JPH0640827B2 - 新規プラスミド及びその構築方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 - Google Patents
新規プラスミド及びその構築方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物Info
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- JPH0640827B2 JPH0640827B2 JP5097386A JP5097386A JPH0640827B2 JP H0640827 B2 JPH0640827 B2 JP H0640827B2 JP 5097386 A JP5097386 A JP 5097386A JP 5097386 A JP5097386 A JP 5097386A JP H0640827 B2 JPH0640827 B2 JP H0640827B2
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
- C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
- C12N9/1074—Cyclomaltodextrin glucanotransferase (2.4.1.19)
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なプラスミド、さらに詳しくは、アルカ
リ性CGTaseの分泌生産に関与する遺伝情報を担うデオキ
シリボ核酸(DNA)断片を組み込んだプラスミド、該プラ
スミドの構築方法及び該プラスミドを含有する新規微生
物に関する。
リ性CGTaseの分泌生産に関与する遺伝情報を担うデオキ
シリボ核酸(DNA)断片を組み込んだプラスミド、該プラ
スミドの構築方法及び該プラスミドを含有する新規微生
物に関する。
シクロデキストリンは、６〜８ヶ又はそれ以上のぶどう
糖分子がα−1, 4結合で環状に結合した非還元性の物質
である。シクロデキストリンを生成する酵素であるCGTa
seは、ＥＣ２．４．１．16として転移酵素に分類され
る。従来このCGTaseは、バチルス属に属する菌種、例え
ばバチルス・マセランス（Bacillus macerans）、バチ
ルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス
・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・
ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilu
s)等又は、クレブシラ属に属する菌種例えば、クレブシ
ラ・ニューモア(Klebsiella pneumoniae)等を pＨ中性
ないし弱酸性の適当な培地で好気的に培養して得る方法
〔「酵素ハンドブック」：赤堀四郎監修、朝倉書店刊
（昭和41年）及び「アミラーゼ」：中村道徳監修、学会
出版センター刊（昭和61年）等参照〕及びバチルス属に
属する好アルカリ性細菌を pＨアルカリ性の適当な培地
に好気的に培養して得る方法〔Horikoshi,K.,Akiba, T.
；“Alkalophilic Microorganisms"、学会センター（1
982年）及び特公昭52−93号公報等参照〕があった。
糖分子がα−1, 4結合で環状に結合した非還元性の物質
である。シクロデキストリンを生成する酵素であるCGTa
seは、ＥＣ２．４．１．16として転移酵素に分類され
る。従来このCGTaseは、バチルス属に属する菌種、例え
ばバチルス・マセランス（Bacillus macerans）、バチ
ルス・サーキュランス(Bacillus circulans)、バチルス
・メガテリウム（Bacillus megaterium）、バチルス・
ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilu
s)等又は、クレブシラ属に属する菌種例えば、クレブシ
ラ・ニューモア(Klebsiella pneumoniae)等を pＨ中性
ないし弱酸性の適当な培地で好気的に培養して得る方法
〔「酵素ハンドブック」：赤堀四郎監修、朝倉書店刊
（昭和41年）及び「アミラーゼ」：中村道徳監修、学会
出版センター刊（昭和61年）等参照〕及びバチルス属に
属する好アルカリ性細菌を pＨアルカリ性の適当な培地
に好気的に培養して得る方法〔Horikoshi,K.,Akiba, T.
；“Alkalophilic Microorganisms"、学会センター（1
982年）及び特公昭52−93号公報等参照〕があった。
しかし、これらの微生物による酵素の醗酵生産は培養時
間が長く、スケールアップが難しく又酵素の生産量が微
量であり、分離精製が困難であった。一方遺伝子工学を
利用したCGTaseの生産に関する研究は、バチルス・マセ
ランス由来のCGTaseをバチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）及びエシェリヒア・コリ(Escherichia col
i)へクローニングした研究（高野敏称，山根國男他；昭
和59年度第７回日本分子生物学大会）及びバチルス・マ
セランス及びバチルス・ステアロサーモフィラス由来の
CGTaseをバチルス・スブチリス及びエシェリヒア・コリ
へクローニングした研究（久保田倫夫、辻阪好夫他；昭
和60年度日本醗酵工学大会）が既に発表されているが、
バチルス属に属する好アルカリ性細菌に由来するアルカ
リ性CGTaseのバチルス・スブチリスへのクローニングの
研究は、見当たらない。
間が長く、スケールアップが難しく又酵素の生産量が微
量であり、分離精製が困難であった。一方遺伝子工学を
利用したCGTaseの生産に関する研究は、バチルス・マセ
ランス由来のCGTaseをバチルス・ズブチリス（Bacillus
subtilis）及びエシェリヒア・コリ(Escherichia col
i)へクローニングした研究（高野敏称，山根國男他；昭
和59年度第７回日本分子生物学大会）及びバチルス・マ
