JPH06505243A

JPH06505243A - 内皮細胞の増殖に対する新規抑制因子

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Publication number: JPH06505243A
Application number: JP4504946A
Authority: JP
Inventors: リーザウ，　ヴェルナー; ドレクスラー，　ハネス
Original assignee: マックス−プランク−ゲゼルシャフト　ツール　フェルデルング　デル　ヴィッセンシャフテン　エー　ファウ
Priority date: 1991-03-01
Filing date: 1992-02-27
Publication date: 1994-06-16
Also published as: EP0580594A1; US5529792A; WO1992015606A1; DE4106570A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】内皮細胞の増殖に対する新規抑制因子新たな血管の形成（Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｅ　（血管形成））は、秩序立フた順序の工程で進行する：新たな血管芽を発芽し始める（多くの場合、後毛細管の小静脈中で）時点で、内皮細胞は、局所的に基底膜を分解し、血管形成を刺激する要因の源に向かって移動し、成長し、かつ分裂し、血管腫（Ｇｅｆａｅｓｓｌｕｍｅｎ）を形成し、かつ別の血管芽または存在する毛細管と衝突し、その結果、新たな毛細管部分（Ｋａｐ目１ａｒａｂｓｃｈｎｉｔｔ　）が生じ、これは、最終的に、新たに形成された基底膜で包囲される。

成長した個体の場合、通常、血管形成活性は、はぼ完全に抑制されている。専ら、創傷治癒の場合および女性の場合に卵巣周期との関係で、血管形成過程が進行する。一般にはしかしながら、生体内の内皮細胞の代謝速度は僅かである。存在する内皮細胞集合（Ｅｎｄ。

ｔｈｅｌｚｅｌｌｅｎ−Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の完全な再生は、数年継続するが、この場合、しかしながら、特徴的な期間−および組織特有の相違が生じる（Ｆｏｌｋｍａｎ、　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ第２９巻（１９８５年）、第１０〜３６頁）。

通常、血管形成が生じている厳格な制御は、固い腫瘍の成長の際に失われる。１〜２ｍｍの直径の場合の腫瘍の成長には、強力な血管形成が絶対的に必要である。即ち、無血管の腫瘍は、制限された拡散によって、ガスおよび栄養素の供給の際および老廃物の除去の際に、極めて僅かな大きさに制限されたままである。硬い腫瘍の、血管形成の上首尾の誘導の不存在下に臨床的に重要な大きさに成長するかまたは転移する能力の欠如は、血管形成を抑制する化合物の研究の際に、大きな重要性を有する。

この種の抑制因子の工業的使用可能性は、一般に、腫瘍成長の抑制の場合、特に、内皮細胞に基づく劃り例えばカポシー肉腫および血管腫の抑制の場合にある。

その上更に、過剰な血管成長に基づくその他の疾患の場合にも、治療学的使用可能性が存在する。殊に、この場合、糖尿病性網膜症および水晶体後繊維増殖症の２つの眼球疾患は、記載されなければならない、もう１つの使用法は、創傷治療の場合であり、この場合、血管形成の抑制因子は、創傷治癒の制御、即ち、血管の再生の抑制の場合に使用することがてきる。更に、また、血管形成抑制因子を、リウマチ様関節炎の治療の範囲で使用する方法もある。前記の疾患の場合、血管形成抑制因子で抑制することができる軟骨の血管新生が（通常、前記領域での全ての炎症の場合と同様に）観察される。

無血管組織から、多数の血管形成抑制抽出液が、製造された（Ｄ’Ａｍｏｒｅ　ｕｎｄ　Ｂｒａｕｎｈｕｔ、　ｉｎ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅ１ｌｓ、　＄ＩＩ巻、υ、Ｓ、Ｒｙａｎ、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　Ｆｌｏｒｉｄａ、第１３〜３７頁を見よ）、また、例えば、Ｐｒ。

