JPH06501608A - ヒト・ミトコンドリアのｎａｄ（ｐ）＋依存リンゴ酸酵素 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ヒト・ミトコンドリアのＮＡＤ　（Ｐ）”依存リンゴ酸酵素本発明は、ヒト・ミ トコンドリアのＮＡＤ　（Ｐ）”依存リンゴ酸酵素（ｍｌａｔｅｅｎｚｙｍｅ） に関する。

リンゴ酸酵素は、リンゴ酸のピルビン酸への酸化的分解、即ち、マレート　＋　 ＮＡＤ　（Ｐ）ゝ→　ピルベート　＋　ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ”＋　Ｈ“を触媒する。

この酵素は、真核および原核生物のいずれにも存在する。これまでに、哺乳類組 織ではリンゴ酸酵素の三種のイソ酵素、即ち、厳密な細胞質性ＮＡＤＰ＋依存酵 素、ＮＡＤＰ”依存ミトコンドリア・イソ酵素、およびＮＡＤ″″およびＮＡＤ Ｐ″″のいずれも使用しつるか、一般的にＮＡＤ”に選択的なミトコンドリア・ イソ酵素が報告されている（フランケル、１９７５）。（以後、このイソ酵素を ＮＡＤ　（Ｐ）’″依存リンゴ酸酵素と呼ぶ）。

哺乳類のイソ酵素の大きさは、約６２−６４ｋＤａである（モリ−ジスおよびレ ニンガー、１９８４ｂ；バグチ等、１９８７）、生体内での大きさか２４０ｋＤ ａであることは、活性酵素が四量体構造を採っていることを推定させる（フラン ケル、１９７５；モリ−ジスおよびレニンガー、１９８４ｂ）。

細胞質性リンゴ酸酵素の活性は、肝臓および脂肪組織で最も高い。即ち、このイ ソ酵素は、脂肪酸のｄｅ　ｎｏｖｏ合成に関する細胞質ゾル性ＮＡＤＰＨの生成 に関連している。このイソ酵素は、食物の組成で制御可能であり、即ち、炭水化 物含量の高い食料、またはチロイドホルモンにより誘導しつる（フランケル、１ ９７５、ドジン等、１９８５）。ＮＡＤＰ”依存ミトコンドリア・リンゴ酸酵素 の活性は数多くの組織（脳、心筋および骨格筋組織、副腎）で検出されており（ リンおよびデービス、１９７４；フランケル、１９７５；ナゲル等、１９８０） 、おそらく該酵素は、還元的生合成に関するＮＡＤＰＧの生産に関連している（ シンプソンおよびニスタブルーフ、１９６９）。しかし、今日まで、この特殊な イソ酵素に関する詳細は分かっていない。

ミトコンドリアＮＡＤ　（Ｐ）＋依存リンゴ酸酵素活性は、例えば、胸腺または 牌臓等、高速で細胞分裂を行う組織、または小腸の粘膜の基底細胞（ソ了等、１ ９７９）、並びにアフリカッメガエルの初期発生における第１細胞分裂サイクル （ドーキンおよびドーキン・ラッスル、１９９０）で検出しつる。このイソ酵素 の活性は、ラットの脳、筋肉組織および正常または再生肝臓組織には存在しない か、もしくは非常に低いが（ナゲル等、１９８０）、ラットの副腎皮質（ツア、 １９７３Ｌハトおよびヒトの骨格筋（リンおよびデービス、１９７４；タロニ等 、１９８８）および多くの生物種の心筋（リンおよびデービス、１９７４；リグ オり等、１９８９）では検出されている。この酵素は、これまでに研究されてき た多くの腫瘍細胞系列で発現されている。ＮＡＤ　（Ｐ）’″依存リンゴ酸酵素 活性は、腹水腫瘍（ツアおよびトーチ−１１９７８Ｌ肝ガン細胞（ツア等、１９ ８０）、および、その他の種々の腫瘍（モレジスおよびレニンガー、１９８４ｂ ）で検出されている。モリス・肝ガン・シリーズにおいては、ＮＡＤ　（Ｐ）” 依存リンゴ酸酵素の発現が増殖に依存している（ツア等、１９８０）。

培養した多くの腫瘍細胞は、呼吸の主要なエネルギー源としてグルタミンおよび グルコースを使用しつるが（レイツアー等、１９７９）、多くの腫瘍細胞におい て、とりわけグルコースを絶対必要条件としているわけではない（ワイス等、＋ ９８１）。ＮＡＤ　（Ｐ）”結合性のミトコンドリア・リンゴ酸酵素活性は、ア ミノ酸のピルビン酸への転換に関連していると考えられる（モレジスおよびレニ ンガー、１９８４ａ；ツア等、１９８０）、ナゲルおよびツア（１９８２）の研 究は、イヌの小腸粘膜からのミトコンドリアＮＡＤ　（Ｐ）！依存リンゴ酸酵素 の部分的ｔＩ製を示し、また、モレジスおよびレニンガ−（１９８４ａ）は、マ ウス肝ガン腫のミトコンドリアからの本リンゴ酸酵素の部分的精製（５１％）お よび物理的性質の測定に関して報告している。

本発明の目的は、初めての均一なヒト・ミトコンドリアＮＡＤ　（Ｐ）”依存リ ンゴ酸酵素（以後、　“リンゴ酸酵素”と呼ぶ）の調製、これを用いた該リンゴ 酸酵素をコードするＤＮＡの同定、およびそのヌクレオチド配列の決定である。

該ＤＮＡを使用することで、適当な宿主生物における該酵素の発現か可能となる 。

さらに、本発明の目的は、組み換え法を用いて調製したタンパク質によるモノク ローナル抗体の調製である。

この目的は、トランスホームしたヒトＴ−リンパ球細胞系列（細胞系列１３０１ ：ボド、１９８１）からのミトコンドリア調製物上清由来のリンゴ酸酵素活性を 含むフラクションの調製、精製、および、イオン交換およびＡＴＰ−アフィニテ ィークロマトグラフィーによるリンゴ酸酵素の濃縮により達成された。この操作 で、直接的アミノ酸シーケンシングの出発物質として約８５−９０％の純度のリ ンゴ酸酵素か得られた。（特別な目的のために必要ならば、さらに精製して均一 な酵素を調製しうる。例えば、分析または微量調製を目的とする場合は、５ＤＳ −ゲル電気泳動およびメンブレンへのプロッティングにより更に精製しうる。均 一な形で本来の酵素を得るには、アフィニティー・クロマトグラフィーにつづい て、ゲル濾過および／または疎水性クロマトグラフィー等のクロマトグラフィー 精製を行いつる。）　本発明における均一なリンゴ酸酵素は、ＦＰＬＣで得た。

このように、本発明は、ヒト・ミトコンドリアＮＡＤ　（Ｐ）”依存リンゴ酸酵 素に関する。

精製したリンゴ酸酵素のトリプシン分解フラグメントのマイクロシーケンシング から４個のアミノ酸配列か得られた。これらの配列の２個から出発して、縮退オ リゴヌクレオチドを合成し、直接、低ストリンジェント条件下でｃＤＮＡライブ ラリー（フィブロザルコーマのライブラリーを使用した）の上清からリンゴ酸酵 素に特異的なりＮＡフラグメントを増幅するためのボリメレース・チェーン・リ アクション（ＰＣＲ）に用いた。このＰＣＲ増幅から単一バンドが得られ、これ をサブクローニングした（ｐＵＣベクター）。増幅したＤＮＡの配列分析は、他 の既知のリンゴ酸酵素配列と有意なホモロジーを示した。得られたクローンをｃ ＤＮＡ増幅に使用したフィブロザルコーマ・ライブラリーのプラーク・ハイブリ ダイゼーションに使用し、１９２３ｂｌ）の挿入物を含むプラークを単離、精製 した。この挿入物は、内部にＥｃｏＲＩ切断部位を含むので、部分消化を行い、 完全な挿入物を適当なベクター（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋）のＥｃｏＲ１ 部位にクローン化した。このクローンからヌクレオチド配列を決定した。第３図 は単離したｃＤＮＡクローンの全ヌクレオチド配列を示している。

全長１９２３ｂｐの配列およびポリ（Ａ）テールを含むｃＤＮＡクローンには、 部位９０（ＡＴＧ）から部位＋　８４１　（ＴＡＧ）までの５８４個のアミノ酸 をコードする長いオーブン・リーディング・フレームか含まれる。５°非翻訳領 域は極端にＧＣリッチであり（７６，３％　Ｇ／Ｃ：最初の８０ヌクレオチドの うち６１個かＧ／Ｃである）、開始シグナル領域のヌクレオチドは、コサツクの コンセンサス配列に比較的よく対応している（コサツク、１９８７）。３′非翻 訳領域は、７Ｑｂｐ長であり、それにポリ（Ａ）セクションか続いている（単離 したｃＤＮＡクローンには２６個の連続するＡグループか存在している）。ポリ （Ａ）セクションの上流１３ｂｐの所には、配列要素（ＡＧＡＴＡＡ）が有り、 この配列はコンセンサスなポリアゾニレ−ジョン・シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）と 特定のホモロジーを有している（バーンスチール等、＋９８５）。このヌクレオ チド配列から誘導されるアミノ酸を含むタンパク質の分子量は、６５．４ｋＤで ある（ミトコンドリアのシグナル配列を含む）。この分子量は、５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅで６２ｋＤと測定されたイヌの小腸粘膜由来のミトコンドリアＮＡＤ　（Ｐ） ”依存リンゴ酸酵素のサイズ（ナゲルおよびツア、１９８２）とよく一致してい る。

誘導したタンパク質の最初の２０個のアミノ酸は、典型的なミトコンドリアのシ グナル配列の特徴、即ち、ヘリックスの一方が非極性アミノ酸および他方か塩基 性アミノ酸を有する二次構造を持つ両親媒性アルファ・ヘリックス（ホン・ヘイ ン、１９８６；アリリンおよびシャツ人　１９８６）を示している（ミトコンド リアのシグナル配列の部分は、科学的興味、またはその必要性に応じて、プロセ シングされたタンパク質のＮ末端シーケンシングから正確に決定しうる。全タン パク質の５８４個のアミノ酸の内、６７個は酸性、７８個は塩基性、１１個はシ スティンである。理論的に推定されるＮ−グリコジル化部位は、このタンパク質 の部位４２１に存在する（Ａｓ　ｎ−Ｘａ　ａ−Ｔｈ　ｒ）。この場合のアミノ 酸ＸａａはＰｒｏである。従って、モノホンおよびカラライホン（１９８４）に よって示されたグリコジル化に関する知見は正しくないと考えられる。また、グ リコジル化か無いことは、大腸菌て発現するヒト・ミトコンドリアのリンフ１酵 素か完全な機能を有するという知見からも確認される。従って、ヒト細胞中でも ＮＡＤ　（Ｐ）”依存ミトコンドリア・リンゴ酸酵素はグリコジル化されていな いであろう。