セランス及びバチルス・ステアロサーモフィラス由来の
CGTaseをバチルス・スブチリス及びエシェリヒア・コリ
へクローニングした研究（久保田倫夫、辻阪好夫他；昭
和60年度日本醗酵工学大会）が既に発表されているが、
バチルス属に属する好アルカリ性細菌に由来するアルカ
リ性CGTaseのバチルス・スブチリスへのクローニングの
研究は、見当たらない。
本発明は、上記従来技術の問題点を解決するアルカリ性
CGTaseの分泌生産能に関与する特定の遺伝情報を担うデ
オキシリボ核酸（ＤＮＡ）を組み込んだ新規プラスミ
ド、及びその構築方法並びに、該プラスミドによって形
質転換した新規微生物を提供することを目的とするもの
である。
CGTaseの分泌生産能に関与する特定の遺伝情報を担うデ
オキシリボ核酸（ＤＮＡ）を組み込んだ新規プラスミ
ド、及びその構築方法並びに、該プラスミドによって形
質転換した新規微生物を提供することを目的とするもの
である。
プラスミドは、微生物の細胞内に見出される染色体外遺
伝子で、近年、微生物の遺伝子組み換えの手段として利
用され、醗酵工業の分野の研究におけるその重要性は益
々増大して来ている。
伝子で、近年、微生物の遺伝子組み換えの手段として利
用され、醗酵工業の分野の研究におけるその重要性は益
々増大して来ている。
近年、アミノ酸やペプチドの例にみられるように、微生
物の生育に必要とする特定の要求性や代謝産物の生産能
に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだプラスミ
ドについて研究がなされ、また若干のプラスミドが宿主
微生物に導入され、その形質転換株が得られている。
物の生育に必要とする特定の要求性や代謝産物の生産能
に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを組み込んだプラスミ
ドについて研究がなされ、また若干のプラスミドが宿主
微生物に導入され、その形質転換株が得られている。
本発明者はバチルス（Bacillus）属に属する微生物の代
謝産物であるアルカリ性CGTaseの分泌生産に関与する遺
伝情報を担うＤＮＡを組み込んだ新規プラスミドを構築
することに成功し、更に前記プラスミドをバチルス・ス
ブチリス(Bacillus subtilis) 1A-289 株に導入して新
規且つ有用な形質転換株、バチルス・ズブチリス(Bacil
lus subtilis) 1A-289(pTUB703)を得ることに成功して
本発明を完成するに至った。
謝産物であるアルカリ性CGTaseの分泌生産に関与する遺
伝情報を担うＤＮＡを組み込んだ新規プラスミドを構築
することに成功し、更に前記プラスミドをバチルス・ス
ブチリス(Bacillus subtilis) 1A-289 株に導入して新
規且つ有用な形質転換株、バチルス・ズブチリス(Bacil
lus subtilis) 1A-289(pTUB703)を得ることに成功して
本発明を完成するに至った。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において用いられる宿主微生物は、バチルス属の
プラスミドとして知られるpUB110等の、培養された細胞
内で増殖し得る形式をとるプラスミド（ベクターＤＮ
Ａ）に、外来の遺伝子ＤＮＡとしてバチルス属に属する
微生物、例えばバチルスsp．＃１０１１菌（微工研菌寄
第8685号）から調製されたＤＮＡ断片を組み込んだプラ
スミドを含有させ得る、バチルス・ズブチリスによって
代表されるバチルス属に属する微生物である。
プラスミドとして知られるpUB110等の、培養された細胞
内で増殖し得る形式をとるプラスミド（ベクターＤＮ
Ａ）に、外来の遺伝子ＤＮＡとしてバチルス属に属する
微生物、例えばバチルスsp．＃１０１１菌（微工研菌寄
第8685号）から調製されたＤＮＡ断片を組み込んだプラ
スミドを含有させ得る、バチルス・ズブチリスによって
代表されるバチルス属に属する微生物である。
本発明に使用される、アルカリ性CGTaseの分泌生産に関
与する遺伝情報を担うＤＮＡを含有する微生物の例とし
ては、バチルスsp．＃１０１１菌（微工研菌寄第8685
号）をあげることができる。バチルスsp．＃１０１１菌
は静岡県袋井市で採取された土壌より分離された微生物
であり、次の菌学的性質を有する。なお、菌学的性質の
試験及び分類方法は、「エアロビック・スポアホーミン
グ・バクテリア」〔“Aerobic Sporeforming Bacteria
”（United State Department of Agriculrture,Nov.1
952 by N.R.Smith, R.E.Gordon & F. E.Clark）〕及び
「バージェーズ・マニュアル・オブ・デタミネイティブ
・バクテリオロジー」〔‘Bergry's Manual of Datermi
native Bacteriology,1957）〕に基づいて行われた。
与する遺伝情報を担うＤＮＡを含有する微生物の例とし
ては、バチルスsp．＃１０１１菌（微工研菌寄第8685
号）をあげることができる。バチルスsp．＃１０１１菌
は静岡県袋井市で採取された土壌より分離された微生物
であり、次の菌学的性質を有する。なお、菌学的性質の
試験及び分類方法は、「エアロビック・スポアホーミン
グ・バクテリア」〔“Aerobic Sporeforming Bacteria
”（United State Department of Agriculrture,Nov.1
952 by N.R.Smith, R.E.Gordon & F. E.Clark）〕及び
「バージェーズ・マニュアル・オブ・デタミネイティブ
・バクテリオロジー」〔‘Bergry's Manual of Datermi
native Bacteriology,1957）〕に基づいて行われた。
（バチルスsp．＃１０１１菌の菌学的性質） イ．形態 １当たりデンプン15ｇ、ポリペプトン10ｇ、イースト
エキス５ｇ、K2HPO4１ｇ、MgSO4・7H2O ０．２ｇ、炭酸
ナトリウム10ｇ、寒天15ｇを含む組成(pＨ10.0)の平板
寒天培地上で（但し、炭酸ナトリウムは、他の成分と別
