼ活性画分を緩衝液ａで透析、脱塩し、最終的に、１
００Ｕのウリカーゼを取得した。本酵素標品を、逆相HP
LC（YMC-AM312, 0.1%TFA−アセトニトリルのグラジェン
ト溶出）で脱塩した後、アミノ酸シークエンサー４７０
Ａ方（アプライドバイオシステム社）を用いて、Ｎ末ア
ミノ酸２２残基の配列を決定したところ、配列番号１に
示したアミノ酸配列と一致した。本酵素の第一アミノ酸
のメチオニンは切除されていた。またリジルエンドペプ
チダーゼにて本酵素を分解したぺプチド群から２種類の
ペプチドを分離取得し、アミノ酸配列の１６９番目のSe
r から１８３番目のThr までの配列と、他方は、２４３
番目のAla から２５４番目のIle までの配列（アミノ酸
配列Ａ）と一致した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２６】実施例２ セルロモナス・フラビジェナ
ＳＫ−４の染色体ＤＮＡの単離 実施例１で得られたセルロモナス・フラビジェナＳＫ−
４の培養菌体約１５ｇを２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１２０ｍｌに懸濁した。
この懸濁液にリゾチーム溶液〔リゾチームを２０ｍｇ／
ｍｌの割合で、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解したもの〕１５ｍｌを
加え、３０℃で１時間放置した。これに２０％ラウリル
硫酸ナトリウム溶液１５ｍｌを加え、ゆっくりと攪拌し
た。次にこの溶液に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．５）を飽和したフェノール１５０
ｍｌを加え、充分に攪拌した。この溶液を遠心分離にか
け、水層１５０ｍｌを分取した。ついで、このフェノー
ル抽出の操作を３回繰り返した。得られた水層１５０ｍ
ｌに２．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液１５ｍｌを加えた後、
さらにエタノール３００ｍｌを加えた。析出した染色体
ＤＮＡをガラス棒にて巻取り、乾燥した。次いで、これ
を１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．５）３０ｍｌに溶解した。これにリボヌクレアーゼ
を５０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で３０分間
放置した。前述と同様のフェノール抽出操作を行なった
後、水層に２．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液３ｍｌおよびエ
タノール６０ｍｌを加えた後、−２０℃にて１６時間放
置した。遠心分離し、得られたペレットを７０％エタノ
ール溶液にて洗浄し、乾燥させ精製染色体ＤＮＡを得
た。これを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．５）に懸濁し、−２０℃で保存した。
ＳＫ−４の染色体ＤＮＡの単離 実施例１で得られたセルロモナス・フラビジェナＳＫ−
４の培養菌体約１５ｇを２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍ
Ｍトリス緩衝液（ｐＨ７．５）１２０ｍｌに懸濁した。
この懸濁液にリゾチーム溶液〔リゾチームを２０ｍｇ／
ｍｌの割合で、２ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解したもの〕１５ｍｌを
加え、３０℃で１時間放置した。これに２０％ラウリル
硫酸ナトリウム溶液１５ｍｌを加え、ゆっくりと攪拌し
た。次にこの溶液に１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭト
リス緩衝液（ｐＨ７．５）を飽和したフェノール１５０
ｍｌを加え、充分に攪拌した。この溶液を遠心分離にか
け、水層１５０ｍｌを分取した。ついで、このフェノー
ル抽出の操作を３回繰り返した。得られた水層１５０ｍ
ｌに２．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液１５ｍｌを加えた後、
さらにエタノール３００ｍｌを加えた。析出した染色体
ＤＮＡをガラス棒にて巻取り、乾燥した。次いで、これ
を１ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ
７．５）３０ｍｌに溶解した。これにリボヌクレアーゼ
を５０μｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で３０分間
放置した。前述と同様のフェノール抽出操作を行なった
後、水層に２．５Ｍ酢酸ナトリウム溶液３ｍｌおよびエ
タノール６０ｍｌを加えた後、−２０℃にて１６時間放
置した。遠心分離し、得られたペレットを７０％エタノ
ール溶液にて洗浄し、乾燥させ精製染色体ＤＮＡを得
た。これを１ｍＭ ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ７．５）に懸濁し、−２０℃で保存した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】２）プローブＤＮＡ断片のクローニング 上記のごとく反応して得られたＰＣＲ反応物ＤＮＡ断片
１μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃ
ｏＲＩを加えて消化を行った。別にベクターｐＵＣ１９
１μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥ
ｃｏＲＩを加えて消化した。消化された上記ＤＮＡ断片
およびベクターＤＮＡをフェノール抽出およびエタノー
ル沈澱操作により精製した。精製ＤＮＡ１００ｎｇおよ
び精製ベクターＤＮＡ２０ｎｇを６６ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ
ＤＴＴおよび０．１ｍＭ ＡＴＰを含有する溶液に懸
濁した。これにＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を１