この配列と、これまでに公表された４ｇＡのリンゴ酸酵素配列（マウス（ハグチ 等、１９８７）またはラット（マグナソン等、１９８６）由来の細胞質性ＮＡＤ Ｐ′依存リンゴ酸酵素、トウモロコシの葉緑体由来のＮＡＤＰ”依存リンゴ酸酵 素（ロサーメルおよびネルリン、１９８９）およびバチルス・ステアロサーモフ ィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の熱 安定性リンゴ酸酵素（コバヤシ等、１９８９））を比較することで以下の事か判 明した：ヒト・ミトコンドリアＮＡＤ　（Ｐ）”依存リンゴ酸酵素は、ラットお よびマウスの酵素と存意に異なる。即ち、ヒトのリンゴ酸酵素は、これらの酵素 各々と５５．４％および５４．２％の一致しか示さず、これらの値は、この酵素 がトウモロコシのリンゴ酸酵素、および、リグニン合成に関係し、かつリンゴ酸 酵素とかなりの配列の一致を示すシンナミルアルコール・デヒドロゲナーゼ（つ オルター等、１９８８）と共有する４７．２％および４８，８％という値と比べ て有意に高くとは言えない。

真核生物のリンゴ酸酵素は、バチルス・ステアロサーモフィラス（ＢａｃｉｌＩ ｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の酵素に対し、低いが、有意な ホモロジーを示す。これら全ての酵素は該酵素と約２７％の一致を示す。種々の リンゴ酸酵素間のホモロジーは、そのタンパク質配列に均一に分散しているので はなく、高いホモロジー領域が、僅かなホモロジーを示すか、または全くホモロ ジーを示さない長いセグメントで中断されている。実際に、ヒト、ラットおよび トウモロコシのリンゴ酸酵素の間では長い配列の一致が存在するが、他の領域は 全く類似性を示さないことが注目される。

アミノ酸１６０−１８９．２５＋−２９４および４１１−４５２の領域は、特に 保存されている。アミノ酸１１１−１１９の領域は、ガチョウの脂肪酸シンセタ ーゼおよびヒトのグリセリンアルデヒド−３−ホスファターゼに関して提唱され ているＮＡＤＰ’″結合部位と類似性を示す（ポーラスおよびコラツクディー、 １９８３）。ウニレンガ等（１９８５）により提唱された“ＡＤＰ結合βαβ− ホールド”に関するコンセンサス配列に相当する配列要素は、アミノ酸１６２− １９３間に存在する。これらの構造要素は、ジヌクレオチドのＡＤＰグループに 結合すると考えられる。即ち、これらはコンパクトなβαβ−ホールド上の特定 の基本的部位に存在するグリシン並びに非極性および親水性基の特徴的な配列を 存する。アミノ酸３１１−３４３のセグメントは、提唱されている補酵素ニコチ ンアミドの結合部位といくらかのホモロジーを示すモチーフを含んでいるが（ス クラットン等、１９９０）、この補酵素特異性は該配列から容易に誘導すること は出来ない。また、ラットのＮＡＤＰ”依存リンゴ酸酵素およびヒトのＮＡＤ（ Ｐ）′″依存リンゴ酸酵素の両方とも、ＮＡＤＰ”結合タンパク質に特徴的な部 位にアラニンを含んでいる。しかし、ＮＡＤＰゝ結合タン結合タンパ特質の部位 に塩基性残基を有するか（おそらく、リン酸基との接触を提供する）、一方、Ｎ ＡＤ”結合タンパク質は、この部位に非電荷、または酸性アミノ酸を含む傾向に ある。本発明のヒト・リンゴ酸酵素は、このセクション（部位３３４．３３５お よび３４１）に優先的に酸性アミノ酸を有するが、一方、醤歯類のＮＡＤＰ”依 存リンゴ酸酵素はこの部位に塩基性側鎖を有するアミノ酸を持つ傾向にある。推 定されるこれら全てのジヌクレオチド結合ドメインは、シンナミルアルコール・ デヒドロゲナーゼを含む、これまでに述べてきた種々のリンコ゛酸酵素での保存 性が非常に高い。また、部位＋２０．１９８および４２８の３個のシスティンも 、これら種々の酵素で保存されており、おそらくジスルフィド結合の部位として 働いている。

アミノ酸１−９０　（ミトコンドリアのシグナル配列を含む）、およびアミノ酸 ５００およびタンパク質末端間のＣ末端、およびアミノ酸３５５−４１０間の領 域にＮＡＤＰ″″依存リンゴ酸酵素と非常に異なる領域がある。この領域に関し て互いに４７−６７％の類似性を示す池の真核性ＮＡＤ　Ｐ″″依存リンゴ酸酵 素と比較すると、本発明のリンフ１酵素は、この領域において僅か３３−３６％ しか一致していない。この事から、該タンパク質のこの領域は特定のアロステリ ック性（フマル酸による刺激、ＡＴＰによる阻害）の一部を担っていると考える ことか出来る。

アミノ酸１９−５８４のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを適当な細菌性発現 プラスミド（ｐＲＨ２８１）にクローン化した。大腸菌における発現の誘導で１ −２■の活性のある可溶性ヒト・リンゴ酸酵素が得られた。細菌性のリンゴ酸酵 素は、ＤＥＡＥ−イオン交換クロマトグラフィーて分離した。得られた組み換え リンゴ酸酵素については、一方では内在的細菌性リンゴ酸酵素、および他方ては その他のイソ酵素から該酵素を区別しつるそのアロステリック特性および基質特 性を調べた。細菌性酵素は、電子受容体としてＮＡＤ”およびＮＡＤＰ″″の両 方を効率的に利用するが、この組み換えヒト酵素はＮＡＤＰ”に関しては実質的 に不活性であることが確認された。また、リンパ球から単離した酵素は、ＮＡＤ ”に対して同様の選択性があることが分かった。フマル酸は、組み換えおよび天 然ヒト・リンゴ酸酵素を同様に活性化したが、内在的細菌酵素には効果が無かっ た。

ＡＴＰは、ヒトおよび組み換えリンゴ酸酵素の活性を阻害したが、内在的細菌酵 素の活性は阻害しなかった。概ね、組み換えリンゴ酸酵素は、アロステリック特 性および速度論的特性に関して実質的に天然の酵素と区別しえないことが分かっ た。

さらに、本発明は、ヒト・ミトコンドリアのＮＡＤ　（Ｐ）”依存リンゴ酸酵素 をコードするＤＮＡに関している。

リンコ゛酸酵素をコードするＤＮＡを用いて、適当な原核または真核性宿主生物 例えば、大腸菌、サツカロミセス　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃ ｅｒｅｖｉｓｉａｅ）または高等生物細胞内で組み換えリンゴ酸酵素を発現する ことか出来る。どの宿主生物を用いるかは、該組み換え酵素または該酵素を発現 する細胞を使用する特定の科学的研究における該リンゴ酸酵素の用途に依存する 。

リンコ゛酸酵素をコードするｃＤＮＡの存在は、ゲノムＤＮＡを入手でき、従っ てリンゴ酸酵素遺伝子の５′非コード領域を明確に出来ることを期待させる。こ の目的のために、ｃＤＮＡの５゛末端から始まるハイブリダイゼーション・プロ ーブを構築し、ゲノムライブラリーをスクリーニングすることが出来る。得られ たクローンを、それらがコード領域に加えて必要な調節配列要素を含んでいるか どうかに関して、例えば、そのＤＮＡ領域を適当なレポーター遺伝子のコード領 域と融合し、ついで、それらのプロモーター機能を調べることにより検定する。

調節要素を用いることにより、リンゴ酸酵素の発現の組織特異性やそれが既知の 発現調節因子、例えば、成長因子または成長ホルモンに応答するかどうかを調べ ることが出来る。

別の特徴として、本発明は、リンゴ酸酵素またはその一部をコードするＤＮＡを 含む組み換えＤＮＡ分子、および該ＤＮＡ分子でトランスホームした宿主生物に 関する。

従って、本発明は、組み換えヒトＮＡＤ　（Ｐ）“依存リンゴ酸酵素およびその 調製方法に関する。本発明における“組み換えリンゴ酸酵素“には、アミノ酸配 列、特にその生物学的活性に重要な特定のドメインのアミノ酸配列か変化した修 正型タンパク質も含まれる。例えば、これらのドメインには、ジヌクレオチド結 合部位または部位指定突然変異誘発で同定しつる基質結合部位か含まれる。

修正型酵素を含む本発明のリンゴ酸酵素、および、これらをコードするＤＮＡは 、例えば、迅速に分裂する細胞における炭素代謝、特に、アミノ酸からのピルビ ン酸の生成を研究するのに使用しつる。

また、十分な量の組み換えリンゴ酸酵素を使用できれば、望ましくはモノクロー ナルな抗リンゴ酸酵素抗体を生産することか出来る。

このように、もう一つの特徴として、本発明はリンゴ酸酵素に対するモノクロー ナル抗体、該抗体を生産するハイブリドーマ細胞、および該細胞の調製方法に関 する。これらには、該ハイブリドーマ細胞系列、および該ハイブリトーマから生 産されるモノクローナル抗体であって、ＮＡＤ　（Ｐ）”依存リンゴ酸酵素と特 異的に反応する、即ち、リンゴ酸酵素の池のイソ酵素との交差反応性が無いか、 または、はとんと無いモノクローナル抗体が含まれる。（特筆しないかぎり、本 発明のおける゛リンゴ酸酵素と特異的に反応する抗体”の定義には、ミトコンド リアＮＡＤ　（Ｐ）”依存リンゴ酸酵素と有意な反応性を示すが、他のリンゴ酸 酵素のイソ酵素とは殆ど反応性を示さない抗体か含まれる。即ち、これらは、イ ソ酵素とほんの僅かしか交差反応しない。）リンゴ酸酵素に対するモノクローナ ル抗体の調製方法は、動物、望ましくはマウスをリンゴ酸酵素で免疫化し、この 免疫化した動物由来のＢ−リンパ球をミエローマ細胞と融合し、生成したハイブ リドーマを抗すンコ１酵素抗体の生産に関して検定し、ポジティブな培養物をク ローン化して培養後、この培養物から抗体を単離することを特徴とする。モノク ローナル抗体の調製は、当業者にとって馴染みの深いものである。適当な説明は 関連するテキスト（例えば、バーローおよびレーン、１９８８ａ）に示されてお り、また、必要ならば適当に修正しつる。