にオートクレーブし、その後培地に加える。）、観察さ
れる形態を表１に示す。
エキス５ｇ、K2HPO4１ｇ、MgSO4・7H2O ０．２ｇ、炭酸
ナトリウム10ｇ、寒天15ｇを含む組成(pＨ10.0)の平板
寒天培地上で（但し、炭酸ナトリウムは、他の成分と別
にオートクレーブし、その後培地に加える。）、観察さ
れる形態を表１に示す。
ロ．生育状態 ＃１０１１菌の各種培地における生育状態を表２に示す なお、培地 pＨ7.0 ではほとんど生育せず、変化が認め
られなかったので、培地にそれぞれ炭酸ナトリウムを１
％加えて pＨ10.0とした。
られなかったので、培地にそれぞれ炭酸ナトリウムを１
％加えて pＨ10.0とした。
ハ．生理的性質 ＃１０１１菌に関し、生理試験用培地にそれぞれ炭酸ナ
トリウムを１％加えて試験した結果を表3-1 〜3-2 に示
す。
トリウムを１％加えて試験した結果を表3-1 〜3-2 に示
す。
バチルスsp．＃１０１１菌は、上記の菌学的諸性質を総
括すると、好気性の有胞子細菌であることから、バチル
ス（Bacillus）属に属する微生物であることは明らかで
あるが、特に生育し得る範囲がpH８〜１２である点にお
いて明らかに公知の菌種と区別され、好アルカリ性菌体
の新菌種と認定することが妥当であると結論された。
括すると、好気性の有胞子細菌であることから、バチル
ス（Bacillus）属に属する微生物であることは明らかで
あるが、特に生育し得る範囲がpH８〜１２である点にお
いて明らかに公知の菌種と区別され、好アルカリ性菌体
の新菌種と認定することが妥当であると結論された。
前記ベクターＤＮＡに組み込まれる。バチルスsp．＃１
０１１菌から調製されたＤＮＡ断片は、前記バチルス属
細菌の代謝産物であるアルカリ性CGTaseの分泌生産に関
与する遺伝情報を担うＤＮＡであり、前記ベクターＤＮ
Ａとしては、天然に存在するものを抽出したものの他、
増殖に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落してい
るものでもよく、例えばpE194 の系統、pC194 の系統、
pUB110の系統等が挙げられる。また、前記のベクターＤ
ＮＡに前記ＤＮＡ断片を組み込む方法は、既知のいずれ
の方法も適用し得る。例えば、適当な制限酵素（Endonu
clease）を選択、処理してＤＮＡ特定部位で切断し、次
いで相補的な塩基配列を切断部位に形成する制限酵素で
処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再
結合する方法が用いられる。このようにして得られた前
記ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡの結合物を、プロトプラ
スト形質転換法〔Chang,S.,Cohen,S.N,：Mol.Gen.Gene
t.168, 11 (1979)〕によって受容菌であるバチルス属の
微生物の菌体に導入し、遺伝形質として安定するまで増
殖すると、所望の遺伝形質とベクターＤＮＡの形質を併
せもつ形質転換株が得られる。
０１１菌から調製されたＤＮＡ断片は、前記バチルス属
細菌の代謝産物であるアルカリ性CGTaseの分泌生産に関
与する遺伝情報を担うＤＮＡであり、前記ベクターＤＮ
Ａとしては、天然に存在するものを抽出したものの他、
増殖に必要な部分以外のＤＮＡの部分が一部欠落してい
るものでもよく、例えばpE194 の系統、pC194 の系統、
pUB110の系統等が挙げられる。また、前記のベクターＤ
ＮＡに前記ＤＮＡ断片を組み込む方法は、既知のいずれ
の方法も適用し得る。例えば、適当な制限酵素（Endonu
clease）を選択、処理してＤＮＡ特定部位で切断し、次
いで相補的な塩基配列を切断部位に形成する制限酵素で
処理したベクターＤＮＡと混合し、リガーゼによって再
結合する方法が用いられる。このようにして得られた前
記ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡの結合物を、プロトプラ
スト形質転換法〔Chang,S.,Cohen,S.N,：Mol.Gen.Gene
t.168, 11 (1979)〕によって受容菌であるバチルス属の
微生物の菌体に導入し、遺伝形質として安定するまで増
殖すると、所望の遺伝形質とベクターＤＮＡの形質を併
せもつ形質転換株が得られる。
後述の実施例において得られる形質転換株は、次の２段
階の操作により創製される。但し、の操作は省略可能
で、バチルスsp．＃１０１１菌から調製されたＤＮＡ断
片を直接pUB110等のベクターＤＮＡへ組み込んで行うこ
とも可能である。
階の操作により創製される。但し、の操作は省略可能
で、バチルスsp．＃１０１１菌から調製されたＤＮＡ断
片を直接pUB110等のベクターＤＮＡへ組み込んで行うこ
とも可能である。
バクテリオファージベクターＤＮＡとしてλＤ69ファ
ージのＤＮＡ〔 Silhavy T.J., Berman M.L.,Enquist
L.W.：Experiments with Gene Fusions "(Cold Spring
Harbar Laboratory (1984)p. 247参照，これは制限 end
onuclease BamHI による切断サイトを１ケ所持つ 38.8k
b のＤＮＡである。制限酵素切断地図を第４図に示
す。〕を用い、これにバチルスsp．＃１０１１菌から調
製されたＤＮＡ断片を組み込んでイン・ビトロ・パッケ
ージング法〔(Horn,B.,Murray,K.：Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.,74.3259 (1977)〕により得られた新規形質導入
ファージ粒子λＤ69-TU110を調製する。
ージのＤＮＡ〔 Silhavy T.J., Berman M.L.,Enquist
L.W.：Experiments with Gene Fusions "(Cold Spring
Harbar Laboratory (1984)p. 247参照，これは制限 end
onuclease BamHI による切断サイトを１ケ所持つ 38.8k
b のＤＮＡである。制限酵素切断地図を第４図に示
