JPH06500472A - グリホセート耐性５―エノールピルビルシキミ酸―３―ホスフェートシンターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

２０、プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓ及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターからなる 群から選択される請求の範囲第１９項に記載のグリホセート耐性植物細胞。 ２１、コーン、コムギ、コメ、ダイス、ワタ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、キャ ノーラ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプ ラ、マツ、リンゴ及びブドウからなる群から選択される請求の範囲第１８項に記 載のグリホセート耐性植物細胞。 ２２、　請求の範囲第１８項に記載の植物細胞を含むグリホセート耐性植物。 ２３、プロモーターか、ＤＮＡ植物ウィルスプロモーターに由来する請求の範囲 第２２項に記載のグリホセート耐性植物。 ２４、プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓ及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターからなる 群から選択される請求の範囲第２３項に記載のグリホセート耐性植物。 ２５、コーン、コムギ、コメ、ダイズ、ワタ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、キャ ノーラ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプ ラ、マツ、リンゴ及びブドウからなる群から選択される請求の範囲第２２項に記 載のグリホセート耐性植物。 ２６、下記工程： ａ）組換え二本ｊｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ分子が作物種子または植物中に挿入された結果 、グリホセート耐性を有する前記作物種子または植物を植え、前記ＤＮＡ分子は 、ｉ）植物細胞中てＲＮＡ配列を生しさせるように機能するプロモーター、 百）アミノ末端葉緑体トランジットペプチド及びクラスｌ［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ 酵素を含むポリペプチドをコードするＲＮＡ配列を生じさせる構造ＤＮＡ配列、 １ｊｉ）ＲＮＡ配列の３゛末端にポリアデニルヌクレオチドのストレッチを付加 させるように植物細胞中で機能する３′非翻訳化ＤＮＡ配列 を育し、 前記プロモーターは、構造ＤＮＡ配列に関して異種であり、融合ポリペプチドを 十分に表現させて、前記遺伝子により形質転換された植物細胞のグリホセート耐 性を高めるために使用され： ｂ）畑中の前記作物及び雑草に十分量のグリホセート殺草剤を与えて、前記作物 には著しい影響を与えずに雑草を制御する を含む、植えられた作物種子または植物を有する作物を含む畑中において雑゛草 を選択的に制御する方法。 ２７、クラスＩＣＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ酵素をコードする構造ＤＮＡ配列が、ＳＥ Ｑ　ＩＤ　ＮＯ：２、ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ０＝４またはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６中 に示された配列から選択される請求の範囲第２６項に記載の方法。 ２８、ＤＮＡ分子が、ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２由来の構造ＤＮＡ配列を含む請求 の範囲第２７項に記載の方法。 ２９、ＤＮＡ分子力、サラニ、ＣＡＭＶ３５Ｓ及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターか らなる群から選択されるプロモーターを含む請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３０、作物植物ＴＳかコーン、コムギ、コメ、ダイズ、ワタ、テンサイ、脂肪種 子ナタネ、キャノーラ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルフ ァルファ、ポプラ、マツ、リンゴ及びブドウからなる群から選択される請求の範 囲第２９項に記載の方法。 明　細　書 グリホセート耐性５−エノールビルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ 本出願は、１９９０年８月３１日に出願された「グリホセート耐性５−エノール ビルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ」という発明の名称の出願番号 ０７１５７６．５３７号を有する継続中の米国特許出願の部分継続出願である。 本発明の背景 本発明は、一般的には植物の分子生物学に関し、より詳しくは、新規のグリホセ ート耐性５−エノールビルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ系に関す る。 遺伝子工学における最近の進歩は、植物を形質転換して外来遺伝子を含ませるた めに必須の手段を提供している。農地経済学的に重要な独特の特徴を存する植物 を生産することは今や可能である。確かに、■のこのような効果的な特徴は、殺 草剤耐性による、よりコスト的に前動て、環境と共存可能な雑草制御である。殺 草剤耐性植物は、耕地に対して雑草を制御する必要性を減少させることかでき、 それにより土壌腐食を効果的に減少することかできる。 この点について多くの研究の対象となっている１の殺草剤は、通常グリホセート と称されるＮ−ホスホノメチルグリシンである。グリホセートは、アミノ酸、植 物ホルモン及びビタミンを含む芳香族化合物の生合成をもたらすシキミ酸経路を 阻害する。特に、グリホセートは、酵素５−エノールビルビルシキミ酸−３−ボ スフェート・　シンターゼ（以下、ｒＥＰｓＰシンターセ」または「ＥＰＳＰＳ Ｊ　と称する）を阻害することによって、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ） 及び３−ホスホシキミ酸の５−エノールビルビル−３−ホスホシキミ酸への転化 を抑制する。 グリホセート耐性植物は、細胞の葉緑体中に高レベルのＥＰＳＰンンターゼを生 成する能力を植物のゲノム中に挿入することによって生成されることかでき（シ ャーら、１９８６）、前記酵素はグリホセート耐性であることが好ましい（キシ ヨーら、１９８８）ことは知られている。ＥＰＳＰＳアミノ酸コード配列中の変 性の結果グリホセート耐性となった野性型のＥＰＳＰＳ酵素の変異体が、単離さ れている（キシヨー及びシャー、１９８８；シュルツら、１９８４．ソストら、 １９８４；キシヨーら、１９８６）。これらの変異体は典型的には、グリホセー ト耐性表現型を与える野性ＷＥＰＳＰＳ酵素よりも、グリホセートについてのＫ ｉが高いが、これらの変異体は、酵素の反応動力学的な効率を低くするＰＥＰに ついての高いＫｍによっても特徴付けられる（キシヨー及びシャー、１９８８； ソストら、１９８４．シュルツら、１９８４；キシ３−ら、１９８６；ソスト及 びアムルハイン、１９９０）。例えば、ＰＥＰについての見かけのＫｍ及びＥ、 ｃｏｌｊ由来の天然ＥＰＳＰＳのグリホセートの見かけのＫｉは、ＩＯμＭ及び ０．５μＭであり、一方、位１１ｉｉ９６におけるグリシンの代りのアラニンの １の単一アミノ酸置換を存するグリホセート耐性単離物については、これらの値 は、それぞれ２２０μ及び４．０　ｍＭである。多数のグリホセート耐性植物変 異体のＥＰＳＰＳ遺伝子は突然変異生成により構成されている。さらに、グリホ セート耐性ＥＰＳＰＳは、ＰＥＰのＫｍの増加及び天然植物酵素のＶｍａｘのわ ずかな減少によって損われ（キシヨー及びシャー、１９８８）、それによって酵 素の触媒効率（Ｖｍａｘ／Ｋｍ　）が低下する。変異体の反応動力学的定数はＰ ＥＰに関して損われるので、変異体酵素の高度の過剰生産、４０〜８０倍が、グ リホセートの存在下での植物中の通常の触媒活性を維持するために要求され得る ことが提案されている（キシヨーら、１９８８）。 このような変異体ＥＰＳＰシンターゼがグリホセートに対して耐性のトランスジ ェニック植物を得るために有用であることか証明されている一方で、反応動力学 的に有効でありながら、高度にグリホセート耐性であり、そのために植物中の通 常の触媒活性を維持するために生産されることか要求されるグリホセート耐性Ｅ ＰＳＰＳの量が減少されまたは改良された耐性か同じ発現レベルで得られるよう なＥＰＳＰシンターゼを得ることはまずます育益である。 従来の研究は、異なる起源に由来するＥＰＳＰＳ酵素がグリホセートによる阻害 に対する感受性の程度に関して広範囲に変化することを示している。グリホセー ト濃度の関数としての植物及び細菌ＥＰＳＰＳ酵素活性の研究は、グリホセート に対する感受性の程度が非常に広範囲であることを示した。感受性の程度は、試 験されたいずれの属または種とは相関関係かないことを示した（シュルツら、１ ９８５）　ｏ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、ＰＯ２９８２由来のＥＰＳＰＳ 活性のグリホセート阻害に対する非感受性は報じられているが、その研究の詳細 は報じられていない（フィッツギボン、１９８８）。一般的に、それらの天然の 耐性は報じられているが、天然発生の細菌グリホセート耐性ＥＰＳＰＳ酵素の、 突然変異生成されたＥＰＳＰＳ酵素に対する連動的な優位性を示唆する報告はな く、いずれの遺伝子も特定されていない。同様に、グリホセート耐性を与える植 物中の天然のグリホセート耐性ＥＰＳＰＳ酵素の発現についての報告はない。 本発明の概要 反応動力学的に有効なグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼをコードするＤＮＡ からなるＤＮＡ分子か提供される。本発明のＥＰＳＰシンターセは、グリホセー ト耐性を与えなから、触媒活性を維持する酵素に必要なトランスジェニック植物 中のＥＰＳＰＳ酵素の過剰生産量を減少させる。本明細書中に開示されている上 記の及びその他のＥＰＳＰシンターセは、新規のＥＰＳＰＳ酵素系（以下ｒクラ スＪ［ＥＰＳＰＳ＃素Ｊと称する）を代表する。クラス［ＩＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ 酵素は、知られた細菌または植物ＥＰＳＰＳ酵素とはほとんと相同関係を持たず 、適当なＫｍ　（ＰＥＰ）Ｗｎ−囲を維持しなからグリホセートに対する耐性を 示す。本発明の酵素のＥＰＳＰＳのＫｍ　（ＰＥＰ）の適当な範囲は、１〜１５ ０μＭであり、１〜３５μＭの範囲かより好ましく、２〜２５μＭの範囲か特に 好ましい。反応動力学定数は、以下に特定するアッセイ条件下で測定される。酵 素のＶ　ｍａＸは、未阻害植物酵素の少なくとも１５％であることが好ましく、 ２５％より大きいことかより好ましい。本発明のＥＰＳＰＳは、２５〜１０００ ０μＭのグリホセート範囲のＫｉを有することか好ましい。Ｋｉ／Ｋｍ比は３〜 ５００てあり、６〜２５０かより好ましい。Ｖｍａｘは、２〜１００単位／　ｍ ｇ　（μｍｏｌｅｓ／分、　ｍｇ、２５°Ｃ）の範囲であることか好ましく、ン キミ酸−３−ホスフェートのＫｍは、０．１〜５０μＭの範囲であることが好ま しい。 クラスＩＣＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ酵素をコードするＥＰＳＰＳは、３つの異なる細 菌から単離されている：即ち、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉ ｅｎｓ　ｓｐ、株ＣＰ４、Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ、株ＬＢＡＡ及び Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、株ＰＧ２９８２である。ＬＢＡＡ及びＰＯ２９ ８２クラス［［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子は、同しであると決定されており、こ れら２つの遺伝子によりコードされたタンパク質は、ＣＰ４タンパク質に非常に 類似しており、それと約８４％のアミノ酸同一性を共存している。クラスｒ［Ｅ 　Ｐ　Ｓ　ＰＳ酵素は、その他のクラス［ＥＰＳＰＳ酵素かクラス］抗体と容易 に反応する条件下て、クラス［ＥＰＳＰＳ酵素から調製されたポリクローナル抗 体と反応することかできない点によって、クラス［ＥＰＳＰＳから容易に区別さ れることかできる。 その他のクラス［ＩＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ酵素は、標準ハイブリッド形成技術を使 用して、本明細書中に開示されているクラスＩＣＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子の１ に由来する核酸プローブを利用して、容易に単離及び同定することかできる。Ｃ Ｐ４株由来のそのようなプローブは、株ＬＢＡＡ及びＰＧ２９８２からクラス［ ＩＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子を単離するために調製され利用されている。これら の遺伝子は、知られた方法論により植物中の発現を高めるためにも採用されるこ とかできる。このようなプローブは、土壌から新たに単離される細菌中の相同の 遺伝子を同定するために使用されている。 このクラス［ｒＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子は、葉緑体トランジットペプチド（Ｃ ＴＰ）と融合して、それか導入され得る植物の葉緑体を、そのタンパク質の目標 とさせることが好ましい。このＣＴＰ−クラス［［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ融合タン パク質をコートするキメラ遺伝子は、標準方法により所望の植物中に導入するた めの３゛ポリアデニル化部位及び適当なプロモーターを使用して調製されること かできる。 従って、本発明はｌの観点において、植物中に導入されたときに、その酵素の触 媒活性及び植物代謝か実質的に通常の状態で維持されるようにその植物かグリホ セート耐性を与えられるように、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）について 低いＫｍ、高いＶｍａｘ／Ｋｍ比及びグリホセートについて高いに１を示す新規 なＥＰＳＰシンターゼ系を提供する。この議論の目的のために、高度に有効なＥ ＰＳＰＳは、グリホセートの存在下での有効性を言う。 本発明のその他の観点において、クラス［ｌＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ酵素をコードす るＤＮＡからなる二本ＭＤＮＡ分子か開示されている。クラス［ｆＥ　Ｐ　Ｓ　 Ｐ　Ｓ酵素ＤＮＡ配列は、３つの起源に由来するものか開示されている：即ち、 Ｃ２０と称されるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、株、ＡＣｈｒＯｍＯｂａ ｅｔｅｒｓｐ、株ＬＢＡＡ及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、株ＰＧ２９８２ である。 本発明のその池の観点において、その他の起源に由来するＤＮＡ配列かプローブ とハイブリット形成する能力をアッセイする二とによって、その他の起源中のク ラス１１Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子をスクリーニングすることにおける使用に適 しているＥＰＳＰＳクラス］ｌ遺伝子由来の核酸プローブか示されている。 本発明のさらにその他の観点において、クラスＩＣＥ　ＰＳＰＳ遺伝子を植物の ゲノム中に導入することによってグリホセート耐性か与えられたトランスジェニ ック植物及び形質転換された植物細胞か開示されている。 本発明のさらにその池の観点において、配列中にａ）ＲＮＡ配列を生じさせるよ うに植物細胞中で機能するプロモーター。 ｂ）クラスＩＩＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ酵素をコートするＲＮＡ配列を生じさせる構 造ＤＮＡ配列、及び Ｃ）ポリアデニルヌクレオチドのストレッチ（５ｔｒｅｔｃｈ）をＲＮＡ配列の ３′末端に付加させるように植物細胞中で機能する３′非翻訳化領域を含み、前 記プロモーターは構造ＤＮＡ配列に関して異種構造であり、融合ポリペプチドを 十分発現させて下記ＤＮＡ分子により形質転換された植物細胞のグリホセート耐 性を高めるために適している組換え二本鎖ＤＮＡ分子が開示されている。 本発明のさらにその他の観点において、植物にグリホセート耐性を与えるために クラス［［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子により形質転換された作物の種子または作 物の植物を植えることによる作物の畑において雑草を選択的に制御する方法か示 されており、その方法によれば、グリホセートを含む殺草剤をその作物に処理し 、グリホセート感受性の雑草を選択的に死滅させながら、前記作物は死滅させな いことかできる。 本発明のその他の及びさらなる目的、効果及び観点は、添付の図面及び本発明の 開示から明らかとなるであろう。 図１は、ゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ３５Ｓ）の全長プロモーターの ＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤＮ０：Ｉ）を示す。 図２は、コスミドクローニングヘクターｐＭＯＮ　ｌ　７０２０を示す。 図３は、細菌単離物Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、株ＣＰ４由来のクラス 目ＥＰＳＰＳ遺伝子の構造ＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：２）及び推定アミノ 酸配列（ＳＥＱ　ＴＤＮｏ　３）を示す。 図４は、細菌単離物Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ、株ＬＢＡＡ由来のクラ スＩＩＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子の構造ＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＪＤ　ＮＯ：４） 及び推定アミノ酸配列（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：５）を示す。 図５は、細菌単離物Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、株ＰＧ２９８２由来のクラ ス［）Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子の構造ＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６） 及び推定アミノ酸配列（ＳＥＱＩＤ　ＮＯニア）を示す。 図６は、Ｅ、ｅｏｌｉＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： ８）とＣＰ４ＥＰＳＰＳのアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）とのベスト フィツトの比較を示す。 図７は、ＣＰ４ＥＰＳＰＳアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３）とＬＢＡＡ ＥＰＳＰＳのアミノ酸配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋５）とのベストフィツトの比 較を示す。 図８は、合成ＣＰ４クラスＩＩＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子の構造ＤＮＡ配列（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）を示す。 図９は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ　ＣＴ 　Ｐに由来し葉緑体プロセシング部位にＳｐ旧制限部位を有する葉緑体トランノ ットペプチド（ＣＴＰ）のＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１０）及び推定ア ミノ酸配列（ＳＥＱ　ＴＤ　Ｎｏ・ＩＩ）を示す（以下、ｒｃＴＰ２」と称する ）。 図１０は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝 子に由来し、ＥＰＳＰＳの成熟領域内にＥｃｏＲ［制限部位を含む葉緑体トラン ジットペプチドのＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：Ｉ２）及び推定アミノ酸配列 （ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３）を示す（以下、ｒｃＴＰ３Ｊ　と称する）。 図１１は、Ｐｅｔｕｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ　ＣＴ　Ｐに 由来し、葉緑体プロセシング部位にＳｐ旧制限部位を含み、その中のプロセシン グ部位におけるアミノ酸か−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−に変更された葉緑体トランジット ペプチドのＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ４）及び推定アミノ酸配列（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ５）を示す（以下、ｒＣＴＰ４」　と称する）。 図１２は、Ｐｅｔｕ旧ａ　ｈｙｂｒｉｄａ　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子の成熟領 域中に天然発生のＥｃｏＲ［部位を存する前記遺伝子に由来する葉緑体トランジ ットペプチドのＤＮＡ配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１６）及び推定アミノ酸配列 （ＳＥＱＩＤ　Ｎｏ・１７）を示す（以下、ｒｃＴＰ５」と称する）。 図１３は、ＣＰ４植物形質転換体／発現ベクターｐＭＯＮ１７１１０のプラスミ ド地図を示す。 図１４は、ＣＰ４合成ＥＰＳＰＳ遺伝子植物形質転換体／表現ベクターｐＭＯＮ １７１３１のプラスミド地図を示す。 図１５は、ＣＰＡＥＰＳＰＳなしのＤＮＡ植物形質転換発現ベクターｐＭＯＮ　 １３６４０のプラスミド地図を示す。 図１６は、ＣＰ４植物形質転換体／直接選択ベクターｐＭＯＮＩ７２２７のプラ スミド地図を示す。 図１７は、ＣＰ４植物形質転換体／発現ベクターｐＭＯＮ１９６５３のプラスミ ド地図を示す。 本発明の開示 二本鎖ＤＮＡ形態中に存在する植物遺伝子の発現は、ＲＮＡポリメラーゼ酵素に よりＤＮＡの１本鎖からメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）を合成すること及 びそれに続く核内のｍＲＮＡ−次産物のプロセシングを必須とする。このプロセ シングは、ポリアデニル化ヌクレオチドをＲＮＡの３′末端に付加する３′非翻 訳化領域を必須とする。 ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写は、通常「プロモーター」と称されるＤＮＡの１の領 域により調節される。このプロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼに、ＤＮＡ と結合させ、ＲＮＡの対応する相補的鎖を生成する鋳型としてＤＮＡ鎖の一方を 使用してｍ　ＲＮ　Ａ中への転写を開始させるシグナルを与える塩基配列を含む 。 植物細胞中で活性の多数のプロモーターが文献に記載されている。これらは、ノ ーバリンシンターゼ（Ｎ。 Ｓ）及びオクトピンシンターゼ（ＯＣ３）プロモーター（これらはＡｇｒｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの腫瘍誘発プラスミド上に担持されて いる）、カリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）１９Ｓ及び３５ＳブローＥ −一ター、リブロースビス−ホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット（ ｓ　５ＲＵＢ　ｌ５ＣＯ１非常に豊富な植物ポリペプチド）由来の光誘導可能な プロモーター及びゴマノハグサモザイクウィルス（ＦＭＶ　３５　Ｓ）由来の全 長転写プロモーターを包含する。これらプロモーターの全ては、植物中で発現さ れた種々の型のＤＮＡ構造物を生成するために使用されている；例えばＰＣＴ公 開ＷＯ３４１０２９１３（ロジャーズら、モンサンド）参照。 知られ、植物細胞中の転写を生じさせることが発見されたプロモーターは、本発 明において使用することができる。このようなプロモーターは、植物及び植物Ｄ ＮＡウィルスのような種々の起源から得ることができ、これらに限定されないか 、ＣａＭＶ３５Ｓ及びＦＭＶ３５Ｓプロモーター並びにｓ　５ＲＵＢ　ｌ５ＣＯ 遺伝子のような植物遺伝子から単離されたプロモーターを包含する。以下に記載 するように、選択された特定のプロモーターは、十分発現することかでき、その 結果、有効量のクラスＩ［ＥＰＳＰＳを生成して、その植物をグリホセート殺草 剤に対して実質的に耐性にすることかできるものであることか好ましい。所望の 耐性を誘導するために要求されるクラス［［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓの量は、植物の 種によって変化することかできる。利用されるプロモーターは、グリホセートか このタイプの植物組織中で移動し蓄積されることか今や知られているので、その 他の組織に加えて、全ての分裂組織中で比較的高度に発現することか好ましい。 代替的に、キメラ遺伝子の組合せを使用して、漸増的に選択されたクラスＩＣＥ 　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ酵素の必要な全体的発現レベルを得て、グリホセート耐性発現 型を得ることかできる。 本発明のＤＮＡ構造物により生成されたｍＲＮＡは、５゛非翻訳化リーダー配列 も含む。この配列は、遺伝子を発現するために選択されたプロモーターに由来す ることかでき、ｍ　ＲＮ　Ａの翻訳を増加するために特定に修正されることかで きる。５′非翻訳化領域はウィルスＲＮＡ、適当な真核遺伝子または合成遺伝子 配列から得ることもてきる。本発明は、下記の例に記載される、非翻訳化領域か プロモーター配列を伴う５′非翻訳化配列及びウィルス被覆タンパク質遺伝子の ５′非翻訳化領域の一部の両方に由来する構造に限定されるものではない。