本発明の抗リンゴ酸酵素モノクローナル抗体は、週令約６オの雌のＢＡＬＢ／Ｃ マウスを４週間の間隔で３回、精製した組み換えリンゴ酸酵素（各々ｌＯμｇ、 １回目は完全フロインドアジュバントと共に、２回目は不完全フロインドアジュ バントと共に、そして３回目はアジュバント無しで）を注射することにより免疫 化することにより、調製した。さらに、ｌ１日後、該マウスから血液を採取した （一般に、この期間の後に血清中に有意なレベルの抗体が検出しえた）。血清中 の抗体値は、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）において、反応を示さない 正常なマウス血清と比較することで測定した。組み換えリンゴ酸酵素を直接マイ クロプレートの表面に結合し、適当に希釈したマウス血清を添加後、ホース・ラ ディッシュ・パーオキシダーゼに結合したマウスＩｇに対する抗体への結合を検 出した。適当な基質（ｌ、２−フェニレンジアミン）と反応させることにより、 色素反応を用いて抗体レベルを測定した。抗体レベルの最も高いマウスから牌臓 を摘出し、その牌細胞をＨＡＴ培地で選択した細胞系列Ｐ３Ｘ６３　Ａｇ８、６ ５３というミエローマ細胞（カーネー等、１９７９）に融合した。（他の適当な ミエローマ細胞には、例えば、Ｘ−Ｘ−６３−Ａ、ＭＰＣ−１１、ＮＳｌ−Ａｇ ４／Ｉ、ＭＯＰＣ−２１ＮＳ／ＩまたはＳＰ　２１０等かある。）　融合はケラ −およびミルスタイン（１９７５）の方法を用い、細胞融合剤ポリエチレングリ コール４０００を添加してＢ−リンパ球とミエローマ細胞を混合することにより 行った。（他の適当な細胞融合剤には、センダイウィルス、塩化カルシウムまた はリソレシチンがある。）　選択的培養培地を使用することで、所謂ハイブリド ーマと呼ばれる融合細胞のみが培養物中に生存することが保証される。

このハイブリドーマを培養しく通常の添加物を含むＲＰＭＩ　１６４０培地中） 、上述のＥＬＩＳＡを用いて、その培養上清における抗リンゴ酸酵素抗体の存在 を検定した。得られた５個のポジティブクローンを、所謂“限界希釈法で再クロ ーニングし、生じた５個のモノクローンを再度培養した後、ＮＡＤ　（Ｐ）“依 存リンゴ酸酵素との反応を試した。５個全てのモノクローンかポジティブの反応 を示した。得られたモノクローンをインビボで大量に培養し、生成した抗体を腹 水から生成して、その特徴を調べた。

ミトコンドリアＮＡＤ　（Ｐ）″″依存リンゴ酸酵素と細胞質ゾルリンゴ酸酵素 との部分的ホモロジーのために、生成した抗体には、他のリンゴ酸酵素イソ酵素 には反応性を示さない（または存意により低い反応性の）抗体に加えて、細胞質 ゾル性イソ酵素および／またはＮＡＤＰ”依存ミトコンドリアイソ酵素に結合す る物かいくらか含まれるであろう。

以上の方法（修正も可能である）を用いて得られる本発明の抗リンゴ酸酵素モノ クローナル抗体を用いて、リンゴ酸酵素調製物の精製、または、これらか他のリ ンゴ酸酵素イソ酵素と交差反応しないならば、他のイソ酵素からミトコンドリア ＮＡＤＰ”依存リンゴ酸酵素を分離に使用する免疫アフィニティー・クロマトグ ラフィー・カラムを作製できる。

本発明のモノクローナル抗体の別の用途には、リンゴ酸酵素の免疫学的検出、並 びにリンゴ酸酵素発現の測定がある。もしも、本発明のモノクローナル抗体の他 のリンゴ酸酵素イソ酵素に対する反応性が無いか、または存意に低いならば、こ れらを用いてミトコンドリアＮＡＤ　（Ｐ）　′″依存リンゴ酸酵素を他のイソ 酵素から区別することが出来る。

リンゴ酸酵素を検出するのに本発明で使用しつる免疫検定法は、当業者には馴染 みの深い標準的方法に基づくものであって、これらの方法は多数使用可能である 。これらの方法は、測定する抗原物質と一つ以上の抗体間の複合体形成に基づく ものである。複合体パートナ−の一つ以上をラベル化しておくことにより、抗原 を検出、または定量することができる。このマーキングには、例えば、結合酵素 、ラジオアイソトープ、金属キレートまたは蛍光、化学発光、または生物発光物 質を用いつる。

競争的免疫検定法では、分析すべきサンプル中の抗原が、抗体結合部位への結合 を既知量のラベル化抗原と競争する。従って、抗体に結合したラベル化抗原の量 は、サンプル中の抗原量に反比例する。

ラベル化抗体を使用する試験では、ラベル化した結合抗体の量が抗原量に比例す る。

抗原への結合をお互いに妨害しない２つの抗体を使用した、抗体／抗原／抗体複 合体の形成に基づく検定法は、“サンドイッチ”免疫検定法と呼ばれる。

図面の簡単な説明 第１図− ヒト・リンゴ酸酵素の５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動。トレースＡ５ Ｂ：ＤＥＡＥ−セルロース・クロマトグラフィー（Ａ）およびＡＴＰ−アガロー ス・アフィニティー・カラム・クロマトグラフィー（Ｂ）を用いてリンパ球から 精製した天然の酵素。Ｃ：誘導された大腸菌ＸＬＩブルー細胞から精製した組み 換えタンパク質。

第２図： リンパ球から精製した天然のヒト・ミトコンドリア・リンゴ酸酵素のイモピロン Ｐを用いたエレクトロプロット。左トレース二分子量マーカー（ＬＭＷ、ファル マシア）。中央および右トレース：実施例１に従って精製した各５０％のリン調 駿酵素。

第３図： ヒト・リンゴ酸酵素のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。単離したｃＤＮＡクロ ーンの全ヌクレオチド配列か示されている。コード領域は大文字で示されており 、５′および３′非翻訳領域は小文字で示されている。このＤＮＡ配列から誘導 されるアミ／酸配列は、ヌクレオチド配列の下に示されている。

第４図工 均−３ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による組み換えヒト・ミトコンド リアＮＡＤ　（Ｐ）’依存リンゴ酸酵素の精気第５図： ＭＥＭ−３は、ヒト・ミトコンドリアＮＡＤ　（Ｐ）”依存リンゴ酸酵素を特異 的に認識する。

第６図： ＭＲＭ−３の種特異性。

以下の実施例は、本発明を説明するものである。

特記しないかぎり、実施例３−６においては、関連する参考書に見られるか、も しくは、業者の推薦する条件に基づく標準的な分子生物学的方法を使用している 。

実施例３−６の説明を簡単にするために、頻繁に繰り返される方法または名称に は略称を用いている。

ＤＮＡの“切断”または“消化″は、制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）に特 異的部位（制限部位）で制限酵素によりＤＮＡを触媒的に切断することを示す。

制限エンドヌクレアーゼは市販されており、業者の推薦する条件下（バッファ、 キャリヤータンパク質としてウシ血清アルブミン、抗酸化剤としてジチオスレイ トール（ＤＴＴ））使用する。制限エンドヌクレアーゼは、大文字、それに続く 小文字、およびローマ数字で表される。その文字は、その制限エンドヌクレアー ゼを単離した微生物に由来する（例えば、Ｓｍａ　Ｉ　：セラチア・マルセセン ス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ｏ通常、約１μｇのＤＮＡは１ 約２０μｌのバッファ中、■ユニット以上の酵素で切断する。また、通常、３７ °Ｃ１１時間のインキュベーション時間が使用されるが、これは業者の推薦条件 に依存する。切断後、５゛　リン酸基はウシ小腸由来のアルカリホスファターゼ （ＣＩＰ）とのインキュベーションにより除去することがしばしばある。これは 、引き続いて行われるリガーゼ反応において不都合な反応（例えば、第２のフラ グメントが挿入しなかった線状プラスミドの環状化）を除外するために行われる 。特筆しないかぎり、通常、ＤＮＡフラグメントは制限エンドデオキシリボヌク レアーゼによる切ＩＮＩ、脱リン酸化を行わない。アルカリホスファターゼとの インキュベーションの反応条件は、例えば、アマ−ジャムにより発行されている Ｍ１３クローニングおよびシーケンシング・ハンドブック、Ｐ　Ｔ／１２９／８ ３／ｌ　２に見ることが出来る。インキュベート後、フェノールおよびクロロホ ルムによる抽出でタンパク質を除去し、エタノールを添加してＤＮＡを水層から 沈殿させる。

特定のＤＮＡフラグメントの“単離“とは、制限消化で得られたＤＮＡフラグメ ントを、例えば、１％アガロースゲル等で分離することを示している。電気泳動 、およびエチジウム・ブロマイド（Ｅ　ｔ　Ｂ　ｒ）による染色によりＵＶ先光 下ＤＮＡを可視化した後、目的フラグメントを分子量マーカーにより位置決めし 、さらに、電気泳動によりＤＥ８１ペーパー（シレイチャーおよびシュル）に結 合させる。低塩バッファ　（２００ｍＭ　ＮａＣｌ、２０ｒｒＭトリスーＨＣｌ 　（ｐＨ７，５）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）で濯ぐことによりＤＮＡを洗浄し、つい で、高温バッファ（ＩＩＪ　ＮａＣ１，２０ｒｒＭトリスーＨＣｌ　（ｐＨ７， ５）、１ｍ　ＥＤＴＡ）で溶出する。このＤＮＡをエタノールで沈殿させる。

“トランスホーメーシゴン”とは、ＤＮＡを生物中に導入し、その結果、該ＤＮ Ａを染色体外、または染色体に組み込まれた形で複製しつるようにする事である 。大腸菌のトランスホーメーションは、アマ−ジャムにより発行されているＭ１ ３クローニングおよびシーケンシング・ハンドブック、Ｐ　Ｉ／１２９／８３／ １２に示されている方法で行う。

ＤＮＡの“シーケンシング１とは、そのヌクレオチド配列の決定のことである。

これを行うためには、先ず、シーケンシングするＤＮＡを種々の制限酵素で切断 し、そのフラグメントを同様に切断したＭ１３ｍｐ８、ｍｐ９、ｍｐ１８または ｍｐ１９二本ｌＤＮＡに導入するが、もしくは、ＤＮＡを超音波で断片化した後 、その末端を修復し、サイズで選択したフラグメントをＳｍａｌ切断し、脱リン 酸化したＭ１３ｍｐ８ＤＮＡに導入する（ショットガン法）。大腸菌ＪＭＩＯＩ にトランスホーメーション後、アマ−ジャムにより発行されているＭ１３クロー ニングおよびシーケンシング・ハンドブック、Ｐ　Ｉ／１２９／８３／１２に示 されている方法で組み換えＭ１３ファージから一本鎖ＤＮＡを単離し、ダイデオ キシ法でシーケンシングする（サンガー等、１９７７）。大腸菌ＤＮＡポリメラ ーゼＩのクレノー断片の使用に対する別法としてＴ７−ＤＮＡポリメラーゼ（“ シークエネース、ユナイテッド・ステーブ・バイオケミカル・コーポレーショグ ）の使用がある。シーケンシング反応は、ハンドブック“シークエネース：シー クエネースを用いたＤＮＡシーケンシングのためのステップ・パイ・ステップ操 作法”　（バージョン２）に従って行う。

シーケンシングの別法として、シーケンスすべきＤＮＡを、とりわけ、ＤＮＡ− 重鎖ファージ（Ｍ１３、ｆｄ）の複製オリジンを含むベクター（例えば、ストラ タジーンで作製されたブルースクライブまたはブルースクリプトＭ１３）にクロ ーニングする方法がある。組み換え分子による大腸菌ＪＭＩＯＩのトランスホー メーション後、そのトランスホーマントにヘルパーファージ（例えば、Ｍ１３Ｋ Ｏ７またはＲ４０８）を感染させる。結果として、ヘルパーファージとバッキン グされた一重鎖組み換えベクターの混合物か得られる。このシーケンシングテン プレートは、Ｍ１３法と同様に取り扱う。二本鎖プラスミドＤＮＡを先に述べた シーケンシングハンドブックに従い、アルカリ処理で変性し、直接シーケンシン グする。その配列は、Ｒ，スタチン（スタチン、１９８２）か開発し、Ｃｈ。