す。〕を用い、これにバチルスsp．＃１０１１菌から調
製されたＤＮＡ断片を組み込んでイン・ビトロ・パッケ
ージング法〔(Horn,B.,Murray,K.：Proc.Natl.Acad.Sc
i.U.S.,74.3259 (1977)〕により得られた新規形質導入
ファージ粒子λＤ69-TU110を調製する。
プラスミドベクターＤＮＡとしてpUB110を用い、これ
に前記形質導入ファージ粒子から調製されたＤＮＡ断片
を組み込んで得られた新規pTUB703 プラスミドを、バチ
ルス・ズブチリス 1A-289 株〔Catalog of Strains 2nd
edition (1982)：The Bacillus Genetic Stock Cente
r, (The Ohio STate Uni.Dep of Microbiology)，遺伝
形質：aroI906, met B5, sacA321, amy E 〕に導入して
プロトプラスト形質転換法により新規微生物を創製し、
これは、バチルス・ズブチリス 1A-289(pTUB703) 〔Bac
illus subtilis 1A-289(pTUB703）〕と呼称される。前
記バチルス・ズブチリス1A-289(pTUB703）のpTUB703 プ
ラスミドの制限酵素切断地図は、第３図に示すとおりで
ある。
に前記形質導入ファージ粒子から調製されたＤＮＡ断片
を組み込んで得られた新規pTUB703 プラスミドを、バチ
ルス・ズブチリス 1A-289 株〔Catalog of Strains 2nd
edition (1982)：The Bacillus Genetic Stock Cente
r, (The Ohio STate Uni.Dep of Microbiology)，遺伝
形質：aroI906, met B5, sacA321, amy E 〕に導入して
プロトプラスト形質転換法により新規微生物を創製し、
これは、バチルス・ズブチリス 1A-289(pTUB703) 〔Bac
illus subtilis 1A-289(pTUB703）〕と呼称される。前
記バチルス・ズブチリス1A-289(pTUB703）のpTUB703 プ
ラスミドの制限酵素切断地図は、第３図に示すとおりで
ある。
第３図から明らかなように、このプラスミドは、pTUB11
0 プラスミドＤＮＡの制限サイトのBamHI サイトに前記
バチルスsp．＃１０１１菌のアルカリ性CGTaseの分泌生
産に関与する遺伝情報を担うアルカリ性CGTaseＤＮＡ断
片が組み込まれているＤＮＡ円形分子であり、即ちpUB1
10プラスミドＤＮＡと約2,600 の塩基対のＤＮＡから成
る7.2Kbの新規なＤＮＡ円形分子である。
0 プラスミドＤＮＡの制限サイトのBamHI サイトに前記
バチルスsp．＃１０１１菌のアルカリ性CGTaseの分泌生
産に関与する遺伝情報を担うアルカリ性CGTaseＤＮＡ断
片が組み込まれているＤＮＡ円形分子であり、即ちpUB1
10プラスミドＤＮＡと約2,600 の塩基対のＤＮＡから成
る7.2Kbの新規なＤＮＡ円形分子である。
次に、前記バチルス・ズブチリス 1A-289 (pTUB703)の
菌学的性質は、ＤＮＡ受容菌であるバチルス・ズブチリ
ス 1A-289 株の性質と、カナマイシン耐性、アルカリ性
CGTase生産性を除いて、同一であるが(Catalog of Stra
ins 2nd edition (1982)：The Bacillus Genetic Stock
Center, (The Ohio State Uni.Dep of Microbiology,
遺伝形質：aroI906, met B5, sacA321, amy E )、他の
特性として、pTUB703プラスミドの特性、即ちアルカリ
性CGTase生産能の遺伝情報を担うpTUB703 プラスミドに
よってCGTaseを菌体外に分必し、蓄積せしめる特性を附
加して成る点がその特徴である。
菌学的性質は、ＤＮＡ受容菌であるバチルス・ズブチリ
ス 1A-289 株の性質と、カナマイシン耐性、アルカリ性
CGTase生産性を除いて、同一であるが(Catalog of Stra
ins 2nd edition (1982)：The Bacillus Genetic Stock
Center, (The Ohio State Uni.Dep of Microbiology,
遺伝形質：aroI906, met B5, sacA321, amy E )、他の
特性として、pTUB703プラスミドの特性、即ちアルカリ
性CGTase生産能の遺伝情報を担うpTUB703 プラスミドに
よってCGTaseを菌体外に分必し、蓄積せしめる特性を附
加して成る点がその特徴である。
バチルス・ズブチリス1A-289(pTUB703)によるアルカリ
性CGTaseの分泌生産は、後述の実施例で示されるよう
に、培養開始後約12時間で認められ、且つ長時間その生
産量が持続される（第１図参照）これに対し、前記バチ
ルスsp．＃１０１１菌によるアルカリ性CGTaseの分泌生
産は、第２図に示すように、培養開始３日後に最高に達
する。従って、本発明は、前記バチルス・ズブチリス1A
-289(pTUB703)、すなわち、従来皆無であったアルカリ
性CGTaseを極めて有利に分泌生産し得る微生物を創製、
提供する点において、新規性と有用性を具備するもので
ある。
性CGTaseの分泌生産は、後述の実施例で示されるよう
に、培養開始後約12時間で認められ、且つ長時間その生
産量が持続される（第１図参照）これに対し、前記バチ
ルスsp．＃１０１１菌によるアルカリ性CGTaseの分泌生
産は、第２図に示すように、培養開始３日後に最高に達
する。従って、本発明は、前記バチルス・ズブチリス1A
-289(pTUB703)、すなわち、従来皆無であったアルカリ
性CGTaseを極めて有利に分泌生産し得る微生物を創製、
提供する点において、新規性と有用性を具備するもので
ある。
これは、本発明によって得られるpTUB703 プラスミドに
含まれる約2,600 の塩基対のＤＮＡが、代謝産物の分泌
生産能を宿主に付与していることを意味するものであ
る。
含まれる約2,600 の塩基対のＤＮＡが、代謝産物の分泌