０Ｕ添加した後、１４℃で１６時間反応させ、両方のＤ
ＮＡを連結させ、組換え体ＤＮＡを得た。
１μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃ
ｏＲＩを加えて消化を行った。別にベクターｐＵＣ１９
１μｇを含む溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥ
ｃｏＲＩを加えて消化した。消化された上記ＤＮＡ断片
およびベクターＤＮＡをフェノール抽出およびエタノー
ル沈澱操作により精製した。精製ＤＮＡ１００ｎｇおよ
び精製ベクターＤＮＡ２０ｎｇを６６ｍＭトリス緩衝液
（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１０ｍＭ
ＤＴＴおよび０．１ｍＭ ＡＴＰを含有する溶液に懸
濁した。これにＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を１
０Ｕ添加した後、１４℃で１６時間反応させ、両方のＤ
ＮＡを連結させ、組換え体ＤＮＡを得た。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３１】 実施例４ ウリカーゼ遺伝子のクローニング １）ジーン・バンクの調製 実施例２で調製した染色体ＤＮＡ １μｇを含む溶液に
ＳｃａＩを加えて消化を行った。別にベクターｐＵＣ１
９ １μｇを含む溶液にＳｍａＩを加えて消化を行った
後、消化液２０μｌに１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）
およびアルカリフォスファターゼ１０Ｕを加え、６５℃
で１時間処理した。消化された染色体ＤＮＡおよびベク
ターＤＮＡを常法によりフェノール抽出およびエタノー
ル沈澱操作を行い精製した。精製染色体ＤＮＡ１００ｎ
ｇおよび精製ベクターＤＮＡ２０ｎｇを６６ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１
０ｍＭ ＤＴＴおよび０．１ｍＭ ＡＴＰを含有する溶
液３０μｌに溶解した後、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）を１０Ｕ添加し、１４℃で１６時間反応
させ、両方のＤＮＡを連結させ組換え体ＤＮＡをえた。
ＳｃａＩを加えて消化を行った。別にベクターｐＵＣ１
９ １μｇを含む溶液にＳｍａＩを加えて消化を行った
後、消化液２０μｌに１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）
およびアルカリフォスファターゼ１０Ｕを加え、６５℃
で１時間処理した。消化された染色体ＤＮＡおよびベク
ターＤＮＡを常法によりフェノール抽出およびエタノー
ル沈澱操作を行い精製した。精製染色体ＤＮＡ１００ｎ
ｇおよび精製ベクターＤＮＡ２０ｎｇを６６ｍＭトリス
緩衝液（ｐＨ７．６）、６６ｍＭ塩化マグネシウム、１
０ｍＭ ＤＴＴおよび０．１ｍＭ ＡＴＰを含有する溶
液３０μｌに溶解した後、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ
（宝酒造社製）を１０Ｕ添加し、１４℃で１６時間反応
させ、両方のＤＮＡを連結させ組換え体ＤＮＡをえた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３５
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３５】３）クローン化遺伝子の確認 上記検出で陽性であった形質転換体を、１００μｇ／ｍ
ｌのアンピシリン含むＬＢ培地１０ｍｌを入れた試験管
に植菌し、３７℃にて約２４時間振盪培養した。培養物
から、遠心分離により培養菌体を得、無細胞抽出液を調
製した。かくして得られた無細胞抽出液を用いウリカー
ゼ活性を測定したところ、２〜４Ｕ／ｍｇ蛋白の活性が
検出された。さらに、上記の集菌体から常法に従いプラ
スミドＤＮＡを調製した。このプラスミド１μｇを含む
溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを加え
て消化を行った。この反応液を０．５μｇ/ｍｌエチジ
ウムブロマイドを含む０．８％アガロース・ゲルにて電
気泳動を行い、挿入断片の断片長を測定し、常法に従い
ナイトラン膜などのメンブラン・フィルターに移した。
このメンブラン・フィルターをノンラジオシステムＤＮ
Ａ標識及び検出キット（ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ法、カタロ
グ番号 １０９３６５７）に従い処理し、上記ウリカー
ゼ検出用プローブにて検出した結果、すべて陽性を示し
た。
ｌのアンピシリン含むＬＢ培地１０ｍｌを入れた試験管
に植菌し、３７℃にて約２４時間振盪培養した。培養物
から、遠心分離により培養菌体を得、無細胞抽出液を調
製した。かくして得られた無細胞抽出液を用いウリカー
ゼ活性を測定したところ、２〜４Ｕ／ｍｇ蛋白の活性が
検出された。さらに、上記の集菌体から常法に従いプラ
スミドＤＮＡを調製した。このプラスミド１μｇを含む
溶液２０μｌにＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを加え
て消化を行った。この反応液を０．５μｇ/ｍｌエチジ
ウムブロマイドを含む０．８％アガロース・ゲルにて電
気泳動を行い、挿入断片の断片長を測定し、常法に従い
ナイトラン膜などのメンブラン・フィルターに移した。
このメンブラン・フィルターをノンラジオシステムＤＮ
Ａ標識及び検出キット（ＤＩＧ−ＥＬＩＳＡ法、カタロ
グ番号 １０９３６５７）に従い処理し、上記ウリカー
ゼ検出用プローブにて検出した結果、すべて陽性を示し
た。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４２】 実施例６ ウリカーゼ高発現微生物の培養 実施例５で得られたエシェリヒア・コリＤＨＵＴ１１８
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６４２）を培養する場合には、高