ピーラ−（ピーラ−１１９８７）により修正されたコンピュータプログラムで評 価する。

“ライゲーション”とは、二本＆１ＤＮＡフラグメントの両末端間にホスホジエ スデル結合を形成させる過程に関する。通常、適当なバッファ溶液１０μｌ中、 ０、０２−０．２μｇのＤＮＡフラグメントを約５ユニツトの７４−ＤＮＡリガ ーゼてライゲーションする（マニアチス等、１９８２）。

トランスホーマントからのＤＮＡの“調製“とは、リゾチームを省くようにバー ンポイムおよびドーリ−によって修正されたアルカリＳＤＳ法を用いて、細菌す らプラスミドＤＮＡを単離することである。１．５−５−５Ｏの培養物の細菌を 使用する。

“オリゴヌクレオチドとは、化学的に合成した短いポリデオキシヌクレオチドで ある。これにはアプライド・バイオシステムズの合成機モデル３８１Ａを使用し た。オリゴヌクレオチドは、モデル３８１Ａユーザー・マニュアル（アプライド ・バイオシステムズ）に従って調製した。（シーケンシング・プライマーはさら に精製すること兼しに直接使用した。その他の鎖長７０までのオリゴヌクレオチ ドは、“ＯＰＣ″法（ＯＰＣ＝オリゴヌクレオチド精製カラム、アプライド・バ イオシステムズ、プロダクト・プレチン、１９８８年１月）で精製した。より長 いすりゴヌクレオチドは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（６％アクリルアミ ド、０．１５％ビスアクリルアミド、６Ｍ　尿素、ＴＢＥバッファ）で精製し、 ゲルからの溶出後、Ｇ−２５セフアロース・カラムて脱塩した。）“ポリメラー ゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）“は、特異的ＤＮＡの酵素的インビトロ 増幅法である。特異的オリゴヌクレオチドブライマーおよび熱安定性ＤＮＡポリ メラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）を用いて、短時間に大量のコピーを合成しつる 。この反応には、増幅するＤＮＡの領域の隣接する配列を有し、従ってその相補 鎖にハイブリダイズする２つのオリゴヌクレオチドブライマーを使用する。ハイ ブリダイズするプライマーは、その３°末端か互いに反対方向に配置するので、 ＤＮＡポリメラーゼによる合成は、そのプライマー間のＤＮＡテンプレートの領 域で進行する。各プライマーは新たに合成された鎖に相補的であるので、各々の 新しい鎖も次のサイクルのプライマー伸張および配列増幅においてテンプレート として参加する。従って、変性、プライマー・ハイブダイゼーションおよび酵素 的伸張のステップを含む各サイクルで、その前のサイクルからのＤＮＡ量は二倍 になる（アーリッヒ等、１９８８；マリスおよびファローナ、１９８７）。この 方法は、短期間のうちに既知配列の分析または検出（例えば、胎児診断、法医学 ）、非クローン化物質の直接的シーケンシング、ハイブリダイゼーション・プロ ーブの生成、ＤＮＡ操作の分野（制限部位の挿入、部位指定突然変異誘発、プロ モーターの付加等）および（部分的）未知配列の分析およびクローニング（例え ば、ペプチド配列に基づく縮退オリゴヌクレオチドの使用によるｃＤＮＡの入手 、および、染色体ＤＮＡ中のイントロンの部位およびサイズのｃＤＮＡによる検 出）等に広範囲に利用されている。

実施例１ リンゴ酸酵素の精製 約２．５Ｘ１０１ｏ個のリンパ球（ヒトのトランスホームＴリンパ球細胞系列１ ３０１；ボド、１９８１）を２．６００ｒｐｍで５分間、へりウス−クリスト・ ミニフユージ２遠心機で遠心し、８２．５ｍＭ　ＮａＣ１，２，５ｄｌＫＣＩ、 １　ｒｄＪＮ　ａ　２ＨＰＯ，，５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，９）を含むバ ッファで洗浄後、４００＋ｎｌのバッファＡ（２０繭　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ ７，４）、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２５！ｉｌサツカロース）中でホモジナイズ した。細胞核およびデブリは、２．５００ｒｐｍ　。

１０分間のベックマンＪＡ２１−２５０ｍｌローターによる遠心で除去した。ミ トコンドリアは、同ローターによる１０，０００ｒｐｍ、１５分間の遠心で単離 した。

ミトコンドリア・フラクションをバッファＡで２度洗浄し、５０ｍ１のバッファ Ｂ（５蘭　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，６）、５０ｍ　ＫＣＩ、０．１繭　ＥＤＴＡ 、０．５蘭ＤＴＴおよび０．２％　ラブロールＰＸ（シグマ））に懸濁した。超 音波処理てミドコンド刃アを破壊した（ブランソン超音波発生機を用い氷水中、 最高出力３０秒×６、超音波処理時間の間に２分間の冷却）。破壊したミトコン ドリア・フラクションに最終濃度１５％となるようにグリセリンを添加し、この 混合物を４°Ｃ１４０，０００ｒｐｍ、３０分間、ベックマンＴｉ５０．２０− ターを用いて遠心し、等容量のバッフｙＤ（３０ｍｌｉｌ　トリス−ＨＣＩ（１ ）Ｈ７，４）、１．５＋ｍ　Ｍｇ　ＣＩ　２．０．５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２ｍ Ｍ　ＤＴＴおよび２０％グリセリン）で希釈した。このサンプルをＤＥＡＥイオ ン交換カラム（１２Ｘ２．５ｃｍ　ＤＥ５２、ワットマン）に入れ、２００ｍ１ のバッファＤで洗浄した。ついで、ＫＣＩの濃度勾配（バッファＤ中４Ｏ−１２ ０ｎ＃　ＫＣＩ）でカラムを洗い出すと、リンゴ酸酵素は８０−９ＭＪ　ＫＣＩ の濃度で溶出した。この溶出液の活性成分を合わせ、等容量のバッファＤで希釈 した後、Ｉｎｎ　フマル酸およびｌｎｍＭｎｃｌ□となるように調製した。（リ ンゴ酸酵素活性はマンデラおよびソア（１９７５）に示されているように、３４ ０ｎｍにおける吸光度で記録した。この反応混合物には、２０ｍＭ１−リス−Ｍ ＣＩ　（ｐＨ７，４）、１ｍＭ　Ｍｎ　Ｃ＋　２　、Ｏ，１２ｍ１ｉｌ　ＮＡＤ ″″および２．５蘭　フマル酸が含まれていた。測定は、温度コントロール・キ ュベツト・ホルダーを装着したベックマンＤＵ６４分光光度計で行った。）この サンプルを５ｍｌのＡＴＰ−アフィニティーカラム（タイプＩＩ　ＡＴＰアガロ ース・アフィニティー・カラム、ファルマシア）に添加した。このＡＴＰカラム からバッファＤ＋１００ｍＭ　ＫＣＩ＋４ｍ１ｉｌ　ＮＡＤ”で高純度のリンゴ 酸酵素を溶出し、等容量のバッファＤて希釈した後、２ｍｌのＤＥＡＥカラムで 濃縮した。

第」回のＤＥＡＥカラムからは、６．４００ｍＥのＮＡＤ”依存リンゴ酸酵素か 得られた（１ｍＥ＝３７℃、１分間にｌｎＭｏ１のＮＡＤＨを生成する）。

第１図は、このサンプルの一部を用いたゲル電気泳動の結果である（１０％５Ｄ Ｓ−ポリアクリルアミド（レムリ、１９７０Ｌ染色はバイオラット・シルバー・ カラー・キットを用いて行った）。このステップで得られたリンコ奄酵素の純度 は８０％以上である。（最終精製ステップでは、組み換えリンゴ酸酵素の精製に 実施例７て使用したパラメーターを用い、ＦＰＬＣて均一にまで該酵素を精製し た。） 実施例２ トリプシン分解ペプチド断片のアミノ酸配列分析ａ）　メンブレンへのエレクト ロプロット実施例１に従って精製した大部分のリンゴ酸酵素（純度８０％）を２ ．５ｍＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５）に対して十分透析し、凍結乾燥後、Ｓ ＤＳキャリヤーバッファに溶解してゲル電気泳動て分離した。これを行うために 、サンプルはメルカプトエタノールで還元し、１０％ポリアクリルアミド・ゲル のレーン２個にチャージした。分離距離＋５．５ｃｍ、ゲル厚さ　０．７５＋ｗ ＋、運転条件＝１００分間、１５０Ｖ定電圧の条件で“マイティー・スモール” システムを使用した。

電気泳動後、不連続バッファ・システムによるセミ・ドライ法を用いて、ゲルを 適当な大きさのイモピロン・Ｐメンブレン（ミリポア製）にブロッティングした 。転移バッファには、アノード側に２０％メタノールを含む０．３Ｍまたは０． ０２５Ｍ　トリス−ＨＣｌ　（１）ＨＩｏ、４）、カソード側に４０−　ε−ア ミノカプロン酸および２０％メタノールを含む０．０２５Ｍ　トリス−ＨＣＩ（ ｐＨ９，４）を使用した（キース・アンプルセン、１９８４）。プロット条件・ ０．８ｍＡ／Ｃｍ２、プロット時間二６０分。プロットされたタンパク質は、メ タノール／酢酸／水（５／ｌ１５）中、０．０５％のコマージ・ブルーで染色し た。

メンブレンへのエレクトロプロットを第２図に示す。約６４ｋＤａのメインバン トが均一なリンゴ酸酵素である。この結果は、ゲル上に約６４ｋＤａの位置に唯 一のバンドか観察される分析的ゲル電気泳動の結果（第１図、トレースＢ）との 関連から確認される。

ｂ）トリプシン分解ペプチドのマツピング過去のＮ末端シーケンシングから、リ ンゴ酸酵素のＮ末端はブロックされていると考えられるので、イモピロンにプロ ットしたタンパク質をプロット上で直接トリプシンで分解した。これを行うため に、実施例２ａ）に従ってプロットしたリンゴ酸酵素の均一バンドを切り出し、 メタノール／酢酸／水（５／１１５）で十分に脱色した。このメンブレンの小片 を、３７℃、３０分間、１００ｍＭ　酢酸中０．５％のＴｗｅｅｎ２０を用いて ブロックした。蒸留水で数回洗浄することで過剰のＴｗｅ　ｅ　ｎ　２０を除去 した。プロットしたリンゴ酸酵素は、エッペンドルフ・チューブ中、３７°Ｃ（ ２４時間）でトリプシン処理して分解した。メンブレンの小片は、２％（Ｗ／冑 ）（リンゴ酸酵素に基づ＜）トリプシン（ベーリンガー・マンハイム、シーケン シング・グレード）を２０ツトを添加した５％アセトニトリルを含む１ｏｏｎ４ 　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，２）２００μｌ中でインキュベートした。生成し たトリプシン分解ペプチドは、デルタ・ノくりＣ１８カラム（ウォーターズ、３ ．９ｘ１５０ａｎ、粒径５μｍ、ポアサイズ１００人）および移動相として０． １％トリフルオロ酢酸水溶液（溶離液Ａ）またはアセトニトリル（溶離液Ｂ）を 用いた３０°Ｃでの逆相ＨＰＬＣで分離した。勾配の増加は、５５分間に溶離液 Ｂの０−５５％で行い、その後、５５％Ｂを１５分間維持した。流速は１　ｍｌ ／ｍｉｎて行い、検出は、２１４　ｎｍ　（０，１ＡＩＪＦＳ）および２８０　 ｒｌｆｆｌ（０，ＯＩ　ＡＵＦＳ）を平行して測定した。