生産能を宿主に付与していることを意味するものであ
る。
以下に、本発明のプラスミドの構築方法と該プラスミド
を含有する前記形質転換株、バチルス・ズブチリス1A-2
89(pTUB703)の製方法並びに前記形質転換株による効果
について、実施例により説明する。
を含有する前記形質転換株、バチルス・ズブチリス1A-2
89(pTUB703)の製方法並びに前記形質転換株による効果
について、実施例により説明する。
実施例 〔実施例 １〕 (1)アルカリ性CGTase生産能の遺伝情報をもつ染色体Ｄ
ＮＡの調製 アルカリ性CGTaseを菌体外に生成、蓄積する能力を有す
る好アルカリ性のバチルスsp．＃１０１１菌（微工研菌
寄第8685号）を培地〔１当りデンプン15ｇ、ペプトン
10ｇ、酵母エキス５ｇ、K2HPO4１ｇ、MgSO4・7H2O ０
０．２ｇを含み炭酸ナトリウム10ｇで pＨ10.0に調整し
た組成〕中、40℃で12時間振盪培養を行い、対数増殖後
期の菌体を集菌後、Saito, Miura法(Saito,H.,Miura,
K.：Biochem.Biophys. Acta, 72, 619,(1964)〕による
ＤＮＡ抽出法によってＤＮＡを抽出、精製し、染色体Ｄ
ＮＡ約５mgを得た。
ＮＡの調製 アルカリ性CGTaseを菌体外に生成、蓄積する能力を有す
る好アルカリ性のバチルスsp．＃１０１１菌（微工研菌
寄第8685号）を培地〔１当りデンプン15ｇ、ペプトン
10ｇ、酵母エキス５ｇ、K2HPO4１ｇ、MgSO4・7H2O ０
０．２ｇを含み炭酸ナトリウム10ｇで pＨ10.0に調整し
た組成〕中、40℃で12時間振盪培養を行い、対数増殖後
期の菌体を集菌後、Saito, Miura法(Saito,H.,Miura,
K.：Biochem.Biophys. Acta, 72, 619,(1964)〕による
ＤＮＡ抽出法によってＤＮＡを抽出、精製し、染色体Ｄ
ＮＡ約５mgを得た。
(2)染色体ＤＮＡ断片のファージＤＮＡへの挿入 前記(1)で得た染色体ＤＮＡ300μｇをとり、制限エンド
ヌクレアーゼSau3AI（宝酒造(株)製）を加え、０℃で30
分反応させて部分的に切断した。更に、蔗糖密度勾配超
遠心法にて、約７〜12Kbの染色体ＤＮＡ断片を分離精製
してＤＮＡ断片を調製した。バクテリオファージλＤ
69のＤＮＡ（東京大学医科学研究所より分譲：制限酵素
切断地図を第４図に示す）20μｇを制限エンドヌクレア
ーゼBamHI(宝酒造(株)製）で完全に分解してその一部
と、前記ＤＮＡ断片を混合しＴ４ファージ由来のＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造(株)製）によって10℃、24時間ＤＮ
Ａ鎖の連結反応を行い、イン・ビトロ・パッケージング
・キット（Amersham International社製）を使用して、
形質導入ファージ粒子とした。１％デンプンを含むλ培
地〔１当りバクトトリプトン(DIfco)10ｇ、NaCl２．
５ｇを含む組成〕寒天平板上にエシェリヒア・コリＳＭ
32株東京大学医科学研究所により分譲，遺伝形質：ＳＡ
500, his, pyrD, lons100, gal, strA）を37℃にて生育
させ、これに前記形質導入ファージ粒子を感染させて得
た多数のプラーク（溶菌斑）の中からアルカリ性CGTase
活性を有する形質導入ファージλＤ69-TU110粒子を得
た。１のλ培地でエシェリヒア・コリ 211SM32株とと
もにこの形質導入ファージ粒子を培養した後ＰＥＧ6000
法〔K.R.Yamamoto,B.M alberto,R.Benzinger,L,Lowhorn
e & G.Treiber：Virolgy, 40,734 (1970)〕により形質
導入ファージＤＮＡを抽出、精製し約50KbのＤＮＡを約
150μｇ得た。
ヌクレアーゼSau3AI（宝酒造(株)製）を加え、０℃で30
分反応させて部分的に切断した。更に、蔗糖密度勾配超
遠心法にて、約７〜12Kbの染色体ＤＮＡ断片を分離精製
してＤＮＡ断片を調製した。バクテリオファージλＤ
69のＤＮＡ（東京大学医科学研究所より分譲：制限酵素
切断地図を第４図に示す）20μｇを制限エンドヌクレア
ーゼBamHI(宝酒造(株)製）で完全に分解してその一部
と、前記ＤＮＡ断片を混合しＴ４ファージ由来のＤＮ
Ａリガーゼ（宝酒造(株)製）によって10℃、24時間ＤＮ
Ａ鎖の連結反応を行い、イン・ビトロ・パッケージング
・キット（Amersham International社製）を使用して、
形質導入ファージ粒子とした。１％デンプンを含むλ培
地〔１当りバクトトリプトン(DIfco)10ｇ、NaCl２．
５ｇを含む組成〕寒天平板上にエシェリヒア・コリＳＭ
32株東京大学医科学研究所により分譲，遺伝形質：ＳＡ
500, his, pyrD, lons100, gal, strA）を37℃にて生育
させ、これに前記形質導入ファージ粒子を感染させて得
た多数のプラーク（溶菌斑）の中からアルカリ性CGTase
活性を有する形質導入ファージλＤ69-TU110粒子を得
た。１のλ培地でエシェリヒア・コリ 211SM32株とと
もにこの形質導入ファージ粒子を培養した後ＰＥＧ6000
法〔K.R.Yamamoto,B.M alberto,R.Benzinger,L,Lowhorn
e & G.Treiber：Virolgy, 40,734 (1970)〕により形質
導入ファージＤＮＡを抽出、精製し約50KbのＤＮＡを約
150μｇ得た。
(3)形質導入ファージＤＮＡ断片のプラスミドベクター
への挿入 前記(2)で得たＤＮＡ50μｇをとり、Sau3AIを加え、０
℃で30分反応させて部分的に切断した。更に蔗糖密度勾
配超遠心法にて約２〜９Kbの形質導入ファージＤＮＡ断
片を分離精製してＤＮＡ断片を調製した。一方プラス
ミドベクターとして用いられるカナマイシン抵抗性（Km
ｒ）とアンピシリン抵抗性（Ampｒ）をもつpUB110プラ
スミドＤＮＡ〔Bethesda Research Laboratories社（米
国）製，制限酵素切断地図を第５図に示す。「ＤＮＡ C
loning Vol.II" IRL PRESS (Oxford washin gton DC) b