ｔａｍｉｎ　（Ｔａｙｌｏｒ　ｕｎｄ　Ｆｏｌｋｍａｎ、　Ｎａｔｕｒｅ第２９７号（１９８２年）、第３０７〜３１２頁）、血管静止的ステロイド（Ｃｒｕ＋＊他、　５ｃｉｅｎｃｅ第２３０号（１９８５年）、第１３７５〜１３７８頁）、胎盤ＲＮアーゼ抑制因子（Ｓｈａｐｉｒｏ　ｕｎｄ　Ｖａｌｌｅｅ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ第８４巻（１９８７年）、第２２３８〜２２４１頁）およびマトリックス合成および安定性に影響を及ぼす（例えばｌｎｇｂｅｒ　ｕｎｄ　Ｆｏｌｋｍａｎ、　Ｌａｂ、　Ｉｎｖｅｓｔ、第５９巻（１９８８年）、第４４〜５１頁）多数の化合物にような炎症抑制作用物質は、血管形成を抑制する（Ｒｏｂｉｎ他、　Ａｒｃｈ、　Ｏｐｈｔｈａｍｏｌ、第１０３巻（１９８５年少、第２８４〜２８７頁；　Ｐｏ１ｖｅｒｉｎｉ　ｕｎｄ　Ｎｏｖａｋ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　ｃｏｍ＋ｍ、第１４０巻（１９８６年）、第９０１〜９０７頁）、前記抑制因子の若干のものの場合、腫瘍成長の抑制または沈静が、生体内で確認されたが、しかしながら、全ての腫瘍の場合ではない、更に、また、前記の血管形成抑制因子の毒性は、相変わらず問題である。

Ｒａ５ｔｉｎｅｊａｄ他（Ｃｅ１１第５６巻（１９８９年）、第３４５〜３５５頁）によって、新血管新生（Ｎｅｏｖａｓｋｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ　）を生体内で抑制する血管形成抑制因子は、ハムスター細胞およびハムスター−ヒトハイブリッド細胞を有する媒体中に見出された。前記化合物は、明らかに、分子量１４０ｋＤａを有する糖蛋白質である。

確かに、前記抑制因子は、僅かな安定性のみを示し、殊に、該抑制因子は、熱安定性ではない。

ドイツ連邦共和国特許第４００６６０９号明細書には、乳児ハムスター腎臓細胞から得られ、ゲル濾過の際に、自然の条件下で、約６０〜１００ｋＤａの分子量を有し、より大きな熱安定性を示す、内皮細胞の層着に対する抑制因子として作用する蛋白質が開示されている。

本発明の課題は、既に公知の抑制因子に代るものおよび補完するものとして治療学的に使用することができる別の血管形成抑制因子を提供することであった。

本発明による課題は、（ａ）出発物質として選択された組織を均一化し、引続き遠心分離し、（ｂ）組織抽出液を陽イオン交換体上にもたらし、かつこの陽イオン交換体に結合している物質を分別し、（Ｃ）工程（ｂ）からの活性画分をゲル濾過クロマトグラフィー処理により分離し、かつ（ｄ）工程（Ｃ）からの画分をＨＰＬＣ逆相を介して精製することによって特徴付けられるような、を椎動物の組織からの内皮細胞の増殖に対する抑制因子の含量を増大させるための方法によって解決される。

出発物質として本発明による方法のために選択されたを椎動物の組織は、胚並びに成体起源のものであってよい、好ましくは、鳥類または哺乳類からの胚組織、特に有利に鶏胚からの組織を、出発物質として使用する。更に、鳥類または哺乳類からの成体の脳組織、殊に成体のウシの脳を出発物質として使用することは、有利である。しかしながら、本発明による方法は、ヒトの組織（胚並びに成体起源のもの）にも転用可能であることを指摘しておかなければならない。

鶏胚を、本発明による方法のための出発物質として使用する場合には、内皮細胞の増殖に対する抑制因子としての作用を有する２つの物質を貯蔵することができる。前記の２つの物質は、ＥＭＢＩＮ　ｌ　およびＡＮＥＭ［Ｎと呼称される。

成体のウシの脳を出発物質として使用する場合には、貯蔵方法の実施と同様の場合に、同様に、生化学的特性および分子量で、５ＤＳ−ゲル電気泳動後に、鶏胚からの２つの抑制因子に相応する２つの抑制作用する物質が得られる０種々の出発物質からの物質が互いに同一であるのかどうかまたは該物質が単に化学的に互いに極めて近い類縁物であるだけであるのかどうかということは、これまではまだ解明されていなかった。しかしながら、前記物質もしくは該物質のそれぞれの種に固有の類縁物も、他のを椎動物、殊に鳥類および哺乳類から得られることは、解明されなければならない。