むし ろ、非翻訳化リーダー配列は、関係のないプロモーターまたは上記のコード配列 に由来することができる。 本発明において使用される好適なプロモーターは、植物特に双子葉植物中に挿入 されるキメラ遺伝子の分裂組織中ての特に良好な発現を伴う強力で均一なプロモ ーターとして作用するゴマノハグサモザイクウィルス（ＦＭＶ３５Ｓ）ｉ：由来 する全長転写（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：ｌ）プロモーターである。得られたトラン スジェニック植物は一般的には、高められたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにより 駆動される同じ遺伝子よりも、形質転換された植物の組織及び細胞の全体を通し て、より高くより均一なレベルで挿入された遺伝子によりコードされるタンパク 質を発現する。図１を参照すると、ＦＭＶ３５ＳブローＥ−一夕一（７）ＤＮＡ 配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ二Ｉ）ｌ；ｔ、ＦＭＶゲノムのヌクレオチド６３６８ 及び６９３ｏの間に存在する。５′非翻訳化リーダー配列はプロモーターと連結 することが好ましい。リーダー配列は、ＦＭＶ３５Ｓゲノム自体から得ることが でき、またはＦＭＶ３５Ｓ以外の起源から得ることかできる。 キメラ植物遺伝子の３′非翻訳化領域は、植物中においてウィルスＲＮＡの３′ 末端にポリアデニル化ヌクレオチドを付加するように作用するポリアデニル化シ グナルを含む。適当な３′領域の例は、（１）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ腫瘍 誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子、例えばノーバリンシンターゼ（ＮＯ３）遺伝子 、のポリアデニル化シグナルを含む３′転写された非翻訳化領域、及び（２）ダ イズ貯蔵タンパク質遺伝子のような植物遺伝子及びリブロ−スー１．５−ビスホ スフェートカルボキシラーゼの小ユニット（ｓ　５ＲＵＢ　Ｉ　５ＣＯ）遺伝子 である。好ましい３゛領域の例は、以下に詳しく説明するマメ（Ｅ９）由来のｓ 　５ＲＵＢ　ｌ５ＣＯに由来のものである。 本発明のＤＮＡ構造物は、グリホセート耐性で高度に有効なりラス［［Ｅ　Ｐ　 Ｓ　Ｐ　Ｓ酵素をコートする二本鎖ＤＮＡ形態中の構造コード配列をも含む。 グリホセート耐性で高度に有効なＥＰＳＰＳ酵素の同定グリホセート耐性で高度 に有効なＥＰＳＰＳ酵素を同定し単離する試みにおいて、グリホセートに対する 耐性を示す多数の細菌に由来由来し、または適当な起源から単離されたＥＰＳＰ Ｓ酵素の反応動力学的分析を行った。 いくつかのケースにおいて、ＥＰＳＰＳ酵素はグリホセートによる阻害に耐性を 示さないことが発見され、細菌の耐性表現型はグリホセートまたはその他の因子 に対する非浸透性によるものであると結論付られている。しかしながら、多数の 場合において、その他の微生物及び植物起源について既に報告されたものと比較 すると、そのＥＰＳＰＳ酵素かグリホセートによる阻害に対して高度の耐性を示 しＰＥＰについて低いＫｍを示す微生物が同定された。これらの微生物に由来の ＥＰＳＰＳ酵素をその他の研究及び分析に付された。 表Ｉは、上記の分析の結果同定及び単離されたＥＰＳＰＳ酵素について得られた データを示す。表■は、グリホセートに対する阻害に高耐性を存し、ＰＥＰにつ いて低いＫｍを存することか観察された３つの同定されたクラス［ＩＥ　Ｐ　Ｓ 　Ｐ　Ｓ酵素についてのデータ、天然ＰｅｔｕｎｉａＥＰＳＰＳ及びＧＡＩＯＩ と称されるＰｅｔｕｎｉａ　Ｅ　Ｐ　Ｓ　ＰＳのグリホセート耐性変異体につい てのデータを含む。 ＧＡＩＯＩ変異体は、不変領域中の位置１０１　（Ｐｅｔｕｎｉａに関して）の グリシン残基にアラニン残基の置換を示すので、そのように命名される。Ｐｅｔ ｕｎｉａ　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ中にもたらされる変化（ＧＡＩＯＩ）はその他の 多数のＥＰＳＰＳ酵素中に導入した場合には、反応動力学における類似の変化、 グリホセートについてのＫｉ及びＰＥＰについてのＫｍの増加か認められた。 表Ｉ　ＥＰＳＰＳ酵素の反応動力学的特徴誘素起源　Ｋ＋ｎ　ＰＥＰ　Ｋｉ　グ リ本セード　Ｋｉ／Ｋｍ（μＭ）　（μＭ） Ｐｅｔｕｎｉａ　５　０．４　０．０８Ｐｅｔｕｎｉａ　ＧＡＩＯＩ　２００　 ２０００　１０ＰＧ２９８２　２．１−３．１’　２５−８２　〜８−４０ＬＢ ＡＡ　〜７．３−８２　６０（ｅｓｔ）　〜７．９ＣＰ４　１２”　２７２０　 ２２７ １　試験されたＰＥＰの範囲＝１−４０μＭ２　試験されたＰＥＰの範囲＝５− ８０μＭ３　試験されたＰＥＰの範囲＝１．５−４０μＭＡｇｒＯｂａＣｔｅｒ ｉｕｍ　Ｓｐ、株ＣＰ４を、１ｍＭホスフェートの存在下で炭素源（１０ｍＭ） としてのグリホセート上て生長するその能力により最初に同定した。株ＣＰ４は 、Ｍａｎｎｖｉｌｌｅ　Ｒ−６３５珪ソウ土ビーズを使用する固定床固定細胞カ ラムから１辱られた採集物から同定された。このコラムは、グリホセート産生植 物から得られる廃水流上で３月間操作された。このコラムは、５０ｍｇ／ｍｌ　 グリホセート及びＮＨ，Ｃ１としてのＮＨ，を含む。全有機炭素は３００　ｍｇ ／ｍｌてあり、ＢＯＤ　（生物学的酸素要求量−「ソフト」の炭素利用能の基準 ）は、３０　ｍｇ／ｍ１未満てあった。この処理カラムは文献に記載されている （ハイトカンプら、１９９０）。１０ｍＭのグリホセート及び１ｍＭのホスフェ ートを含むドウすルキンーフオスターの最小塩培地を使用して、このカラムの洗 浄液から単一の炭素源としてのグリホセート上で生長することかできる微生物を 選択した。トウすルキンーフオスターの最小培地は、Ｉ！！（オートクレーブさ れたＨ２０）中に、Ａ、Ｂ及びＣをそれぞれ１ｍｌ並びにＤ（それぞれ以下に示 す）ＩＯｍｌ及びチアミンＨＣＩ（５ｍｇ）を混合することによって生成された 。 Ａ、Ｄ−Ｆ塩（１００ＯＸストック：ｌ００ｍ１当り二オートクレープ滅菌）： ＨｚＢＯａ　１ｍｇ Ｍｎ５Ｏａ、７Ｈ２０＋ｍｇ ＺｎＳＯａ、７Ｈ２０１２，５ｍｇ ＣｕＳＯ４，５Ｈ２０８ｍｇ ＮａＭｏＯｘ、３Ｈ２０１，７ｍｇ Ｂ、Ｆｅ５０＜、７Ｈ２０（ｌ　Ｏ００Ｘストック：１００ｍ１当り二オートク レープ滅菌）　０．１ｇＣ，Ｍｇ５Ｏａ、７Ｈｚ　Ｏ（１０００Ｘストック；１ ００ｍ１当り二オートクレープ滅菌）　２０ｇＤ、（ＮＨ，）２　Ｓｏ、（１０ ０Ｘストック：１００ｍ１当り：オートクレープ滅菌）　２０ｇ 酵母抽出物（ＹＥ；ディフコ）を最終濃度か０．０１または０．００１％になる ように添加した。株ＣＰ４も、炭素源としてのグルコース、グルコン酸塩及びク エン酸塩（各０．１％）並びにリン源としての有機リン酸塩（０６１〜１．　Ｏ ｍＭ）を含む、上記のように補正されたＤ−Ｆ塩からなる培地上で生長した。 微生物を含むその他のクラス［［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓか、既に文献に記載された （ハラスら、１９８８）細菌の採集物に由来するＡｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　 ｓｐ、株ＬＢＡＡ及び文献に記載されている（ムーアら、１９８３．フィッツギ ボン、１９８８　）　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、株ＰＧ２９８２として同 定された。粗溶解物の測定から、株ＰＧ２９　Ｆ３２に由来するＥＰＳＰＳ酵素 は、ｌＥ、ｃｏｌｉのＥＰＳＰＳ酵素よりもグリホセートに対する阻害への感受 性が小さいことが既に報告されているが、感受性の欠如に関する詳細は報告され ておらず、この酵素のＰＥＰのＫｍまたはこの酵素の遺伝子のＤＮＡ配列につい ての報告もまだない（フィッツギポン、１９８８；フィッツギポン及びプレイマ ー、１９９０）。 クラスＩＣＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓと既に研究されたものとの関連今日までに研究さ れた全てのＥＰＳＰＳタンノ々り質は、著しい程度の相同を示している。例えば 、細菌及び植物ＥＰＳＰＳは約５４％か同一で、８０％もの高率の類似性を有す る。細菌ＥＰＳＰＳ及び植物ＥＰＳＰＳそれ自体内の、同−性及び類似性の程度 はより大きい（表Ｉ！参照）。 Ｅ、ｅｏｌｉ対Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　９３．０　８８．３Ｐ、　ｈｙ ｂｒｉｄａ対Ｅ、　ｃｏｌｉ　７１．９　５４．５Ｐ、　ｈｙｂｒｉｄａ対トマ ト　９２．８　８８．２１　ここで比較されたＥＰＳＰＳ配列は、下記の文献か ら得られた：Ｅ、ｃｏｌｉ、ロシャーズら、１９８３；Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒ ｉｕｍ　、スタルカーら、１９８５　；　Ｐｅｔｕ旧ａｈｙｂｒｉｄａ　、シャ ーら、１９８６；及びトマト、ガツサーら、１９８８゜ ＣＦ２及びＬＢＡＡの粗抽出物（タンパク質５０μｇ）をウェスタン分析におい てＰｅｔｕｎｉａ　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓタンパク質に対するウサギ抗ＥＰＳＰＳ 抗体（パジェットら、１９８７）を用いてプローブしたら、対照ＥＰＳＰＳ（Ｐ ｅｔｕｎｉａ　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ、２０ｎｇ；クラス［ＥＰＳＰＳ）か容易に 検出された条件下で、延長された露出時間（タンパク質Ａ　１２５Ｉ現像システ ム）を用いても、プラスのシグナルは検出されなかった。これらの抽出物中のＥ ＰＳＰＳ活性の存在は酵素アッセイにより確認された。 これらの細菌単離物由来のＥＰＳＰＳと既に研究されたＥＰＳＰＳとの間の類似 性がないことか、ＰＥＰの低いＫｍとグリホセートの高いＫｉとの組合せに関連 することを示すこの驚くへき結果は、これらの新規のＥＰＳＰＳ酵素が知られた ＥＰＳＰＳ酵素とは異なることを示している（以下、「クラス［ＥＰＳＰＳＪ　 と称する）。 微生物単離物中のグリホセート耐性酵素開示を明瞭かつ簡潔にするために、クラ ス［ｌＥ　Ｐ　Ｓ　ＰＳ酵素をコードする遺伝子の単離物についての以下の記載 は、細菌単離物に由来するそのような遺伝子の単離物を指すものとする。当業者 は、同じまたは類似の方法を利用して、その他の微生物単離物、植物または真菌 の起源からそのような遺伝子を単離することができることを理解するであろう。 Ｅ、ｃｏｌｉ中のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、株ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝 子のクローニング ＡｇｒＯｂａＣｔｅｒｉｕｍ　Ｓｐ、株ＣＰＪ中の適当なＥＰＳＰＳの存在か確 証されたので、２つの平行的な方法を実施して遺伝子をクローニングした：グリ ホセート耐性ＥＰＳＰＳの所期の発現型に基づくクローニング：及び酵素を精製 して、抗体を生じさせタンパク質からアミノ酸配列を得るための物質を提供しク ローニングの立証に役立てた。 特に断らない限り、クローニング及び遺伝子技術は、一般的にはマニアチスら、 １９８２またはサムプルツクら、１９８７に記載された技術である。クローニン グ方法は下記の通りとした：抹Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、株ＣＰ４の コスミドバンクをＥ、ｃｏｌｉ中に導入すること及び阻害濃度のグリホセート上 での生長について選択することによってＥＰＳＰＳ遺伝子の選択を行うこと。 染色体ＤＮＡは、株Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、株ＣＰ４から下記のよ うにして調製した：　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、株の２００ｍ１Ｌ− ブロス（ミラー、＋９７２）、後期対数期培養物に由来の細胞ペレットを、溶液 １１０ｍ１；グルコース５０ｍＭ５ＥＤＴＡ　１０ｍＭ、トリス−ＣＬ　２５　 ｍＭ、　ｐＨ８゜０中に再懸濁した（バーンホイム及びドーリ−１１９７９）。 ＳＤＳを最終濃度か１％になるように添加し、この懸濁液を、それぞれか乾燥水 中に１５分間及び７０°Ｃの水中に１０分間浸漬することからなる３回の凍結− 解凍サイクルに付した。次いでこの溶解物を、等容量のフェノール：クロロホル ム（ｌ・ｌ；ＴＥにより飽和されたフェノール；ＴＥ＝１０ｍＭ）リスｐＨ８， Ｏ；　１．　ＯｍＭＥ　ＤＴＡ）により４回抽出し、得られた相を遠心分離（１ ５０００ｇ、１０分間）により分離した。２容量のエタノールを添加した後、短 時間の遠心分離（８０００ｇ；５分間）により、エタノール沈殿物質を上清から ペレット化した。このペレットをＴＥＳｍｌ中に再懸濁し、ＴＥ２１に対して４ °Ｃて１６時間透析した。この調製により５５２μｇ／ｍｌのＤＮＡ溶液溶液５ ハｌられた。 部分的に制限されたＤＮＡは下記のようにして調製した。ＣＰ　４　ＤＮＡの３ つの１００μｇの少量試料を、それぞれ４．２及びｌ酵素単位／μｇ　ＤＮＡの 割合で、制限エンドヌクレアーゼＨ４ｎｄ［ＩＩにより１時間３７°Ｃにおいて 処理した。このＤＮＡ試料を集め、ＥＤＴＡにより０、２５　ｍＭとし、等容量 のフェノール：クロロホルムにより抽出した。酢酸ナトリウム及びエタノールを 添加した後、ＤＮＡを２容量のエタノールにより沈殿させ、遠心分離によりペレ ット化した（１２０００ｇ；１０分間）。 乾燥したＤＮＡペレットをＴＥ５００μｌ中に再懸濁し、０、５　ＭＮａＣｌ、 ５００１Ｍトリス、ｐＨ８，０、ＳｍＭＥＤＴＡ中の１０〜４０％のシュクロー ス勾配上（各５．５　ｍｌの５％増加）で層にした。ＳＷ２８０−ターによる２ ６．００Ｏｒｐｍにおける２０時間の遠心分離の後、管に穴を開け、〜１．５　 ｍｌの両分を採集した。各第２画分の試料（２０μＩ）を、０．７％アガロース ゲル上で操作し、ＤＮＡのサイズを線状にされたλＤＮＡ及び旧ｎｄ［［［−消 化されたλＤＮＡ標準との比較により測定した。２５〜３５ｋｂの断片のＤＮＡ を含む画分を集め、ＡＭＩＣＯＮＩＯカラム上て脱塩しく７０００ｒｐｍ；２０ °Ｃ；４５分間）、沈殿により濃縮した。この操作により、所望の寸法のＣＰ４ ＤＮＡ１５μｇが生成された。コスミドバンクはベクター１）ＭＯＮＩ７０２０ を使用して構成された。このベクター、図２に示される地図は、ｐＢＲ３２７レ プリコンに基づき、Ｔｎ７由来のスペクチノマイシン／ストレブオマイシン（Ｓ ｐ゛　；５ｐｃ）耐性遺伝子（コリンズら、１９８５）、Ｔｎ９由来のクロラム フェニコール耐性遺伝子（Ｃｍ’　：ｃａｔ　）　（アルドンら、＋９７９）、 ファージエフ由来の遺伝子１０プロモーター領域（ドユーンら、１９　Ｆ３３） 及びｐＨＣ７９由来の１．６　ｋｂＢｇｌｌ［ファーソλコス断片（ホーン及び コリンズ、＋９８０）を含む。多数のクローニング部位かｃａｔ遺伝子の下流に 存在している。Ｅ、ｃｏｌｉ中のその他の微生物起源由来の遺伝子の表現に対す る優勢な阻止は、転写のレベルであると考えられるので、Ｔ７プロモーターの使 用及びｐＧＰｌ−２プラスミドからのその位置でのＴ７ボリメラーセの提供（テ ィパー及びリチャードソン、１９８５）は、ＲＮＡボリメラーセ転写終結配列を 含むとしても、外来ＤＮＡの大ＤＮＡ部分の表現を可能にする。ｓｐｃ遺伝子の 表現は、Ｃｍ’のみかｐＧＰｌ−２を含む株中て選択され得るように、Ｔ７プロ モーターからの転写により損われる。膜成分を採用しないＣｍ耐性のような抗生 物質耐性の使用は、膜成分、例えばβ−ラクタマーゼのような膜成分及びＡｍｐ 耐性を含む耐性遺伝子の高レベルの表現かグリホセート耐性表現型を生じさせる ことの観察によることか好ましい。多分これは、膜局在耐性タンパク質による細 胞からのグリホセートの排除によるものである。また選択可能な標識は、Ｔ７プ ロモーターと同じ方向に配向していることか好ましい。 次いでこのベクターを、クローニングの調製において、Ｈｉｎｄｌ［［により切 断し、子牛アリカリホスファターゼ（ＣＡＦ）により処理した。ベクター及び標 的配列は、下記： ベクターＤＮＡ　（Ｈｉｎｄ［［［／ＣＡＰ）　３　μｇサイズ分画されたＣ　 Ｐ　４　Ｈｉｎｄｌ（断片　１．５μｇ１０Ｘ連結緩衝液　２．２ｇｇ Ｔ４ＤＮＡリガーゼにューイングランドバイオラブズ）　（４００Ｕ／μｌ　） 　１．０ｇｇを結合し、Ｈ２０を２２．０μｌになるまで添加することによって 連結した。この混合物を１６°Ｃにおいて１８時間インキュベートした。ＩＯＸ 連結緩衝液は、２５０ｔｎＭトリスーＨＣｌ、ｐＨ８，０；　ｌｏｏｍＭＭｇｃ ］ｔ　；　ｌ　００ｍＭジチオトレイトール；２ｍＭスペルミジンである。この 連結されたＤＮＡ　（５μＩ）を、製造者による手順を使用して、λフアージ粒 子（ストラータジーンギガバックゴールド）中に充填した。 Ｔ７ボリメラーゼ発現プラスミドｐＧＰ１−２（ティパー及びリチャードソン、 １９８５）を含みＬ−ブロス（０，２％のマルトース及び５０ｇｇ／ｍｌのカナ マイシン）中で一晩生長したＥ、ｃｏｌｉＨＢ　１０１　（ポイヤー及びローラ ンドーデュソー、１９７３）の試料（２００μｌ）を充填されたＤＮＡ５０μｌ により感染させた。形質転換体を、３．０　ｍＭのグリホセートと、カナマイシ ン（５０ｇｇ／ｍｌ）、クロラムフェニコール（２５ｕｇ　／ｍｌ）、Ｌ−プロ リン（５０ｕｇ　／ｍｌ）　、Ｌ−ロイシン（５０ｇｇ／ｍｌ）及びＢｌ（５μ ｇ／ｍｌ）を含むＭ９（ミラー、１９７２）寒天上で３０″Ｃて選択した。少量 試料をグリホセートを欠く同し培地上で培養し、充填されたコスミドを滴定した 。コスミド形質転換体を、３日後に３０’Ｃにおいてｃ　Ｐ　４Ｈｉｎｄ［ｌＩ 　ＤＮＡ　ｌ　ｕｇ当り〜５×ｌｏ５の割合て、このｉ＆者の培地上で単離した 。３日から１５日に最終割合か〜ｌ／２００コスミドで、コロニーがグリホセー ト寒天上に発生した。ＤＮＡが１４のグリホセート耐性クローンから調製され、 この発現型を確認した後に、Ｅ、ｃｏｌｉＧＢ　＋　００／ｐＧＰ　Ｉ−２中に 形質転換しくＥ、ｃｏｌｉＧ　Ｂ　１００はＭＭ２９４のａｒｏ　Ａ誘導体であ る［タルマッシ及びギルバート、１９８０］）、添加された芳香族アミノ酸及び アミノ安息香酸の不在下での生長の相補性を試験した。ＳＲ４８１のようなその 他のａｒ。 Ａ（バッハマンら、１９８０．バジェットら、１９８７）を使用することか可能 であり、この実験に適している。Ｃ；Ｂ１００の使用はほとんと例かなく、限定 された意味において考察されるべきてはない。このａｒｏ　Ａ株は通常、生長培 地か最小培地中の生長のために、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロノン及びＬ− ）リブトファンをそれぞれ１００　ｌ１ｇ　／ｍｌ並びにｐ−ヒドロキシ安息香 酸、２．３−ジヒドロキシ安息香酸及びｐ−アミノ安息香酸をそれぞれ５μｇ　 ／ｍ１１ｔｌ給されることを要求する。試験された１４のコスミトのうち、■の みかａｒｏ　Ａ−表現型の相補性を示した。このコスミドの形質転換体、ｐＭ。 Ｎｌ７０７６は、１０日後に未補給の最小培地上において弱いが均一な生長を示 した。 コスミドによりコードされたタンパク質を、Ｔ７表現系（ティパー及びリチャー ドソン、１９８５）を使用して生体内で測定された。ｐＧＰｌ−２（ティパー及 びリチャードソン、１９８５）と試験及び対照コスミドを含むＥ、ｃｏｌｉの培 養物を、クロラムフェニコール及びカナマイシン（それぞれ２５及び５０ｇｇ　 ／ｍｌ）を含むし一グロス（２ｍｌ）中で３０°Ｃにおいてクレットの目盛か〜 ５０になるまで生長させた。少量の１を取り、細胞を遠心分離により採集し、Ｍ ９塩（ミラー、１９７２）により洗浄し、０．２％グルコース、２０ｇｇ／ｍｌ チアミン及び０．０１％１８アミノ酸（−システィン及びメチオニン）を含むＭ ９培地１ｍｌ中に再懸濁した。３０℃において９０分間インキュベートした後、 この培養物を４２°Ｃの水浴中に移し、そこで１５分間保持した。リファンピシ ン（シグマ社）を２００ｇｇ／ｍｌになるまで添加し、培養物を４２°Ｃにおい てさらに１０分間保持し、次いで３０℃に２０分間移した。試料に５分間３０℃ において、２５Ｓ−メチオニン１０μＣｊを適用した。この細胞を遠心分離によ り集め、クラッキング緩衝液（６０ｍＭ）リス−ＨＣ１６，８，１％ＳＤＳ、１ ％２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、０．０１％ブロモフェノー ルブルー）６０〜１２０μｌ中に懸濁した。少量の試料を１２．５％５ＤＳ−Ｐ ＡＣ；Ｅ上での電気泳動に付し、１０容量の酢酸−メタノール−水（１０：３０ ：６０）中に６０分間浸漬した後、ゲルを製造者の指示に従ってＥＮＬ　ＩＧＨ ＴＮ　ＩＮＧ”（デュポン製）中に浸漬し、乾燥させ、−７０°ＣにおいてＸ線 フィルムに暴露した。３Ｍ５−メチオニンで標識された約４５ｋｄのサイズのタ ンパク質か、Ｉ）ＭＯＮ１７０７６を含む多数のニスミド中で検出された。 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｓｐ、株ＣＰ４からのＥＰＳＰＳの精製全てのタ ンパク質精製方法を、３〜５℃において実施した。ＥＰＳＰＳ酵素アッセイを、 Ｉ＋ｎＭホスホエノールピルベート（ＰＥＰ、ベーリンガー）及び２ｍＭシキミ 酸−３−ホスフェート（３３Ｐ）基質濃度を使用して、パジェットらにより１９ ８７年に記載されたホスフェート放出または放射性ＨＰＬＣ方法のいずれかによ り実施した。放射性ＨＰＬＣアッセイでは、”Ｃ−ＰＥＰ　（アマースハム）を 利用した。３３Ｐは、ウィペンマイヤーらにより１９８８年に記載された方法に より合成された。 Ｎ末端アミノ酸の配列決定を、乾燥しながら試料をアリコートに分割してポリブ レンプリサイクルフィルター上に充填することによって行った。自動ニドマン分 解化学を使用して、アブライトバイオシステムズＩ　２０ＡＰＴＨ分析装置を含 むアブライトバイオシステムダモデル４フ０Ａ気相配列決定装置（バンカピラー ら、１９８３）によりＮ末端タンパク質配列を決定した。 ５の１０１の発酵を、液体培地中で生長した場合に少ない凝集塊を示す株ＣＰ４ の自然発生的な「滑らかな」単離物上で行った。この減少された凝集口及び滑ら かなコロニー形態は、この単離物により減少された多糖類の生成によるものであ り得る。下記のＥＰＳＰＳ酵素の精製を扱うセクションにおいて、ＣＦ２を「滑 らかな」単離物−ＣＦ２−３ｌと称する。高特異活性を示す３つのバッチに由来 の細胞を集めた。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、　ＣＰ４の細胞ペースト （３００ｇ）を、０．９％生理食塩水０．５Ｌで２回洗浄し、遠心分離（３０分 間、ＧＳ３ソーパルローター中、８０００　ｒｐｍ　）により集めた。この細胞 ペレットを抽出緩衝液（１００ｍＭ）リスＣＩ、１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＢＡＭ 　（ベンズアミジン）　、５ｍＭＤＤＴ。 １０％グリセロール、ｐＨ７，５）　０．９　Ｌ中に懸濁し、マントンガラリン セルを２回通過させることにより溶解させた。得られた溶液を遠心分離しく３０ 分間、８０００ｒｐｍ）、得られた上清を１．５％プロタミン硫酸塩０．２１Ｌ （１００ｍＭ）リスＣＩ中、ｐＨ７，５，０，２％ｗ／ｖ最終プロ最終プロタミ ン硫酸塩法り処理した。１時間撹拌した後、混合物を遠心分離しく５０分間、８ ０００　ｒｐｍ　）　、得られた上清を固形硫酸アンモニウムにより処理し、４ ０％飽和とし、１時間撹拌した。遠心分離（５０分間、８０００　ｒｐｍ　）の 後、得られた上清を固形硫酸アンモニウムにより処理して７０％の飽和とし、５ ０分間撹拌し、不溶性のタンパク質を遠心分離（１時間、８０００　ｒｐｍ　） により集めた。次いで、この４０〜７０％硫酸アンモニウム画分を抽出緩衝液中 に溶解し、最終容量を０．２Ｌとして、抽出緩衝液２Ｌに対して２回、全体で１ ２時間透析した（スペクトラムＩＯ，ｏ００ＭＷカットオフ透析チューブ）。 得られた透析された４０〜７０％の硫酸アンモニウム画分（０，２９Ｌ）に、固 形硫酸アンモニウムを添加して最終濃度をＩＭとした。この材料を、１Ｍ硫酸ア ンモニウムを含む抽出緩衝液により平衡化されたフェニルセファ０−スＣＬ−４ Ｂ　（ファルマシア）樹脂を充填したカラム（５ｃｍｘ１５ｃｍ、２９５ｍ１） 上に充填しく　２　ｍｌ／分）、同じ緩衝液により洗浄した（１．５Ｌ、２ｍ１ ／分）。 ＥＰＳＰＳを、ＩＭから０．００Ｍの硫酸アンモニウムの抽出緩衝液の線状勾配 により溶離した（全容量１．５Ｌ、２　ｍｌ／分）。画分を集め（２０ｍｌ）、 ホスフェート放出アッセイによりＥＰＳＰＳ活性をアッセイした。高ＥＰＳＰＳ 活性を有する画分（画分３６〜５０）を集め、１０ｍＭトリスＣ１，２５ｍＭＫ Ｃｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭＤＴＴ、１０％グリセロール、ｐＨ７，８に対し て透析した。 透析されたＥＰＳＰＳ抽出物（３５０ｍｌ）を、ｌ０ｍＭトリスＣ１，２５ｍＭ ＫＣｌ、５　ｍ１ｉｌＤ　Ｔ　Ｔ、１０％グリセロール、ｐＨ７，８（Ｑセファ ロース緩衝液）により平衡化されたＱ−セファロースファーストフロー（ファル マシア製）樹脂を充填したカラム（２，４ｃｍｘ　３０　ｃｍ、１３６ｍ１）上 に充填した（　５　ｍｌ／分）、ＥＰＳＰＳを０．０２５Ｍ〜０．４０ＭＫＣｌ のＱセファロース緩衝液の線上勾配により溶離した（全体の容量か１．４Ｌ、５ ｍ１／分）。画分を集め（１５ｍｌ）、ホスフェート放出アツセイによりＥＰＳ ＰＳ活性をアッセイした。高ＥＰＳＰＳ活性（画分４７〜６０）を有する画分を 集め、固形硫酸アンモニウムを８０％飽和になるように添加して沈殿させ、１時 間撹拌した。沈殿したタンパク質を遠心分離（２０分間、ＧＳＡＳ−ソーパルロ ーター中０００ｒｐｍ）により集め、Ｑセファロース緩衝液中に溶解しく全容量 １４ｍ１）、同じ緩衝液に対して透析した（２ＸＩＬ、１８時間）。 得られた透析され、部分的に精製されたＥＰＳＰＳ抽出物（１９ｍｌ）をＱセフ ァロース緩衝液により平衡化されたモノＱＩＯ／１０カラム（ファルマシア製） 上に充填しく１．７ｍｌ／分）、同じ緩衝液（３５ｍｌ）により洗浄した。ＥＰ ＳＰＳを０．０２５Ｍから０．３５ＭＫＣｌの線状勾配により溶離した（全容量 １１９ｍｌ　１．７ｍｌ／分）。 画分を集め（１，７ｍ１）、ホスフェート放出アッセイによりＥＰＳＰＳ活性を アッセイした。高ＥＰＳＰＳ活性を有する画分（画分３０〜３７）を集めた（６ ｍｌ）。 固形硫酸アンモニウムを添加することにより、モノＱプールを硫酸アンモニウム ＩＭとし、２ｍｌを、１００ｍＭトリスＣ１，５ｍＭＤ　Ｔ　Ｔ、１Ｍ硫酸アン モニウム、１０％グリセロール、ｐＨ７，５（フェニルスペローズ緩衝液）で平 衡化されたフェニルスペローズ５１５カラム（ファルマシア製）上でクロマトグ ラフィー処理した。試料を充填しく　Ｉ　ｍｌ／分）、フェニルスベローズ緩衝 液（１０ｍｌ）により洗浄し、ＩＭから０．ＯＯＭの硫酸アンモニウムのフェニ ルスペローズ緩衝液の線状勾配により溶離した（全容量６０　ｍｌ　１　ｍｌ／ 分）。両分を集め（１ｍｌ）、ホスフェート放出アッセイによりＥＰＳＰＳ活性 をアッセイした。高ＥＰＳＰＳ活性を有する各流れから得られた両分（画分〜３ ６〜４０）を−緒に集めた（１０ｍｌ、２、５　ｍｇタンパク質）。