y D.M.Glover 1985 」〕をBamHI で完全に分解して65
℃、10分の熱処理をして、ＢＡＤ（；Bacterial Alkela
nd Phosphatase）処理後前記ＤＮＡ断片と混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼによって10℃、24時間ＤＮＡ鎖の連結
反応を行い、ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドＤＮＡ
を構築した。
への挿入 前記(2)で得たＤＮＡ50μｇをとり、Sau3AIを加え、０
℃で30分反応させて部分的に切断した。更に蔗糖密度勾
配超遠心法にて約２〜９Kbの形質導入ファージＤＮＡ断
片を分離精製してＤＮＡ断片を調製した。一方プラス
ミドベクターとして用いられるカナマイシン抵抗性（Km
ｒ）とアンピシリン抵抗性（Ampｒ）をもつpUB110プラ
スミドＤＮＡ〔Bethesda Research Laboratories社（米
国）製，制限酵素切断地図を第５図に示す。「ＤＮＡ C
loning Vol.II" IRL PRESS (Oxford washin gton DC) b
y D.M.Glover 1985 」〕をBamHI で完全に分解して65
℃、10分の熱処理をして、ＢＡＤ（；Bacterial Alkela
nd Phosphatase）処理後前記ＤＮＡ断片と混合し、Ｔ
４ＤＮＡリガーゼによって10℃、24時間ＤＮＡ鎖の連結
反応を行い、ＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドＤＮＡ
を構築した。
(4)アルカリ性CGTaseの分泌生産遺伝子を担うプラスミ
ドによる形質転換 前記(3)で得たプラスミドＤＮＡの溶液を用いて、バチ
ルス・ズブチリス 1A-289 株を宿主とするプロトプラス
ト形質転換法〔(Chang,S.,Cohen,S.N.：Mol. Gen. Gene
t. 168, 111, (1979)〕を行ない前記プラスミドＤＮＡ
を細胞内に導入し、デンプン１％，カナマイシン150 μ
ｇ／ml，寒天0.8 ％を含むＤＭ３培地（５％カザミノ酸
100 ml, 1Mクエン酸ナトリウム(pH7.3) 500 ml, 3)5%K2
HPO4 50 ml,1.5% KH2PO4 50 ml, 10% イーストエキス50
ml,20%グルコース25ml, 1M MgCl220ml,2% 牛血清アルブ
ミン５mlを含む）に添加して37℃にて培養し、カナマイ
シン耐性で且つアルカリ性CGTase活性を有するバチルス
・ズブチリス 1A-289(pTUB703 )を得た。
ドによる形質転換 前記(3)で得たプラスミドＤＮＡの溶液を用いて、バチ
ルス・ズブチリス 1A-289 株を宿主とするプロトプラス
ト形質転換法〔(Chang,S.,Cohen,S.N.：Mol. Gen. Gene
t. 168, 111, (1979)〕を行ない前記プラスミドＤＮＡ
を細胞内に導入し、デンプン１％，カナマイシン150 μ
ｇ／ml，寒天0.8 ％を含むＤＭ３培地（５％カザミノ酸
100 ml, 1Mクエン酸ナトリウム(pH7.3) 500 ml, 3)5%K2
HPO4 50 ml,1.5% KH2PO4 50 ml, 10% イーストエキス50
ml,20%グルコース25ml, 1M MgCl220ml,2% 牛血清アルブ
ミン５mlを含む）に添加して37℃にて培養し、カナマイ
シン耐性で且つアルカリ性CGTase活性を有するバチルス
・ズブチリス 1A-289(pTUB703 )を得た。
〔実施例 ２〕 実施例１の(4)で得られた形質転換株、バチルス・ズブ
チリス 1A-289(pTUB703)をLGKm培地〔１当たりトリプ
トン(Difco) 10g 、イーストエキス(Difco) 5g、 NaCl 5
g グルコース２ｇ、カナマイシン10mgを含む組成〕 100
mlを含む500 ml容坂口フラスコで37℃にて振盪培養し
た。細胞の生育（菌体量）は660 nmの吸光度(OD)で、測
定した。アルカリ性CGTaseの酵素活性は、酵素液0.05 m
lにＭ／10グリシン-NaCl 緩衝液(pH10.5)に溶解した１
％可溶性デンプン液0.5mlを加えて40℃にて２時間反応
した後、酢酸で pＨを中性にし、100 ℃で10分間加熱し
た。これに50μｇのグルコアミラーゼを加えて、40℃で
１時間未反応のデンプンを分解した後、生じたグルコー
スの量をジニトロサリチル酸法で測定した。また、対照
として酵素液のかわりに水を加えたものを上記と全く同
様に処理し、この両者の差をもってシクロデキストリン
の生成量とした。ここで１単位とは上記の方法で１mgの
シクロデキストリンを生成する酵素量をいう（特公昭52
−93号公報参照）。
チリス 1A-289(pTUB703)をLGKm培地〔１当たりトリプ
トン(Difco) 10g 、イーストエキス(Difco) 5g、 NaCl 5
g グルコース２ｇ、カナマイシン10mgを含む組成〕 100
mlを含む500 ml容坂口フラスコで37℃にて振盪培養し
た。細胞の生育（菌体量）は660 nmの吸光度(OD)で、測
定した。アルカリ性CGTaseの酵素活性は、酵素液0.05 m
lにＭ／10グリシン-NaCl 緩衝液(pH10.5)に溶解した１
％可溶性デンプン液0.5mlを加えて40℃にて２時間反応
した後、酢酸で pＨを中性にし、100 ℃で10分間加熱し
た。これに50μｇのグルコアミラーゼを加えて、40℃で
１時間未反応のデンプンを分解した後、生じたグルコー
スの量をジニトロサリチル酸法で測定した。また、対照
として酵素液のかわりに水を加えたものを上記と全く同
様に処理し、この両者の差をもってシクロデキストリン
の生成量とした。ここで１単位とは上記の方法で１mgの
シクロデキストリンを生成する酵素量をいう（特公昭52
−93号公報参照）。
形質転換株の菌体量は培養開始後12時間で最大に達し
（第１図に示す）、菌体外アルカリ性CGTase の活性
は、ほぼ24時間で最大に達した。生産されたアルカリ性
CGTaseは安定である。
（第１図に示す）、菌体外アルカリ性CGTase の活性