ＥＭＢ！Ｎ　Ｉ　と呼称される、本発明による方法によ）て得られる内皮細胞の増殖に対する抑制因子は、該抑制因子が、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中てのゲル電気泳動の場合に、２．５〜６．２ｋＤａの範囲内で見かけの分子量を有するバンドを生じることによって顕著である。

また、ＥＭＢＩＮ　＋　４！、９０℃ｔ６０分間の培養後にも、内皮細胞の増殖に対する衰えなかった抑制を示す、従って、ＥＭＢＩＮ　＋　は、ごく少ない蛋白質だけが、この種の治療を、その活性の保持下に克服することができるを基礎にする場合に、極めて耐熱性の化合物であることが判明する。

更に、ＥＭＢＩＮ　＋　は、多数の種々のプロテアーゼに抗して耐性であることが確認された。この場合、次のプロテアーゼを試験したニトリプシン、Ｓ、アウレウスｖ８　プロテアーゼ（Ｓ、　ｕｒｅｕｓ　Ｖ８　Ｐｒｏｔｅａｓｅ）　、クロストリパイン（Ｃ１ｏｓｔｒｉｐａｉｎ）　、サーモリシン（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）　、ズブチリシン（Ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）　、プロナーゼ（Ｐｒｏｎａｓｅ）　Ｅ、プロテアーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）　Ｋ、カルボキシペプチダーゼ　Ｙ、パパイン、ペプシン（シグマ社）、キモトリプシン、ピログルタミン酸塩−アミノペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼ（Ｅｎｄ。

ｐｒｏｔａｉｎａｓｅ）　Ａｒｇ−Ｃ，エンドプロテイナーゼ　ＬｙｓＪｌ：（ベーリンガー　マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ＋ｍ））、プロリン特異性エンドペプチダーゼ（セイカガクコウギョウ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ　Ｋｏｇｙｏ）　、日本）。前記の試験の場合、試験されたプロテアーゼは、それぞれプロテアーゼに必要な乾燥剤中に溶解され、かつＥＭＢＩＮＩのアリコートと一緒に、当該の酵素のために製造業者によって記載された条件下に培養された。いずれの実験においても、抑制因子の活性またはＥＭＢＩＮ　＋の移動挙動（Ｗａｎｄｅｒｕｎｓｖｅｒｈａｌｔｅｎ　）は、ゲル中で生じなかった。

ＥＭＢＩＮ　＋　が、例えば血管形成誘導因子“アンギオトロビン（Ａｎｇｉｏｔｒｏｐｉｎ　）″に該当する（Ｗｉｓｓｌｅｒ他、Ｐｒａｔｉｄｅｓ　Ｂｉｏ、　ＦｌｕｉｄＳ、第３４巻（１９８６年）第５２５〜５３６頁）ヌクレイン酸分子と連合したペプチドとして存在するかどうかの可能性を試験するために、ＥＭＢＩＮ　Ｉ　を、ＤＮアーゼ並びにＲＮアーゼと一緒に培養した。ゲル電気泳動の間の移動挙動における変化は、見出されなかった。

ＥＭＢＩＮ　ｌ　が、グリコペプチドであるかもしれないことを考慮して、解糖酵素を用いて消化を実施した。このために、ＥＭＢＩＮ　Ｉ　に、まず、ノイラミニダーゼ、次に、β−ガラクトシダーゼを用いて、逐次消化を施した。更に、ＥＭＢＩＮ　Ｉ　を、グリコペプチダーゼ　Ｆで処理した。更に、ＥＭＢＩＮ　Ｉ　が、マンハイムのベーリンガー　マンハイム社（Ｆｉｒｍａ　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈ’ｅｉｍ）の“グリカン検出キット（Ｇｌｙｃａｎ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）　”を用いて反応を示すかどうかを試験した。しかしながら、前記のいずれの実験においても、グリコジル化の存在は、立証することができなかった。