Ｃ）トリプシン分解ペプチドの配列分析ｂ）で得られたリンゴ酸酵素のトリプシ ン分解ペプチドの一部を自動アミノ酸配列分析にかけた。これを行うために、逆 相ＨＰＬＣの対応するピークを回収し、乾燥後、７５μｌの７０％蟻酸に溶解し た。この溶液を、業者の推薦するシーケンシング条件を用いたアプライド・バイ オシステムダ４フフム＜７レスド・リキ、ｙド・フェーズ・シークエネーターに よるシーケンシングに直接使用した。表１にトリプシン分解ペプチドの配列分析 の結果を示すが、括弧付きのアミノ酸は、精度良く検出することか出来なかった 。（“Ｘａａ”は、この時点でこのアミノ酸が同定できなかったことを意味する 。）トリプシン分解ピーク３６および４４には、各サイクルにほぼ等量の２つの アミノ酸が存在する。結果的に、最初はこれらを２つのペプチド配列に割り振る ことが出来なかった。後に、ｃＤＮＡ配列を用いることにより２つのペプチド配 列を同定できた。

表１ ピーク　アミノ酸配列　ｃＤＮＡ配列 からのＡＳ番号 ３６　Ｉ：Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−５３０−５３８Ｔｙｒ− Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ Ｉ［：Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−（Ａｒｇ）　９５　−９８４４　１：（Ａｌａ ）−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｇｉｎ−４９７−５１１Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ −Ｇｌｕ−（Ｇｌｕ）−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＡｒｇＩＩＩ（Ｓｅ ｒ）−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｘａａ−Ａｓｎ−１４５−１５６Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｇｌ ｕ−Ａｓｎ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ ５２　（Ａｓｐ）−（Ｍｅｔ）−Ｔｈｒ−Ｇｉｎ−Ｇｉｎ−２２６−２４０Ｔｙ ｒ−（Ａｓｐ）−（Ａｓｐ）−Ｌｅｕ−１１ｅ−（Ａｓｐ）　−Ｃ；ｌｕ−Ｐｈ ｅ−Ｍｅｔ−（Ｌｙｓ）５６　（Ａｓｎ）−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｇｌｎ− ２４９−２６４Ｐｈｅ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｃ；ｌｙ−Ａｓｎ−Ｘａａ− Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−（Ａｒｇ） ６４　（Ｓｅｒ）−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−５６０−５７９（Ａｌａ ） Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−（Ｃｙｓ）−Ｐｒ ｏ−（Ｇｌｕ）　−Ｘａａ−Ａｌａ−３ｅｒ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−７２（Ｉｌｅ） −（Ａｓｐ）−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−３５８−３７７Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈ ｅ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−３ｅｒ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｓｅｔ−１１ｅ−Ｐｒ ｏ−（Ａｓｐ）−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−実施例３ トリプシン分解ペプチドのアミノ酸配列に相補的なオリゴヌクレオチドの調製ト リプシン分解ペプチド（ペプチド５６および６４）の部分的領域に相補的な縮退 （６４−９６倍）デオキシオリゴヌクレオチド（以後、“オリゴヌクレオチドと 呼ぶ）を調製し、かつ、これに、後のサブクローニングを容易にするためにＥｃ ｏＲＩ制限切断部位を含ませた。ある場合には（ペプチド５６、ＦＢＩ−２８２ ４）、ペプチド配列か細胞質リンゴ酸酵素の領域と高い類似性を示し、また、別 の場合には（ペプチド６４、ＦＢＩ−２８３４）、それらか比較的低レベルの縮 退を存することから、これらのペプチド配列を選択した。

オリゴヌクレオチドＦＢＩ−２８２４（ペプチド５６）ニー　Ｉｌｅ　−Ｇｉｎ 　−Ｐｈｅ　−Ｇｌｕ　−Ａｓｐ　−Ｐｈｅ　−Ｇｌｙ　−ＡＣＧＧＡＴＣＡ　 ＡＴＡ　ＣＡＡ　ｍ　ＧＡＡ　ＧＡＣＴｒＣＧＧＥｃｏＲ［ＣＧ　ＣＧ　Ｔ　Ｔ オリゴヌクレオチドＥＢＴ−２８２４は、その配列の３′末端に存在する。すな わち、これはリンゴ酸酵素のコード鎖と同一である。

オリゴヌクレオチドＥＢＩ−２８３４（ペプチド６４）ニー　Ｐｒｏ　−Ａｓｐ 　−Ｖａｌ　−Ｔｙｒ　−Ｇｌｕ　−Ｃｙｓ　−Ｐｒｏ　−（Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　 Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ）ＡＣＧＴＧＡＡＴｒＣＧＧ　ＡＣＡ 　ＣＴＣＡＴＡ　ＡＡＣＡＴＣＴＧＧＥｃｏＲ［Ｇ　Ｔ　Ｇ　ＣＧ Ｇ 丁 このオリゴヌクレオチドは、この配列の５°末端に存在し、右方向に向いている 鎖と逆相補の関係にある。

実施例４ ポリメレース・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）によるｃＤＮＡライブラリー からのリンゴ酸酵素配列の増幅 リンゴ酸酵素特異的ＤＮＡのＰＣＲ増幅には、ヒト・フィブロザルコーマ細胞系 列Ｈ３９１３のｃＤＮＡライブラリーを使用した。

ＣＤＮＡライブラリーの調製は、出発物質にヒトＴＮＦ−ａ　（１０ｎｇ／ｍｌ ）で刺激して培養した細胞系列Ｈ３９１３Ｔの１０９個のフィブロザルコーマ細 胞を使用すること以外は、ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーに関するＥＰ−ＡＩ− ０２９３に示されている方法を用いた。λｇｔｌＯの代わりに、λｇｔｌｌを使 用した（ｃＤＮＡ合成ニアマージャムＲＰＮ１２５６　；ＥｃｏＲＩ消化λｇ消 化１アｔ１１アームガ・バイオチク：ライゲーションＤＮＡのインビトロ・パッ キング二ギガパック・プラス、ストラタジーン）。

ＰＣＲ増幅は、９５°Ｃで熱変性したファージ上清５μｌ（それ以前にその他の 精製ステップ無い、５０ｍＭ　ＫＣＩ、１０ｄｌ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８， ３）１．５−　ＭｇＣｌ□、０．０１％ゼラチン、０．２−　デオキシヌクレオ チドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ１ｄＣ；ＴＰおよびｄＴＴＰ、各２００ｐｍｏ１　２個 のプライマーおよび２ユニツトのＴａｑポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイ ム）を含むｌＯＯμｌの反応溶液で行った。０．１ｍｌのパラフィンで覆うこと により反応混合物からの蒸発を防いだ。ＰＣＲは、パーキン・ニルマー製のサー マル・サイクラ−を用い、以下のパラメーター： ９５℃、４５秒（変性）： ４０°Ｃ１４５秒（低ストリンジエンシー条件でのアニーリング）ニア２°Ｃ１ ３分（合成） で３０サイクル行った。得られた生成物は完全に均一なものではなかった。アガ ロースゲル電気泳動（０，８％ジ−プラーク、ＦＭＣコーポレーション）は、約 １１００ｂｐ長の主要ＤＮＡフラグメントおよび育意に小さいフラグメント（約 ３００ｂｐ長）を示している。

実施例５ ＰＣＲ増幅で得られたＤＮＡフラグメントのクローニングおよびシーケンシング ラット由来の細胞性リンゴ酸酵素とのホモロジー比較から、実施例４で得られた フラグメントの大きい方が目的のフラグメントであると考えられるので、これを アガロースゲルから溶出した。このＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩ切断したプ ラスミドｐＵＣ１８にライゲージコンし、このライゲーション混合物で大腸菌Ｊ ＭＩＯＩをトランスホーメーシ３ンした。挿入物の長さを測定するために、ミニ プレバレージョン法で調製したプラスミドをＥｃｏＲＩで切断し、これを電気泳 動した。次に、この挿入物について二本鎖の両サイドから２つのｐＵＣ特異的プ ライマーを用いてシーケンシングし、このステップで両末端から始めの２５０− ３００ｂｐを決定した。目的のクローンをｐＵＣ＊ｈｍｔＭＥＡと命名した。配 列比較により、ａ）　ＰＣＲで使用したプライマーに続＜ＤＮＡフラグメントは 、その他のアミノ酸配列と一致しており、かつ、ｂ）　ｃＤＮＡ由来のアミノ酸 配列がそのＮ末端において報告されている細胞質性ラットリンゴ酸酵素の配列と 育生なホモロジーを有していることから、このフラグメントが高い確度でリンゴ 酸酵素をコードしていることが示された。

実施例６ リンゴ酸酵素ｃＤＮＡクローンの単離 ａ）　ヒト・フィブロザルコーマｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング完全な 長さのｃＤＮＡクローンを探索するためにフィルター・ハイブリダゼーション法 を用いた（ベントンおよびデービス、１９７７）。ハイブリダイジング・プロー ブには、実施例４で得たリンゴ酸酵素ｃＤＮＡフラグメントを使用した。

Ｈ３９１３Ｔ　ｃＤＮＡライブラリーの約２００．０００個のファージを大腸菌 Ｙ１０８８と共にＬＢトップアガロース（０，７％ＬＢ−アガロース）に混合し 、１５ｃｍのＬＢ寒天シャーレにブレーティングした（シャーレ当たり約２０． ０００個のファージプラーク）。このプレートは、プラークかおよそピンヘット の大きさになるまで、３７℃で約６時間インキュベートした。各プレートから２ 枚のニトロセルロース・フィルター抽出物を調製した（シュレイチャー・アンド ・シュル、ＢＡ８５フィルター）。このフィルターを変性バッファ（０，５Ｍ　 ＮａＯＨ１１，５Ｍ　ＮａＣ１）中で５分、再生バッフｙ（０，５Ｍ）リス−Ｈ Ｃ１（ｐＨ７，５）、３Ｍ　ＮａＣＩ）中で５分、および２０ＸＳＳＣ（３ＭＮ ａＣ１，０，３Ｍ　クエン酸ナトリウム）中で１分処理した後、真空オーブン中 、８０°Ｃで１時間焼いた。