は、ほぼ24時間で最大に達した。生産されたアルカリ性
CGTaseは安定である。
比較として、ＤＮＡ供与菌である前記好アルカリ性バチ
ルスsp．＃１０１１菌（微工研菌寄第8685号）を培養し
て、アルカリ性CGTase活性を測定した。１当たりデン
プン15ｇ、ポリペプトン10ｇ、イーストエキス 5g、H2H
Po４1g、MgSO4・7H2O 0.2ｇ、炭酸ナトリウム10g を含
む培地(pH10.0)に接種し、40℃にて振盪培養した。
ルスsp．＃１０１１菌（微工研菌寄第8685号）を培養し
て、アルカリ性CGTase活性を測定した。１当たりデン
プン15ｇ、ポリペプトン10ｇ、イーストエキス 5g、H2H
Po４1g、MgSO4・7H2O 0.2ｇ、炭酸ナトリウム10g を含
む培地(pH10.0)に接種し、40℃にて振盪培養した。
菌体量は培養開始後24時間で最大に達し、（第２図に示
す）菌体外アルカリ性CGTaseの活性は、接種後24時間で
徐々に活性が上がり、72時間に至ってやっと活性は最高
に達した。
す）菌体外アルカリ性CGTaseの活性は、接種後24時間で
徐々に活性が上がり、72時間に至ってやっと活性は最高
に達した。
〔実施例 ３〕 形質転換株、バチルス・ズブチリス 1A-289(pTUB703)を
実施例２と同様な操作にて培養開始後24時間の培養液を
遠心分離し、除菌して調整した培養上澄液100 mlに硫酸
アンモニウムを加えて塩析した後、沈澱を水に溶かして
一夜流水で透析し、アルカリ性CGTase酵素液とした。フ
ラスコにＮ／10グリシン-NaCl 緩衝液にてpH10.5に調製
した５％のデンプン糊化液(CaCl2を10mM含む)１を入
れ、上記酵素液25ml加えて65℃にて６時間酵素反応し
た。反応終了後遠心分離して沈澱物を除き、トリクロル
エチレンを加えて生成物を沈澱させ、沈澱物を水で洗條
後、トリクロルエチレンを加熱して除き、60％プロピル
アルコール水溶液から再結晶して白色の結晶約２ｇを得
た。アビセル薄層クロマトグラフィーにより前記結晶を
分析したところ、ｎ−ブタノール：プロパノール：水
（３：５：４）の展開液で２回上昇法にて分離した後１
％ヨウ素メタノール溶液を雰霧して、試薬のRf値と一致
したα−及びβ−シクロデキストリン特有の呈色を示す
スポットを認めた。
実施例２と同様な操作にて培養開始後24時間の培養液を
遠心分離し、除菌して調整した培養上澄液100 mlに硫酸
アンモニウムを加えて塩析した後、沈澱を水に溶かして
一夜流水で透析し、アルカリ性CGTase酵素液とした。フ
ラスコにＮ／10グリシン-NaCl 緩衝液にてpH10.5に調製
した５％のデンプン糊化液(CaCl2を10mM含む)１を入
れ、上記酵素液25ml加えて65℃にて６時間酵素反応し
た。反応終了後遠心分離して沈澱物を除き、トリクロル
エチレンを加えて生成物を沈澱させ、沈澱物を水で洗條
後、トリクロルエチレンを加熱して除き、60％プロピル
アルコール水溶液から再結晶して白色の結晶約２ｇを得
た。アビセル薄層クロマトグラフィーにより前記結晶を
分析したところ、ｎ−ブタノール：プロパノール：水
（３：５：４）の展開液で２回上昇法にて分離した後１
％ヨウ素メタノール溶液を雰霧して、試薬のRf値と一致
したα−及びβ−シクロデキストリン特有の呈色を示す
スポットを認めた。
本発明のアルカリ性CGTaseの分泌生産に関与する遺伝情
報を担うＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドは、これを
遺伝子工学的手法によりバチルス・ズブチリスに含有さ
せて形質転換させることにより、短い培養時間でアルカ
リ性CGTaseを生産する新規微生物バチルス・ズブチリス
を創製することができ、この微生物を使用することによ
り、工業的かつ効率的に大量のCGTaseを生産することが
可能となった。
報を担うＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドは、これを
遺伝子工学的手法によりバチルス・ズブチリスに含有さ
せて形質転換させることにより、短い培養時間でアルカ
リ性CGTaseを生産する新規微生物バチルス・ズブチリス
を創製することができ、この微生物を使用することによ
り、工業的かつ効率的に大量のCGTaseを生産することが
可能となった。
第１図は、本発明方法で用いたバチルス・ズブチリス 1
A-289(pTUB703)による菌体外アルカリ性CGTase生産活性
を、第２図は、バチルスsp．＃１０１１菌による菌体外
アルカリ性CGTase生産活性をそれぞれ示すグラフであ
る。第３図は、バチルス・ズブチリス 1A-289(pTUB703)
のプラスミド（pTUB703）の制限酵素切断地図であり、
白ぬきの部分はpUB110プラスミドＤＮＡ由来、黒塗りの
部分はバチルスsp．＃１０１１菌染色体ＤＮＡ断片（ア
ルカリ性CGTaseＤＮＡ断片）を示す。 第４図は、バクテリオファージλＤ69の制限酵素切断地
図である。又第５図はベクターＤＮＡpUB110の制限酵素
切断地図である。
A-289(pTUB703)による菌体外アルカリ性CGTase生産活性
を、第２図は、バチルスsp．＃１０１１菌による菌体外
アルカリ性CGTase生産活性をそれぞれ示すグラフであ
る。第３図は、バチルス・ズブチリス 1A-289(pTUB703)
のプラスミド（pTUB703）の制限酵素切断地図であり、
白ぬきの部分はpUB110プラスミドＤＮＡ由来、黒塗りの
部分はバチルスsp．＃１０１１菌染色体ＤＮＡ断片（ア
ルカリ性CGTaseＤＮＡ断片）を示す。 第４図は、バクテリオファージλＤ69の制限酵素切断地
図である。又第５図はベクターＤＮＡpUB110の制限酵素
切断地図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (16)
- 【請求項１】バチルス・ズブチリス（Bacillus subtill
s）を宿主とするプラスミドであって、バチルス(Bacill
us)属に属する微生物のアルカリ性シクロマルトデキス
トリン グルカノトランスフェラーゼ(Cyrclomaltodext