ＥＭＢＩＮ　Ｉ　およびＡＮＥＭＩＮの脂質抽出液は、これまで、脂質含量について顧慮されなかった。

ＥＭＢＩＮ　ｌが、蛋白質の特性を有する物質であるがどうかという問題を試験するために、ジエチルピロ炭酸塩と一緒に培養を実施した。ジエチルピロ炭酸塩は、リジンの遊離α−アミノ基またはε−アミノ基と、Ｎ−カルボキシ誘導体の形成下に反応する。ジエチルピロ炭酸塩を用いるＥＭＢＩＮ　Ｉ　の処理の場合に、抑制因子の活性が完全に失われていることが確認された。このことは、ＥＭＢＩＮ　＋の抑制因子の活性が、１つまたはそれ以上の機能的に重要なアミノ基に基づいていることを意味している。また、フェノールを用いる処理の場合に、ＥＭＢＩＮ　Ｉの抑制因子の活性が失われうるという事実は、前記物質のペプチド特性に、更に関連している。更にまた、ＥＭＢ［Ｎ　ｌ　をニンヒドリン噴霧試薬（Ｎｉｎｈｙｄｒｉｎｓｐｒｕｅｈｒｅａｇｅｎｚ）　（アミノ基の検出のために使用される）で、着色できることが確認された。

更に、ＥＭＢＩＮ　＋　が、ペプチドであってもよいことに関連して、ローリイ（Ｌｏｗｒｙ）の方法（Ｌｏｗｒｙ他、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、第１９３巻（１９５１年）、第２６５〜２７５頁）による蛋白質決定は、可能である。

ＥＭＢＩＮＩのアミノ酸分析（にｎｅｃｈｔおよびＣｈａｎｇ、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｗ、第５８巻（１９８６年）、第２３７５〜２３７９頁による、６ＮのＨＣＩを用いる加水分解および引続く４−ジメチルアミノアゾベンゾ−ルー４Ｉ− スルホニルクロリドを用いる誘導）によって、アミノ酸Ａ　Ｓ　Ｘ　（Ａｓｎおよび／またはＡＳｌｌ）　、　Ｇ　Ｌ　Ｘ　（Ｇｌｎおよび／またはＧｌｕ）、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＬｙｓおよびＨｉｓを検出することができた。同様に、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｒｇ％Ｇｌｙ、Ａｌａ％　Ｉ　ｌｅ、ＰｈｅおよびＴｙｒの特性的ピークが見出され、この場合、見出された量は、少な過ぎて、その存在は、明確に証明することができなかった。

ＥＭＢＩＮ　＋　の特性決定のこれまでの結果は、小さな塩基性のペプチドであることに関連しており、この場合、しかし、他の方法は、まだ排除することができない。

ＥＭＢＩＮ　＋が、ペプチドであると仮定する場合には、分子のＮ−末端は、ペプチドの遊離α−アミノ基が必要であるエドマン（Ｅｄｍａｎ）の方法によるＥＭＢＩＮ　＋　の配列化がこれまで不可能であったので、遮断されているようである。

ＥＭＢＩＮ　＋　のもう１つの異常な性質は、−面で、ゲル濾過、他面で、５ＤＳ−ＰＡＧＥの間の移動挙動での相違である。ＥＭＢＩＮ　Ｉ活性は、ゲル濾過カラムのほぼ５００〜１ｏｏＯＤａの分子量に相応する位置で溶離される。しかしながら、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって活性画分を試験した場合には、使用した電気泳動系に無関係に、約２．５〜６．５ｋＤａの間の範囲内でＥＭＢＩＮ　＋のバンドが見出される。

また、本発明による方法によって得られる別の抑制因子ＡＮＥＭＩＮは、ゲル濾過および５ＤＳ−ＰＡＧＥの間の移動挙動での前記の相違を示している。　ＡＮＥＭＩＨの場合、５ＤＳ−ＰＡＧＥでは、はぼ１６〜２０ｋＤａの範囲内でバンドが見出され、他方、ゲル濾過後に分子量は１０００Ｄａ未満でなければならない、　ＥＭＢＩＮ＋　と同様にＡＮＥＭＩＨも、極めて高い安定性およびプロテアーゼに抗する耐性を有する。

ＥＭＢＩＮ　Ｉ　およびＡＮＥＭＩＮの構造が、詳細に解明されているにもかかわらず、これらが、本発明による方法によって、後加工可能に、純粋な物質として得ることができるのは、２つの抑制因子が、５ＤＳ−ゲル中で別個のバンドとして、記載する価値のある汚染物質なしに検出することができるからである。