密度培養法〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエン
ジニアリング(Biotechnol.Bioeng. ) 17、227〜239、(1
975)〕が好適であり、以下の様に行った。エシェリヒア
・コリＤＨＵＴ１１８を下記組成からなる種培地５００
ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間培養した。 種培地組成：ＫＨ2 ＰＯ4 ３．５ｇ／ｌ、（ＮＨ4 ）
2 ＨＰＯ4 ３．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
１．０ｇ／ｌ、グルコース ５．０ｇ／ｌ、酵母エキス
５０ｇ／ｌ、微量元素液 ３ｍｌ／ｌ（１２０℃、３
０分間蒸煮滅菌）。微量元素液組成：ＦｅＣｌ3 ・６Ｈ
2 Ｏ ２７ｇ／ｌ、ＺｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ２ｇ／ｌ、Ｃ
ｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ
2 Ｏ ２ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ、Ｃ
ｕＣｌ2 １ｇ／ｌ、Ｈ3 ＢＯ3 ０．５ｇ／ｌ、濃ＨＣ
ｌ １００ｍｌ／ｌ。
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３６４２）を培養する場合には、高
密度培養法〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエン
ジニアリング(Biotechnol.Bioeng. ) 17、227〜239、(1
975)〕が好適であり、以下の様に行った。エシェリヒア
・コリＤＨＵＴ１１８を下記組成からなる種培地５００
ｍｌに植菌し、３０℃で１６時間培養した。 種培地組成：ＫＨ2 ＰＯ4 ３．５ｇ／ｌ、（ＮＨ4 ）
2 ＨＰＯ4 ３．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ
１．０ｇ／ｌ、グルコース ５．０ｇ／ｌ、酵母エキス
５０ｇ／ｌ、微量元素液 ３ｍｌ／ｌ（１２０℃、３
０分間蒸煮滅菌）。微量元素液組成：ＦｅＣｌ3 ・６Ｈ
2 Ｏ ２７ｇ／ｌ、ＺｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ２ｇ／ｌ、Ｃ
ｏＣｌ2 ・６Ｈ2 Ｏ ２ｇ／ｌ、Ｎａ2 ＭｏＯ4 ・２Ｈ
2 Ｏ ２ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ １ｇ／ｌ、Ｃ
ｕＣｌ2 １ｇ／ｌ、Ｈ3 ＢＯ3 ０．５ｇ／ｌ、濃ＨＣ
ｌ １００ｍｌ／ｌ。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４３】次に、７．５リットル容量の発酵槽に３リ
ットルの発酵培地（上記組成からなる種培地３リットル
にさらにＫＨ2 ＰＯ4 ・３Ｈ2 Ｏ １０ｇおよびＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2 Ｏ ５ｇを加えて調製した培地）を封入
し、１２０℃で３０分間蒸煮滅菌した。５０％（Ｗ／
Ｗ）グルコース溶液１５０ｍｌを滅菌し、発酵槽に添加
した後、ＤＨＵＴ１１８株を培養した前記種培地５００
ｍｌを添加した。
ットルの発酵培地（上記組成からなる種培地３リットル
にさらにＫＨ2 ＰＯ4 ・３Ｈ2 Ｏ １０ｇおよびＭｇＳ
Ｏ4・７Ｈ2 Ｏ ５ｇを加えて調製した培地）を封入
し、１２０℃で３０分間蒸煮滅菌した。５０％（Ｗ／
Ｗ）グルコース溶液１５０ｍｌを滅菌し、発酵槽に添加
した後、ＤＨＵＴ１１８株を培養した前記種培地５００
ｍｌを添加した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５３】配列番号：７ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGAAAGCTTATGAGCACGACCACCCCGACCGCCGA GCAG
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/06 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 長谷川 勝 東京都町田市旭町３−６−６ (72)発明者 山口 和夫 神奈川県相模原市磯部2121−８ (72)発明者 矢野 敬一 東京都町田市旭町３−６−６ (72)発明者 横尾 義春 神奈川県相模原市横山３−４−17 (72)発明者 橋本 幸生 神奈川県大和市中央林間３−５−15
Claims (5)
- 【請求項１】 配列番号１で表わされるアミノ酸配列を
コードするウリカーゼ遺伝子。 - 【請求項２】 配列番号１で表わされるアミノ酸配列を
コードするウリカーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミ
ド。 - 【請求項３】 配列番号１で表わされるアミノ酸配列を
コードするウリカーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミド
を含む形質転換体。 - 【請求項４】 配列番号１で表わされるアミノ酸配列を
コードするウリカーゼ遺伝子を含む組換え体プラスミド
を含む形質転換体を培地に培養し、培養物中にウリカー
ゼを生成蓄積させ、該培養物からウリカーゼを採取する
ことを特徴とするウリカーゼの製造法。 - 【請求項５】 セルロモナス属に属し、ウリカーゼ生産
能を有する微生物を培地に培養し、培養物中にウリカー
ゼを生成蓄積させ、該培養物からウリカーゼを採取する
ことを特徴とするウリカーゼの製造法。
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|---|---|---|---|
| JP3320525A JP2971218B2 (ja) | 1991-12-04 | 1991-12-04 | ウリカーゼ遺伝子およびウリカーゼの製造法 |