rin glucanotransferase,以下、アルカリ性CGTaseとい
う。）の分泌生産に関与する遺伝情報を担い、下記の制
限酵素地図を有するバチルスｓｐ．＃１０１１菌（微工
研菌寄第８６８５号）由来のデオキシリボ核酸（ＤＮ
Ａ）断片をその制限サイトに組み込んだプラスミド。 - 【請求項２】プラスミドがpTUE703 であることを特徴と
する特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。 - 【請求項３】プラスミドのベクターがpUB110プラスミド
のＤＮＡであることを特徴とする特許請求の範囲第１項
記載のプラスミド。 - 【請求項４】制限サイトがBamHI サイトであることを特
徴とする特許請求の範囲第１項記載のプラスミド。 - 【請求項５】バチルス属に属する微生物が好アルカリ性
細菌に属する微生物であることを特徴とする特許請求の
範囲第１項記載のプラスミド。 - 【請求項６】好アルカリ性細菌に属する微生物がバチル
スｓｐ．＃１０１１菌（微工研菌寄第８６８５号）であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載のプラス
ミド。 - 【請求項７】バチルス属に属する微生物のアルカリ性CG
Tase の分泌生産能を与え、下記の制限酵素地図を有す
るバチルスｓｐ．＃１０１１菌（微工研菌寄第８６８５
号）由来のＤＮＡ断片を制限酵素を用いて調製するこ
と、前記ＤＮＡ断片のアルカリ性CGTaseの分泌生産に関
与する遺伝情報を妨害しない制限酵素を用いてプラスミ
ドのベクターＤＮＡを制限すること、制限された前記プ
ラスミドのベクターＤＮＡの制限サイトに前記ＤＮＡ断
片を組み換えること及び組み換えられたプラスミドを抽
出することからなる、アルカリ性CGTaseの分泌生産に関
与する遺伝情報を担い、下記の制限酵素地図を有するバ
チルスｓｐ．＃１０１１菌由来のＤＮＡ断片を組み込ん
だプラスミドの構築方法。 - 【請求項８】プラスミドがpTUB703 プラスミドであるこ
とを特徴とする特許請求の範囲第７項記載のプラスミド
の構築方法。 - 【請求項９】アルカリ性CGTaseの分泌生産能を与え、下
記の制限酵素地図を有するバチルスｓｐ．＃１０１１菌
（微工研菌寄第８６８５号）由来のＤＮＡ断片を、前記
細菌のＤＮＡを制限酵素で分解することにより直接調製
することを特徴とする特許請求の範囲第７項記載のプラ
スミドの構築方法。 - 【請求項１０】アルカリ性CGTaseの分泌生産能を与え、
下記の制限酵素地図を有するバチルスｓｐ．＃１０１１
菌（微工研菌寄第８６８５号）由来のＤＮＡ断片を、前
記細菌のＤＮＡを制限酵素で分解して得たＤＮＡ断片を
一旦λＤ69バクテリオファージＤＮＡへ組み換えてCGTa
se生産能を有する形質導入ファージ粒子を調製した後、
そのＤＮＡを前記制限酵素で分解することにより調製す
ることを特徴とする特許請求の範囲第７項記載のプラス
ミドの構築方法。 - 【請求項１１】プラスミドのベクターＤＮＡとしてpUB1
10プラスミドのＤＮＡを用いることを特徴とする特許請
求の範囲第７項記載のプラスミドの構築方法。 - 【請求項１２】制限サイトとしてBamHI サイトを用いる
ことを特徴とする特許請求の範囲第７項記載のプラスミ
ドの構築方法。 - 【請求項１３】ＤＮＡ断片を調製する制限酵素(Endonuc
lease)として、Sau3AIを用いることを特徴とする特許請
求の範囲第７項記載のプラスミドの構築方法。 - 【請求項１４】バチルス属に属する微生物が好アルカリ
性細菌の属する微生物であることを特徴とする特許請求
の範囲第７項記載のプラスミドの構築方法。 - 【請求項１５】好アルカリ性細菌に属する微生物がバチ
ルスｓｐ．＃１０１１菌（微工研菌寄第８６８５号）で
あることを特徴とする特許請求の範囲第14項記載のプラ
スミドの構築方法。 - 【請求項１６】アルカリ性CGTaseの分泌生産に関与する
遺伝情報を担うバチルスｓｐ．＃１０１１菌（微工研菌
寄第８６８５号）由来のＤＮＡ断片を組み込んだ、下記
の制限酵素地図によって特徴づけられるプラスミドpTUB
703 を含有し、アルカリ性CGTaseの生産能を有するバチ
ルス・ズブチリス1 A-289 (pTUB703) ［Bacillus subt
illis 1A-289(pTUB703)］。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5097386A JPH0640827B2 (ja) | 1986-03-08 | 1986-03-08 | 新規プラスミド及びその構築方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5097386A JPH0640827B2 (ja) | 1986-03-08 | 1986-03-08 | 新規プラスミド及びその構築方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62208287A JPS62208287A (ja) | 1987-09-12 |
| JPH0640827B2 true JPH0640827B2 (ja) | 1994-06-01 |
Family
ID=12873754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5097386A Expired - Lifetime JPH0640827B2 (ja) | 1986-03-08 | 1986-03-08 | 新規プラスミド及びその構築方法並びにそのプラスミドを含有する新規微生物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0640827B2 (ja) |
-
1986
- 1986-03-08 JP JP5097386A patent/JPH0640827B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62208287A (ja) | 1987-09-12 |
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