更に、本発明による方法の個々の工程は、詳説されなければならない、工程（ａ）は、出発物質として選択された組織の均一化および遠心分離である。好ましくは、出発物質として、成体のウシの脳または、４〜ｌＯ日経ったの鶏胚を使用する。しかしながら、別の組織種、殊に別の種族の肝組織または脳組織も好適である１組織の均一化および引続く遠心分離によって、次の処理工程に供給することができるような組織抽出液が得られる。均一化および遠心分離の工程は、常用の当業者に公知の方法により実施することができ、かつ本発明による方法のためには、特に重要というものではない。

本発明による方法の工程（ｂ）は、組織抽出液を、陽イオン交換体上にもたらし、かつ陽イオン交換体に結合した物質を分別することにある０本発明による抑制因子は、はぼ中性のｐＨ条件および１００ミリモル／ｌまでの塩濃度で、陽イオン交換体に結合している状態であり、他方、繊維抽出液中に含有された物質の大部分は、前記の状態ではない。交換カラムの本発明による物質は、例えば７００ミリモル／１への塩濃度の上昇によって溶離することができる０例えば、ＣＭ− セファロースーマトリックス（ファルマツイア（ｐｈａｒｍａｃｉａ／　ＬＫＢ　）　）は、適当な陽イオン交換体であることが判明した。しかしながら、別の陽イオン交換体を使用することもできる。

試験管内活性試験（赤外）の際に内皮細胞の増殖に対する抑制を示す陽イオン交換体−溶出液からの両分は、本発明による方法の工程（Ｃ）により、クロマトグラフィー処理により分離することができる。しかしながら、陽イオン交換体を介する分別後に、活性画分を、更に水酸燐灰石カラム上にもたらし、次に、水酸燐灰石カラムの通過量を限外濾過することが有利である。水酸燐灰石でのクロマトグラフィー処理の場合、水酸燐灰石マトリックスのものでない極めて小さな蛋白質含量だけが見出される０本発明による抑制因子は、カラムの通過量中に存在するので（即ち、これらは結合していない）、良好な精製効果が、前記工程によって達成される。

水酸燐灰石クロマトグラフィー処理後に存在する活性蛋白質画分の容量を、ゲル濾過工程前に減少させるために、限外濾過を実施した。濃縮を、抑制因子の僅かな分子量に基づいて、５００Ｄａ膜上で行なう、この後、抑制因子の作用物質を、滞留物中に再度見出し、この濾液は、内皮細胞の増殖に対して何等抑制する作用を有していない。

その上更に、この限外濾過は、２つのダイヤ濾過工程（Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｓｓｃｈｒｉｔｔｅ）を用いる試料の十分な脱塩のために、有用である。この後、試料の容量は、出発容量のほぼ１／６〜ｌ／１０である。もう１つの濃縮は、試料の引続く凍結乾燥および０．２Ｍの酢酸の最少容量中での凍結乾燥物の吸収によって達成することができる。また、前記緩衝液を用いて、試料を引続きプロットするゲル濾過カラムを平衡させることができる。

本発明による方法の工程（Ｃ）は、これまでに得られた活性画分のゲルクロマトグラフィー処理による分離である。はぼ１．８ｋＤａの名目上の排除限界寸法を有するバイオゲルＰ２は、ゲル濾過に好適な物質であることが判明した。抑制因子の作用物質は、選択された条件下で、カラムの遮断容量中では、溶離しない。

従って、抑制因子の作用物質は、１８００Ｄａ未満の分子量を有する。他方、マトリックスとの著しく特異的な相互作用は、物質の異常な著しい遅滞をまねき、ひいては分子量が少な過ぎるように見せかけてしまう可能性がある。５ＤＳ−ＰＡＧＥによるゲル濾過の活性画分からのアリコートの分離および引続く銀着色後に、２．５〜２０ｋＤａの間の分子量である多数のバンドを目視可能にすることができた。前記のバンドパターンに基づいて、単離の他の進行のために、２〜６ｋＤａの幅広のバンドを有し、ＥＭＢＩＮ　Ｉ　の概念が、以下これに関連するものである両分をまとめる。同様に、１４〜２０ｋＤａの範囲内の幅広のバンドを示した両分をまとめた。前記の画分と結合した抑制作用物質を、八ＮＥＭＩＮと呼称し、かつ以下で、ＥＭＢＩＮ　Ｉ　とは別個に精製した。