Ｎ末端アミ ノ酸配列決定のために、１の画分の１部分（流れｌから得た＃３９）を５０ｍＭ ＮａＨＣＯ＝に対して透析した（２ＸＩＬ）。得られた純度の高いＥＰＳＰＳ試 料（０，９ｍｌ、７７μｇタンパク質）は、下記の単−Ｎ末端アミノ酸配列：Ｘ Ｈ（Ｇ）ＡＳＳＲＰＡＴＡＲＫＳＳ　（Ｇ）ＬＸ　（Ｇ）（Ｔ）Ｖ（Ｒ）ＩＰＧ （Ｄ）（Ｋ）（Ｍ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：Ｉ８）を示すことか判明した。 このアミノ酸配列及び以下の全てのアミノ酸配列は、標準−文字名称を使用した 。下記の記載において示される全ペプチド構造は、Ｎ末端のアミノ酸が左で、Ｃ 末端のカルボキシル基か右に示される従来の方式で示す。同様に、タンパク質中 に見られる天然発生のアミノ酸のアミノ酸名称は、下記の通りとする・アラニン （Ａｌａ：Ａ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ＋Ｄ） 、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、システィン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン酸（Ｇｌ ｕ；Ｅ）、グルタミン（Ｇｉｎ；Ｑ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（ Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン （Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅ　ｔ　；Ｍ）　、フェニルアラニン（Ｐｈｅ ：Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ 　；Ｔ）　、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）及びバリ ン（Ｖａｌ；Ｖ）。 アミノ酸残基か知られていない場合に「Ｘ」を用い、カッコは、明白な指定が可 能でないこと及び括弧内のアミノ酸の指定が知られた情報に基づいて最も可能性 の高い推定であることを示している。 残りのフェニルスペローズＥＰＳＰＳブールを、５０ＩｎＭトリスＣ１，２ｍ１ ｉｌＤＴＴ、１０ｍＭＫＣＩ、１０％グリセロール、ｐ）ｔ７．５　（２ｘ　Ｉ 　Ｌ）に対して透析した。Ｑセファロース緩衝液で平衡化したモノＱ５１５カラ ム（ファルマシア製）上にアリコート（０，５５ｍｌ、　０．６１　ｍｇタンパ ク質）を充填しく　ｌ　ｍｌ／分）、同じ緩衝液で洗浄しく５ｍ１）　、０〜０ ．１４ＭＫＣＩのＱセファ０−ス緩衝液の線状勾配により１０分間溶離し、次い で、０．１４ＭＫＣｌで保持した（　１　ｍｌ／分）。両分を集め（１ｍｌ）、 ホスフェート放出アッセイによりＥＰＳＰＳ活性をアッセイし、５ＤＳＰＡＧＥ に付しく１０〜１５％、ファストシステム、ファルマシア製、銀染色を伴う）、 タンパク質純度を決定した。５ＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質の単一のバンド を示す画分（２２〜２５．２２２μｇ）を集め、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム 、ｐＨ８，１に対して透析した（２ＸＩＬ、９時間）。 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｓｐ、株ＣＰ４ＥＰＳＰＳのトリブシノリシス及 びペプチド配列決定 得られた純粋なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、株ＣＰ４ＥＰＳＰｉＳ（Ｉ ｌｌμｇ）に、トリプシン３μｇ　（カルノくイオケム）を加え、トリブシノリ シス反応を１６時間３７°Ｃにおいて進行させた。次いて、トリプシンの消化物 をノくジェットらか１９８８年にＥ、ｃｏｌｉＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓについて開示 した方法により、ＣＩ８逆相ＨＰＬＣカラム（）くイダ、ツク）上でクロマトグ ラフィー処理した（１ｍｌ／分）。全てのペプチド精製について、０．１％トリ フルオロ酢酸（ＴＦＡ、ピアス）を緩衝液ｒＲＰ−ＡＪ　と称し、アセトニトリ ル中の０．１％ＴＦＡを緩衝液ｒＲＰ−ＢＪ　と称した。トリプシン処理された Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、ＣＰ　４ＥＰＳＰＳの溶離のために使用さ れた勾配は二０．８分、０％ＲＰ−Ｂ　：　８〜２８分、０〜１５％ＲＰ−Ｂ　 、　２８〜４０分、１５〜２１％ＲＰ−Ｂ　；　４０〜６８分、２Ｉ〜４９％Ｒ Ｐ−Ｂ　；　６８〜７２分、４９〜７５％ＲＰ−Ｂ；７２〜７４分、７５〜１０ ０％ＲＰ−Ｂてあった。 両分を集め（１ｍ１）　、２１０ｎｍにおける溶離グラフに基づいて、少なくと も７０のはつきりしたペプチドをトリプシン処理されたＥＰＳＰＳから生成した 。画分４０〜７０を蒸発乾固し、１０％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ 酢酸各１５０μｌ中に再溶解した。 画分６１のペプチドを下記勾配によりＣＩ８カラム上てさらに精製した２０〜５ 分、０％ＲＰ−Ｂ、５〜１０分、０〜３８％ＲＰ−Ｂ　、ｌ　０〜３０分、３８ 〜４５％８０両分を２１０ｎｍにおけるＵＶシグナルに基づいて集めた。画分２ ４中の大きなペプチドピークを４２％ＲＰ・　−Ｂにおいて溶離し、次いて乾燥 させ、上記と同様にして再懸濁させ、下記勾配によりＣＩ８カラム上で再びクロ マトグラフィー処理した２０〜５分、０％ＲＰ−Ｂ　；５〜１２分、θ〜３８％ ＲＰ−Ｂ　；　１２〜１５分、３８〜３９％ＲＰ−Ｂ；Ｉｓ〜１８分、３９％Ｒ Ｐ−８、１８〜２０分、３９〜４１％ＲＰ−８，２０〜２４分、４１％ＲＰ−Ｂ 　；　２４〜２８分、４２％ＲＰ−Ｂ、４１％ＲＰ−Ｂて溶離されペプチド６１ −２４−２５と称される画分２５中のペプチドをＮ末端アミノ酸配列決定に付し 、下記の配列が決定された： ＡＰＳＭ（Ｉ）（Ｄ）ＥＹＰＩＬＡＶ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１９） ＣＰＪＥＰＳＰＳ画分５３トリプシンのペプチドを、０％Ｂ（５分）、０〜３０ ％Ｂ（５〜１７分）、３０〜４０％Ｂ（１７〜３７分）の勾配によりＣｌ　８Ｈ ＰＬＣによりさらに精製した。３４％Ｂにおいて溶離し、ペプチド５３〜２８と 指定された画分２８中のペプチドをＮ末端アミノ酸配列決定に付し、下記の配列 を決定した：ＩＴＧＬＬＥＧＥＤＶＩＮＴＧＫ（ＳＥＱ　ＩＤＮ０：２０） ＣＰ４ＥＰＳＰＳコスミドクローンを確かめるために、多数のオリゴヌクレオチ ドプローブを、ＣＰ４酵素由来の２のトリプシン配列の配列に基づいて設計した （表１１１　＞。ＭＩＤと同定されたプローブは、非常に低い変性であり、最初 のスクリーニングに使用した。ＥＤＶ−Ｃ及びＥＤＶ−Ｔであると同定されたプ ローブは、同じアミノ酸配列を基礎として、ｌの位置において異なり（下記表ｒ ｌＩ中のアンダーライン）、これら２つのプローブのうちの一方のみから期待さ れる確実性を存する確認のプローブとして使用された。下記のオリゴヌクレオチ ドにおいて、特定の位置における代替的な許容され得るヌクレオチドは、Ａ／Ｃ ／Ｔのように「／」により示ペプチド６１−２４−２５　ＡＰＳＭ（ｔ）（Ｄ） ＥＹＰ［ＬＡＶ（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１９）プローブＭ［Ｄ＋１７−ｍｅｒ　 ；混合プローブ；２４−倍変性ＡＴＧＡＴＡ／Ｃ／ＴＧＡＣ／ＴＧＡＧ／ＡＴＡ Ｃ／ＴＣＣ（ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２１）ベブチ）”５３−２８１ＴＧＬＬＥＧ ＥＤＶＩＮＴＧＫ（ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：２０）プローブＥＤＶ−Ｃ；　１７− ｍｅｒ　；混合プローブ：４８−倍変性ＧＡＡ／ＧＧＡＣ／ＴＧＴＡ／Ｃ／Ｇ／ ＴＡＴＡ／Ｃ／ＴＡＡＣＡＣ（ＳＥＱ　ｌ［ｌ　Ｎｏ・２２）プローブＥＤＶ− Ｔ；１７−ｍｅｒ　；混合プローブ：４８−倍変性ＧＡＡ／ＧＧＡＣ／ＴＧＴＡ ／Ｃ／Ｇ／ＴＡＴＡ／Ｃ／ＴＡＡ工ＡＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３）このプロ ーブをγ−”Ｐ−ＡＴＰ及びポリヌクレオチドキナーゼを使用して標識した。上 記の１４のコスミト由来のＤＮＡをＥｃｏＲｌにより制限し、膜に移し、オリゴ ヌクレオチドプローブによりプローブした。採用した条件は下記の通りである： 前ハイブリッド形成を６ＸＳＳＣ，ＩＯＸデンハルト中で２〜１８時間６０°Ｃ において行い、ハイブリッド形成を６ＸＳＳＣ，ＩＯＸデン／％ルト、１００　 ａｇ　／ｍｌ　ｔ　ＲＮＡ中で、プローブのＴｄの下で１０″Ｃにおいて行った 。プローブのＴｄは、式２°Ｃ×（Ａ＋Ｔ）＋４°ＣＸ　（Ｇ＋Ｃ）から概算さ れる。次いて、フィルターを室温においてそれぞれ１０分間、６ＸＳＳＣにより ３回洗浄し、乾燥し放射能写真を撮影した。ＭＩＤプローブを使用して、ｐＭＯ Ｎ　１７０７６コスミド中の〜９．９　ｋｂの断片が１の正のシグナルを与えた 。次いでこのコスミドＤＮＡを、ＥＤＶ−Ｃ（ＳＥＱ　ＩＤＮｏ　：　２２）及 びＥＤＶ−Ｔ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３）プローブにより別個にプローブし、 再びこの〜９．９ｋｂバンドがＥＤＶ−Ｔプローブのみを伴いｌのシグナルを与 えた。 グリホセート耐性発現型、Ｅ、ｃｏｌｒａｒｏ　Ａ−発現型の相補性、〜４５Ｋ ｄタンパク質の発現及びＣＰ４ＥＰＳＰＳアミノ酸配列に由来す酸二列のプロー ブとのハイブリット形成に関する合わせられたデータは、ｐＭＯＮ１７０７６コ スミトかＥＰＳＰＳ遺伝子を含むことを強く示した。 ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子の配置及びサブクローニングＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子を さらに下記のようにして配置した：多数の追加のサザン分析を、ＭＩＤ　（ＳＥ ＱＩＤ　ＮＯ：２１）及びＥＤＶ−Ｔ　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ　２３）プローブ を別個に使用して、ｐＭＯＮ　１７０７６の異なる制限消化物上で行なった。こ れらの分析及び結果として得られたｐＭＯＮ　１７０７６由来の〜９．９ｋｂ断 片のｐブルースクリプト（ストラータジーン）サブクローンの詳細な制限地図に 基づいて、両プローブかそれにハイブリッド形成する３、　８　ｋｂＥｃｏＲ［ −５ａｌｌ断片を同定した。この分析はまた、ＭＩＤ（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：２ １）及びＥＤＶ−Ｔ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２３）プローブかＢａｍＨＩ　、　 Ｃ１ａ［及びＳａｃ　Ｉ　［部位の異なる部位ニア１イブリツド形成することを 示した。この３．８　ｋｂの断片は、ｐブルースクリプト中の両配向にクローニ ングされて、ｐＭＯＮ１７０８１及びｐＭＯＮｌ　７０８２を生成した。 次いでこれらのクローンによりＥ、ｃｏｌｉに与えられる発現型を測定した。グ リホセートを３ｍＭ含有するＭ９寒天培地上のｐＧＰｌ−２（ｐブルースクリプ トはＴ７プロモーターをも含む）を含むＥ、ｃｏｌｉＭＭ　２９４への形質転換 の後に、グリホセート耐性を測定した。ｐＭＯＮ　Ｉ　７０８１及びＩ）ＭＯＮ １７０８２の両者は、グリホセートを欠く同し培地上の対照の約半分のサイズの ３０℃での３日目におけるグリホセート耐性コロニーを示した。この結果は、３ ．８　ｋｂの断片か完全なＥＰＳＰＳ遺伝子を有していることを示唆している。 この発現型の配向依存の明らかな欠如は、クローニング部位の１の側部における Ｔ７プロモーター及び他方におけるＩａｃプロモーターによって説明されること かできる。ａｒｏ　Ａ発現型は、芳香族補給物のないＭ９寒天培地上のＥ、ｃｏ ｌｉＧ　Ｂ　１００の形質転換体において測定した。Ｐｌａｃ誘導物質Ｉ　ＰＴ Ｇを使用してまたは使用しないで行なわれたこの実験において、りＭＯＮ１７０ ８２は、ｐＭＯＮｌ７０８１よりもはるかに大きな成長を示したか、それは、Ｅ ＰＳＰＳ遺伝子か５ａｉ１部位からＥｃｏＲ１部位の方向に発現されることを示 唆している。 ヌクレオチド配列決定は、上記のＢａｍＨ［部位を含む多数の制限部位末端から 開始される。Ｎ末端タンパク質配列と近接に適合しトリプシン断片５３〜２８（ ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：２０）（ＥＤＶ−Ｔプローブの基礎）のタンパク質配列をコ ードする配列は、このＢａｍＨ［部位の５ａ１１部位に配置されている。これら のデータは、ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子のクローニング及びこの遺伝子の転写の方 向の決定的な証拠を提供した。制限地図データに関連するこれらのデータはまた 、完全な遺伝子が〜２．３　ｋｂＸｈｏ　［断片上に配置され、この断片かｐブ ルースクリプト中にサブクローニングされることを示している。この断片の約２ ｋｌ）のヌクレオチド配列は、クローニングされた制限断片からの配列決定の組 合せ及び配列を延長する特異的プライマーの使用によって決定される。ＣＰ４Ｅ ＰＳＰＳ遺伝子のヌクレオチド配列及び側面に位置する領域を図３　（ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：２）に示す。ペプチド６１−２４−２５に対応する配列（ＳＥＱ　 ＪＤ　Ｎｏ・＋９）も配置された。この配列を、ＩＢＩ（インターナショナルバ イオテクノロジーズインコーポレイテッド）のシーケナーゼキット及びファルマ シア製のＴ７配列決定／デアサキットの両方を使用して決定した。 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、株ＣＰ４から精製されたＥＰＳＰＳ活性を コードするクローニングされた遺伝子を下記の方法により確認したニ一連の部位 特異的突然変異生成により、Ｂｇｌｌｌ及びＮｃｏ　１部位をＮｃｏｌ認識配列 内に含まれるｆＭｅｔとともにＮ末端において存在させ、第１の内部Ｎｃｏ［部 位を除去しく第２の内部Ｎｅｏ　［部位はその後除去した）、Ｓａｃ　１部位を 終結コドンの後に存在させた。後の段階において、内部Ｎｏｔ１部位も部位特異 的突然変異生成により除去した。下記の表は、ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子の部位特 異的突然変異生成（制限部位の添加または除去）のためのプライマーを含む。突 然変異生成を、実質的にはサムプルツクら（１９８９）により記載された方法と 同じクンケルら（＋９８７）の方法により行なった。 プライマーＢｇＮｃ（Ｎ末端へのＢｇｌ［［及びＮｅｏ　［部位の付加）ＣＧＴ ＧＧＡＴＡＧＡＴＣＴＡＧＧＡＡＧＡＣＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴＣＡＣＧＧＴＣ（ ＳＥＱ　１０　Ｎｏ、２４） プライマー５ｐｈ２（Ｎ末端へのｓｐｈ　［部位の付加）ＧＧＡＴＡＧＡＴＴＡ ＡＧＧＡＡＧＡＣＧＣＧＣＡＴＧＣＴＴＣＡＣＧＧＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＣ（Ｓ ＥＱＩＤ　ＮＯ：２５） プライマーＳｌ（終結コドンの直後のＳａｃ　１部位の付加）ＧＧＣＴＧＣＣＴ ＧＡＴＧＡＧＣＴＣＣＡＣＡＡＴＣＧＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧ（ＳＥＱ　１０　Ｎ Ｏ・２６）プライマーＮｌ（内部Ｎｏｔｌ認識部位の除去）ＣＧＴＣＧＣＴＣＧ ＴＣＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＣＧＧＣ（ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：２７ ）プライマーＮｃａｌ　（第１内部Ｎｅｏ　［認識部位の除去）ＣＧＧＧＣＡＡ ＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＴＡＴＧＧＧＣＧＣＣ（ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：　２８ ）プライマーＮｃｏ２　（第２内部Ｎｃｏ　Ｉ認識部位の除去）ＣＧＧＧＣＴＧ ＣＣＧＣＣＴＧＡＣＴＡＴＧＧＧＣＣＴＣＧＴＣＧＧ　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ： 　２９）次いでこのＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子を、文献記載された（つｔングら、 １９８８ニオリンズら、１９８８）ものと類似のＰｒｅｃＡ−遺伝子１０Ｌ表現 ベクター中に、Ｎｃｏ　［−ＢａｍＨ［Ｎ末端断片及びＢａｍＨ［−５ａｃ　［ Ｃ末端断片として、クローニングし、ｐＭＯＮ］　７１０１を生成した。ＰＥＰ のＫｍ及びグリホセートのＫｉを、ナリジキシン酸による誘導の後に、ｐＭＯＮ １７１０１／ＧＢ１００形質転換体の粗溶解物中のＥＰＳＰＳ活性について決定 したところ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、株ＣＰ４から得られた精製及 び粗の調製物について決定されたものと同じであることか判明した。 部分的に旧ｎｄｌｌｌにより制限されたＬＢＡＡＤＮＡのコスミドバンクを、ベ クターｐＨＣ７９（ホーン及びコリンズ、１９８０）においてＥ、ｃｏｌｉＭＭ 　２９４中で構成した。このバンクをコロニーハイブリッド形成により全長ＣＰ ４ＥＰＳＰＳ遺伝子プローブを使用してプローブし、正のクローンを４００コス ミド当り〜１の割合て同定した。ＬＢＡＡＥＰＳＰＳ遺伝子をさらに、サザン分 析によりこれらのニスミド中に配置させた。この遺伝子を〜２．８　ｋｂＸｈｏ ｌ断片上に配置させ、制限断片端部から一連の配列決定工程により、及びＣＰ４ ＥＰＳＰＳ遺伝子の配列決定からオリゴヌクレオチドブライマーを使用すること により、ＬＢＡＡＥＰＳＰＳ遺伝子のヌクレオチド配列を完全にして、図４　（ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　４）中に示す。 ＰＧ２９８２由来のＥＰＳＰＳ遺伝子もクローニングした。ＥＰＳＰＳタンパク 質を、下記の点について異なる他はＣＰ４酵素について記載した方法と実質的に 同じ方法で精製した：セファロースＣＬ−４Ｂカラムの後に、高ＥＰＳＰＳ活性 を育する画分を集め、固形硫酸アンモニウムを８５％の飽和状態となるまで添加 して１時間撹拌することによってタンパク質を沈殿させた。沈殿したタンパク質 を遠心分離により集め、Ｑセファロース緩衝液中に再懸濁し、同じ緩衝液に対す る透析の後に、カラム上に充填した（ＣＰ４酵素の場合と同じ方法で）。 Ｑセファロースカラム上での精製の後に、１００ｍＭ）リスｐＨ７，８，１０％ グリセロール、１ｍＭＥＤＴＡ、１［１１ＭＤＴＴ及び１Ｍ硫酸アンモニウム中 のタンパク質〜４０ｍｇを、フェニルスペローズ（ファルマシア）カラム上に充 填した。カラムを上記緩衝液中の１．　ＯＭ〜０．００Ｍ硫酸アンモニウムの勾 配４０ｍ１により１．０　［＋１１／分で溶離した。 フェニルスペローズ１０／１０カラムの活性画分由来のタンパク誓約１．０ｍｇ を、流速０．７５　ｍｌ／分のファルマシアモ／Ｐ５／１０クロマトフオーカシ ングカラム上に充填した。開始緩衝液は、２５ｍＭビス−トリス、ｐＨ６，３で あり、カラムをポリバッファー７４の３９　ｍｌ、　ｐＨ４，０により溶離した 。クロマトフオーカシングカラムから得たピーク画分約５０μｇを、２５ｍＭ重 炭酸アンモニウム中に透析した。次いでこの試料を使用してＮ末端アミノ酸配列 を決定した。 得られたＮ末端配列は： ＸＨ３ＡＳＰＫＰＡＴＡＲＲ３Ｅ　（式中Ｘ＝未同定の残基’）（ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：３０’）であった。多数ノ変性したオリゴヌクレオチドプローブをこの 配列に基づいて設計し、使用して緩和条件下のコロニーハイブリッド形成により コスミドｐＨＣ７９（ホーン及びコリンズ、１９８０）中のＰＧ２９８２部分− Ｈ４ｎｄｌ［ｌ　Ｄ　Ｎ　Ａのライブラリーをプローブした。最終洗浄条件は、 ５５℃においてｌＸ５ｓｃ、０．１％ＳＤＳを１５分間使用することであった。 配列ＧＣＧＧＴＢＧＣ３Ｇ（１；ＹＴＴＳＧＧ（式中Ｂ＝Ｃ，ＧまたはＴ　；　 Ｓ＝ＣまたはＧ、及びＹ＝ＣまたはＴ）（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３１）を存する １のプローブか１組のコスミドクローンを同定した。 このようにして同定されたコスミド組は、種々の旧ｎｄＩＮ断片のコスミドによ り構成された。しかしなから、この組かＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子プローブにより プローブされたときに、ＰＯ２９８２ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むコスミドが同定さ れた（元来コスミド９Ｃ１と称され、後にｐＭＯＮ２０１０７と称された）。一 連の制限地図作成及びサザン分析の後に、この遺伝子を〜２．８　ｋｂＸｈｏ［ 断片に配置させ、この遺伝子のヌクレオチド配列を決定した。このＤＮＡ配列（ ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　６）を図５に示す。ＥＰＳＰＳ遺伝子配列はＬＢＡＡ　 （ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：４）及びＰＯ２９８２（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、６）との間 にヌクレオチドの相違がなかった。２つの酵素の反応動力学的因子は、実験誤差 の範囲内であった。 Ｅ、ｃｏｌｉ中のグリホセート耐性に影響を与えるＰＧ２９８２由来の遺伝子の 配列は決定されている（フィッッギボン、１９８８：フィッッギポン及びプレイ マー、１９９０）。ＰＯ２９８２ＥＰＳＰＳクラスＩＩ遺伝子の配列は、既に報 告された配列と相同関係かなく、従来の研究のグリホセート耐性表現型かＥＰＳ ＰＳと関係がないことを示している。 多数のクラス１１遺伝子か単離されており、本明細書中に記載されている。ＣＰ ４由来の遺伝子のものである、第１遺伝子クローニングは、クラスＩ及びクラス ［１酵素及び遺伝子の間において類似の程度が低いことにより困難であることは 明らかである。しかしなから、その他の遺伝子の同定は、プローブとしてこの第 １の遺伝子を使用することによって多いに促進された。ＬＢＡＡＥＰＳＰＳ遺伝 子のクローニングにおいて、ＣＰ４遺伝子プローブは、コスミドクローンの迅速 な同定及び完全な遺伝子の小制限断片への配置を可能にし、いくつかのＣＰ４配 列プライマーを用いて、ＬＢＡＡ　（及びＰＯ２９８２）ＥＰＳＰＳ遺伝子の配 列決定をした。ＣＰ４遺伝子プローブをも使用してＰＧ２９８２遺伝子クローン を確認した。クラス［ＩＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子の高低度の類似性を利用して 、クラス［ＥＰＳＰＳ遺伝子プローブを使用してその他のクラスＩ遺伝子をクロ ーニングしたのとほとんど同じ方法により、追加の遺伝子を同定及びクローニン グした。後者の例は、プローブとしてＰ、ｈｙｂｒｉｄａ遺伝子を利用するＡ、 　ｔｈａｌｉａｎａＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子のクローニングにおけるものであ った（リーら、１９８７）。 グリホセート耐性ＥＰＳＰＳ活性は、多数の起源に由来するＥＰＳＰシンターゼ についてすでに報告されている。これらの酵素はほとんどの場合においてまった く特性化されていなかった。クラスＩ及びクラスＩＩＥ　Ｐ　Ｓ　ＰＳ遺伝子プ ローブまたは抗体プローブの使用は、ＥＰＳＰＳの特性の最初のスクリーニング のための迅速な方法を提供し、そのような酵素の遺伝子の迅速なりローニング及 び特性化のための手段を提供する。 記載された３つの遺伝子の２つがグリホセート処理設備から単離された細菌がら 単離された（株ＣＰ４及びＬＢＡＡ）。３番目（ＰＯ２９８２）は培養採集株が ら単離された細菌から得られた。この後者の単離は、グリホセートへの接触は高 グリホセート耐性ＥＰＳＰＳ酵素の単離のための必要条件ではなく、細菌の採集 物のスクリーニングは追加の単離物を生成することかできたことを示唆している 。そのような微生物を豊富にすることかクラスＩ［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ微生物の 単離頻度を高めると考えられる場合において、グリホセート分解またはグリホセ ート耐性微生物母集団（フィンら、１９８８：タルホットら、１９８４）を豊富 にすることは可能である。クラスｌ［ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むその他の細菌も同 定されている。 ＣＦ２　（上記参照）と同じ処理カラムビーズから、しかしグリホセートか炭素 及びリンの両源として供給された培地中て単離されたＣＩ２と称される細菌が、 サザン分析によって、ＣＰ４ＥＰＳＰＳコード配列からなるプローブとハイブリ ッド形成することか示された。株ＬＢＡＡについての結果と関連して、この結果 はこの豊富化方法かクラス［［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ単離物の同定を促進すること を示唆している。クラス目ＥＰＳＰＳ遺伝子を含む新規の細胞単離物は、グリホ セート廃棄処理施設以外の環境から同定されている。接種原は、土壌（イリノイ 州ジャーソービルの最近収穫されたタイプの畑から得られた）及び炭素原として １０ｍＭのグリホセート（及び１００μｇ／ｍｌのシクロヘキシミドにより真菌 の成長を防止する）を含むドウオルキン−フォスター培地中での２８°Ｃにおけ る成長により選択された細菌の母集団を採集することによって調製された。Ｌ寒 天培地上で培養したら、５のコロニータイプか同定された。染色体ＤＮＡをこれ らの単離物のＬブロス培地２ｍｌから調製し、クラス［ＩＥ　Ｐ　ＳＰＳ遺伝子 の存在を、厳格なハイブリッド形成及び洗浄条件下で、サザン分析によりＣＰ４ ＥＰＳＰＳコード配列プローブを使用してプローブした。土壌単離物のＩ、Ｓ２ はこのスクリーニングにより正であった。 異なるＥＰＳＰＳ遺伝子間遺伝保 間数のクラス］及びクラス［ＩＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ酵素の推定アミノ酸配列を、 ＵＷＧＣＧパッケージに与えられたベストフィツトコンピュータープログラムを 使用して（デベルーら、１９８４）比較した。このプログラムを使用して決定さ れた類似及び同一の程度を報告する。クラス１及びクラスＩＩタンパク質配列に おいて測定された類似／同一の程度は、著しく高く、例えばＥ、ｃｏｌｉとＳ、 　ｔｙｐｈｊｍｕｒｉｕｍとの比較（類似／同一＝９３％／８８％）及びＥ、ｃ ｏｌｉと植物ＥＰＳＰＳとの比較（ＰｅｔｕｎｉａｈＹｂｒｉｄａ　；　７２％ １５５％）である。しかしなから、クラス１及びクラス１１の間の配列の比較は 、クラス間の関連が非常に低い程度であることを示す（類似／同一＝５０〜５３ ％／２３〜３０％）　、　Ｅ、ｃｏｌｉ　（ＳＥＱ　Ｉ　ＤＮＯ：８）及びＣＦ ２（ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：３）ＩＩＩＩのベストフィツト分析の表示は、保有さ れた残基の位置を示し、図６に示されている。ＥＰＳＰＳ配列の先の分析は、酵 素配列の保有の程度が高いことと２つの領域、「２０〜３５」及び［９５〜１０ ７Ｊ領域中の配列（ガッサーら、１９８８　；　Ｐｅｔｕｎｉａ　Ｅ　ＰＳ　Ｐ Ｓ配列に従って番号を付けた）のほとんどの不変性及びクラスＩ細菌及び植物Ｅ ＰＳＰＳ配列と比較したときにＣＦ２及びＬＢＡＡの場合において、これらの領 域の保存程度か低いことに注目していた（Ｅ、ｃｏｌｉ及びＣＰ４ＥＰＳＰＳ配 列の比較について図６を参照。Ｉｌ：、ｃｏｌｉ配列は、図の最上の配列として 示されている）。ＣＰ４クラスＩＩＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ中の対応する配列は： ＰＧＤＫＳＩＳＨＲＳＦＭＦＧＧＬ（ＳＥＱ　ＩＤＮ０・３２）及びＬＤＦＧＮ ＡＡＴＧＣＲＬＴ　（ＳＥＱＩＤ　ＮＯ：３３）である。 これらの比較は、クラス［及びクラスＩＩＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓタンパク質の全体 の関連性か低く、仮定の保育された領域中の配列が相当に分岐したことを示す。 ＣＰ４ＥＰＳＰＳにおいて、アラニン残基は「グリシン＋０１」位置に存在する 。保有されたグリシン（「９５〜ｌ０７Ｊ領域）をアラニンにより置換すること は、クラスＩ　ＥＰＳＰＳにおけるグリホセートのＫｉ及びＰＥＰのＫｍを高め る結果となる。この位置においてアラニンを存するＣＰ４ＥＰＳＰＳの場合にお いて、ＰＥＰのＫｍは低い範囲にあり、クラスｒ