| DE69225050T DE69225050T2 (de) | 1991-12-04 | 1992-12-02 | Uricase kodierende DNA und Verfahren zur Herstellung von Uricase |
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| EP92311004A EP0545688B1 (en) | 1991-12-04 | 1992-12-02 | DNA Coding for Uricase and Process for Producing Uricase |
| US07/985,690 US5376545A (en) | 1991-12-04 | 1992-12-03 | DNA coding for uricase and process for producing uricase |
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| JP3320525A JP2971218B2 (ja) | 1991-12-04 | 1991-12-04 | ウリカーゼ遺伝子およびウリカーゼの製造法 |
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| JP2971218B2 JP2971218B2 (ja) | 1999-11-02 |
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ID=18122410
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Country Status (5)
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|---|---|
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| EP (1) | EP0545688B1 (ja) |
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| DE (1) | DE69225050T2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022172343A1 (ja) | 2021-02-10 | 2022-08-18 | オリエンタル酵母工業株式会社 | ウリカーゼ活性化剤及び尿酸測定試薬 |
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| ATE474052T1 (de) * | 1999-09-27 | 2010-07-15 | Genentech Inc | Verfahren zur herstellung von rekombinanten proteinen mittels inhibitoren von apoptose |
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| JPH0671425B2 (ja) * | 1985-06-05 | 1994-09-14 | サッポロビール株式会社 | ウリカ−ゼおよびその製造法 |
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| JPH0671428B2 (ja) * | 1988-08-17 | 1994-09-14 | サッポロビール株式会社 | ウリカーゼのｄｎａ配列および製法 |
| NZ234453A (en) * | 1989-07-13 | 1993-01-27 | Sanofi Sa | Recombinant dna encoding urate oxidase, and vector, host, protein and pharmaceutical compositions associated therewith |
-
1991
- 1991-12-04 JP JP3320525A patent/JP2971218B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-12-02 EP EP92311004A patent/EP0545688B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-02 DE DE69225050T patent/DE69225050T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-02 CA CA002084384A patent/CA2084384C/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-12-03 US US07/985,690 patent/US5376545A/en not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022172343A1 (ja) | 2021-02-10 | 2022-08-18 | オリエンタル酵母工業株式会社 | ウリカーゼ活性化剤及び尿酸測定試薬 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2971218B2 (ja) | 1999-11-02 |
| CA2084384A1 (en) | 1993-06-05 |
| DE69225050T2 (de) | 1998-10-22 |
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| EP0545688A3 (ja) | 1994-01-05 |
| EP0545688B1 (en) | 1998-04-08 |
| CA2084384C (en) | 2002-06-04 |
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