抑制因子の作用物質の含量を増大させるための本発明による方法の工程（ｄ）は、逆相ＨＰＬＣによる精製である。このためには、逆相ＨＰＬＣのための異なる製造業者の種々の敷き詰められたカラムマトリックスおよびトリフルオロ酢酸／アセトンニトリル勾配を、溶離剤として使用した。しかしながら、抑制因子の作用物質は、前記処理方法の場合、カラムには結合できず、規則的に、結合しなかった物質の含量で見出された１個々の両分のゲル電気泳動分析から、抑制因子の作用画分中に、２．５〜６．５ｋＤａの範囲内の分子量を有する幅広のバンド（ＥＭＢＩＮ　りが存在していたことは明らかであったやアサヒパーク（Ａｓａｈｉｐａｋ）　ＯＤ　Ｐ　５０カラムのポリビニルマトリックスの良好なｐＨ安定性に基づいて、クロマトグラフィー処理は５アルカリ性の環境〒、別の珪酸マトリックスの使用の際に必要なアルキルアンモニウムイオンの添加量なしに実施することができた。

１２．５のｐＨＭ（７）場合の逆相ＨＰＬＣ（７）実施の際に、カラムマトリックスへのＥＩＪＢＩＮ　Ｉ　の結合が見出された。ポリアクリルアミドゲル中の抑制因子の作用画分の分析の場合に、２．５〜６．２ｋＤａの分子量範囲の幅広のバンドが存在することが見出された。

更にまた、ＨＰ　Ｌ　Ｃ精製を、酸性のイオン対形成剤の存在下に実施することも有用であることが判明した。

酸性のイオン対形成剤としては、有機スルホン酸、殊に、アルキル−またはアリールスルホン酸が好適である。前記のスルホン酸分子は、−面でその疎水性のアルキル含量により、カラムマトリクスの疎水性基と相互作用することができ、他方、該スルホン酸分子は、同時にそのスルホン酸基により、プラスに負荷された物質を結合することができる。このスルホン酸の濃度は、有利には、Ｏ８１〜５０ミリモル／１、特に有利に１−１ｏミリモル／ｌの間である。

実際、ＥＭＢＩＮ　＋　が、ヘプタンスルホン酸５ミリモル／ｌでｐＨ３，５に平衡したアサ上バーク０ＤＰ５０カラムに結合し、かつ線状の勾配中で再度溶離できる。

また、ゲルクロマトグラフィー処理のＡＮＥＭＩＮ含有画分は、逆相ＨＰＬＣによって、例えばイオン対形成剤としてのへブタンスルホン酸の存在下に、ＥＭＢＩＮ　Ｉと同様に、更に精製することができる。ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動の場合、１６〜２０ｋＤａの間の範囲内でＡＮＥＭＩＮのバンドが見出される。

本発明による方法によって、内皮細胞の増殖に対する、ＥＭＢＩＮ　＋　もしくはＡＮＥＭＩＮと呼称された抑制因子を、純粋な物質として製造することができ、この場合、鶏胚からの組織を、出発物質として使用した。成体のウシの脳を、出発物質として使用する場合には、同じ処理工程で、ポリアクリルアミドゲル中での電気泳動の場合に、ＥＭＢＩＮ　＋　およびＡＮＥＭＩＨの流動性の性質を有する２つの相応する物質を得ることに成功する。

抑制因子の作用物質の活性を、試験管内ではＢＡＥＣ試験によって、および生体内ではＣＡＭ試験によって分析し、以下、例１中に詳細に記載している。

本発明による物質は、増大した血管形成を生じ、既に上記された全ての疾患の治療の場合に使用することができる。殊に、本発明による物質は、カポシー肉腫または血管腫のような腫瘍の成長の抑制、増大した血管成長が生じる眼球疾患、殊に、糖尿病性網膜症および水晶体後繊維増殖症の治療並びにリウマチ様関節炎の際または創傷治癒の調節に使用することができる。