【酵素か先に特性化されたＥＰ ＳＰＳ酵素と多くの点において異なることを示している。 クラスＩＩ単離物内ては、類似性／同一性の程度は、クラスＩ内のものについて 述べたものと同じ程度に高い（表ＩＶ）。図７は、ＣＦ２　（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ ｏ：３）及びＬＢＡＡ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５）ＥＰＳＰＳの仮定アミノ酸配 列のベストフィツトコンピュータープログラムによる配列を示し、ＣＰ４配列を 図中の上の配列として示す。図６及び７中で使用される記号は、類似性及び同一 性の程度を示すためのベストフィツトコンピュータープログラム中で使用される 標準記号である。 表ＩＶ　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓタンパク質配列の関連性の比較クラス■及び■のＥ ＰＳＰＳタンパク質配列間の比較類似性　同一性 ｆｉ、ｃｏｌｉ対ＣＰ４　５２．８　２６．３Ｅ、ｃｏｌｉ対しＢＡＡ　５２． 　ｌ　２６．７Ｓ、ｔＹＰｈｉｍｕｒｉｕｍ　Ｎ　ＣＦ２　５１．８　２５．８ Ｂ、　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ対ＣＰ４　５２．８　２７．３Ｓ、　ｃｅｒｅｖ　ｉ ｓ　ｉａｅ対ＣＰ４　５３．５　２９．９Ｐ、　ｈｙｂｒｊｄａ対ＣＰ４　５０ ．２　２３．４１１ｉ、ｃｏｌｉ対Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　９３．０　 ８８．３Ｐ、　ｈｙｂｒｉｄａ対Ｅ、　ｃｏｌｉ　７１．９　５４．５Ａｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、株ＣＰ４対Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｓｐ、株 ＬＢＡＡ　８９．９　８３．７１ここで比較されたＥＰＳＰＳ配列は、下記の参 考文献から得られた：Ｅ、ｃｏｌｉ、ロジャーズら、＋９８３゜Ｓ、　ｔｙｐｈ ｊｍｕｒｉｕｍ　、スタルカーら、Ｉ　９８５　；　Ｐｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉ ｄａ　、シャーら、１９８６　；　Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　、マスケルら、＋ ９８８．及びＳ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、ドゥンカンら、１９８７゜ ＣＦ２及びＬＢＡＡＥＰＳＰＳタンパク質の仮定アミノ酸配列間で着目すること かできるｌの相違点は、ＣＰ４酵素の場合にアラニンか見られ、ＬＢＡＡ酵素の 場合にグリシンか見られる位置ｌＯＯである。クラスＩＥＰＳＰＳ酵素において 、グリシンは通常対応する位置、即ち、Ｅ、　ｃｏｌ　ｉ及びに、　ｐｎｅｕｍ ｏｎｉａｅ中ではグリシン９６、Ｐｅｔｕｎｉａではグリシン１０１中に見られ る。これらの３つの酵素の場合に、グリシンからアラニンへの転化はグリホセー トの見かけのＫｉを高め及びＰＥＰの見かけのＫｍを付随的に高める結果となり （キショアら、１９８６：牛ショア及びシャー、１９８８；ソスト及びアムルハ イン、１９９０）　、それは上記したように、より低いＰＥＰＩＩ度の条件下に おいて酵素を特に低効率とすることか報告されている。ＬＢＡＡＥＰＳＰＳのグ リシン１００は、アラニンに転化され、ＰＥＰの見かけのＫｍ及びグリホセート の見かけのＫｉの両方を変異体について測定した。このグリシン１００のアラニ ンへの変化は、下記のプライマｍ： ＣＣ；ＧＣＡＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣ；ＣＣ（ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：３４） を使用する突然変異精製により誘発され、野性型及び変異体の両遺伝子がＲｅｃ Ａプロモーター表現ベクター中のＥ、ｃｏｌｉ中で表現され（それぞれｐＭＯＮ １７２０１及びｐＭＯＮ１７２６４）、見かけのＫｍ及び見かけのＫｉを粗溶解 物中で測定した。このデータは、Ｇ１００Ａ変異体の見かけのＫｉが約１６倍に 高められることを示す（表Ｖ）。この結果は、クラスＩ　ＥＰＳＰＳ酵素の見か けのＫｉ　（グリホセート）の上昇におけるＧ−Ａの変化の重要性の観察と一致 している。しかしながら、クラス［Ｇ−Ａ変異体における結果とは対照的に、ク ラスＩ【（ＬＢＡＡ）Ｇ−Ａ変異体の見かけのＫｍ　（ＰＥＰ）は変化しない。 これはクラス■１及びクラスＩ　ＥＰＳＰＳ酵素の間のその他の相違点を提供す る。 表■ 見かけの　見かけの Ｋｍ（ＰＥＰ）　［ｊ（グリホセート）下記から調製された溶解物： Ｅ、ｃｏｌｉ／ｐＭＯＮ１７２０１　（野性Ｗ）　５．３μＭ　２８μＭ　”Ｅ 、　ｃｏｌｉ／ｐＭＯＮＩ７２６４　５．５μＭ４５９μＭ′（Ｇ１００Ａ変異 体） ＠ＰＥＰの範囲：２〜４０μＭ ＊グリホセートの範囲、Ｏ〜３１０μＭ；＃グリホセートの範囲：０〜５０００ μＭ ＬＢＡＡＧ　１００Ａは、その優れた反応動力学的特性により、ｐｌａｎｔａに おけるグリホセートの改良を与えることＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ、株 ＣＰ４由来のＥＰＳＰＳ遺伝子は、植物中の遺伝子の高表現に対して有害な配列 を含む。 これらの配列は、頻繁に存在しＡ十Ｔに富む潜在的ボリア、デニル化部位、植物 遺伝子に多く見られるものよりも高いＧ十Ｃ％（６４％対〜５０％）、Ｇ及びＣ 残基の高濃度のストレッチ、植物遺伝子中において殆んど使用されていないコド ンを含む。ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子中の高いＧ＋Ｃ％は、下記を含む多数の潜在 的結果を存する：コドンの第３の位置において植物遺伝子中に見られるよりも高 いＧまたはＣを使用すること及びＲＮＡの発現または安定性に影響を与え得る強 力なヘアピン構造を生成する能力。ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子のＧ＋Ｃ含量の減少 、Ｇ及びＣのストレッチの破壊、潜在的ポリアデニル化配列の除去及び植物遺伝 子においてより頻繁に使用されるコドン利用における改良は、植物中のＣＰ４Ｅ ＰＳＰＳ遺伝子の表現を高める結果をもたらし得る。 上記の有害な配列を可能な限り完全に変化させるために合成ＣＰ４遺伝子を設計 した。要約すると、遺伝子配列を、下記の配列または配列特性を可能な限り多く 除去するように再設計した（一方で不要な制限部位の導入を避けながら）：５ま たはそれより大きい直線状のＧ及びＣ：　（優勢的に）ポリアデニル化部位とし て作用し得るＡ＋Ｔに富む領域または潜在的ＲＮＡ脱安定領域。この遺伝子の配 列を図８に示す（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）。 このコード配列を、ＲｅｃＡプロモーター由来のＥ、ｃｏｌｉ中で表現し、ＥＰ ＳＰＳ活性をアッセイし、天然ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子のものと比較した。天然 及び合成遺伝子のＰＥＰの見かけのＫｍはそれぞれ、１１．８及び１２．７であ り、合成遺伝子から表現された酵素が変化していないことを示唆している。コー ド配列のＮ末端を突然変異生成して、Ｓｐｈ［部位をＡＴＧに配置して葉緑体移 入のためのＣＴＰ２−ＣＰ４合成融合体の構成を可能にした。下記のプライマー はこの突然変異生成を達成するために使用された： ＧＧＡＣＧＧＣＴＧＣＴＴＧＣＡＣＣＧＴＧＡＡＧＣＡＴＧＣＴＴＡＡＧＣＴＴ ＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧＧ（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３５）。 葉緑体特異的ＣＰ４ＥＰＳＰＳの発現 植物中のグリホセート標的、５−エノールビルビル−シキミ酸−３−ホスフェー トシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）酵素は葉緑体中に配置されている。ＥＰＳＰＳを含 む多くの葉緑体配置されたタンパク質は、前駆体として核遺伝子から表現され、 移入工程中に除去される葉緑体トランジットペプチド（ＣＴＰ）により集録体を 標的とする。 その池のこのような葉緑体タンパク質の例は、リブロース−１，５−ヒスホスフ エートカルボキシラーセ（ＲＵＢＩＳＣＯ）の小サブユニット（ＳＳＵ）、フェ レドキシン、フエレドキシンオキッドリダクターセ、光−収穫−複合体タンパク 質］及び１１並びにチオレドキシンＦを包含する。非葉緑体タンパク質はＣＴＰ とのタンパク質融合体の使用により葉緑体を標的とすることができ、ＣＴＰ配列 はタンパク質をして葉緑体を標的とさせるのに十分であることか生体内及び生体 外において示されている。 ＣＴＰ−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ融合体は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ　ＣＴ　Ｐ　（リーら、Ｉ　９８７）及びＣＰ４ＥＰＳＰＳ コート配列の間で構成される。 Ａｒａｂｉｃｏｐｓｉｓ　ＣＴ　Ｐは、部位特異的突然変異生成によりＳｐ旧制 限部位をＣＴＰプロセシング部位に配置することにより操作された。この突然変 異生成は、この存在位置におけるＧｌｕ−ＬｙｓをＣｙｓ−Ｍｅｔにより置換し た。ＣＴＰ　２と称されるこのＣＴＰの配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０）を図 ９に示す。ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子のＮ末端を変異させて、Ｍｅｔコドンを回転 させるｓｐｈ　［部位を配置した。この第２コドンは、この工程におけるロイシ ンのものに転化された。この変化は、ａｒｏＡ対立遺伝子の相補の割合により判 断されたように、Ｅ、　ｃｏｌｉ中のＣＰ４ＥＰＳＰＳの生体内活性に明らかな 影響を与えなかった。次いてこの変異されたＮ末端を５ａｃｌＣ末端と結合し、 ＣＴＰ２配列の下流でクローニングした。ＣＴＰ２−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ融合体を ｐブルースクリプトＫＳ　（＋）中にクローニングした。このベクターは、Ｔ７ ポリメラーゼ及び３５−メチオニンにより翻訳されたＲＮＡを使用して生体内で 転写されて、下記に記載の方法（プラージオツバら、１９８６．１９８７）を使 用してＬａｃｔｕｃａ　５ａｔｉｖａから単離された葉緑体中への移入について 評価され得る物質を提供することができる。この鋳型をＴ７ボリメラーゼを使用 して生体外で転写し、２ＳＳ−メチオニン標識されたＣＴＰ２−ＣＰ４ＥＰＳＰ Ｓ物質が対照Ｐｅｔｕｎｉａ　ＥＰＳＰＳと匹敵し得る効率で葉緑体中に移入さ れることか示された（対照＝　２５　Ｓ標識されたＰｒｅＥＰＳＰＳ［ｐＭＯＮ ６１４０　；プラージオツバら、１９８６］）。 その他の例において、ＣＴＰ３と称されるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｅ　Ｐ　Ｓ 　Ｐ　Ｓ　ＣＴ　Ｐは、ＥｃｏＲ［部位を介してＣＰ４ＥＰＳＰＳと融合した。 このＣＴＰ３の配列（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２）を図１Ｏに示す。ｌのＥｃｏ Ｒ１部位をアミノ酸２７のまわりのＡｒａｂｉｃｏｐｓｉｓ　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　 Ｓ成熟領域中に導入し、配列−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−をプロセス中 の−Ａｒｇ−［１ｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−により置換した。下記配列のプライマー を使用してＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子のＮ末端を変異して、ＥｃｏＲ［部位を付加 してＣＴＰ３への融合を達成した： ＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＧＧＴＧＣＡＡＧＣＡＧＣＣＧＧ（ ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３６）（ＥｃｏＲ１部位に下線を引いた）。 このＣＴＰ３−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ融合体もｐブルースクリプトベクター中にクロ ーニングし、Ｔ７表現された融合体は、対照Ｐｅｔｕｎｉａ　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　 Ｓと匹敵可能な効率で葉緑体中に移入されることが判明した（ｐＭＯＮ６１４０ ）。 ＣＴ　Ｐ　４　（ＳｐｈＤ及びＣＴＰ５　（εｃｏＲＩ　）と称される関連する 一連（７）ＣＴＰは、Ｐｅｔｕｎｉａ　ＥＰＳＰＳＣＴＰ及び遺伝子に基づいて 、５ｐｈＩ−及びＥｃｏＲ［変異されたＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子配列と融合され た。ｓｐ旧部位を、部位特異的突然変異生成により付加して、葉緑体プロセシン グ部位に、この制限部位を配置した（及びアミノ酸配列を−Ｃｙｓ−Ｍｅｔ−に 変化させた）、ＣＴＰ−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ融合体の全てか概ね等しい効率で葉緑 体中に輸入されることか示された。ＣＴＰ４　（ＳＥＱ　ｒＤ　Ｎｏ：１４）及 びＣＴＰ５（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６）配列を図１１及び１２に示す。 ＣＴＰ２−ＬＢＡＡＥＰＳＰＳ融合体は、５ｐｈＩ部位の付加によりＬＢＡＡＥ ＰＳＰＳ遺伝子のＮ末端の変異の後に構成された。この融合体はまた、葉緑体中 に効率良く輸入されることが判明した。 類似の方法により、ＣＴＰ２−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ及びＣＴＰ４−ＣＰ４ＥＰＳＰ Ｓ融合体は、コーンの葉鞘から調製された葉緑体中に効率良く移入されることか 示されている。これらの結果は、これらのＣＴＰ−ＣＰ４融合体か単子葉植物種 にグリホセート耐性を与える宵用な遺伝子を提供することができるであろうこと を示している。 当業者は、特定のＣＴＰかクラス［ＩＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ酵素を植物細胞葉緑体 中に輸入する機能を利用する種々のキメラ構造を生成することができることを理 解するであろう。 クラス［［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓの葉緑体輸入は、下記のアッセイを使用して粗区 営することができる。 葉緑体取り込みアッセイ 完全な葉緑体を、バートレットら（１９８２）の方法の変形によりパーコル／ラ イコル勾配中の遠心分離によりレタス（Ｌａｔｕｃａ　５ａｔｉｖａ、　ｖａｒ 、　ｌｏｎｇｉｆｏｌｉａ）から単離する。完全な葉緑体の最終ペレットを、５ ０　ｍＭＨｅｐｅｓ−Ｋ　ＯＨ，ｐＨ７，７中の３３００ＩＭソルビトール０． ５　ｍｌ中に懸濁し、クロロフィルについてアッセイしくアーノン、１９４９） 、最終クロロフィル濃度が４　ｍｇ／ｍｌになるように調節（ソルビトール／Ｈ ｅｐｅｓを使用）した。単頭レタスの完全葉緑体の収量は、３〜６Ｂのクロロフ ィルである。 典型的な３００μｌの取り込み実験は、５　ｍＭＡ　Ｔ　Ｐ、８、３　ｍＭ未標 識のメチオニン、３３２ｍＭソルビトール、５８、３ｍＭＨｅｐｅｓ　−ＫＯＨ （ｐＨ８，０）　、５０　ａ’ｉ網状赤血球溶解物翻訳生成物及びり、５ａｔｉ Ｖａ由来の完全葉緑体（２００μｇクロロフィル）を含存していた。取り込み混 合物を最大光濃度（１５０ワツト灯）に設定された光フアイバー照明器の直前で 室温において穏やかに振盪した（ｌＯＸ７５ｍｍのガラス管中）。この取り込み 混合物の少量試料（約５０μｍ）を種々の時間において採取し、ＩＩ。 ０００Ｘｇて３０秒間遠心分離することによりシリコーン−油勾配置００μｌ上 で分画した（１５０μｌのポリエチレン管中）。これらの条件下で、シリコーン 油層の下で、完全葉緑体はペレットを形成し、（ｔ！Ｉｉ状赤血球を含む）イン キュベート培地は表面上に浮遊する。遠心分離の後、シリコーン−油勾配を乾燥 水中で直ちに凍結する。次いて葉緑体ペレットを溶解緩衝液５０〜１００ｕ　ｌ 　（１０ｍＭＨｅｐｅｓ−Ｋ　ＯＨＳｐＨ７，５，１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭベン ズアミジン、５ｍＭｅ−アミノ−ｎ−カプロン酸及び３０μｇ／ｍｌアプロチニ ン）中に再懸濁し、１５．０００Ｘｇで２０分間遠心分離して、チラコイド膜を ペレット化する。この遠心分離から得られた清澄な上溝（ストロマタンパク質） 及び各取り込み実験に由来の網状赤血球溶解物インキュベート培地を少量、電気 泳動のために等容量の２ＸＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液と混合する（レムリ、１ ９７０）。 ５ＤＳ−ＰＡＧＥを、レムリ（１９７０）の方法に従って、３〜１７％（Ｗ／Ｖ ）アクリルアミドスラブゲル（６０ｍｍｘ１．５ｍｍ）及び３％（ｗ　／　ｖ　 ）アクリルアミドスタッキングゲル（５ｍｍｘ　１．５　ｎｕｎ）中で行なった 。このゲルを４０％メタノール及び１０％酢酸を含む溶液中に２０〜３０分間固 定する。次いて、このゲルをＥＮ’　ＨＡＮＣＥ”（デュポン製）中に２０〜３ ０分間浸漬し、ゲル乾燥器上でこのゲルを乾燥する。ゲルを増強スクリーンを使 用して一晩露出して放射能写真を撮影し、ＣＰ４ＥＰＳＰＳが単離された葉緑体 中に移入されているか否かを測定する。 植物形質転換体 本発明の実施によってグリホセート耐性を与えられることができる植物は、これ らに限定されないか、タイズ、ワタ、コーン、キャノーラ、脂肪種子ナタネ、ア マ、テンサイ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、コムギ、コメ、アルフ ァルファ、及びレタス並びに、種々の木、堅果及びつる植物を包含する。 本発明の二本１１ＤＮＡ分子（「キメラ遺伝子」）は、いずれの適当な方法によ ってもＩの植物のゲノム中に挿入されることができる。適当な植物形質転換ベク ターは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミ ド由来のものの他、例えば、ヘレラーエストレラ（１９８３）、ビーパン（１９ ８４）、リー（１９８５）及びＥＰＯ公開り１２０，５１６号（シルペルートら ）により開示されたものを含む。ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのＴｊまたは根誘 導（Ｒ１）プラスミド由来の植物形質転換ベクターに加えて、代替的な方法を使 用して本発明のＤＮＡ構造物を植物細胞中に挿入することができる。このような 方法は例えば、リポソーム、電気泳動、遊離ＤＮＡ取り込みを増加させる化学物 質、徴発耐衝撃による遊離ＤＮＡ放出及びウィルスまたは花粉を使用する形質転 換の使用を包含する。 クラスＩ［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ　ＤＮＡ配列は、知られた技術を使用して植物を 形質転換することかできるベクター中に操作されることかできる。下記の説明は 、説明のためのものであり、限定の意味において読まれるべきものではない。当 業者は、その池のプラスミド、ベクター、標識、プロモーター等を使用して適当 な結果を得ることかできることを理解するであろう。ＣｒＦ２−ＣＰ４ＥＰＳＰ Ｓ融合体は、植物ベクターｐＭＯＮ９７９（下記に記載する）中に、Ｂｇ　ｌ　 ［Ｉ−ＥｃｏＲ［断片としてクローニングされ、ｐＭＯＮｌ　７１１０を生成す るが、その地図を図１３に示す。このベクター中でＣＰ４遺伝子は、高められた ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターから発現される（Ｅ３５Ｓ；ケイら、１９８７）。 ＦＭＶ３５Ｓプロモーター構造物（ｐＭＯＮ　１７１１６）は下記の方法で完成 される：ＳｐＣ／ＡＡＣ（３）−ＩＩＩｌｏｒｉＶを含むｐＭＯＮ９７９に由来 の５ａ１１−Ｎｏｔｌ及びＮｏｔ［−Ｂｇｌ［Ｉ断片並びにｐＭＯＮ１７１１０ 由来のｐＢＲ３２２／右端／ＮＯ３３′／ＣＰ４ＥＰｓｐｓ遺伝子部分ヲ、ｐＭ ＯＮ９８１由来（ＤＸｈｏｌ−Ｂｇｌ（ＩＦＭＶ３５Ｓプロモーター断片と連結 した。これらのベクターをタバコ、ワタ及びキャノーラ中に導入した。 一連のベクターがベクターｐＭＯＮ９７７中で完成され、その中でＣＰ４ＥＰＳ ＰＳ遺伝子、ＣｒＦ２−ＣＰ４ＥＰＳＰＳ融合体及びＣｒＦ２−ＣＰ４融合体は 、Ｂｇ　ｌ　Ｉ　［−５ａｃ　Ｉ断片としてクローニングされ、それぞれｐＭＯ Ｎ１７１２４、ｐＭＯＮｌ　７　ｔ　ｌ　９及びｐＭＯＮ１７１２０を生成した 。これらのプラスミドをタバコ中に導入した。ＣｒＦ２−ＬＢＡＡＥＰＳＰＳ遺 伝子を含むｐＭＯＮ９７７誘導体もまた完成され（ｐＭＯＮ　ｌ　７２０６）、 タバコ中に導入された。 ｐＭＯＮ９７９植物形質転換／発現ベクターは、ｐＭＯＮ８８６中のネオマイシ ンホスホトランスフェラーゼタイプ［１（ＫＡＮ）を、細菌ゲンタマイシン−３ −Ｎ−アセチルトランスフェラーゼタイプＩＩＩ　（ＡＡＣ（３）−ＩＩＩ）遺 伝子（ヘイフォードら、１９８８）で置換することにより、ｐＭＯＮ８８６　（ 下記に記載する）から得られた。キメラＰ−３５Ｓ／ＡＡ　（３）　−ＩＩＩ　 ／Ｎ。 ３３′遺伝子は、ゲンタマイシン耐性をコードし、それか形質転換された植物細 胞の選択を可能にする。ｐＭＯＮ９７９は、高められたＣａＭＶ３５Ｓプロモー ター（ケイら、１９８７）、いくつかの特異の制限部位及びＮＯ３３’末端（Ｐ −Ｅｎ−ＣａＭＶ３５Ｓ／ＮＯ３３′）からなる０、　９５　ｋｂの発現カセッ トをも含む。ｐＭＯＮ９７９部分の残りは、ｐＭＯＮ８８６におけるものと全く 同じである。 プラスミドｐＭＯＮ８８６は、下記のＤＮＡ部分から構成される。第１は、Ｅ、 ｃｏｌｉ及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ中の選択のた めの決定基である細菌スペクチノマイシン／ストレプトマイシン耐性（Ｓｐｃ／ ３１ｒ）をコードするトランスポゾン７から単離された０、９３　ｋｂＡｖａ［ から操作されたＥｃｏＲＶ断片である。これを形質転換された植物細胞を選択す るキメラカナマイシン耐性をコードするＤＮＡの１．６１ｋｂ部分に接合された 。このキメラ遺伝子（Ｐ−３５Ｓ／ＫＡＮ／ＮＯ３３’　）は、カリフラワーモ ザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ネオマイシンホスホトランス フェラーゼタイプＩ［（ＫＡＮ）遺伝子及びノーバリンシンターゼ遺伝子の３′ 非翻訳化領域（ＮＯ３３’　）（フレイリーら、１９８３）からなる。次の部分 は、ＲＫ２プラスミド由来の複製起点を含む０．７５　ｋｂｏｒｉ　Ｖである。 これは、Ｅ。 ｃｏｌｉ中での維持のための複製の起点及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ細胞中への接合転移のためのｂｏｍ部位を提供するｐＢＲ３２ ２（ｏｒｉ　３２２）の３．１　ｋｂｓａｌ［からＰｖｕ１部分に接合される。 この次の部分は、ノーｌくリンタイプのＴ−ＤＮＡ右端（フレイリーら、１９８ ５）を担持するｐＴｉＴ３７由来の０．３６　ｋｂＰｖｕ［からＢｃｌｌである 。 ｐＭＯＮ９７７ベ’ｙ９−は、ＦＭＶ３５Ｓプロモーターの代りにＰ−Ｅｎ−Ｃ ａＭＶ３５Ｓプロモーターか存在すること以外は、ｐＭＯＮ９８１と同じである 。 ｐＭＯＮ９８１プラスミドは、下記のＤＮＡ部分を含む、細菌スペクチノマイシ ン／ストレプトマイシン耐性をコードするトランスポゾンＴｎ７から単離された ０、９３ｋｂ断片（Ｓｐｃ／Ｓｔｒ　；　Ｅ、ｃｏｌｉ及びＡｇｒｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ中の選択のための決定基（フリンゾら、１９８ ５）　）　；０．３５ｋｂカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（ Ｐ−３５３）（オーデルら、１９８５）、０．８３ｋｂネオマイシンホスホトラ ンスフエラーセタイブＩＩ遺伝子（ＫＡＮ）　、及びノーノくリンシンターゼ遺 伝子の０．２６ｋｂ３’非翻訳化領域（ＮＯ３３’　）（フレイリーら、１９８ ３）からなる、形質転換された組織の選択を可能にする植物表現のために操作さ れたキメラカナマイシン耐性遺伝子、ＲＫ２プラスミド由来の複製の０．