放射性ハイブリダゼーション・プローブの調製：ＰＣＲから得られ、サブクロー ニングしたリンゴ酸酵素特異的フラグメントをＥｃｏＲＩでｐｔｒｃｉｓから切 り出し、低融点アガロースゲル（ＦＭＣジ−プラーク）から溶出した。このフラ グメントｌｏＯｎｇを１００℃、５分間で変性させランダム・ブライミングによ り放射能ラベルした。５０μｌの反応溶液には、以下のものが含まれる： １５μｌの”Ｐ−ｄＣＴＰ　（１５０ｍｃｉ　）５μｌのｉｏｘクレノー・バッ ファ（１００ｒＩＭトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ８，０）１００ｍＭ　ＭｇＣ１＊） １００１ｇの変性ＤＮＡフラグメント 各２μｌのｌ繭　ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ５０μｌとなるようにＨ， ０ １０ユニツトのクレノー酵素（ベーリンガー・マンハイム）。

この混合物を室温で３０分間インキュベートした。未反応の放射性ヌクレオチド は、“スピン・カラム”　（ファルマシア）で分離した。合計ｌＸ１Ｏ”ｃｐｍ がＤＮＡ中に取り込まれた。

ニトロセルロース・レプリカのハイブリダゼーション：振盪恒温槽を用い、２０ ０ｍ１のプレハイブリダイジング・バッファ（３ＸＳＳＣ１１×デンハード液（ マニアチス等、１９８２）、５０％ホルムアミド、０．５％ＳＤＳおよび１００ 　μｇ／ｍｌのサケ精子変性ＤＮＡ）中、４３°Ｃで２時間、レプリカをインキ ュベートした。その後、プレハイブリダイジング・バッファを２００ｍ１のハイ ブリダイジング・バッファ（ｌＸｌＯ”ｃｐｍの放射能を添加したプレハイブリ ダイジング・バッファに相当する：比活性５００．　ＯＯＯｃｐｍ／ｍｌ）に置 換した。ハイブリダゼーションは、振盪恒温槽中、４３℃、２０時間行った。

このフィルターに対し２ＸＳＳＣ，０，５％ＳＤＳ中、６５℃、１５分間の洗浄 を４回行い、これを乾燥後、アマ−ジャム・ハイパーフィルムおよびアンブリフ ァイヤ・フィルム（デュポン・クロネックス）を用いて一晩感光させた。２つの 明確なポジティブ・シグナルか得られ、このプラークを針で正確に突き刺しファ ージを釣り上げた。このファージを５００ｍ１のトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，５ ）、１０ｔｒＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　ｔに懸濁し、種々の希釈率で９ｃｍシャーレに ブレーティングして、３７℃で一晩インキユベートした。約１００個のプラーク を含むプレートから、先に述べたようにハイブリダイズするフィルター抽出物を 調製した。明確なシグナルかうよ（単離したプラークに割り当てられるまで、こ の操作を繰り返した。

ラムダ−ｇｔ１１特異的プライマーＥＢＩ−１８８０および１９１３を用いたＰ ＣＲによるサイズ測定は、得られたクローンの１つが、完全長のクローンに期待 される長さに対応する約２００ｂｐの挿入物を有していることを示している。こ のクローンのＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩで切断した。この挿入物は、内部にＥ ｃｏＲＩ制限切断部位を有していることか分かった。このＤＮＡをＥｃｏＲＩに より部分分解し、完全な挿入物の大きさのフラグメントを低融点アガロースゲル から溶出した。このフラグメントをベクターＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＫＳ＋（ス トラタジーン、う・ジョラ）のＥｃｏＲＩ切断部位にクローン化した。制限地図 により、各々反対方向に挿入物を含む２つのクローンか得られた（ＢＳ＊ｈｍｔ ＭＥ−ｆｏｒｗおよびｈｍｔＭＥ−ｒｅｖ）。

ｂ）リンゴ酸酵素クローンのシーケンシング：ａ）で得られたＢＳ＊ｈｍｔＭＥ −ｆｏｒｗおよび−ｒｅｖを、ダイデオキソ−チェーン・ブレーク法によるユニ バーサル・シーケンシング・プライマー（ＥＢｌ−１５１３）を用いたシーケン シングで検定した。このために、得られた配列情報を基づいて１９個の両方向に 配向する挿入物特異的プライマーを調製し、両方向に重複しながら、このクロー ンを完全にシーケンシングした。完全なヌクレオチド配列、および、それから誘 導されるアミノ酸配列を第３図に示す。このシーケンシングしたクローンは、５ ８４個のアミノ酸をコードするオープン・リーディング・フレームおよび３′末 端に２６ｂｐ長のポリＡテールを含んでいる。

実施例７ 大腸菌におけるリンゴ酸酵素の発現 ａ）発現プラスミドの調製 ヒト・ミトコンドリア・リンゴ酸酵素を発現するために、ＤＥ−Ａ−３８１０４ ７４に報告されている、誘導可能なトリプトファンオペロンを含む発現ベクター ｐＲＨ２８１（プラスミドｐＥＲＩ０３（ＥＰ−Ａ−０１１５６１３）の誘導体 ）を使用した。２つの構築物を調製した：１つのクローンは、リンゴ酸酵素の完 全なコーディング配列を含み、第２のクローンは、アミノ酸１９−５８４をコー ドする領域、即ち、推定されるミトコンドリア・シグナル配列を欠く領域を含ん でいる。これらの発現プラスミドは、以下のように調製した。

精製したＢＳ＊ｈｍｔＭＥ−ＤＮＡを用いたＰＣＲにより、その中央にコーディ ング領域（ミトコンドリア・リーダー・ペプチドをコードする配列を持つもの、 または持たないもの）、３゛末端にＨｉｎｄｌ［［切断部位（ＥＢ　Ｉ−２９８ ２）および５゛末端にＸｈｏ　Ｉ切断部位、シャイン・ダルガルノ配列（リボゾ ーム結合部位）、および、そのペプチドの５′末端に特異的な２０塩基対の配列 （ＥＢＩ−２９８０：リーダー育り、ＥＢＩ−２９８１：リーダー無し）を育す る２つの構築物を調製した。ＰＣＲは、実施例４で示したバッファ系を使用した 。

以下の反応条件で３０サイクル行った：９５℃、４５秒変性； ５５℃、４５秒アニーリングニ ア２℃、５分合成。

得られたＰＣＲ産物をＸｈｏＩおよびＨｉｎｄｌｌＩで切断して、ミトコンドリ ア・リーダー配列有り、または無しのリンゴ酸酵素発現カセットを精製し、これ を発現ベクターｐＲＨ２８１にライゲーションした。Ｃａ”＋コンピテント大腸 菌ＸＬｌ−ブルー（ストラタジーン、う・ジョラ）のトランスホーメーション後 、相当するプラスミドを含むクローンをアンピシリン選択で単離した。ミトコン ドリア・リーダー配列を持たないリンゴ酸酵素を含むプラスミドをｐＲＨ２８１ ＊ｈｍｔＭＥと命名した。配列の正確性は、シーケンシング（サンガー等、１９ ７７）で確認した。両構築物から対応するタンパク質を誘導可能的に、かつ、高 収率で生産するクローンか得られた。しかし、ミトコンドリア・リーダーをコー ドする配列を含む構築物からは、不活性型の酵素か得られた。この理由としては 、非ブロセソング前駆体の不溶性またはミトコンドリア・リーダーによる該タン パク質の活性の阻害か挙げられる。

（ｂ）組み換えリンゴ酸酵素の醗酵的生産および精製ｐＲＨ２８１４ｈｍｔＭＥ でトランスホーメーシ３ンした大腸菌ＸＬＩブルー（ストラタジーン、う・ジョ ラ）細胞を１００　ｔｔｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１リツトルのルリア培地 で対数増殖期のおよそ中間まで培養し、そこで５０Ｍｇ／ｍｌのインドールアク リル酸で誘導して、さらに３時間培養した。このバクテリアのサスペンションを ベックマンのローターＪＡ−１０を用い、４０００ｒｐｍで遠心し、１０ｍ１の バッフｙＡ（２０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ　（ｐＨ７，４）、１ｍ　ＥＤＴＡ、０ ．２５Ｍ　サッカロース）で回収した。この細胞を超音波処理（ブランソン超音 波発生機、最大出力、３０秒×２回、超音波処理の間に氷による２分間の冷却） で破壊した。破壊した細胞に最終濃度１５％となるようにグリセリンを添加し、 この混合物をベックマンのＴｉローターを用い、４°Ｃ，４０，００Ｏｒｐｍで ３０分間遠心し、等容量のバッファＦ（３０Ｏｍ　トリス−ＨＣｌ　（ｐＨ７， ４）、２０抛ｌＫＣｌ、３嘘　ＭｇＣＩｔ、０．２ｍＭ　ＤＴＴ、０．２＋ｍ　 ＥＤＴＡ）に希釈した。

このサンプルを直接、バッファＦで平衡化したＤＥＡＥイオン交換カラム（２０ Ｘ３ｃｍ、ワットマンＤＥ５２セルロース）に入れ、４００ｍ１のバッファＦて 洗浄した。組み換えリンゴ酸酵素を該バッファ中のＫＣＩ濃度勾配（４０−１７ ０鴎ＩＫＣＩ）でカラムから溶出すると、ヒト細胞由来の天然のタンパク質と同 様に、８ＭＪ　ＫＣＩの濃度の所てカラムから溶出した。内在性細菌リンゴ酸酵 素は、１５０−１７０ｍＭ　ＫＣＩの濃度で溶出した。溶出物の活性フラクショ ンを合わせ、等容量のバッファＦで約１００ｍ１に希釈した。（リンゴ酸酵素活 性は、実施例１の方法で測定した。）このサンプルを１ｍｌＪＭｎｃ１２の濃度 に調整し、１０ｍ１のＡＴＰアフィニティーカラム（ファルマシア　タイプＩＩ 　ＡＴＰ　アフィニティーカラム）にチャージして、１００ｍ１のバッファＦ＋ ｌ酬　フマル酸／ＭｎＣ１ｚで溶出した。リンゴ酸酵素をバッファＦ＋１００ｍ Ｍ　ＫＣＩ＋１蘭ＮＡＤ＋でカラムから溶出したところ、ゲル電気泳動によると （実施例１の方法で行った。第４図、トレースＣ参照）、該酵素の純度は少なく とも９５％であつた。この精製蛋白質の収量は、細菌培養物１リツトル当たり約 ２ｍｇであった。