体重１ｋｇ当りの本発明による物質の好ましい使用用量は、μｇから最大でｍｇの範囲内であってよい。

次の実施例は、本発明を、図面と関連させて解説するものである０図面には、次のものが示されている：図１：鶏胚からの組織抽出液のゲル濾過クロマトグラフィー処理、図２＝ゲルクロマトグラフィー処理からの両分の内皮細胞増殖に対する抑制、図３ニゲル画分からの画分１１〜１７の蛋白質パターン、図４　：　ＴＦＡ／７セ）＝）−ＩＪル中でのＲＰ−ＨＰＬＣの場合のＥＭＢＩＮ　Ｉ　の溶離線図、図５：ｐＨ１２，５７７）場合のＲＰ−ＨＰＬＣの場合のＥＭＢＩＮ　Ｉ　の溶離線図、図６二へブタンスルホン酸の存在下でのＥＩｉｌＢＪＮ　Ｊ　の溶離線図、図７．ヘプタンスルホン酸の存在下でのＲＰ−ＨＰＬＣの場合のＡＮＥＭＩＮの溶離線図、図８　：　ＡＮＥＭＩＮの５ＤＳ−ＰＡＧＥ。

例　１増殖試験における抑制因子の活性の検証網膜ファクター（Ｒｅｔｉｎａ−Ｆａｋｔｏｒ）の調製網膜ファクターは、内皮細胞分裂促進剤（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｚｅｌｌｍｉｔｏｇｅｎ）として本質的にｂＦＧＦ中に含有するウシの網膜からの水性抽出液である（ｂａｓｉｃ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　；　Ｍａｓｃａｒｅｌｌｅ他、１９８７年）。

ウシの眼球２５〜５０個からの網膜を、調製して取り出し、ＰＢＳ　（リン酸塩で緩衝された食塩水）の同じ容量を用いて翌日まで４℃で培養した（Ｄ’　Ａ＋＊ｏｒｅ他、Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、第９９巻（１９８４年）、第１５４５〜１５４９頁）、調製を、数回注意深〈実施した。

固体成分を、まず、１０分間の遠心分離によって、ｌＯ１０００ｒｐヘロイス（Ｈｅｒａｅｕｓ）　）で除去し、上清を、引続き更に３０分間に亘って４５０００Ｇで遠心分離した（Ｓｏｒｖａｌｌ、　ＳＳ３４　）　、　２回目の遠心分離の上清を、アリコート化し、かつ−２０℃で凍結させた。使用前に、このアリコートを滅菌濾過（孔径０゜２または０．４５μｍ）した。

ＢＡＥＣ試験内皮細胞の増殖に対する抑制の検証のために、ウシ大動脈から取得された内皮細胞培地を使用した（ＢＡＥ　Ｃ；　ｂｏｖｉｎｅ　ａｏｒｔｉｃ　ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　；第６〜１７節）、活性試験のために、開始時に（１回目）、凹み（コスタ−（Ｃｏｓｔａｒ）　）　２４個を有する細胞培養皿で、凹み１個当りＢＡＥＣＩ　Ｏ〜１５０００個を、ドゥルベツコのＤｕｌｂｅｃｃｏ’　ｓ　）で変性された最小培地（ＤＭＥＭ）中に播種し、この場合、このＢＡＥＣは、５％のウシ胎児血清（ｆｏｅｔａｌｅｓ　Ｋａｅｌｂｅｒｓｅｒｕ’ ｍ）　（Ｆｅ２）を含有し、最初の６〜８時間でプラスチック基底上に付着している。

翌日（２日目）に、付着しない細胞を、古い栄養媒体と一緒に除去し、がっＤＭＥＭに抗して５％のＦｅ２および網膜ファクター４０μｍ／１と交換した。媒体への網膜ファクターの添加によって、内皮細胞の増殖を、強力に刺激する。媒体の交換後に、試験すべき試料を添加した（４０ｍｌ／凹み）、この細胞を、更に３日間、Ｇｏ、７．５％および３７℃で培養し、この後（５回目）、細胞数を、コールタ−カウンター中で測定した。試験の前記構想にょフて、内皮細胞の増殖を、分裂促進剤の存在下であってさえも抑制できる試験した試料の物質の含量を調べた。