７５　 ｋｂ起点（ｏｒｉ　Ｖ）　（スタルカーら、１９８１）　；Ｉｌｉ、ｃｏｌｉ中 の保持のための複製の起点（ｏｒｉ−３２２）及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞中への接合転移のためのｂｏｍ部位を提供するｐ ＢＲ３２２の３．１　ｋｂｓａｌ［からＰｖｕ１部分並びにノーバリンタイプＴ −ＤＮＡ右端領域を含むｐＴｉ７３７由来の０．３６　ｋｂＰｖｕ［からＢｃｌ ［断片（フレイリーら、１９８５）。発現カセットは、ゴマノハグサモザイクウ イルス由来の０．６ｋｂ３５Ｓプロモーター（Ｐ−ＦＭＶ３５Ｓ）（ゴウダら、 １９８９）及び７メｒｂｃｓ−Ｅ　９遺伝子の０．７ｋｂ３’非翻訳化領域（Ｅ ９３’）（コルッジら、１９８４及びモレリら、１９８５）からなる。ＦＭＶ３ ５Ｓプロモーター（図１）を含む０．６　ｋｂｓｓｐ［断片を操作して、適当な りローニング部位を転写開始部位の下流に配置した。ＣｒＦ２−ＣＰ４ｓｙｎ遺 伝子融合体を、植物発現ベクター中に導入して（ｐＭＯＮ９８１を含む、ｐＭＯ Ｎｌ　７１３１を生成する：図１４）、タバコ、キャノーラ、ジャガイモ、トマ ト、テンサイ、ワタ、レタス、キュウリ、脂肪種子ナタネ、ポプラ及びＡｒａｂ ｉｄｏｐｓｉｓ中に形質転換した。 クラス［［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子を含む植物ベクターを、所望の植物種の形 質転換のためのいずれかの適当なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株中に起動させる ことかできる。植物ベクターをＡ　Ｂ　Ｉ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株中に 起動させることかできる。適当なＡＢＩ株は、無力化されたＴｉプラスミドｐＴ ｉｃ５８を担持するＡ　２０８　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉ ｅｎｓ　（ｐ　Ｍ　Ｐ　９０　ＲＫ　）である（コンク及びシェル、１９８６） 。ＴｉプラスミドはＴ−ＤＮＡ植物ホルモン遺伝子を担持しておらず、従ってそ の株はクラウンゴール病を引起こすことか不可能である。植物ベクターをＡＢＩ 中に交配することは、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３を使用する二親接合系 により行なった（ジッタら、１９８０）。植物組織をＡＢＩ：二値物ベクター接 合物とともにインキュベートした場合には、ベクターか、無力化されたｐＴｉＣ ５８プラスミドによりコードされたｖｉｒ作用により植物細胞へ転移する。この ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ右端領域において開いており、全体の植物ベクター配列 を、宿主植物染色体中に挿入することかできる。ｐＴｉｃ５８Ｔｉプラスミドは 、植物細胞へ転移しないがＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中に保存される。 クラスｌ［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遊離ＤＮＡベクタークラス［［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　 Ｓ遺伝子は、直接放出方法により植物中に導入されることかできる。多数の直接 放出ベクターは、ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子に関して完成された。ベクターｐＭＯ ＮＩ３６４０（その地図を図１５に示す）をここで説明する。プラスミドベクタ ーは、この場合、Ｔｎ　９０３に由来のｎｐｔｌＩ遺伝子（カナマイシン耐性： ＫＡＮ）を含むｐＵＣプラスミド（ビエイラ及びメリック、１９８７）に基づき 、Ｅ、ｃｏｌｉ中の選択可能な標識を提供する。ＣＴＰ４−ＥＰＳＰＳ遺伝子融 合体は、Ｐ−ＦＭＶ　３５　Ｓプロモーターから発現され、Ｎ０Ｓ３’　ポリア デニル化配列断片を含み、及びＥ３５Ｓプロモーター、ＣＴＰ４−ＣＰ４遺伝子 融合体及びＮＯ３３°配列からなる第２のカセットから発現される。計測可能な ＧＵＳ標識遺伝子（ジェファーソンら、１９８７）は、マンノビンシンターゼプ ロモーター（Ｐ−ＭＡＳ　、ベルテンら、１９８４）及びダイズ７Ｓ貯蔵タンパ ク遺伝子３′配列（シュラ−ら、１９８２）か発現される。ＣＴＰ−ＣＰ４ＥＰ ＳＰＳ融合体を高められたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターまたはその他の植物プロ モーターから発現される類似のプラスミドをも生成することができる。 植物中への遊離ＤＮＡ放出に適したその他のベクターを生成することができ、そ れらは当業者のレベルの範囲内であり、本明細書の開示の範囲内のものであると 考えらクラスＩＩＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子の発現が形質転換された細胞（また はプロトプラスト）中で行なわれた場合は、細胞（またはプロトプラスト）は植 物全体中で再生される。 再生工程の方法の選択は不可欠ではないか、適当な方法は、マメ科（アルファル ファ、タイズ、クローバ−等）、セリ科にンジン、セロリ、アメリカボウフウ） 、アブラナ科（キャベツ、ラディッシュ、ナタネ等）、ウリ科（メロン及びキュ ウリ）、イネ科（コムギ、コメ、コーン等）、ナス科（ジャガイモ、タバコ、ト マト、゛カラン）、種々の花作物並びにポプラまたはリンゴのような種々の木、 堅果作物またはブドウのようなつる植物から選ばれる宿主に対して有用である。 例えば、アミラード、１９８４；シマモト、１９８９；フロム、１９９０＋バジ ル、＋９９０参照。 下記の実施例は、本発明の実施をより詳しく説明するだめのものであり、本発明 の範囲を限定するものであるとは決して解釈されてはならない。当業者は、本発 明の精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載された方法及び遺伝 子に種々の変更及び省略を行い得ることを理解するであろう。 下記の実施例において、植物中のＥＰＳＰＳ活性は、下記の方法によりアッセイ した。組織試料を集めて液体窒素中において直ちに凍結させた。若業組織１ｇを 液体窒素とともに乳鉢中で凍結させ、乳棒で微粉末になるように粉砕した。この 粉末を第２乳鉢に移し、抽出緩衝液を添加しく１ｍｌ／ｇ）、次いて試料をさら に４５秒間粉砕した。キャノーラ用の抽出緩衝液は、１００ｍＭ）リス、ＩｍＭ ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、５ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＢ　Ａ　Ｍ、５ｍＭアス コルビン酸塩、１．　Ｏｍｇ／ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ、　ｐＨ７，５（４°Ｃ）から 成る。タバコ用の抽出緩衝液は、１００ｍＭトリス、ｌ　ＯｍＭＥＤＴＡ、３５ ｍＭＫＣＩ、２０％グリセロール、５ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＢＡＭ、５ｍＭアスコ ルビン酸塩、１．　Ｏｍｇ／ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ、　ｐＨ７，５（４°Ｃ）をから 成る。 混合物を遠心分離管に移し、５分間遠心分離した。得られた上清を、０．２５　 ｍｌづつに分けて、予め抽出緩衝液（ＢＳＡ無し）により平衡化されたスピンＧ −５０（ファルマシア製）カラム上て脱塩処理した。脱塩処理された抽出物を、 放射性ＨＰＬＣアッセイによりＥＰＳＰシンターゼ活性をアッセイした゛。試料 中のタンパク質濃度を、標準としてＢＳＡを使用するバイオラッドの微量タンパ ク質アッセイにより測定した。 タンパク質濃度をバイオラッドの微量タンパク質方法を使用して測定した。ＢＳ Ａを使用して、２〜２４μｇの範囲の標準曲線を作成した。８００μｌの標準試 料または希釈試料のいずれかを、濃縮されたバイオラッドのプラットフォーム試 薬２００μｌと混合した。この試料を渦状に回転させ、〜５分後にＡ（５９５） において目盛を読み、標準曲線と比較した。 ＥＰＳＰＳ酵素アッセイは、ＨＥＰＥＳ　（５０ｍＭ）、シキミ酸−３−リン酸 塩（２ｍＭ）　、Ｎ　Ｈ４モリブデン酸塩（０，１ｍＭ）及びＫＦ（５ｍＭ）を 含み、グリホセート（０，５または１．０　ｍＭ）は含むものと含まないものか ある。 このアッセイ混合物（３０μＩ）及び植物抽出物（１０μｍ）を２５°Ｃにおい て１分間予備インキュベートし、目Ｃ−ＰＥＰ　（ＩｍＭ）を添加することによ って反応を開始した。この反応物を３分後に９０％Ｅ　ｔ　０Ｈ１０，１ＭＨＯ Ａｃ　（ｐ）１４．５）５０ｕｌによりクエンチングした。 この試料を６０００　ｒｐｍで遠心分離し、得られた上演を、ＨＰＬＣにより” Ｃ−Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓについて分析した。グリホセートを用いる場合と用いな い場合のＥＰＳＰＳ活性から、耐性ＥＰＳＰＳの百分率を算出した。 １４Ｃ標識されたＰＥＰから”ＣＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐへの転化の百分率を、０．２８ Ｍイソクラティック（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ　）のリン酸カリウム溶離液（ｐＨ６ ，５）を使用するＣ１８保護カラム（ブラウンリー）及びＡＸ１００ＨＰＬＣカ ラム（０，４ｘ２５ｃｍ、シンクロパック）を１　ｍ１７分で用いて、ＨＰＬＣ 放射性アッセイにより測定した。初期の速度は、単位時間当りの分割回転に、標 識された基質の濃度（ＩｍＭ）を掛けることにより算出した。アッセイは、〜３ 分までの時間及びＥＰＳＰＳの３０％回転に比例していた。 試料を必要であれば１０１１１Ｍトリス、１０％グリセロール、１０ｍＭＤＴＴ ＳｐＨ７，５（４℃）により希釈し、比例の範囲内において結果を得た。 これらのアッセイにおいて、ＤＬ−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）　、ベンズア ミジン（ＢＡＭ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、実質的にグロブリン無し） はシグマ社から入手した。ホスホエノールピルベ−１−（ＰＥＰ）はベーリンガ ーマンハイムから、及びホスホエノール−（１−”Ｃ）ピルベート（２８ｍＣｉ ／ｍｍｏｌ）　ｌｅｔ　ファージャムから入手した。 実施例１ 形質転換されたタバコ植物が、ＥＰＳＰＳの適当な発現を有する上記のＣＰ４Ｅ ＰＳＰＳＤＮＡ配列を含む多数のクラス［ＩＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子ベクター により産生されている。これらの形質転換された植物は、クラスＩ［ＣＰ４ＥＰ ＳＰＳにより移入されたグリホセート耐性を示す。 タバコの形質転換は、約１月齢の健常な葉組織を利用するタバコ葉ディスク形質 転換方法を採用する。１０％クロロツクス及び表面活性剤により１５〜２０分間 表面を滅菌した後、葉を滅菌水中で３回すすぐ。滅菌紙パンチを使用して、葉デ ィスクに穴を開け、ＭＳ　ｌ　０４培地（ＭＳ塩４．３ｇ／ｌ、シュクロース３ ０ｇ／ｌ、Ｂ５ビタミン５００　Ｘ　２ｍｌ／Ｉ、　ＮＡＡＯ，ｌ　ｍｇ／ｌ及 びＢ　Ａ　１．　Ｏｍｇ／Ｉ）上に裏返しにして置き、１日子備培養する。 次いで、１１５に希釈された（即ち、約０．６０Ｄ）対象ベクターを含む無力化 されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ａ　Ｂ　Ｉ株の一晩の培養物を植付ける。 この植菌は、ディスクを前記培養物とともに遠心分離管に入れることにより行わ れる。３０〜６０秒後に、液体を排出し、ディスクの水分を滅菌濾紙の間に吸収 させる。次いてこのディスクをフィルターディスクとともにＭＳ　Ｉ　Ｏ４フイ ーダープレート上に裏返しにして置き、共培養する。 ２〜３日間共培養した後、ディスクを裏返しにしたまま、ＭＳ　１０４培地を有 する選択プレート上に移す。２〜３週間後に、カルス組織が生成し、個々の塊を 葉ディスクから分離する。若技か茎と区別がつくほど十分に大きくなったら、若 技をカルスから清潔にして切断する。 この若技を、適当な抗生物質耐性の選択対象を有するホルモン無しの根付は培地 （ＭＳＯ：ＭＳ塩４．３ｇ／Ｉ、シュクロース３０ｇ／ｌ及びＢ５ビタミン５０ ０　Ｘ　２ｍｌ／ｌ）上に置く。根は１〜２週間で発生する。滅菌しなから、根 付いた若技においていずれの葉カルスアッセイを行うことも好ましい。次いで根 付いた若技を、土中に入れ、高湿度環境中に維持する（即ち、プラスチック製容 器または袋）。若技を周囲湿度条件に徐々にさらすことによって、強化する。 形質転換された植物におけるＣＰ４ＥＰＳＰＳタンパク質の表現 タバコ細胞を、天然ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子を含む多数の植物ベクターにより、 異なるプロモーター及び／またはＣＴＰのものを使用して形質転換した。遺伝子 の表現の予備的証拠は、抗生物質選択された形質転換ベクターの葉組織かグリホ セート上て再カルス生成する能力によって得られた。この場合において、グリホ セート耐性カルスは形質転換の後に直接選択された。ＣＰ４ＥＰＳＰＳの表現の レベルは、グリホセート耐性ＥＰＳＰＳ活性のレベル（（１，５ｍＭグリホセー トの存在下でアッセイした）またはヤギ抗ＣＰ４ＥＰＳＰＳ抗体を使用するウェ スタンプロット分析により測定した。ウェスタンプロットは、光度計の記録と精 製ＣＰ４ＥＰＳＰＳを使用して得られた標準曲線との比較により定量された。こ れらのデータを可溶性葉タンパク質の％で示す。多数の形質転換された植物系及 び形質転換ベクターから得られたデータを下記表Ｖｌに示す。 （％葉タンパク質） ｐＭＯＮ１７１１０　２５３１３　０．０２ｐＭＯＮ１７１１０　２５３２９　 ０．０４ｐＭＯＮ１７１１６　２５０９５　０．０２ｐＭＯＮ１７１１９　２５ １０６　０．０９ｐＭＯＮ１７１１９　２５７６２　０．０９ｐＭＯＮ１７１１ ９　２５７６７　０．０３グリホセート耐性は、形質転換されたタバコ植物中の 全体の植物レベルで示された。タバコにおいて、ＣＴＰ２−ＣＰ４ＥＰＳＰＳの Ｒ０形質転換は、０．４　ｌｂ／ニーカー（０，４４８ｋｇ７ヘクタール）、即 ち、７．１４及び２８日において、それぞれ３．１及びＯの割合に応じて対照の 非形質転換タバコ植物を殺滅するのに十分な割合、で噴霧され、生長性及び再生 性について分析したＣ表ＶＩＩ）。 表Ｖｔ［Ｒ，タバコＣＰ４形質転換体に噴霧割合＝　０．４１ｂ／ニーカー（０ ，４４８ｋｇハククール）７日　１４日　２８日 ｐＭＯＮ１７１１０／２５３１３　６　４　２　なしｐＭＯＮＩ７１１０／２５ ３２９　９　１０　１０　ありｐＭＯＮ１７１１９／２５１０６　９　９　１０ 　あり本　植物をＯからｌＯの数値によるスコアシステムで評価し、生長スコア か１０は、非噴霧の対照と比較して損傷かないものを示し、０は死滅した植物を 示す。再生のスコア（受精）は、噴霧後２８日目に測定し、植物か受精したかど うかを評価する。 実施例２ キャノーラ植物をｐＭＯＮ１７１１０、ｐＭＯＮ１７１１６及びｐＭＯＮ１７１ ３１により形質転換し、グリホセート耐性を示す、形質転換されたキャノーラの 植物Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ　ｃｖ　Ｗｅｓｔａｒの種苗をメトロミック ス３５０を含む２インチ（〜５　ａｍ）の容器中に定着させた。 これらは２４°Ｃ１１６／８時間の光周期、４００μＥｍ−２秒−’（ＨＩＤ灯 ）の光濃度の生長室において生長した。 それらに、ピータープ２０−１０−２０ゼネラルパーパススペシヤルの肥料を与 えた。２１／２週間後に、これらを６インチ（〜１５ｃｍ）の容器に移植し、１ ５／１０°Ｃ昼／夜温度において、１６／８時間の光周期、８００μＥｍ−”秒 −’（ＨＩＤ灯）の光濃度の生長室において生長した。これらにビータープ１５ −３０−１５ハイーフオススペシヤルの肥料を与えた。 形質転換／選択／再生 抽蓄の直前または抽蔓中であるが開花前に、植物から４の頂生節間を除去し、７ ０％Ｖ／Ｖエタノール中で１分間、２％Ｗ／Ｖ次亜塩素酸ナトリウム中で２０分 間表面滅菌し、次いで滅菌脱イオン水で３回すすいだ。付着した葉を有する茎を 、滅菌前に７２時間まで、湿潤プラスチック容器中に冷蔵してもよい。６〜７の 茎部分を、基底端の方向を維持しなから、レドコ植物スライサー２００を用いて ５ｍｍディスクに切断した。 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ＋＋＋を、５０ｍｇ／ｌカナマイシン、２４Ｂ／１ク ロラムフエニコール及び１００ｍｇ／ｌスペクチノマイシンを含むルリアブロス ２ｍｌ中において２４°Ｃで回転器上で一晩生長させた。約９Ｘ１０”細胞／ｍ ｌを与えるようにＭＳ（ムラシゲ及びスクーグ）培地中で１：１０に希釈した。 これを６６０ｍｕにおける光学濃度の読みで確認した。茎ディスク（外植片）に Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１．０　ｍｌを植付け、過剰分をその外植片から 吸引除去した。 この外植片を１／ＩＯＸ標準ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％シュクロース、０．８ ％寒天、ｐＨ５，７，１，０ｍｇ／Ｉ　６−ベンジルアデニン（ＢＡ）を含むベ トリブレート中に基底を裏にして置いた。このプレートに、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミ ン、３％シュクロース、ｐＨ５，７，４，０ｍｇ／ｌｐ−クロロフェノキシ酢酸 、０．００５　ｍｇ／ｌカイネチンを含む培地１．５ｍｌを重ね、滅菌濾紙で覆 った。 ２〜３日間共培養した後、外植片を、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％シュクロース 、０．８％寒天、ｐＨ５，７，１ｍｇ／ＩＢＡ、５００ｍｇ／ｌカルベニシリン 、５０ｍｇ／Ｉセフすタキシム、選択の２００ｍｇ／ｌカナマイシンまたは１７ ５ｍｇ／ｌゲンタマイシンを含む深皿ベトリブレートに移した。 ７つの外植片を各プレート上に置いた。３週間後に、これらを新鮮な培地へ、各 プレート当り５つの外植片として移した。この外植片を、２５°Ｃの連続光（冷 白色）の生長室中で培養した。 発現アッセイ ３週間後に、若技を外植片から摘出した。葉再カルス生成アッセイを開始して、 Ｒ０１若技の変異を確認した。 策組織の３つの小片を、ＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、３％シュクロース、０．８％寒 天、ｐＨ５，７，５，０ｍｇ／ＩＢ　Ａ　、　０．５ｍｇ／ｌナフタレン酢酸（ ＮＡＡ）　、５００ｍｇ／ｌカルへニジリン、５０ｍｇ／ｌセフすタキンム及び ２００　ｍｇ／ｌカナマイシン若しくはゲンタマイシンまたは０．５　ｍＭグリ ホセートを含む再カルス生成培地上に置いた。葉アッセイを外植片と同じ条件下 で生長室中でインキュベートした。３週間後に、葉再カルスアッセイの殺草前耐 性（カルスまたは緑色葉組織）または感受性（漂白）についてスコアを摘出の際 に、若技茎をＲｏｏｔｏｎｅ　（登録商標）中に浸し、メトロ−ミックス３５０ を含む２インチ（〜５　ｃｍ）の容器中に入れ、密閉した湿潤環境中に置いた。 これらを、２４°Ｃ１１６／８時間の光周期、４００　μＥｍ−’秒−２（ＨＩ Ｄ灯）の生長室中に、約３週間の強化期間中量いた。 Ｒ０植物から得られた収穫された種子は、Ｒ１植物を生産するＲ１種子である。 Ｒ，植物のグリホセート耐性を評価するために、その子孫を評価する。Ｒ０植物 は各挿入位置においてヘミ接合であると考えられるので、自家受粉の結果、Ｒ１ 最大遺伝子量分離が起こる。各挿入は、連鎖の不在下で優勢対立遺伝子として作 用し、ｌのヘミ接合挿入のみが耐性発現のために要求されると考えられるので、 ｌの挿入が３：１，２の挿入、１５：１．３の挿入６３，１等に分離するであろ う。従って、比較的少ないＲ１植物か少なくともｌの耐性表現型を見出すために 生長することが要求される。 Ｒ，植物から得られた種子を収穫し、脱穀し、グリホセート噴霧試験において植 えられる前に乾燥する。種々の技術を使用して、Ｒ３噴霧評価のために前記植物 を生長させた。試験は、グリーンハウス及び生長室の両方で行う。２つの植生系 を使用する：３２または３６の細胞を含む〜ｌ０ｃｍの容器または植物トレイ。 植生のために使用された土は、メトロ３５０及び３種類の徐放性肥料または植物 メトロ３５０のいずれかである。潅水は、グリーンハウスの頭上からかまたは生 長室の下潅水とする。 肥料は、潅水中に必要に応じて与える。キャノーラに適した温度管理を維持した 。１６時間の光周期を維持した。 開花か始った時に、植物を〜１５ｃｍの容器に移植し、種子を生成させる。 噴霧「バッチ」は、全て同じ日に噴霧された数組のＲ１子孫からなる。いくつか のバッチは、Ｒ１植物以外の評価を含んでいてもよい。各バッチはまた、形質転 換されたと仮定される特定のバッチ内の遺伝子型を発現する噴霧された及び未噴 霧の非トランスジェニック遺伝子型を含む。バッチ中にはまた、いくらかの耐性 を有すると予め同定された１またはそれ以上の非分離形質転換された表現型が含 まれる。 各Ｒ０子孫から得られた２〜６の植物は噴霧されず、グリホセートにより誘導さ れないいずれの変異性を評価するとともに、グリホセート耐性を比較し測定する 対照として作用する。通常植生後１０〜２０日に、その他の植物か２〜４葉の段 階に達したときに、研究の対象に応じて、グリホセートを０．２８から１．１２ 　ｋｇ／ｈａの範囲の割合で与える。低容量を使用する少量敷用技術か採用され ている。実験室用トラック噴霧器に目盛を付けて、煽ての条件と等しい量で供給 される。 ０〜ＩＯの尺度を用いて、生長耐性について噴霧された植物を評価する。この尺 度は同じＲ０植物由来の未噴霧の植物との比較である。０は死滅を意味し、１０ は未噴霧の植物と可視的な相違かない場合を意味する。θ〜１０て数値が高いほ ど、未噴霧の植物と比較して、損傷が少ないことを示す。処理（ＤＡＴ）後また は抽薔まで、７．１４及び２８日目に植物のスコアを付け、Ｒ０植物族内の噴霧 された植物の平均スコアに１の傾向か与えられる。 ６の整数を使用して、グリホセートから与えられる再生損傷の程度を質的に示す ： ０：花のつぼみの生長がない ２：花のつぼみは存在するが、開花前に発育不全となる ４：花は開くか、朽がないかまたは朽か花弁を押し出すことができない ６：実りのない朽 ８：部分的に実りのない朽 １０：完全に受粉した花 孔構造の発育の段階に応じて、開花開始時または少し後に、この尺度を用いて、 植物を評価する。 キャノーラにおけるＥＰＳＰＳの表現 ３週間後に、形質転換したキャノーラ植物をグリホセート耐性ＥＰＳＰＳ活性の 存在についてアッセイした（０．５ｍＭのグリホセートの存在下でアッセイした ）。結果を下記表Ｖ＋ｒ［に示す。 表Ｖｌｌ＋　形質転換されたキャノーラ植物にｐＭＯＮ　１７１１０　４１　４ ７ ｐＭＯＮ１７１１０　５２　２８ ｐＭＯＮＩ７１１０　７１　８２ ｐＭＯＮＩ７１１０　１０４　７５ ｐＭＯＮ１７１１０　１７２　８４ ｐＭＯＮ１７１１０　１７７　８５ ｐｌｉｌＯＮ１７１１０　２５２　２９゜ｐＭＯＮ１７１１０　３５０　４９ ｐＭＯＮ＋７１１６　４０　２５ ｐＭＯＮ１７１１６　９９　８７ ｐＭＯＮ１７１１６　１７５　９４ ｐＭＯＮ１７１１６　１７８　４３ ｐＭＯＮ１７１１６　１８２　＋８ ｐＭＯＮ１７１１６　２５２　６９ ｐＭＯＮ１７１１６　２９８　４４” ｐＭＯＮ＋７１１６　３３２　８９ ｐＭＯＮＩ７１１６　３８３　９７ ｐＭＯＮＩ７１１６　３９５　５２ ”１．０ｍＭグリホセートの存在下でアッセイした次いでキャノーラのＲ１形質 転換体を、生長室中で生長サセ、０．５６　ｋｇ／ヘクタールでグリホセートを 噴霧し、生長性を評価した。この結果を表ＩＸＡｉＸｃに示す。 全組織中のグリホセート耐性ＥＰＳＰＳの発現は、これらのトランスジェニック 植物中の最適グリホセート耐性遺伝子型を観察することが好ましいことに注意さ れたい。 下記表中に、葉組織に関して得られた表現結果のみを示す。 （ｐＭＯＮ１７１１０＝　Ｐ−Ｅ３５Ｓ：ｐｌＪＯＮ１７１１６＝　Ｐ−ＦＭＶ ３５Ｓ：Ｒ＋植物：噴霧割合＝　０．５６ｋｇ／ｈａ） 対照ウェスター　０　５　３ ｐＭＯＮ１７１１０／４１　４７　６　７ｐＭＯＮ１７１１０／７１　８２　６ 　７ｐＭＯＮ１７１１０／１７７　８５　９　１０ｐＭＯＮ１７１１６／４０　 ２５　９　９ｐＭＯＮ１７１１６／９９　８７　９　１０ｐＭＯＮ１７１１６／ １７５　９４　９　１０ｐＭＯＮ１７１１６／１７８　４３　６　３ｐＭＯＮ１ ７１１６／１８２　１８　９　１０ｐＭＯＮ１７１１６／３８３　９７　９　１ ０表ＩＸＢ　クラスＩＩＥＰＳＰＳキャノーラＲ１形質転換体におけるグリホセ ート耐性 （ｐＭＯＮ１７１３１　＝　Ｐ−ＦＭＶ３５Ｓ；Ｒ＋植物：噴霧割合＝　０．８ ４ｋｇ／ｈａ）対照ウエスター　１０ 転換体におけるグリホセート耐性 （Ｐ−Ｅ３５Ｓ　：　Ｒ２植物：噴霧割合＝　０．２８ｋｇ／ｈａ）ｐＭＯＮ８ ９９／７１５　９６　５　６ｐｌｉｌＯＮ８９９／７４４　９５　８　８ｐＭＯ Ｎ８９９／７９４　８６　６　４ｐＭＯＮ８９９／８１８　８１　７　８ｐＭＯ Ｎ８９９／８８５　５７　７　６零０．５ｍＭグリホセートの存在下における耐 ＥＰＳＰＳ活性（％） 本本　生長スコアの１０は損傷がないことを示し、スコアＯは死滅植物に与えら れる。 クラスＩ［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ形質転換体について得られたデータを、同一のプ ロモーターを使用してＥＰＳＰＳ遺伝子を発現しグリホセート耐性ＥＰＳＰＳ活 性のレベルがこの２つの型の形質転換体にとって比較可能であるグリホセート耐 性クラス［ＥＰＳＰＳ形質転換体と比較してもよい。Ｉ）ＭＯＮ１７１１０（表 ＩＸＡ）及びｐＭＯＮ１７１３１　（表ＩＸＢ）のデータと、ｐＭＯＮ８９９　 （表ＩＸＣ；　ｐＭＯＮ８９９中のクラス■遺伝子は、Ａ、　ｔｈａｌｉａｎａ 　（リーら、１９８７）由来であり、位置ｌＯ１のグリシンは、アラニンに変更 されている）のデータとの比較は、クラスＩＩＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓは少なくとも クラス！ＥＰＳＰＳと同等に良好であることを示している。クラス［ＩＥ　Ｐ　 Ｓ　Ｐ　Ｓの生長耐性における改良は、クラスＩＩ植物が２倍の割合で噴霧され 、ＲＩ植物として試験されることを考慮に入れると明らかである。 実施例３ ダイズ植物をｐＭＯＮ１３６４０（図１５）ベクターにより形質転換し、グリホ セート耐性を発現する形質転換された多数のダイズの植物系を得た。 ダイズ植物をクリストウら（１９８８）に記載された粒子ガン技術を用いる徴発 射方法を使用して、ｐＭＯＮ１３６４０により形質転換した。Ｒ０植物から収穫 した種子は、Ｒ１植物を生産するＲ１種子である。Ｒ０植物のグリホセート耐性 を評価するために、その子孫を評価する。Ｒ０植物は、各挿入位置においてヘミ 接合であると考えられるので、自己受粉の結果、Ｒ１に最大遺伝子型分離か起こ る。