（全細菌サスペンションのゲル電気泳動を分解した細菌の可溶性超遠心物のゲル 電気泳動と比較することにより、生成したリンゴ酸の約９５−９８％は不溶性の 封入体として生ずることか分かった。）ＡＴＰクロマトグラフィー後のリンゴ酸 酵素にも僅かな蛋白質不純物か含まれている。均−物までの完全な精製は、５１ ５ＭｏｎｏＱカラム（ファルマシア）によるＦＰＬＣ（ファルマシア）イオン交 換クロマトグラフィーにより行った。（以下のパラメーターに従った＝２５蘭ト リス（ｐＨ７，４）、３ｍ１Ｊ　ＭｇＣＬ　、Ｉｎ！ｌ　ＥＤＴＡ中、２０−１ ５２０−１５Ｏの塩濃度勾配８０ｍ１、流速１ｍｌ／ｍ１ｎ）　この方法で精製 したヒトＮＡＤ（Ｐ）°依存リンゴ酸酵素は、ゲル電気泳動により少なくとも９ ９％の純度であることが確認された。（精製しこリンゴ酸酵素０．　５および５ μｇを１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離し、蛋白質バンドは“銀染色 試薬キッド　（バイオラド）を用いた銀染色で可視化する。一方、リンゴ酸酵素 の実質的な均一性は、ゲルに５μｇのオーバーロードしたときでさえ、混入バン ドは出現しなかつたことて確認される。ＳＤＳゲルを第４図に示す。）実施例８ ヒトＮＡＤ　（Ｐ）＋依存リンゴ酸酵素に対するモノクローナル抗体の調製（ａ ）免疫化： ３匹の週令約６歳の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、実施例７に従って調製し、均一 に精製したリンゴ酸酵素を用いて、以下に示す計画で免疫化した。

−次免疫化：完全フロインドアジュバント中、マウス当たり約１０μｇのリンゴ 酸酵素を腹腔内注射で投与 二次免疫化ニー次免疫化の４週間後、不完全フロインドアジュバント中、マウス 当たり約ｌＯμｇのリンゴ酸酵素を腹腔内注射で投与三次免疫化二二次免疫化の ４週間後、ＰＢＳ　（リン酸緩衝液）中、マウス当たり約ｌＯμｇのリンゴ酸酵 素を腹腔内注射で投与１１日後、マウスから血清サンプルを採取し、ＥＬＩＳＡ テストを行い、血清値を測定した。（ＥＬＩＳＡテストは、実施例９ａ）に従っ て行った。血清は、１１０’から１：１０１希釈物をテストした。）最もレベル の高いマウスに対し、３日間続けて３μｇのリンゴ酸を投与した。このマウスの 牌臓を／Ｘイブリドーマ細胞との融合に使用した。

ｂ）融合・ マウスの牌臓を無菌状態で摘出し、機械的に砕いてから、無血清培地（１％抗生 物質および１０％Ｌ−グルタミンを添加したＲＰＭＩ　ｌ　６４０）で洗浄した 。

約１０”個の牌細胞をケラ−およびミルシュタイン（１９７５）の方法を用い、 ＰＥＧ４０００（無血清培地中４０％）の存在下でミエローマ細胞系列Ｐ３Ｘ６ ３　Ａｇ８．６５３　（カーニー等、＋９７９）約１０”個と融合した。その後 、細胞をＨＡＴ選択培地（１％抗生物質、ｌＯ％Ｌ−グルタミンおよび２０％Ｆ Ｃ８を補ったＲＰＭ１１６４０培地に、１０−’Ｍヒボキサンチン、４ＸＩＯ− ’Ｍアミノプテリン、および１．６　Ｘ　１０−’Ｍチミジンを添加した培地） に懸濁し、９６穴の細胞培養プレートに分配した。５日後、クローンに栄養を与 え、１１日後、上溝を採取して抗体生産に関するＥＬＴＳＡテストを実施例９ａ ）に従って行った。

このテストで１２４個のポジティブクローンか得られた。約２５日後、ＨＡＴ培 地をＨＴ培地に交換し、さらに、１０日後、通常の培養培地（１％抗生物質、ｌ Ｏ％Ｌ−グルタミン、１０％ＦＣＳを含む完全なＲＰＭＩ　１６４０）に交換し た。

Ｃ）ハイブリドーマの選択およびクローニング：全ての上溝に関する最初のテス トの後、１２４個のポジティブクローンの反応特異性（抗原育り、および、無し ）を調べた。さらに、テストで５個の（ポリ）−クローンが生じ、これらを限界 希釈法で再クローン化した。希釈は１００μｌの培養培地が１個の細胞を含むよ うに行い、これを９６穴のプレートのウェルに入れた（前日、ウェル当たり１０ ０μＩのマウス末梢マクロファージ懸濁液を満たしておいた全部で３枚のプレー トを用いた。）。さらに、５個のモノクローン（ＭＥＭ−１からＭＥＭ−５）の 上溝を分析した（実施例９ｂ参照）。

インビボで抗体を生産するために、各ハイブリドーマ培養物ＭＥＭ−１からＭＥ Ｍ−５の約１５Ｘ１０＠個の細胞を３日前に０．５ｍｌの不完全フロインドアジ ュバントで処理したＢＡＬＢ／ｃに腹腔内終車下。７−１Ｏ日後、腹水を採取し た。

生成したモノクローナル抗体を硫安沈殿させ、業者（ファルマシア）の説明書に 従ってキャリヤー結合プロティン−Ｇを用いたアフィニティー・クロマトグラフ ィーで精製した。テスト用として生産物の一部をホース・ラディッシュ・パーオ キシダーゼに結合した（ウィルソン等、１９７８）。

実施例９ モノクローナル抗体ＭＥＭ−ＩＳＭＥＭ−２、ＭＥＭ−３、ＭＥＭ−４、ＭＥＭ −５の分析 ａ）酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）検定は標準法に従って行った。コス タ−３５９０型の９６穴マイクロプレートをリンゴ酸酵素１　ｔ１ｇ／ｍｌ　（ この量は、先の検定で最適であることが分かつている）を含む１００μＩのＰＢ Ｓ　（リン酸緩衝液）で４°Ｃ１−晩、または３７“Ｃ，を時間インキュベージ ａンした。２００μｌのＰＢＳｌｏ、０５％Ｔ’ｗｅｅｎで３回洗浄した後、生 成物を２００μｌのＰＢＳｌｏ、５％ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）１０、０ ５％Ｔｗｅｅｎで、３７°Ｃ，１時間プロｙ７りし、さらに、３回洗浄した。

抗リンゴ酸酵素抗体含量を検定する試料（１００μｍ）（１：　１０”　−１： 　１０’に希釈したテスト血清、ｌ　：　Ｉ−１：　１００に希釈したハイブリ ドーマ培養上清）を添加した。ネガティブコントロールとしては、ＢＳＡおよび 正常マウス血清を使用した（１：１０”）。３７°Ｃ，１時間のインキュベート 後、生成物をもう１度洗浄した。さらに、１００μＩのパーオキシダーゼ結合ウ サギ抗マウス免疫グロブリン（１：４０００．ＤＡＫＯ１Ｐ１６１）と、３７℃ で１時間インキュベートした。その後、これを洗浄し、１００μｌの基質溶液（ ８ｍｌのクエン酸バッファ　（ｐＨ５，０）：３４ｍｇ　１．２−フェニレンジ アミン、１７ｍｇ　ＮａＢＯｔＸＨｔＯｔ　Ｘ３ＨｔＯ１４＋１１１　Ｈ２Ｏ） とインキュベージａンし、ｔｏ−１５分後、４Ｎ　ＨｘＳＯ４１００μｌで停止 して、マルチ・チャンネルＥＬＩＳＡリーダーを用いて４９２止を測定した。モ ノクローナル抗体の特異性を表２に示す。

抗体または血清　抗原 ＭＥ　ＢＳＡ ＭＥＭ−１＋　− ＭＥＭ−２＋　− ＭＥＭ−３＋　− ＭＥＭ−４＋　− ＭＥＭ−５＋　− ＊ＮＭＳ＝正常マウス血清 反応：＋：吸収約２．０ 一：吸収＜０．１ ｂ）モノクローナル抗体の分子特性 分子量：　＞ｔｓｏ、ｏｏｏダルトン 生物種：マウス クラス：ＩｇＧ サブクラス二Ｇｌ 軽＃Ｉ：カッパ 実施例８ｃ）に従って得られた精製モノクローナル抗体の分子量は、レムリ（１ ９７３）の方法を使用した７、５％５ＤＳ−ＰＡＧＥて測定した。染色には、０ ．１％コマージ・ブリリアント・ブルーを使用した。

免疫グロブリンは、業者の説明書に従ってサブクラス・テスト・キット（セロチ ク）を用いて分析した。

Ｃ）　ヒト・ミトコンドリアＮＡＤ　（Ｐ）’″依存リンゴ酸に対するモノクロ ーナル抗体ＭＥＭ−３の特異性 バーローおよびレーン（１９８８ｂ）の方法を用い、５０ｎｇの精製組み換えＮ ＡＤ　（Ｐ）”依存リンゴ酸酵素、ＨＳ９１３Ｔフィブロザルコーマ細胞（ＡＴ ＣＣＮｏ、ＨＴＢ１５２）由来の分解物および１３０１細胞（ボド、１９８１） を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分離した。特異的蛋白質バンドは、未 希釈のハイブリドーマ上清（ＭＥＭ−３）との４５分間のインキュベーション、 ウサギ抗マウスＩｇＧ（希釈１ニア５００、アルカリホスファターゼとの結合物 ）との４５分間のインキュベーションおよび発色反応（ＮＥＴ−ＢＣＩＰ＝ニト ロブルー・テトラゾリウム、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェ ート）により可視化し總ウェスタン・プロットを第５図に示す。モノクローナル 抗体ＭＥＭ−３は、１３０１細胞由来のミトコンドリアＮＡＤ　（Ｐ）ゝ依存リ ンゴ酸酵素と特異的に反応する。Ｈ３９１３Ｔ細胞の場合、このイソ酵素の活性 は検出限界以下であった。これらの細胞により生産されるその他のイソ酵素は有 意な活性を有していた。Ｈ３９１３Ｔのトレースにみえる弱いバンドは該モノク ローナル抗体と別のリンゴ酸酵素のイソ酵素との弱い交差反応性によるものと考 えられる。

ｄ）モノクローナル抗体ＭＥＭ−３の種特異性１３０１細胞、ゼノパス・レビス ・オーサイトおよびＣＶＩ細胞の全分解物（細胞質子ミトコンドリア）１００μ ｇを、Ｃ）に従って１０％ＳＤＳゲルで分離しブロツフィックした。ＭＥＭ−３ 由来のハイブリドーマ上清（未希釈）を用いて免疫的検出を行い、上述したよう に発色反応を行った。この第６Ａ図に示した実験は、該モノクローナル抗体が１ ３０１細胞由来のヒトＮＡＤ　（Ｐ）“依存リンゴ酸酵素と特異的に反応するが （ＣＶＩ細胞由来のＮＡＤ　（Ｐ）″″依存リンゴ酸酵素との反応は、弱いバン ドを示した）、予備実験でＮＡＤ　（Ｐ）“依存リンゴ酸酵素の高い活性を示し たゼノパス・オーサイトとは反応を示さなかったことを示している。

別の実験で、１３０１細胞およびゼノバス・レビス・オーサイトの全分解物各々 １００μｇを上述のように分画し、ブロッティングした。モノクローナル抗体の 調製に使用した抗血清（ＰＢＳ中１　：　１００希釈）を免疫的検出に使用した 。

抗マウスＩｇＧ（アルカリホスファターゼ結合物）との結合反応は上述のように 行った。第６Ｂ図に示したウェスタン・プロットは、ヒトＮＡＤ　（Ｐ）＋依存 リンゴ酸酵素に対するポリクローナル抗体は、カエルのリンゴ酸酵素と交差反応 することを示しており、この事は、２つの生物種におけるリンゴ酸酵素のイソ酵 素間の有意なホモロジーによる。さらに、この実験は、カエルとヒトとては異な るリンゴ酸酵素のエピトープに反応するモノクローナル抗体ＭＥＭ−３の特異性 を示している。