各挿入は、連結の不在下で優勢対立遺伝子として作用し、■のヘミ接合挿入 のみか耐性発現のために必要であると考えられるので、■の挿入か３：ｌ、２の 挿入、１５：１．３の挿入６３，１等に分離するであろう。したかって、比較的 少ないＲ１植物か少なくともｌの耐性表現型を見出すために生長することか要求 される。 Ｒｅダタイ植物由来の種子を収穫し、グリホセート噴霧試験のために植生する前 に乾燥する。種子をメトロ３５０を含む４インチ（〜５　ｃｍ）の四角形の容器 に植える。 各Ｒ０植物由来の２０の種苗が試験のために適当であると考えられる。植物をグ リーンハウス環境に維持し生長させる。１２．５〜１４時間の光周期並びに昼３ ０°Ｃ及び夜２４°Ｃの温度を調節する。水溶性のピーターズビートライト肥料 を必要に応じて与える。 噴霧「バッチ」は、全て同じ日に噴霧を受けた数組のＲ，子孫からなる。いくつ かのバッチはＲ１植物以外の評価を含んでいてもよい。各バッチはまた、形質転 換されたと仮定される特定のバッチ中の遺伝子型を発現する噴霧されたまたは未 噴霧の非トランスジェニックの遺伝子型を含む。１のバッチ中には、予めいくら かの耐性を有すると同定されたｌまたはそれ以上の非分離の形質転換された遺伝 子型か含まれる。 各個々のＲ０子孫由来の１〜２の植物には噴霧せず、・　グリホセートにより誘 発されないいずれかの変異を評価するとともに、グリホセート耐性を比較、測定 する対照として作用する。通常植生後２〜３週間目に、その他の植物が第１の第 三葉期に達した時に、グリホセートをＲｏｕｎｄｕｐ　（登録商標）　１２８ｏ ｚ、／ニーカー（８，８９５ｋｇ・　／ｈａ　）に等しい割合で処理する。実験 室用トラック噴霧器に目盛を施してこれらの条件と等しい割合で排出させる。 ０〜１０の生長スコアを使用する。このスコアは、同一のＲ０植物に由来する無 噴霧の子孫との比較である。 ０は死滅を意味し、１０はその未噴霧の植物と可視的には相違かない場合を示す 。θ〜ＩＯの間で数値が大きいほと、未噴霧植物と比較して損傷が少ないことを 示す。 処理（ＤＡＴ）後、７．１４及び２８日目に植物のスコアをつける。１組の形質 転換されたダイズ及び対照のダ１　イズの分析から得られたデータを表Ｘに記載 するが、ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子かダイズにもグリホセート耐性を与えることを 示している。 表Ｘ　クラス［ＥＰＳＰＳダイズ形タイ換体（Ｐ−Ｅ３５Ｓ、　Ｐ−ＦＭＶ３５ Ｓ　：ＲＯ植物：噴霧割合＝　Ｌ２８ｏｚ、　／ｘ−カー）１３６４０／４０〜 ３　滲　１０　１０ｃｏｎｔｒｏｌ　Ａ３４０３　２　１　０ｃｏｎｔｒｏｌ　 Ａ３４０３　１　１　０実施例４ ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子を使用して、グリホセートを含む培地上て形質転換され た植物材料を直接選択することかできる。形質転換された植物材料を選択し、同 定する能力は、はとんどの場合、正常に阻害する物質の存在下で形質転換された 組織の優先的及び連続的生長を可能にする優勢の選択可能な標識の使用に応じて 決定される。 抗生物質耐性及び殺草剤耐性遺伝子は、対応する抗生物質または殺草剤の存在下 でのそのような優勢の選択可能な標識遺伝子としてほとんど排他的に使用されて いる。 ｎｐｔｌｌ　／カナマイシン選択スキームは、多分もっとも頻繁に使用されるも のである。ＣＰ４ＥＰＳＰＳは、形質転換された植物を生産し同定するための可 動でしかも多分優れた選択可能な標識／選択スキームである。 このスキーム中で使用することかできる植物形質転換体は、ｐＭＯＮ１７２２７ 　（図１６）である。このプラスミドは、上記のその他のプラスミドの多くと似 ており、このプラスミドをＥ、ｃｏｌｉ中で複製させ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ中に導入させ複製させることを可能にする上記の細菌レプリコンシステム及 び細菌選択可能な標識遺伝子（Ｓｐｃ／Ｓｔｒ　）から実質的になり、Ｔ−ＤＮ Ａ右端及び左端の間には、ＦＭＶ３５Ｓプロモーター−Ｅ９３’　カセット中の ＣＴＰ２−ＣＰ４合成遺伝子か存在する。このプラスミドはまた、端間及び発現 カセットの外側に存在する多数の制限酵素のための単一部位を存する。これは、 その他の遺伝子及び遺伝子要素を、植物への導入のためのベクターに容易に付加 することを可能にする。 グリホセート上で形質転換された植物を直接選択する方法をタバコについて簡単 に説明する。外植片を実施例１において説明したものと同じ標準方法により予備 培養するために準備する。１月齢のタバコ植物から得られた葉の表面滅菌（１０ ％クロロックス及び表面活性剤中で１５分間；３Ｘ脱イオン水で洗浄）；外植片 を均一の組織型にするために葉の端部、中央脈、先端及び葉脈端を除去して、０ ．５　Ｘｏ、　５　ｃｍの四角形に切断する。外植片をＭＳ　ｌ　０４プレート 及び２ｍ１４ＣＯ０５に培地上に一枚ずつ、裏返しにして置き、表面を湿潤する ：ｌ〜２日間予備培養する。外植片に４ＣＯ０５に培地により１．２×１０９細 菌／［Ｏｌの力価に調節された植物形質転換プラスミドを含むＡｇｒｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍの一晩の培養物を使用して、植菌する。外植片を遠心分離管中に入れ 、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ懸濁液を添加し、細菌と外植片の混合物を最大の 設定で２５分間「フォルテックス」し、細菌の浸透を均一にする。この細菌を流 出させ、外植片を乾燥、滅菌濾紙層間に置いて吸収して、過剰の細菌を除去する 。 濾紙で吸い取った外植片をＭＳ　１０４プレート、２ｍ１４Ｃｏ０５に培地及び フィルターディスク上に裏返しにして置く。共培養を２〜３日間行う。この外植 片をＭＳＩ０４、カルベニシリンｌ　０００ｍｇ／Ｉ及びセフオタキシム１００ ｍｇ／ｌに３日間移す（遅延期）。次いてこの外植片を、ＭＳ　Ｉ　０４、グリ ホセート０．０５　ｍＭ、カルベニシリン１０００ｍｇ／Ｉ及びセフオタキシム １００ｍｇ／Ｉに選択期のために移す。４〜６週間目に、若技をカルスから切除 し、ＭＳＯ及びカルベニシリン５００ｍｇ／ｌ根付は培地上に置く。３〜５日間 で根が生成するが、その時に葉片を根付いたプレートから採取して、グリホセー ト耐性及び材料が形質転換されたことを確認することかできる。 これらの形質転換された組織中のＣＰ４ＥＰＳＰＳタンパク質の存在は、葉ディ スクの免疫プロ・ノド分析によ１　って確認されている。ｐＭＯＮ１７２２７を 使用するｌの実験から得られたデータを以下に示す＝４００の外植片からグリホ セート上で生成された１３９の若技にＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ＡＢ　Ｉ／ 　ｐＭＯＮ　１７２２７を植菌する；これらのうち９７がグリホセート上での再 カルス生５　成についてプラスてあった。これらのデータは、１００の外植片に つき２４の形質転換率を示し、本方法か植物にとって非常に効率的で省時間型の 方法であることを意味する。同様の形質転換頻度かｐＭＯＮｌ　７１３１につい ても得られており、ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子を使用するグリホセート上の形質転 換体の直接的な選択は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　、ジャガイモ、トマト、ワタ 、レタス及びテンサイを含むその他の植物種についても示されている。 ｐＭＯＮ１７２２７ブラスミドは、その他の遺伝子のクローニング及びそれらの 遺伝子の植物中への導入を促進するために、ＣＰ４グリホセート選択領域とベク ターの左端との間に単一の制限酵素認識分割部位（Ｎｏｔｌ、Ｘｈｏ　Ｉ及びＢ ｓｔＸ［）を存している。 実施例５ ＣＰ４ＥＰＳＰＳ遺伝子は、ブラックメキンカンスウィート（ＢＭＳ）コーン細 胞中に導入されており、タンパク質及びグリホセート耐性の発現がカルス中で検 出されている。 このプラスミドの骨格は、高複写プラスミドｐＵｃｌ１９の誘導体である（ビエ ラ及びメリック、１９８７）。 複製の起点を含む１．３　ＫｂＦｓｐ［−Ｄｒａｌ　ｐ　Ｕ　Ｃ１１９断片を、 ネオマイシンホスホトランスフェラーゼタイプ１１遺伝子を含むｐＫＣ７に由来 の１．３　ＫｂＳｍａ［−Ｈｌｎｄｌ［Ｉを充填された断片（う才及びロジャー ズ、１９７９）に融合し、細菌カナマイシン耐性を与えた。このプラスミドは、 −９０〜−３００領域の重複を存する０、　６　ｋｂのカリフラワーモザイクウ ィルス（ＣａＭＶ）３５ＳＲＮＡプロモーター（ケイら、１９８７）、５’非翻 訳化リーダー領域中のトウモロコシ遺伝子由来のイントロンを含む０．８　ｋｂ 断片、次いでポリリンカー及びノーバリンシンターゼ（ＮＯ３）遺伝子由来の３ ′終終結列（フレイリーら、１９８３）を含む単子葉植物発現カセットベクター を構築するために使用した。細菌ＣＰ４ＥＰＳＰシンターゼのための１．４　Ｋ ｂコード配列にフレームにおいて融合されたＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｅ　Ｐ　 Ｓ　Ｐシンターゼ由来の３００ｂＰ葉緑体トランジットペプチドを含む１．７　 Ｋｂ断片を、イントロンとＮＯ３終結配列の間のポリリンカー内の単子葉植物発 現カセット中に挿入し、プラスミドｐＭＯＮｌ　９６５３を生成した（図１７） 。 ｐＭＯＮｌ　９６５３ＤＮＡを、ＥＣ９、トウモロコシアセトラクテートシンタ ーゼ遺伝子のスルホニル尿素耐性体を含むプラスミドとともに、共衝撃によりブ ラックメキシカンスウィ−１−（ＢＭＳ）細胞中に導入した。各プラスミド２． ５　ｍｇをタングステン粒子上に被覆し、文献記載（クラインら、＋　９８９） の方法と実質的に同じ方法によりＰＤＳ−１０００粒子ガンを使用して対数期の ８ＭＳ細胞中に導入した。形質転換体を２０ｐｐｂクロロスルフロンを含むＭＳ 培地上で選択する。クロロスルフロン上の初期の選択の後、カルスをウェスタン プロットにより直接アッセイすることができる。グリホセート耐性は、カルスを ５ｍＭのグリホセートを含む培地に移すことによって評価することができる。表 ＸＩに示されるように、ＣＰ４遺伝子はグリホセート耐性をコーンカルスに与え る。 ２８４　０、００６％ ２８７　０、０３６ ２９０　０、０６１ ２９５　０、０７３ ２９９　０．１１３ ３０９　０、０４２ ３１３　０．００３ コーンカルス中のＣＰ４ＥＰＳＰＳ表現を測定するために、下記の方法を使用し た：　８ＭＳカルス（３重量ｇ）を真空下で濾紙（ワットマン＃ｌ）上で乾燥さ せ、再重量計測し、抽出緩衝液（５００μＩ／ｇ乾燥重量；１００ｍＭ）リス、 １ｍＭＥＤＴＡ、１０％グリセロール）を添加した。この組織を２．８電力設定 して３０秒間フィートンのオーバーヘッド撹拌器を使用して均質化した。 遠心分離後（３分間、エッペンドルフの遠心分離機）、上溝を除去し、タンパク 質を定量した（バイオラッドのタンパク質アッセイ）。試料（５０μｇ／ウェル ）を、ＣＰ４ＥＰＳＰ］Ｗ！準（１０ｎｇ）とともに５ＤＳＰＡＧＥゲル（ジュ ール、３〜１７％）上に充填し、電気泳動に付し、上記記載の方法（パドジェッ ト、１９８７）に類似の方法によりニトロセルロースに移した。ニトロセルロー スプロットをヤギ抗ＣＰ４ＥＰＳＰＳ　ＩｇＧによりプローブし、ｌ−１２５タ ンパク質Ｇにより展開した。 放射性プロットを放射能写真により可視化した。結果をＬＫＢウルトラスキャン ＸＬレーザー濃度計を使用する濃度測定により定量し、下記表Ｘ中に示す。 １９６５３　２５３　１２０　８１／１２０＝６７．５％１９６５３　２５４　 ８０　３７／８０＝４６％ＥＣ９対照　２５３／２５４　８　０／８＝０％クラ ス［ＥＰＳＰＳの表現における改良は、より強い植物プロモーターを使用して、 より優れた３′ポリアデモ 訳開始の開始コドンの回りの配列を最適にして遺伝子を表現することにより、ま たはこれらのまたはその他の表現または調節配列若しくは因子を組合せることに よって達成することかできる。所望の植物を、その他のグリホセート耐性ＥＰＳ ＰＳ遺伝子またはグリホセートを分解することかできる遺伝子と共に、クラス［ ＥＰＳＰＳ遺伝子により形質転換して、形質転換された植物のグリホセート耐性 を高めることも有益である。 上記の記載から、本発明は、明白で本発明に固有である効果を伴って、本明細書 において上記した全ての目的を達成するために採用されるｌの発明であることが 明らかとなるであろう。　いくつかの特徴及びサブコンビネーションが有用であ り、その他の特徴及びサブコンビネーションに関係な（それらを採用することが できることが理解されるであろう。これは本発明の特許請求の範囲によって意図 され、含まれるものである。 本発明の多くの可能な具体例を特許請求の範囲から離脱せずに作ることかできる ので、本明細書中に開示され、または添付の図面に示される全ての事柄は、説明 のためのものであり、限定する意図はないと解釈されたい。 実施例６ ＬＢＡＡクラスＩ［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子を植物中に導入し、また、グリホ セート耐性を害する。ｐＭＯＮ１７２０６により形質転換されたタバコに関する データを表ｘｕｒ中に示す。 表ｘｒｒｔ　タバコグリホセート噴霧実験Ｓａｍｓｕｍ　４ （対照） 旦田ム―ΩシＵ田Ｘ Ａｌｔｏｎ、　Ｎ、Ｋ　ａｎｄ　Ｖａｐｎａｋ、　Ｄ、　（１９７９）　Ｎａｔ ｕｒｅ　２８２：８６４−８６９゜Ａｒｎｏｎ、　Ｄ、１．　乙現止シ「−止２ ４：１−１５　（１９４９）。 Ｂａｃｈｍａｎｎ、　Ｂ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍ−ｍｌＬシＬ、　４４： １−５６　（１９８０）。 Ｂａｒｔｌｅｔｔ、　Ｓ、Ｇ、、　Ｇｒｏｓｓｍａｎ、　ｋ、Ｒ，、ａｎｄ　Ｃ ｈｕａ、　Ｎ、Ｈ，（１９８２）　ｉｎ　Ｍｍ１辺ム”　ｐｐ、　１０８１−１ ０９１．　Ｍ、　Ｅｄｅｌｍａｎ。 Ｒ，Ｂ、、　Ｈａｌｌｉｃｋ、　ａｎｄ　Ｃｈｕａ、　Ｎ、Ｈ，、ｅｄｓ。 Ｂｅｖａｎ、　Ｍ、　（１９８４）　”　（２２）：　８７１１−８７２１゜Ｂ ｉｒｎｂｏｉｍ、　Ｈ，Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏｌｙ、　Ｊ、　（１９７９）　Ａ　ｒ ａｐｉｄ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏ ｒ　ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮ＆　 Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ。 Ｒｅｓ、　７：１５１３−１５部。 Ｂｏｙｅｒ、　Ｈ，Ｗ、　ａｎｄ　Ｒｏｌｌａｎｄ−Ｄｕｓｓｏｉｘ、　Ｄ、　 （１９６９）　Ａ　ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｒ　 ｔｈｅ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｒ　 ＤＮＡ　ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃ■奄■ ｒｖｌｉ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４１：４５９゜Ｃｈｒｉｓｔｏｕ、 　Ｐ、、　Ｄ、　Ｅ、　ＭｃＣａｂｅ、　ａｎｄ　Ｗ、Ｆ、　Ｓｗａｉｎ　（１ ９８８）　Ｓｔａｂｌｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｒ　５ｏｙｂｅａｎ 　Ｃａ１ｌｕｓ　ｂｙ　ＤＮＡ−Ｃｏａｔｅｄ　Ｇｏｌｄ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ 。 ム盃１Ｅ■廊止８７：６７１−６７４゜Ｃｏｒｕｚｚｉ、　Ｇ、、　Ｂｒｏｇｌ ｉｅ、　Ｒ，、Ｅｄｗａｒｄｓ、　Ｃ，、ａｎｄ　Ｃｈｕａ、　Ｎ、Ｈ−（１９ ８４）。 Ｔｉ５ｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｎｄ　ｌｉｇｈｔ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ　 ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｐｅａ　ｎｕｃｌｅａｒｇｅｎｅ　ｅｎｃｏ ｄｉｎｇ　ｔｈ１口ｍ１ｓｕｂｕｎｉｔ　ｏｆ　ｒｉｂｕｌｏｓｅ−１，５−ｂ ｉｇｐｈｏｓｐｈａｔｅｃｍｂｏｘｙＬａｓｅ、　ＥＭＢＯＪ　３：１６７１゜ ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ、　Ｇ、、　Ｂａｕｅｒ、　Ｓ、　Ｃ，、Ｋｌｅｉｎ 、　Ｂ、　Ｌ、　５ｈａｈ、　Ｄ、　Ｍ、、　Ｆｒｍ１ｅｙB Ｌ　Ｔ、　ａｎｄ　−ｈｏｒｅ　Ｇ、に、　（１９８６）　ＴｒａｎｓＪｏｃａ ｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　ｏｆ５−ｅｒｗｌｐｙｒｕｖｙ ｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ−シｐｈｏｓｐｈａｔｅ　−ｔｈａｓｅ　１ｎｔｏ　ｃｈ ｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ　ｏｆｈｉｇｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ、 　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８３：　６８７３−６ ８７７゜ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ、　Ｇ、、　Ｂａｕｅｒ、　Ｓ、　Ｃ，、Ｔ ａｙｌｏｒ、　Ｍ、　Ｔ、、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｄ、　Ｅ、。 Ｉ’Ｇｅ１ｎ、　Ｂ、　Ｌ　５ｈａｈ、　Ｄ、　Ｍ、、　Ｆｒａｌｅｙ、Ｒ，Ｔ 、　ａｎｄ　Ｋ１５ｈｏｒｅ　Ｇ−Ｍ、　（１９８７）Ｄｅｖｅｒｅｕｘ、　Ｊ 、、　Ｈａｅｂｅｒｌｉ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈｉｅｓ、　Ｏ，（１９８ ４）　Ａｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　ｓｅｔ　ｏｆ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎ ａｌｙｓｉｓ　ｐｒｏｇｒａｍｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ＶＡＬＮｕｄ、　Ａｃ１ｄ ｓ、　Ｒｅｓ、１２：３８７−３９５゜Ｄｉｔｔａ、　Ｇ、、　５ｔａｎｆｉｅ ｌｄ、　Ｓｌ、　Ｃｏｒｂｉｎ、　Ｄ、、　ａｎｄ　Ｈｅ１ｉｎｓｋｉ、　ＤＪ Ｌ　（１９８０）　aｒｏａｄ ｈｏｓｔ　ｒａｎｇｅ　ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｇｒ ａｍ−Ｎｅｇｇ市ｖｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ：ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　 ａ　ｇｅｎｅ　ｂａｎ＆ｃ　ｏｒ　Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｔｌｉｌｏｔｉ、　 Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌん】■ Ｓｃｉ　ＵＳＡ　７７、７３４７−７３５１゜Ｄｕｎｃａｎ、　Ｌ　Ｅｄｗａｒ ｄｓ、　Ｒ，Ｍ、、　Ｃｏｇｇｉｎｓ、　Ｊ、Ｒ，（１９８７）　Ｔｈｅひｕｎ ｎ、　Ｊ、Ｊ、　ａｎｄ　５ｔｕｄｉｅｒ、　Ｆ、Ｗ、、　（１９＆３）　Ｊ、 　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１６６：４７７−５３５゜Ｆｉｔｚｇｉｂｂｏｎ、　 Ｊ、　Ｅ、　（１９８８）　Ｐｓｅｕｄｏｒｒｗｎａｓ　ｓｐ、　５ｔｒａｉｎ 　ＰＧ２９８２：　ｕｐｔａｋｅ@ｏｒ Ｕｎｉｖｅｒｇｉｔｙ。 Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，Ｔ、、　Ｒｏｇｅｒｔｓ、　Ｓ、Ｇ、、　Ｈｏｒｓｃｈ、 　ＬＢ、、　５ａｎｄｅｒｓ、　Ｐ、ｌ’Ｌ　Ｆｌｉｃｋ、@Ｊ、Ｓ、。 Ａｄａｍｓ、　Ｓ、Ｐ、、　Ｂｉｔｔｎｅｒ、　Ｍ、Ｌ、、　Ｂｒａｎｄ、　Ｌ 人、　Ｆｉｎｋ、　Ｃ，Ｌ、、　Ｆｒｙ、　Ｊ、Ｓ、。 Ｇａ１ｌｕｐｐｉ、　Ｇ、Ｒ，、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ、　Ｓ、Ｂ、、　Ｈｏｆｆｍ ａｎ、　Ｎ、Ｌ、、　ａｎｄ　Ｗｏｏ、　Ｓ、Ｃ。 １９８３、　Ｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｇｅｎｅｓ　ｉ ｎ　ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。 Ａｃａｄ、　Ｓｅｉ、　ＵＳＡ　８０：４８Ｑ３−４８０７゜Ｆｒａｌｅｙ、　 Ｒ，Ｔ、、　Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ、　Ｇ、、　Ｈｏｒｇｃｈ、　ＰＬＢ、、　Ｅ ｉｃｈｈｏｌｔｚ　Ｄ、　Ａ、、　Ｆｌｉモ求B Ｊ、　Ｓ、、　Ｆｉｎｋ、　Ｃ，Ｌ、、　Ｈｏｆｆｍａｎｎ、　Ｎ、　Ｌ、　ａ ｎｄ　５ａｎｄｅｒｓ、　Ｐ、　Ｒ，（１９８５）　ＴｈｅＳＥＶ　ｓｙｓｔｅ ｍ：　ａ　ｎｅｗ　ｄｉｓａｒｍｅｄ　Ｔｉ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ　 ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｐｌａｎｔｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ。 Ｆｒｏｍｍ、　Ｍ、、　（１９９０）　ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ　ｆｏｒＣｒｏｐ　Ｉｍｐｒｏｖｅ ｍｅｎｔ、　Ａｐｒｉｌ　１６−２２．１９９０．　Ｋｅｙｓｔｏｎｅ、　Ｃｏ 。 Ｇａ５５ｅｒ、　Ｃ，Ｓ、、　Ｗｉｎｔｅｒ、　Ｊ、　Ａ、、　Ｈｉｒｏｒｕａ ｋａ、　Ｃ，Ｍ、　ａｎｄ　５ｈａｈ、　Ｄ、　Ｍ。 （１９８８）　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ、　ａｎｄ　ｅｖ ｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ５−ｅｎｏｌｐ）＋ｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａＬ ｅ　３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ　ｇｅｎｅｓ　ｏｆ　ｐｅｔｕ ｎｉａａｎｄ　ｔｏｍａｔｏ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：　４ ２８０−４２８９゜Ｇｏｗｄａ、　Ｓ、、　Ｗｕ、　Ｆ、Ｃ，、ａｎｄ　５ｈｅ ｐａｒｄ、　ＲＪ、　（１９８９）、　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆＨ ａｌｌａｓ、　Ｌ、　Ｅ、、　Ｈａｈｎ、　Ｅ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｋｏｒｎｄｏ ｒｆｅｒ、　Ｃ，（１９８８）Ｈａｙｆｏｒｄ、　Ｍ、　Ｂ、、　Ｍｅｄｆｏｒ ｄ、　Ｊ、　１．、　Ｈｏｆｆｍａｎｎ、　Ｎ、　Ｌ、、　Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ 、　Ｇ、　≠獅■ Ｋｌｅｅ、　Ｈ，Ｊ、　（１９８８）　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ａ　ｐ ｌａｎｔ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　５ｅｌｅｃｔｉ盾■ Ｈｅｒｒｅｎｉ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ、　Ｌ、、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８３）　 社−ユ３０３：２０９　Ｈｏｒｓｃｈ、　Ｒ，Ｂ、　ａｎｄＨ，ＫＩ舵、　（１ ９８６）　’　８３：４４２＆−３２゜Ｈｅｉｔｋａｍｐ、　Ｍ、　Ａ、、　Ｈ ａｌｌａｓ、　Ｌ　ａｎｄ　Ａｄａｍｓ、　Ｗ、　Ｊ、　（１９９０）　Ｂｉｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｒ　１ｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ｗａｓｔｅｗａｔｅｒ　ｗｉ ｔｈ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　−Ｐｒｅｓｅ ｎｔｅｄ　ｉｎ　５ｅｓｓｉｏｎ　１１．Ｐａｐｅｒ　３４０．５ｏｃｉｅｔｙ 　ｆｏｒ　ＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ａｎｎｕａｌ　Ｍ ｅｅｔｉｎｇ、　０ｒｌａｎｄｏ、　Ｆｌｏｒｉｄａ、　Ｊｕｌｙ　２９−Ａｕ ｇｕｓｔ　３K １９９０゜ Ｈａｈｎ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｃｏ１１ｉｎｓ　Ｊ、　（１９８０）　Ａ　ｓｍａ ｌｌ　ｃｏｓｍｉｄ　ｆｏｒ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｄｏｎ奄獅■ ｏｆｌａｒｇｅ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ、　Ｇｅｎｅ　１１：　２９１− ２９８゜Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　Ｍ、　Ｗ、、　Ｈｅｗｉｅｋ、　Ｒ，Ｍ、 、　Ｄｒｅｙｅｒ、　１’Ｌ　Ｊ、、　ａｎｄ　Ｈｏｏｄ、　Ｌ。 （１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｘｙｍｏｌ、　９１．３９９−４１３゜Ｊ ｅｆｆｅｒｓｏｎ、　Ｒ人、　Ｋａｖａｎａｕｇｈ、　Ｔ人ａｎｄ　Ｂｅｖａｎ 、　Ｍ、Ｗ、、シロ已ＬＫａｙ、ＰＬ、Ｃｈａｎ、Ｌ、Ｄａｌｙ、Ｍ、ａｎｄ　 ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ、Ｊ、　１９８７．　Ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆ　ｔｈｅ 　ＣａＭＶ　３５Ｓ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　町ｕａｎｃｅ　ｃｒｅａｔｅｓ　ａ　 ｓｔｒａｒｓｇ　ｅｎｈａｎｃｅｒ　ｆｏｒｐｌｓｎｂｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　 ２３６．