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Ｍｅｔｈ、１０，２０３−２０９゜ レムリ、Ｕ、に、（１９７０）、Ｎａｔｕｒｅ　２２７．６８０−６８５゜レム リ、Ｕ、に、（１９７３）、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、８０，５７５−５９９゜リ グオリ、Ｍ９、テサロロ、Ｄ７、フェロ、Ｍ、およびギアカネリ、Ｍ。

（１９８９）、Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｍｙｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２゜２０ ３−２０４゜ リン、Ｒ，Ｃ，オヨびデービス、Ｅ、Ｊ、（１９７４）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ。

２４９．３８６７−３８７５゜ マグヌソン、Ｍ、　Ａ、　、モリ才力、Ｈ９、テセ、Ｍ、　Ｆ、およびニコデム 、Ｖ。

Ｍ、（１９８６）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６１．１１８３−１１８６゜マ ンデラ、Ｒ，Ｄ、およびツア、Ｌ、Ａ、（１９７５）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ 。

２５０．５８７７−５８８４゜ マニアチ人Ｔ９、フリッシュ、Ｅ、Ｆ、およびサムブルーフ、Ｊ、（１９８２） 。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａ ｌ、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−，４７４゜モノホン、■、 およびカラライホン、Ｅ、（１９８４）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａ ｃｔａ　７８８．３６２−３６７゜モレジス、Ｒ，Ｗ、およびレニンガー、Ａ、 Ｌ、（１９８４ａ）、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２５９．６２１５−６２２１゜モレジス、Ｒ，Ｗ、およびレニンガー 、Ａ、Ｌ、（１９８４ａ）、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２５９．６２２２−６２２７゜ムリス、Ｋ、Ｂ、およびフッ０−ナ、 Ｆ、Ａ、８１９８７）、Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、１５５，３３５−３５０゜ ナゲル、Ｗ、Ｃ２、トーチ−１Ｒ，Ｔ、およびツア、Ｌ、Ａ、（＋９８０）、Ｊ 。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５．３８４９−３８５４゜ナゲル、Ｗ、０．およびツ ア、Ｌ、Ａ、（１９８２）、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

２５７、　１２４０５−１２４１１゜ ピーラ−Ｃｈ、（１９８７）、Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｊｔ ａｔ　Ｗｉｅｎ　ボロース、Ａ、Ｊ、およびコラツカディ、Ｐ、Ｅ、（１９８３ ）。

Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　２２０．６５２−６５６゜ リーツァー、Ｌ、Ｊ、　、ワイス、Ｂ、　Ｍ、およびケネル、Ｄ、（１９７９） 、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５４．２６６９−２６７６゜ロサーメル、Ｂ、　Ａ、お よびネルソン、Ｔ、（１９８９）、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２６４．１９５８７−１９５９２゜サンガー、Ｆｌ、ニクレン、Ｄ、 およびクールソン、Ａ、Ｒ，（１９７７）。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４．５４６３−５４６７゜ ツア、Ｌ、（１９７３）、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ ｕｎ、５０．５２４−５３１゜ ツア、Ｌ、　Ａ、およびトーチ−１Ｒ，Ｔ、（１９７８）、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ ｓ。

３８．１７５１−１７５６゜ ツア、Ｌ、　Ａ、　、トーチ−１Ｒ，Ｔ、およびナゲル、Ｗ、Ｏ，（１９７９） 。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１８４，１８５−１８８゜ツア、Ｌ、　Ａ、　、トーチ− １Ｒ，Ｔ、ナゲル、Ｗ、０．およびモリス、Ｈ，Ｐ。

（１９８０）Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５５．３８４４−３８４８゜スクラッ トン、Ｎ、Ｓ、　、ベリー、Ａ、およびバーハム、Ｒ，Ｎ、（１９９０）Ｎａｔ ｕｒｅ　３４３．３８−４３゜ シンプソン、Ｅ、　Ｒ，およびニスタブルーフ、Ｒ，Ｗ、（１９６９）、Ａｒｃ ｈ。

ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ　１２９゜３ ８４−３９５゜ スタテン、Ｒ，（１９８２）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１０゜４７ ３１−４７５１゜ タロニ、Ｆｏ、ゲレラ、Ｃ０およびシトナト、Ｓ、（１９８８）、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　９１６，４４６−４５４゜フォノ　バイン、Ｇ 、（１９８６）、ＥＭＢＯＪ、５．１３３５−１３４２゜ウォルター、Ｍ、　Ｈ ，、グリ７・ペテナチ、Ｊｌ、グランド、Ｃ１、ボーデ、Ａ。

Ｍ、およびラム、Ｃ，Ｊ、（１９８８）、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓ ｃ　ｔ。

ＵＳＡ　８５．５５４６−５５５０゜ ワイス、Ｂ、　Ｍ、　、レイツアー、Ｌ、Ｊ、およびケンネル、Ｄ、（１９８１ ）。

Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５６．７８１２−７８１９゜ライレンガ、Ｒ，Ｋ、 　、デ・メイヤー、Ｍ、Ｃ，Ｈ，およびホル、Ｗ、　Ｇ、Ｊ、（１９８５）、Ｂ ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２４．１３４６−１３５７゜ウィルソン、Ｍ、Ｂ、お よびナカハネ、Ｐ、に、（１９７ｇ）Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　 ａｎｄ　Ｒｅ１ａｔｅｄ　Ｓｔａｉｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、　エルス ピア、２１５−２２４゜Ｆｉｇ、Ｉ ＡＢ　Ｃ ｋＤ　ｌ（［） −４３：２９／２４ Ｆｉｇ、２ ｇ４　１ｃ（）　−−−−―− ２（１１ｋＤ　−一鴫一− Ｆｉｇ、　３／１ Ｆｉｇ、３／２ Ｆｉｇ、３／３ Ｆｉｇ、４ ４３−　・ １８．４−−ζアミ１−− １Ｆｉ、Ｓ ’　１＠　−ｈｍｔＭＥ　（５０ｎｇ）Ｈ５９１３Ｔ　細胞 Ｆｉｇ、６ １３０１　細胞 マーカー マーカー 国際調査報告 −−−−＾帥−−Ｉｌｌｓ−ＩＩ−，ＰＣＴ／ＥＰ　９１１０１６０２−−−＾ −，１１，，ＰＣＴ／ＥＰ　９１１０１６０２フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１５３ Ｃ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４８ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０− ２Ｊ３３１５７３　Ａ　９０１５−２Ｊ ／／　Ｃ１２Ｎ　１５１０６ （Ｃ１２Ｎ　９１０４ ＣＩ２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｐ　２１１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、ＪＰ、 ＵＳ （７２）発明者　クリユーシュチック　ニーデルトラウドオーストリア　ア−１ １３０ウィーン　スパイジンガー　シュトラーセ　１８−１５Ｉ （７２）発明者　マウレル　フォギー　イングリッドオーストリア　ア−１２３ ８ウィーン　リンダウエルガッセ　３５ （７２）発明者　フルーバイス　ベールベルオーストリア　ア−１１３０ウィー ン　グラーザウエルガッセ　１６−６

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒト・ミトコンドリアＮＡＤ（Ｐ）＋依存リンゴ酸酵素。
2. ２．ヒト・ミトコンドリアＮＡＤ（Ｐ）＋依存リンゴ酸酵素をコードする領域、 および該酵素のミトコンドリア・シグナル配列を含むＤＮＡであって、以下の配 列式： 【配列があります】 （式中、Ｒ１は５′非コード領域を示し、かつ、配列式：【配列があります】 で表されるＤＮＡ部分を含み、また、Ｒ２は３′非コード領域を示し、かつ、配 列式： 【配列があります】 で表される配列を有する。） で表される配列を有するＤＮＡ。
3. ３．請求項２記載のコードＤＮＡまたは該ＤＮＡの一部を含むことを特徴とする 組み換えＤＮＡ分子。
4. ４．請求項３記載の組み換えＤＮＡ分子であって、ミトコンドリア・シグナル配 列の全て、または、一部を欠いているコードＤＮＡの一部を含むことを特徴とす るＤＮＡ分子。
5. ５．原核性または真核性宿主生物中で複製可能な、請求項３または４記載の組み 換えＤＮＡ分子であって、請求項２で定義したコードＤＮＡ、または、その一部 に機能的に結合した発現調節配列を含むことを特徴とするＤＮＡ分子。
6. ６．請求項５記載の組み換えＤＮＡ分子であって、宿主生物により発現したリン ゴ酸酵素が生物学的に活性となるように短縮したミトコンドリア・シグナル配列 をコードする配列を有するＤＮＡを含むことを特徴とするＤＮＡ分子。
7. ７．大腸菌中で複製可能な請求項６記載の組み換えＤＮＡ分子。
8. ８．請求項６記載の組み換えＤＮＡ分子でトランスホームした宿主生物。
9. ９．請求項７記載の組み換えＤＮＡ分子でトランスホームした大腸菌。
10. １０．拒み換えヒト・ミトコンドリアＮＡＤ（Ｐ）＋依存リンゴ酸酵素。
11. １１．生物学的に活性な組み換えヒト・ミトコンドリアＮＡＤ（Ｐ）＋依存リン ゴ酸酵素。
12. １２．請求項１１記載の組み換えヒト・ミトコンドリアＮＡＤ（Ｐ）＋依存リン ゴ酸酵素であって、以下の配列式： 【配列があります】 で表される配列を有することを特徴とする酵素。
13. １３．請求項１１または１２記載の組み換えヒト・ミトコンドリアＮＡＤ（Ｐ） ＋依存リンゴ酸酵素の調製方法であって、請求項９記載の大腸菌を培養し、発現 した酵素を単離することを特徴とする方法。
14. １４．ヒト・ミトコンドリアＮＡＤ（Ｐ）＋依存リンゴ酸酵素に対する抗体、お よび、望ましくはモノクローナル抗体。
15. １５．請求項１４記載の抗体であって、他のリンゴ酸酵素イソ酵素と交差反応し ない抗体。
16. １６．請求項１４記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞。
17. １７．請求項１５記載のモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマ細胞。
18. １８．請求項１４または１５記載のモノクローナル抗体の調製方法であって、マ ウスをヒト・ミトコンドリアＮＡＤ（Ｐ）＋依存リンゴ酸酵素で免疫化し、該免 疫化マウスからＢ−リンパ球を採取し、該Ｂ−リンパ球をミエローマ細胞と融合 し、該ハイブリドーマに関して抗リンゴ酸酵素抗体の生産を検定し、ポジティブ 培養物をクローン化し、該クローンを培養し、および、該培養物から抗体を単離 することを特徴とする方法。
19. １９．生物試料中のリンゴ酸酵素を測定する方法であって、該試料を１つ以上の 請求項１４または１５記載の望ましくはモノクローナル抗体と接触させ、ついで 、リンゴ酸酵素−抗体複合体の形成を測定することを特徴とする方法。