１２９９−１３０２゜Ｋ１５ｈｏｒｅ、　Ｇ、、　５ｈａｈ、　Ｄ、、 　Ｐａｄｇｅｔｔｅ、　Ｓ、、　ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ、　Ｇ、、　Ｇａ５ ５ｚｒ、　b，。 Ｒｅ、　Ｄ、、　Ｈｉｒｏｎａｋａ、　Ｃ，、Ｔａｙｌｏｒ、　Ｍ、、　Ｗｉｂ ｂｅｎｍｅｙｅｒ、　Ｊ、、　Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ、　Ｄ、B Ｈａｙｆｏｒｄ、　Ｍ、、　Ｈｏｆｆｍａｎ、　Ｎ、、　Ｄｅｌａｎｎａｙ、　 Ｘ、、　Ｈｏｒｓｃｈ、　Ｒ，、Ｋｌｅｅ、　Ｈ，。 Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ、、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｄ、、　Ｂｒｕｎｄａｇｅ、 　Ｌ、、　ｇａｎｄｅｒｓ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｆｒ１ｌｅｙB Ｅｄｓ、　Ｈｅｄｌｉｎ　Ｐ−Ａ、、　Ｍｅｎｎ、　Ｊ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｈｏ ｌｌｉｎｇｓｗｏｒｔｈ、　Ｒ，Ｍ、　ｐｐ、　３７−４８K Ｋ１５ｈｏｒｅ、　Ｇ、　ａｎｄ　５ｈａｈ、　Ｄ−（１９８８）　Ａｎｎ、　 Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５７：６２７−６６３゜Ｋ１５ｈｏｒｅ、　Ｇ、 　Ｍ、　Ｂｒｕｎｄａｇｅ、　Ｌ、、　Ｋｏｌｋ、　Ｌ　Ｐａｄｇｅｔｔａ、　 Ｓ、　Ｒ，、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ。 Ｄ−、Ｈｕｙｎｈ、　Ｑ、　Ｋ　ａｎｄ　ｄｅｌｌａ−Ｃｉｏｐｐａ、　Ｇ、　 （１９８６）　Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　４５：　１５０６゜Ｋｌｅｅ、　ＨＪ、 、　ｅｔ　ａＬ　（１９８５）　圧ｌ−出国垣α３：６３７−４２゜Ｋｌｅｅ、 　Ｈ，Ｊ、、　Ｍｕｓｋｏｐｆ、　Ｙ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｇａ５５ｅｒ、　Ｃ， Ｓ、　（１９８７）　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ａ■ Ｋｌｅｉｎ、　Ｔ、Ｍ、、　Ｋｏｒｎｓｔｅｉｎ、　Ｌ、、　５ａｎｆｏｒｄ、 　Ｊ、Ｃ，、ａｎｄ　Ｆｒｏｍｍ、　Ｍ、Ｅ、　１９８９゜Ｋｏｎｅｚ、　Ｃ， ａｎｄ　５ｃｈｅｌｌ、　Ｊ、　（１９８６）　Ｔｈｅ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｏ ｆ　ＴＬ−ＤＮＡ　ｇｅｎｅ　５ｃｏｎｔｒｏｌｓ　ｔｈｅ　ｔｉｓｓｕｅ−ｓ ｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｇｅｎｅｓ 　ｃａｒｒｉ■п@ｂｙ ａ　ｎｏｖｅｌ　ｔｙｐｅ　ｏｒＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｉｎａｒｙ　 ｖｅｃｔｏｒ、　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ。 ２０４：３＆３−３９６゜ Ｋｕｎｋｅｌ、Ｔ、　Ａ、、　Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｊ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ｚａｋ ｏｕｒ、　Ｒ，Ａ、　（１９８７）　Ｒａｐｉｄ　ａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　 ５ｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｐｈ ｅｎｏｔｙｐｉｃ　５ｅｌｅｃｔｉｏ氏B Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５４：３６７゜Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｕ、 に、、　℃ｌｅａｖａｇｅ　ｏｒ　５ｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　 ｄｕｒｉｎｇ　ｔｈｅａｓｓｅｍｂｌｙ　ｏｒｔｈｅ　ｈｅａｄ　ｏｆ　ｔｈｅ 　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ４”　凡曲３．２２７：６８０（１９７０） 。 Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｅｈ、　Ｅ、　Ｆ、　ａｎｄ　Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ、　Ｊ、　（１９８２）　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ 　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｒｔｈｅ　ａｒｏＡ　ｇｅｎｅ　ｏｒＢｏｒｄｅｔｅｌ ｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、　Ｊ。 Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ、　１７０：２４６７−２４７１゜Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｊ、　 Ｈ，（１９７２）、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇ ｅｎｅｔｉｃｓ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ。 Ｐｗｌｏｏｒｅ、　Ｊ、　Ｋ、、　Ｂｒａｙｍｅｒ、　Ｈ，Ｄ、　ａｎｄ　Ｌａ ｒｓｏｎ、　Ａ、　Ｄ、　（１９８３）　ｌ５ｏｌａｔｉｏ氏@ｏｒ ａ　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ、　ｗｈｉｃｈ　ｕｔｉｌｉｚｅｓ　ｔｈｅ 　ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ　ｈｅｒｂｉｃｉｄｅｇｌｙｐｈｏｓｉｔｅ、　Ａｐ ｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　４６：　３１６−３２０゜ Ｍｏｒｅｌｌｉ、　Ｇ、、　Ｎａｇｙ、　Ｆ、、　Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，Ｔ、、 　Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ、Ｇ、、　ａｎｄ　Ｃｈｕａ、　Ｎ、@Ｈ。 （１９８５）、　Ａ　ａｈｏｒｔ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｉ ｓ　１ｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅｌｉｇｈｔ−ｉｎｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ　 ｏｒ　ａ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｒｉｂｕｌｏ８ｅ１．５−ｂｉｓｐｈ ｏｓｐｈａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ　ａｍａｌｌ　５ｕｂｕｎｉｔｏｆｐａ ａ、Ｎａｔｕｒｅ３１５，２００−２０４゜０ｄｅｌｌ、　Ｊ、Ｔ、、　Ｎａｇ ｙ、　Ｆ、、　ａｎｄ　Ｃｈｕａ、　Ｎ、Ｈ，（１９８５）、　Ｉｄｅｎｔｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ　ｏｒ　cＮＡ ５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔ ｈｅ　ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ　ｍｏｓａｉｃ　ｖｉｒｕｓ@３５Ｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒ、　Ｎａｔｕｒｅ　３１３．８１０−８１２゜０１ｉｎｓ、　 Ｐ、　０．、　Ｄｅｖｉｎｅ、　Ｃ，Ｓ、、　Ｒａｎｇｗａｌａ、　Ｓ、　Ｈ， ａｎｄ　Ｋａｖｋａ、　Ｋ　Ｓ、　（１９８W） Ｇｅｎｅ　７３：　２２７−２３５゜ Ｐａｄｇｅｔｔｅ、　Ｓ、　Ｌ、　Ｈｕｙｎｈ、　Ｑ、　Ｋ−、Ｂｏｒｇｍｅｙ ｅｒ、　Ｊ、、　５ｈａｈ、　Ｄ、　Ｍ、、　Ｂｒａｎｄ。 Ｌ、　Ａ、、　Ｒｅ、　Ｄ、　Ｂ、、　Ｂ１５ｈｏｐ、　Ｅ、　Ｆ、、　Ｒｏｇ ｅｒｓ、　Ｓ、　Ｇ、、　Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，Ｔ、、　ａ獅■ Ｋｉｓｈｏｒｅ、　Ｇ、　（１９８７）　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎ　ａｎｄ　１ｓｏｌａｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｐｅｔｕｒｔ奄■ ｈｙｂｒｉｄａ　５−ｅｒＬＤ７−ｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａＬｅ−３−ｐ ｈｏｓｐｈａｔｅ　５ｙｎｔｈａｓｅ、　Ａｒｃｈ。 Ｂｉｏｅｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２５８．５６４−５７３゜Ｐａｄｇｅｔ ｔｅ、　Ｓ、　Ｉｔ、　Ｈｕｙｎｈ、　Ｑ、　Ｋ、、　Ａｙｋｅｎｔ、　Ｓ、、 　Ｓａｍｍｏｎｓ、　Ｒ，Ｄ、。 ５ｉｋｏｒｓｋｉ、　Ｊ、　Ａ、、　ａｎｄ　Ｋ１５ｈａｒｅ、　Ｇ、　Ｍ、　 （１９８８）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３゜１７８１８０２゜ Ｑｕｉｎｎ、　Ｊ、　Ｐ−、Ｐｅｄｅｎ、　Ｊ、　Ｍ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｄｉｃ ｋ、　Ｅ、　（１９８８）　Ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ａｎｄ 　ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｂｙ　Ｌｈｅ　ｍ１ｃｒｏｆｌｏｒａ　ｏｒ　５ｏ ｉｌｓ　ｔｒｅａｔｅｄ　ｗｉ狽■@ｔｈｅ ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ ｏｌ、　２９＋　５１１−５１６゜Ｒａｏ、　Ｒ，Ｎ、　ａｎｄ　Ｒｏｇｅｒｓ 、Ｓ、Ｇ、　１９７９．　Ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＫＣ７：　Ａ　ｖｅｃｔｏｒｃｏ ｎｔａｉｎｉｎｇ　ｔｅｎ　ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｅｎｄｏｎｕｄｅａｓｅ 　５ｉｔｅｓ　５ｕｉｔａｂｌｅ　ｆｏｒ　ｃｌｏｎｉ獅■ ＤＮＡ　ｓｅｇｍｅｎｔｓ、　Ｇｅｎｅ　７：７９゜Ｒｏｇｅｒｍ、　Ｓ、Ｇ、 、　Ｂｒａｎｄ、　Ｌ、Ａ、　Ｈｏ１ｄｅｒ、　Ｓ、Ｂ、　Ｓｈｔｕｐｍ、　Ｅ 、Ｓ、　ａｎｄ　ＢｒａｃｋｉｎB Ｍ、Ｊ、　（１９８３）　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｒ　ｔｈｅ　ａｒａ Ａ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｅ、　ｃｏｌｉ　ｒｅｓｕｌｔｓ@１ｎ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ　ｇｌｙｐｈｏｓａｔ ａ、　Ａｐｐｌ、　Ｅｎｖｉｒｏｎ、　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌB ４６：３７−４３゜ Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈｓｉｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９８９）。 ５ｃｈｕｌｅｒ、　Ｍ、　Ａ、、　Ｓｃｈｍｉｔｔ、　Ｅ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｂ ｅａｃｈｙ、　Ｒ，Ｎ、　（１９８２）　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、 　１０：８２２５−８２４４゜５ｃｈｕｌｚ、　Ａ、、　Ｋｒｕｐｅｒ、　Ａ、 　ａｎｄ　Ａｍｒｈｅｉｎ、　Ｎ、　（１９８５）　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｒ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　５−ｅｎｏｌｐｙｒｕｖ ｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅｇｙｎｔｈａｓｅｓ　ｔｏ　 ｔｈｅ　ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ　ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ、　ＦＥＭＳ　Ｍｉｅｒｏ ｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔ、　２８F ２９７−３０１゜ ５ｃｈｕｌｚ、　Ａ、、　５ｏｓｔ、　Ｄ、　ａｎｄ　／ｕｎｒｈｅｉｎ、　Ｄ 、　（１９８４）　Ａｒｃｈ、　Ｍｉｅｒｏｌ）ｉｏｌ、　P３７： １２１−ル３゜ ５ｈａｈ、　Ｄ、、　Ｈｏｒｓｃｈ、　Ｒ，、Ｋｌｅｅ、　Ｈ−、Ｋ１５ｈｏｒ ｅ、　Ｇ、、　Ｗｉｎｔｅｒ、　Ｊ、、　Ｔｕｍｅｒ。 Ｎ、、　Ｈｉｒｏｎａｋａ、　Ｃ，、５ａｎｄｅｒｓ、　Ｐ、、　Ｇａ５５ｅｒ 、　Ｃ，、Ａｙｋｅｎｔ、　Ｓ、、　Ｓｉｅｇａｌ、　Ｎ、B Ｒｏｇｅｒｓ、　Ｓ、、　ａｎｄ　Ｆｒａｌｅｙ、　Ｒ，（１９８６）、　Ｅｎ ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｈｅｒｂｉｃｉｄｅ　ｔｏｌｅｒａｎモ■ ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｅ　ｐｌａｎｔｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３．４７ ８−４８１゜Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ、　（１９８９）　よさ １」コ」Ｌ工１」：ｆ；３３８二２７４−２７６゜５ｏｓｔ、　Ｄ、、　５ｃｈ ｕｌｚ、　Ａ、　ａｎｄ　Ａｍｒｈｅｉｎ、　Ｎ、　（２９８４）　ＦＥＢＳ　 ＬｅｔＬ　１７３：２３８−２４１゜ ”　５ｏｓｔ、　Ｄ、　ａｎｄ　Ａｍｒｈｅｉｎ、　Ｎ、　（１９９０）　５ｕ ｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ　ｏｆＧｌｙ−９６ｔｏにａ　ｉｎ　狽■■ ５ｔａｌｋａｒ、　Ｄ、Ｍ、、　Ｔｂｏｒｒｕ＊ｓ、　Ｃ，Ｍ、、　ａｎｄ　Ｈ ｅ１ｉｎｓｋｉ、　Ｄ、Ｌ　（１９８１）。 Ｎｕｄｅｏｔｉｄａ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　 ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏuｔｈｅ ｂｒｏａｄ　ｈｏｓｔ　ｒａｎｇｅ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＲＫ２．　Ｍｏｌ　Ｇａ ｎ　Ｇｅｎｅｔ、１８１：　８−１２゜５ｔａｌｋｅｒ、　Ｄ、　Ｍ、、　Ｈｉ ａｔｔ、　Ｗ、　ＦＬ　ａｎｄ　Ｃｏｍａｉ、　Ｌ、　（１９８５）　Ａ　ｓｉ ｎｇｌｅ　ａｍｉｎB Ｔａｂｏｒ、　Ｓ、　ａｎｄ　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　Ｃ，Ｃ，（１９８５） 　Ａ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　Ｔ７　ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓａ／ｐｒ ｏｍｏｔｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｅｘｃｌｕｓｉ ｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　盾■ ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｇｅｎｅｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅ ｉ、　ＵＳＡ　８２二１０７４−１０７８゜Ｔａ１ｈｏｔ、　Ｈ，Ｗ、、　Ｊｏ ｈｎｓｏｎ、　Ｌ、　Ｍ、　ａｎｄ　Ｍｕｎｎｅｃｋｅ、　Ｄ、　Ｍ、　（１９ ８４）２５５−２６０゜ Ｔａｌｍａｄｇｅ、　Ｌ　ａｎｄ　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、、　−Ｃｏｎｓｔｒ ｕｄｉｏｎ　ｏｒ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒｓｗｉｔｈ　ｕｎｉｑｕｅ　 Ｐｓｔｌ　ｄｏｎｉｎｇ　５ｉｔｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｉｇｎａｌ　５ｅｑｕ ｅｎｃｅ　ｃｏ市ｎｇｒｅｇｉｏｎ″Ｑｒｘ＝、　（１２）　２３５−２４１　 （１９８０）−Ｖａｓｉｌ、　Ｖ、、　Ｆ、　Ｒｅｄｗａｙ　ａｎｄ　Ｌ　Ｖａ ｓｉｌ、、’　８：４２９−４３４　（１９９０）。 Ｖａｌｔａｎ、　Ｊ、、　Ｖｅｌｔｅｎ、　ＩＬ、　Ｈａｉｎ、　Ｒ，ａｎｄ　 ５ｅｈｅｌｌ、　Ｊ、　（１９８４）　ＥＭＢＯＪ。 ３：２７２３−２７３０゜ Ｖｉｅｒａ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　１９８７．　Ｐｒｏｄ ｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｉｎｇｌｅ−ｓｔｎｕｎｄｅｄｐｌＵｍｉｄ　ＤＮＡ、 　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍ、　１５３：３−１１゜％Ｖｉｂｂｅｎｍｅｙｅ ｒ、　Ｊ、、　Ｂｒｕｎｄａｇｅ、　Ｌ、　Ｐａｄｇｅｔｔｅ、　Ｓ、　Ｒ，、 Ｌａｏｓ、　Ｊ、　Ｊ、、　ａｎｄ脂ｈｏｒｅ、　Ｇ、　Ｍ、　（１９８８）　 Ｂｉｏｅｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍ、　１５３．７６０ −７６６゜Ｗｏｎｇ、　Ｅ、　Ｙ、、　Ｓｅｅｔｈａｒａｍ、　Ｒ，、Ｋｏｔｔ ｓ、　Ｃ，Ｅ、、　Ｈｅｅｔｅｎ、　Ｒ，Ａ、、　Ｋｌｅｉｎ、　Ｂ。 Ｌ　Ｂｒａｆｏｒｄ、　Ｓ、　Ｒ，、Ｍａｔｈｉｓ、　Ｋ、　Ｊ、、　Ｂ１１Ｉ ｈｏｐ、　Ｂ、　Ｆ、、　Ｓｉｅｇｅｌ、　Ｎ、　Ｒ，。 ａｍｊｔｈ、　Ｃ，Ｅ、　ａｎｄ　Ｔａｃｏｎ、　Ｗ、　Ｃ１７１９８８）　Ｅ ｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｃｒｅｔｅｄｉｎｓｕｌｉｎ−１ｉｋｅ　ｇｒｏ ｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ−１ｉｎ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ、　Ｇｅｎ ｅ　６８：　１９３−２O３゜ 配列表 （１１一般的情報 （ｉ）　出願人：バリー、ゲラルド　Ｆ。 キショア　ガネシュ　Ｍ。 バジェット　ステフェン　Ｒ９ （１、発明の名称：グリホセート耐性 ５−エノールビルビルシキミ酸−３−ホスフェートシンターゼ （ｉｉｉ）　配列の数：３６ （ｉｖ）　通信の住所： （Ａ）　受信人コモンサンドカンパニーＢ８４ＦデニスＲ，ヘーナージュニア （Ｂ）通り：チェスターフィールドビレッジバークウエイ７００ （Ｃ）都市：セントルイス （Ｄ）州：ミズーリ （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：６３１９８ （Ｖ）　コンピュータ判読可能な形態 （Ａ）媒体の盟：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＭ　ＰＣコンパチブル（Ｃ）作動システム：　ＰＣ −ＤＯＳ／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウェア：パテントインリリース＃１．０゜ バージョン１１．２５ （ｖｉ）　最近の出願データ （Ａ）出願番号：米国第０７１５７６５３７号（Ｂ）出願臼：　１９９０年８月 ３１日（Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）　アト−ニー／エージェント情報（Ａ）氏名：へ−ナージュニア、 デニスＲ１（Ｂ）登録番号：３０．９１４ （Ｃ）照会／認可番号：　３８−２１（１０５３５）（ｉｘ）　電話通信情報 （Ａ）電話＝（３目）５３７−６０９９（Ｂ）ファックス：　（３１４）５３７ −６０４７（２＋　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：　１に関する情報：（ｉ）　配列の特徴 ： （Ａ）長さ：５９７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）　Ｈの数二二本鎖 （Ｄ）トボロジーコ直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：ｌ：（２１ＳＥＱ　［ＯＮＯ：２に関する情報＝（ｉ）　配列の特 徴： （Ａ）長さ：　１９８２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　特徴： （Ａ）　ＮＡＭＥ　：　ＫＥＹ　：　ＣＤ５（Ｂ）存在位置：　６２．、Ｉ４２ ６ （ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：２：ｃｃτｅｃｃｔｃｅｃ　ｃｃ ｃｃｃｅｃｅｔｃ　ｃ丁ｃａＡｃｃｃｃｃ　ａｔ；ｃｃｃｐｔ；ｃｒτ　πｃｃ ｃｃｃｃσ丁　Ｃ＾ＣｅＣＣＧ■■`　１？ｓ＆ ｅｋ　’！ＱＡｃｃＯ：Ａ？　ＡＴｅｌ）ＧＣ＾ＣＯＯテＯａテＣテ（５０１！ ＴＱＣＯＣＣＯＣ％ｊｌＡＯＣ’ｒｅＴ　１１１１６（２）　ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎ Ｏ：３に関する情報（ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ＝４５５アミノ酸 （Ｂ）型二アミノ酸 （Ｃ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類二タンパク質 （ｘｉ）配列の記述：　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：３ＧｌｙＬ＃ｌ１ｊａｒＯ１ｙＴ ｈｒＶａＬ＾ｘｑＸＬｅＰｒｏＯＬｙ＾−ｐＬｙｓＳ嗜ｒ！ｉｓ細ｒＨ１ｍ２０ 　２６　ｆｆ。 ０１７　Ａｓｎ　島ｌａ　Ａｔ−丁ｈｒ　６１ｙ　ｅｙ−人ｒｇ　Ｌａ＋ａ　Ｔ ｈｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　ｖａｔ　Ｏｌｙ　Ｖａｎｌｏｏ　１０％　１１ ０ Ｖａｌ　ＸＬｍ　ＱＬｕ　１ｌｒｏ　！ｌ＠　Ｍａｔ　Ｔｔ％ｒ　Ａｒｇ　ｊｌ ａｐ諺Ｌ＠　しｈｅ　Ｏｌｕ　Ｌｙｅ　１４ｅｔレーＣ１，１９％　２００　２ ０％ Ｃ１ｙ　Ｐｈａ　Ｏｌｙ　Ａｌａ　＾−ｎ　Ｌ＃ＩＩ　Ｔｈｅ　Ｖａｌ　Ｇｌ＋ ａ　Ｔｈｘ　ｊｕｐ　Ａｌａ　＾ｍｙ　ｄｌｙ　ｖａｌ　ＭX ｘｘｏ　ｘｌｓ　２ａ。 丁ｈｒ！ｉｓｋｅｇＬａｕＧ五ｕＣ１ｙＭｅＧｌｙＬｙｓＬ虐Ｕテｈｒ（ｌｌｙ ａｌｒ＋ＶａｌＸＬｅ＾−２２２％　２３０　２３５　２４０ Ｖａｔ　Ｐｒｏ　Ｑｌｙ　＾−ｐ　Ｐｒｏ　軸ｒ　ｊａｒ　Ｔｈｅ　Ａｌａ　Ｐ ｈ＠　Ｐｒｅ　Ｌｋｕ　Ｖａｌ　ＡＸ−Ａｌａ　Ｌｅｕ２４５　２＄０　２６５ ＾ｒｇＶａｌ入ｒｇｓｅｒｓａｔ丁ｈｒｕｕＬＦ＠ＣＬｙＶａｌＴｈｒＶａｔＰ ｒｏＯＩＩＪＡＩＩＰ＾ｒ９３０Ｓｊ！ＯＪ！ｊｆｆ２０ （２１ＳＥＱ　［ＯＮＯ：４に関する情報：（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）長さ：１６７３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｊｘ）　特徴： （Ａ）　ＮＡＭＥ　：にＥＹ：ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：８６．　、１４３２ （ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：（２１ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：５に関する情報：（Ｂ）型二アミノ酸 （ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　５　：ＣＩＬｙ　＾−ｒｓ　 Ａｌａ　Ｃ１ｙ　Ｔｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　＾ｒｇＬａｕ　Ｔｈｔ　Ｈ・ｔ　Ｇ ｌｙ　Ｌａ＋ａ　ＶａＬ　Ｇｌｙ　丁■■ Ｗｏｏ　１０％　１１０ 菖Ｌｌｌ　＾ｘｇ　！ｌ＊　Ｊｋｌａ　にａｔ　ｍｔ　ｐｍ　Ｌ＊ｕ　Ｖａｌ　 Ｎｅｔ　ａ↓Ｙ　−＾１蟲　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｅ４０！　４１０　４！１ （２１ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：６に関する情報：（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）長さ：　１５００塩基対 （Ｂ）覆：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ＋７に関する情報：（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝４４９アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：タンパク質 （ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：　７　：（ｌｌｙＬａｕＬｅｕ Ｏｌｕ（ＩｌｙＯＬｕＭＰ、ｖａｌＸ１ｍＡｓｒ＋？ｈｒＧｌｙＡｒｇ＾ｌａｇ ｓヒｄｌｒｓＳ０　５５　６０ Ａｌａ　Ｈｅｔ　Ｏｌｙ　ＡＬａ　ＬＹ＠　！ｌ＠　＾ｒｇ　ＬｙＩＩ　６１ｕ 　Ｏｌｙ　ＡＱＩ　ＶＩＩＬ　Ｔｒｐ　Ｋｌ・　１１−　＾Pｎ ａｓ　７０　ｔｓ　ｓ。 ０１ｙ　ＶａｌＯ１ｙ　ｋｅｎ　Ｃ１ｙ　ｃｙｍ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｐ ｒｏ　６１ｕ＾１１＾１ル−＾−ｐ　Ｐｈ＊Ｉｓ　９０　Ｉ！ ６１ｙ　Ａｓｎ　入Ｌａ　ｌ：ｌｙ　Ｔｈｅ　Ｇｌｙ　ＡＬａ　λｒｇ　Ｌａ＋ ａ　Ｔｈｅ　Ｍａｔ　＋ｆｌｙ　Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　嘯■■ １００　１０％　１１０ Ｔｙｒ　Ａｍｐ　Ｍｅｔ　Ｌｙ−丁ｈｒ　ｊａｒ　ＰｈＩＩ　！ｉｓ　Ｏｌｙ　 ＡｊＰ　Ａ１１ｌ　Ｍｙ　Ｌｍ　ｊａｒ　ＬＹＩＩ　＾ｒ９Ｌｙｓ　Ｓｅｔ　Ａ ｌａ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｌ＃ｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｔｈｘ　Ｐ ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　テｈｒ　丁ｈｒ１ａＯ１ｌ１５１９０ ＬｙｅＧＬｕ寥・ｔＡＩＩＰ＾ｔｇｔｘａ鳥１ａ＾１ａＶａｌ＾１ａ＾ｔ＠１ｌ ｌｙＬａｕ＠１ｕＡｌａ＾１１３Ｓ％　３６０　３６％ （２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８に関する情報：（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：４２３アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　ｊｌｉの数ニー木調 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （２）分子の種類：タンパク質 （ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　［ＤＮＯ：　８　：−Ｋｌ　ｔｈｘ　Ｇｌｙ 　（ｌｕ　Ｐｒｏ　Ｊｌｒｇ　Ｎｅｔ　Ｌｙｓ　Ｃ１ｕ　ｋｅｇ　ＩＰｒｏ　Ｘ Ｌ拳Ｇｌｙ　ｌ１ｌ−一−Ｖａｌ！１％　１２０　１２％ ＡｍｐＡｌａＬａｕｋｅｇＬ會すＧｌｙＯ１ｙＡｌａＬｙｅ！Ｌ・τｈｒ丁ｙｒ ＬｅｕＣ１ｕＧｉｎＧＬｕ１３０１１％１４０ ＾−ｐ　Ｖａｔ　Ｊｎｐ　Ｏｌｙ　Ｓａｔ　Ｖａｔ　ｌ＠ｒ　＄＠ｒ　ｄｉｎ　 ｔｈｘ　Ｌａｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌｅ＋ａ　Ｌｓｕ　ｍｔヱ６５１）Ｏエフ５ Ｇｉｎ　Ｌａｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　ＸＬ＊シＩｔ　ＧＬｎ２Ｇ （２＋　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：９に関する情報：（１）　配列の特Ｗｋ： （Ａ）　長さ：　１３７７塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：　９　：τＣ１：ＴＣＣＣ？ＣＣ；　ｆｆ１ｃ　＋Ｊ？ＡＡＣＣ１ ｍ：　ＴＣｍＴＡＡＣＣＣＴＴｃＴＧＧＡＧｃ＾　ＣＣＴｌ１ＣＣ１：？Ａ　１ ２O０ Ｃ１：ＣＡＣｍ＾　丁Ｃ＾ＣＣＧ丁＾丁ＣＧＣ丁ＡＭ＾ＧＣＴ　ＴＣＣＴＯりＴ τＡτ　ｃｃＣテＣテｃａｒｔ　丁ＣテＣ入入＾＾ＣＣＩ２■p （２１ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　ｌ　Ｏに関する情報：（ｉ）　配列の特徴・ （Ａ）　長さ＝３１８塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）　特徴 （Ａ）　ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤ５ （Ｂ）　存在位置：８７、．３１７ （ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ　Ｏ：（２１ＳＥＱ　ＩＤ　 Ｎｏ：　ｌ　１に関する情報＝（り　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝７７アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：タンパク質 （ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：１１　：（２＋　ＳＥＱ　［Ｏ ＮＯ：　１２に関する情報：（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝４０２塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）　特徴： （Ａ）　ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤ５ ＣＢ）　存在位置：８７．．４０１ （ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：ｌ　２　：＾ＣＡＴｃｒＡ？Ｃ １２Ａ丁＾＾ＣＣτＴＣＡ　ｔｃｔａｕｒｒｃｃｘ　Ｗ＾八へ＾丁Ｃ＾＾　＾＾ τττ丁Ｃ＾＾テ　ＣＣＣＣＡτ丁ＣＭ@Ｇ。 ｆ２）　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：　１３に関する情報：（１）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝１０５アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （西）分子の種類：タンノくり質 （ｘｌ）配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：ｌ　３　：Ｍｌｌｔ＾ＬａＧＬｎＶ ａＬ！ｓｒＡｒｇＨａＣｙｓ＾ａｎＣ１ｙＶａｔＧｉｎ＾−ｎＰｒｏｊａｒＬｅ ｕｓ　ｌｏ　ｘｓ （２１ＳＥＱ　［Ｄ　Ｎｏ：　１４に関する情報：（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝２３３塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　特徴 （Ａ）　ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤ５ （Ｂ）　存在位置＋１４．　、２３２ （ｘｉ）　配列の記述：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１４　：τｅｃ　τＴτ　＾ＱＣ Ａ’ｒ’Ｔ　ＴＣＡ　ｃｃＡＴｃＡ　ＣテａｃＣｉ　入ＣＡ　ＣＣＣ丁ｗｅ　＾ ’ｌ’Ｔ：（：　２コ３ｊ＠ｒ　Ｆｈｓ＾ｒｇ　ｌ＠！＠ｒ＾ｌａ　Ｓ＠ｔ　Ｖ ａｌ＾Ｌａ　Ｔｈｅ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｍｔ６Ｓ　７０ （２１ＳＥＱ　［ＯＮＯ：　ｌ　５に関する情報：（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝７３アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：タンパク質 （ｘｉ）　配列の記述：ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：ｌ　５　：（２）　ＳＥＱ　１０ 　Ｎｏ：　１６に関する情報。 （ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：３５２塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｘ）　特徴： （Ａ）　ＮＡＭＥ／ＫＥＹ：ＣＤ５ （Ｂ）　存在位置：４９．．３５１ （ｘｌ）配列の記述：ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：ｌ　６　：＾Ｃ＾　＾丁τ　Ｃコ５ ２ ＋２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　ｌ　７に関する情報：（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：　ｔｏｔアミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の種類：タンパク質 （ｘｉ）　配列の記述：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７　：絢にＡｌａ　＠ｉｎ　Ｋ ｌｅ＾−Ｒａｎａ　＃ｉｆｔ　＾１ｍ　ｌ！ｌａ　６１ｙ　Ｘｉ・クエｎＴｈｔ しＮ＾・ｎ１Ｐｒ・ｔｏ　ｚｓ ＾−ＲｓｓｒＡ＊ｎ？１１１８Ｌ７＠ＰｅｔｓＯＬｎＶ＆１１ｐｒｔｓＩ＋Ｙ＠ １１愉ｔｍｅｔｈｅＰｈｅムａｖスｏ　２５　３０ Ｖａ五ｐｍｏ工ｙｓｉｒＬｙｅｔ−ｙａＬＩＩｕＬｙｓ＾−ｎｍｃ＾１龜＾−ｎ ＄ｅｒＮｅｔ−Ｖａｌｊｓ　４０　４％ Ｌｔｕ　Ｌ、ｙｌｌ　Ｌ７＃　ｍｓｐ　Ｍａｔ　Ｘｌ嗜　ｔｈｅ　Ｍａｔ　ｃＬ ｎ　Ｌｙｅ　Ｐｈｓ　１７＠　ｓｅｒ　ｒｈｅ　ａｒｇ　！戟■ ｇｏ　ラｓ　６０ ＢａｒＡｌａＭｅｔＷｉｌｌＡＬａ’ｒｈｒ島ＬａＧ工―ム７ａＰｒｏｕｒＧＬ ｕＸＬ・ＶａｎＬａｗ０１＋１６Ｓフａフ５ＳＯ Ｐｒａ　！ｉ＠Ｌｙｅ　６１ｕ　ＸＬｍ　ｋｔ　ａＸｙ　Ｔｈｅ　ｖａｌ　Ｌｙ ｅしｎａ　ｐｒｏ　ＧＬｙ　ｕｒ　Ｌｙ＋ａ　５ｅｒ−Ｓ　やＯ１％ し−ｍａｔ　Ａ＠ｈｓ　＆ｅｑ　ＸＬｍｆ２１　ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：　１８に 関する情報：（１）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝２８アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （！１）分子の種類、ペプチド （Ｘｌ）配列の記述：ＳＥＱ　１０　ＮＯ：１８　：Ｘａａ　ｌｌＬ＠ＧＬｙ　 ＾ｌａ　Ｓ＠ｒ　＄壷ｒ　Ａｒｇ　Ｐｅａ　＾ｌａ　ｉｈｒ　＾１畠　入ｒｇ　 Ｌｙｓ　Ｓｉｒ　Ｓｉｒ　Ｃ１ｙＩ　Ｓ　１０　Ｉｓ 特表平６−５００４７２　（３５） （２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：　１９に関する情報：（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：１３アミノ酸 （Ｂ）　梨二アミノ酸 （Ｃ）　Ｍの数ニー木繊 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：ペプチド （ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　ｔＤ　ＮＯ：ｌ　９　：（２１ＳＥＱ　［Ｄ 　ＮＯ：２０に関する情報：（１）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：１５アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　鎖の数ニー木繊 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （百）分子の種類：ペプチド （ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：２０　＋（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯ：２１に関する情報：（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：１７塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー木繊 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（Ｂ）　盟：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　 １０　ＮＯ：２７　：ＣＧＴＣＧＣＴＣＧＴ　ＣＧＴＧＣＧＴＧＧＣＣＧＣＣＣ ＴＧＡＣＧ　ＧＣ３２（２１ＳＥＱ　１０　ＮＯ：２８に関する情報：（ｉ）　 配列の特徴： （Ａ）　長さ：２９塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数、−木繊 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　 １０　ＮＯ：２８　：ＣＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＧＣＴ　ＡＴＧＧＧ ＣＧＣＣ２９（２）　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：　２９に関する情報：（ｉ）　配列 の特徴： （Ａ）　長さ＝３１塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：２９　：ＣＧＧＧＣＴＧＣＣＧ　ＣＣＴＧＡＣＴＡＴＧ　ＧＧＣＣ ＴＣＧＴＣＧ　Ｇ　３１ｆ２１　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：３０に関する情報：（１） 　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝１５アミノ酸 （Ｂ）　型、アミノ酸 （Ｃ）　Ｈの数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：タンパク質 （ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：３０　：＋２）　ＳＥＱ　ＩＤ Ｎ０：３１に関する情報：（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝１７塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　 ［ＯＮＯ：３１　：ＧＣＧＧＴＢＧＣＳＧ　ＧＹＴＴＳＧＧ　１７７　ＳＥＱ　 ＩＤ　ＮＯ：３２に関する情報：（１）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝１６アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　Ｈの数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：ペプチド （ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：３２　：（２１ＳＥＱ　［Ｄ　 Ｎｏ：　３３に関する情報：（り　配列の特徴。 （Ａ）　長さ：１３アミノ酸 （Ｂ）　型二アミノ酸 （Ｃ）　Ｍの数、−木繊 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：ペプチド （ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　［ＯＮＯ：３３　：（２１ＳＥＱ　［ＯＮｏ ＋　３４に関するｔｆｌ報：（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ＝２６塩基対 （Ｂ）　梨：核酸 （Ｃ）　ｊＪＩの数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）　分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　 ［Ｄ　ＮＯ：３４　：ＣＧＧＣＡＡＴＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧ　ＣＧＣＧＣ Ｃ２６（２）　ＳＥＱ　１０　ＮＯ：　３５に関する情報：（１）　配列の特徴 ・ （Ａ）　長さ＝４９塩基対 （Ｂ）　型：ＰＡ酸 （Ｃ）　Ｒの数ニー重鎖 （０）トポロジー：直鎖状 （１１）分子の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　ｉｎ 　ＮＯ：３５　：ｃｃＡｃａｃｅｒｃｃｔｒｃＣ＾Ｃｃｃｔｃ入＾Ｃｃｘｒｃｅ ｒｒＡ＾ＣＣＴ丁ｃｃｃｃ丁＾＾τＣＡ丁ＧＯ４９（２１ＳＥＱ　［ＯＮＯ：３ ６に関する情報：（ｉ）　配列の特徴： （Ａ）　長さ：３５塩基対 （Ｂ）　型：核酸 （Ｃ）　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉｉ）分子の種類：　ＤＮＡ（ゲノム）（ｘｉ）　配列の記述：　ＳＥＱ　［ Ｄ　ＮＯ＋３６　：ＧＧＡＡＧＡＣＧＣＣＣＡＧＡＡＴＴＣＡＣＧＧＴＧＣＡＡ ＧＣＡ　ＧＣＣＧＧ　３５ＦＪＧ、　２ ｏ　ｏ　ｏ　ｏ　ｏ　Ｏｏ　Ｏｏ　Ｏｏ　ｏ　。 Ｏへ（０？　Ｏψへ■９ｏψヘロ望 りｒ＋ｒ＋へｆｉ（’ｌ’）リマのψψさ〉■０　０　０　０　０　０　ロ　。 　ｏ　ｏ　ｏ　ｏ　。 ｏ（′ＩＩａＯマ０すへのり。リヘロマ％−ｏ　Ｆ−１１−１Ｃ％Ｊｎ内ママ□ リリささロヘψへＬ１″）へ的へいｍ　ｍ　。 への００　Ｌｌ”）　Ｌｌ”）　００　ＶｌＬｌ”）　Ｏ’Ｉ　Ｏ？ｕ’＋　ｕ ”＋　ｒ−ｔ　ｒ−ｔ　ｒ−ｔ　Ｆ−１へへへへへｔｖｔｍ０　ｏ　ｏ　ｏ　Ｏ ｏ　Ｏｏ　ｏ　０００００へ■？０ψへＱ）　？　Ｏψへ■ｑ ψ　−Ｈへ　（ｖｌｊＱ　リ　リ　罰　リ　ψ　さ　〉　のｒ−ｔ　ｒｎ　＋　 −Ｆ４　Ｆ−１−一−Ｆ−１−−１＋ｌ　＋−１すへＣＤ　？　Ｏψへω！０リ ヘω ｒｎｒｎへｎの！すのりψごご ○　ｏ　０ ＦＩＧ、　１３ ＦＩＧ、　１６ ＦｆＧ、１７ 手続補正書く睦） 平成５年５月１４日囚

Claims (30)

【特許請求の範囲】
1. １．ＳＥＱＩＤＮＯ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４及びＳＥＱＩＤＮＯ：６からなる 群から選択される配列由来のＤＮＡプローブとハイブリッド形成することが可能 である、ホスホエノールピルベート（ＰＥＰ）のＫｍが１〜１５０μＭでＫｉ（ グリホセート）／Ｋｍ（ＰＥＰ）比が３〜５００であるＥＰＳＰＳ酵素をコード する単離されたＤＮＡ配列。
2. ２．ホスホエノールピルベートのＫｍが、２〜２５μＭである請求の範囲第１項 に記載のＤＮＡ分子。
3. ３．Ｋｉ／Ｋｍ比が、６〜２５０である請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ分子。
4. ４．ＥＰＳＰＳ活性を示すタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ配列であっ て、前記タンパク質はクラスＨＥＰＳＰＳ酵素に対して生じた抗体と反応するこ とが可能であることを特徴とする前記ＤＮＡ配列。
5. ５．タンパク質が、ＳＥＱＩＤＮＯ：３、ＳＥＱＩＤＮＯ：５及びＳＥＱＩＤＮ Ｏ：７からなる群から選択されるクラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素に対して生じた抗体 と反応することが可能な請求の範囲第４項に記載のＤＮＡ配列。
6. ６．抗体が、ＳＥＱＩＤＮＯ：３のクラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素に対して生じる請 求の範囲第５項に記載のＤＮＡ配列。
7. ７．配列中に： ａ）植物細胞中においてＲＮＡ配列を生じさせるように機能するプロモーター； ｂ）クラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素をコードするＲＮＡ配列を生じさせる構造ＤＮＡ 配列；及び ｃ）ＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニルヌクレオチドのストレッチを付加させ るように植物細胞中で機能する３′非翻訳化領域 を含む組換え二本鎖ＤＮＡ分子であって、前記プロモーターは前記構造ＤＮＡ配 列に関して異種であり、融合ポリペプチドを十分に表現させて前記ＤＮＡ分子に より形質転換された植物細胞のグリホセート耐性を高めるために使用されること を特徴とする前記ＤＮＡ分子。
8. ８．構造ＤＮＡ配列が、アミノ末端葉緑体トランジットペプチド及びクラスＩＩ ＥＰＳＰＳ酵素を含む融合ポリペプチドをコードする請求の範囲第７項に記載の ＤＮＡ分子。
9. ９．クラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素をコードする構造ＤＮＡ配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４及びＳＥＱＩＤＮＯ：６からなる群から選択される請 求の範囲第８項に記載のＤＮＡ分子。
10. １０．配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２に由来する請求の範囲第９項に記載のＤＮＡ 分子。
11. １１．プロモーターが、植物ＤＮＡウィルスプロモーターである請求の範囲第８ 項に記載のＤＮＡ分子。
12. １２．プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓ及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターからなる 群から選択される請求の範囲第１１項に記載のＤＮＡ分子。
13. １３．下記工程： ａ） ｉ）植物細胞中でＲＮＡ配列を生じさせるように機能するプロモーター、 ｉｉ）アミノ末端葉緑体トランジットペプチド及びクラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素を 含む融合ポリペプチドをコードするＲＮＡ配列を生じさせる構造ＤＮＡ配列及び ｉｉｉ）ＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニルヌクレオチドのストレッチを付加 させるように植物細胞中で機能する３′非翻訳ＤＮＡ配列 を含み、 前記プロモーターは構造ＤＮＡ配列に関して異種であり、融合ポリペプチドを十 分に表現させて前記遺伝子により形質転換された植物細胞のグリホセート耐性を 高めるために使用される組換え二本鎖ＤＮＡ分子を、植物細胞のゲノム中に挿入 し； ｂ）形質転換された植物細胞を得て；次いで、ｃ）前記形質転換された植物細胞 から、グリホセート殺草剤に対する耐性が増加し遺伝学的に形質転換された植物 を再生する を含む、グリホセート殺草剤に対して耐性である遺伝学的に形質転換された植物 の生産方法。
14. １４．クラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素をコードする構造ＤＮＡ配列が、ＳＥＱＩＤＮ Ｏ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４及びＳＥＱＩＤＮＯ：６からなる群から選択される 請求の範囲第１３項に記載の方法。
15. １５．配列が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２中に示されたものと同じである請求の範囲第 １４項に記載のＤＮＡ分子。
16. １６．プロモーターが、植物ＤＮＡウィルスに由来する請求の範囲第１３項に記 載の方法。
17. １７．プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓ及びＦＭ３５Ｓプロモーターからなる群 から選択される請求の範囲第１６項に記載の方法。
18. １８．請求の範囲第８、９または１２項に記載のＤＮＡ分子を含むグリホセート 耐性植物細胞。
19. １９．プロモーターが、植物ＤＮＡウィルスプロモーターである請求の範囲第１ ８項に記載のグリホセート耐性植物細胞。
20. ２０．プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓ及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターからなる 群から選択される請求の範囲第１９項に記載のグリホセート耐性植物細胞。
21. ２１．コーン、コムギ、コメ、ダイズ、ワタ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、キャ ノーラ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプ ラ、マツ、リンゴ及びブドウからなる群から選択される請求の範囲第１８項に記 載のグリホセート耐性植物細胞。
22. ２２．請求の範囲第１８項に記載の植物細胞を含むグリホセート耐性植物。
23. ２３．プロモーターが、ＤＮＡ植物ウィルスプロモーターに由来する請求の範囲 第２２項に記載のグリホセート耐性植物。
24. ２４．プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓ及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターからなる 群から選択される請求の範囲第２３項に記載のグリホセート耐性植物。
25. ２５．コーン、コムギ、コメ、ダイズ、ワタ、テンサイ、脂肪種子ナタネ、キャ ノーラ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルファルファ、ポプ ラ、マツ、リンゴ及びブドウからなる群から選択される請求の範囲第２２項に記 載のグリホセート耐性植物。
26. ２６．下記工程： ａ）組換え二本鎖ＤＮＡ分子が作物種子または植物中に挿入された結果、グリホ セート耐性を有する前記作物種子または植物を植え、前記ＤＮＡ分子は、ｉ）植 物細胞中でＲＮＡ配列を生じさせるように機能するプロモーター、 ｉｉ）アミノ末端葉緑体トランジットペプチド及びクラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素を 含むポリペプチドをコードするＲＮＡ配列を生じさせる構造ＤＮＡ配列、ｉｉｉ ）ＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニルヌクレオチドのストレッチを付加させる ように植物細胞中で機能する３′非翻訳化ＤＮＡ配列 を有し、 前記プロモーターは、構造ＤＮＡ配列に関して異種であり、融合ポリペプチドを 十分に表現させて、前記遺伝子により形質転換された植物細胞のグリホセート耐 性を高めるために使用され； ｂ）畑中の前記作物及び雑草に十分量のグリホセート殺草剤を与えて、前記作物 には著しい影響を与えずに雑草を制御する を含む、植えられた作物種子または植物を有する作物を含む畑中において雑草を 選択的に制御する方法。
27. ２７．クラスＩＩＥＰＳＰＳ酵素をコードする構造ＤＮＡ配列が、ＳＥＱＩＤＮ Ｏ：２、ＳＥＱＩＤＮＯ：４またはＳＥＱＩＤＮＯ：６中に示された配列から選 択される請求の範囲第２６項に記載の方法。
28. ２８．ＤＮＡ分子が、ＳＥＱＩＤＮＯ：２由来の構造ＤＮＡ配列を含む請求の範 囲第２７項に記載の方法。
29. ２９．ＤＮＡ分子が、さらに、ＣＡＭＶ３５Ｓ及びＦＭＶ３５Ｓプロモーターか らなる群から選択されるプロモーターを含む請求の範囲第２８項に記載の方法。
30. ３０．作物植物ＴＳがコーン、コムギ、コメ、ダイズ、ワタ、テンサイ、脂肪種 子ナタネ、キャノーラ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、アルフ ァルファ、ポプラ、マツ、リンゴ及びブドウからなる群から選択される請求の範 囲第２９項に記載の方法。