細胞数の決定７２時間の培養期間後に、Ｃａ−およびＭｇ−遊離ＰＢＳを存する細胞を成長させ、基底のトリプシン化によって溶解しく０．０５％のトリプシン１０．０２％のＥＤＴＡ溶液０．５ｍｌ、ジブコ（Ｇｉｂｃｏ）　）、かつ同中性子体溶液９．５ｍｌ中に移送した。細胞数を、コールタ−カウンター、インダストリアル（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ）　Ｄ　（アテニュエーション：２：開ロ部流（Ａｐｅｒｔｕｒｅ　Ｃｕｒｒｅｎｄ）　：　Ｏ、ＯＯ９３；入口（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　）：１２．毛細管穿孔（Ｋａｐｉｌｌａｒｂｏｈｒｕｎｇ）　：　２００　μｍ）中で測定した。得られたデータを、プログラム“クリケラトグラフ（Ｃｒｉｃｋｅｔ　Ｇｒａｐｈ）”および“カレイダグラフ（Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ　）“を用いてアップル社（Ｆａ、　Ａｐｐｌｅ）のコンピュータで、グラフィック評価した。

ＳＭＣ−試験および３Ｔ３−試験平滑筋細胞（Ｓ　Ｍ　Ｃ；　ｓｍｏｏｔｈ　１ｌｕｓｃｌｅ　ｃｅｌｌｓ）およびＮＩＨ３Ｔ３−繊維芽細胞を用いる増殖試験を、同じ方法により実施した。ＢＡＥＣとは異なり、ＳＭＣおよび３　Ｔ　３−ｍ維芽細胞の増殖に対する刺激は、Ｆｅ２１０％の存在下に、培地中で十分であり、網膜ファクターの添加は不用である。

抑制因子の生体内試験（ＣＡＭ試験）ヘルッル社（Ｆａ、　）Ｉｏｅｌｚｌ）　（ヴアッサープルク　アム　イン（Ｗａｓｓｅｒｂｕｒｇ　ａｍ　Ｉｎｎ）　）の卿化卵を、卵の自動回転装置を備えた胛卵器中で、それぞれ６時間、３７℃および湿度７０〜８０％で畔化させた。

Ｅ３３回目、約１ｃｍの直径を有する窓を、受精して３日経った鶏卵の殻の中に切り込み、それによって、後に、メチルセルロース中に埋設されたファクターを、ＣＡＭ上に塗布することができた。このために、卵の殻の表面上に、まず、− 片のスコッチ社の粘着デーブを貼付だ。次に、卵の尖った面で、１０ｍ１の注射器および靭性のカニユーレを用いて卵白を除去して、卵黄上で浮遊している胚を若干沈下させた。こうして、尖ったハサミを用いて、粘着テープの中央で、孔を卵の殻に切り込んだ。こうして、ＣＡＭ上への卵の殻の断片の落下は、更に回避される。この殻の断片は、それ自体、血管形成と同様の反応を惹起することができる。

それ故、卵の殻の孔を、二片目のスコッチ社の粘着テープで密閉し、かつこの卵を、更に３〜４日、前記と同じ条件下に卿化させた。

試験すべき両分を、滅菌した１％のメチルセルロース溶液（４０００ｃｐ　ｉ　；シグマ社）の同じ容量と、ｌ：１の比で混合した。それぞれ１０μｌを、テフロン小棒（ｄ＝３ｍｍ）の平滑にされた切断面上にピペットで移し、滅菌キャップ（Ｓｔｅｒｉｌｈａｕｂｅ）の下で乾燥させた。精密ビンセットを用いて、テフロン小棒のメチルセルロースの小薄片（Ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−３ｃｈｅｉｂｃｈｅｎ　）を剥離し、かつ注意深く、発育日Ｅ６またはＥ７に、ＣＡＭ上へ載置することができた。４８〜７２時間後に、メチルセルロースの小薄片の周囲のＣＡＭの領域を、両眼で、血管形成の抑制について試験した。

脈絡膜のコントラストづけのために、胚に、ガラス管を用いて、ＰＢＳ中の４０％のルコニルプルー（Ｌｕｃ。

ｎｙｌ−Ｂｌａｕ　）　（ヘキスト社（Ｈｏｅｃｈｓｔ）　）の溶液約２０μＩを、尿膜静脈中に注射した。

メチルセルロース小片１個当り（ｎ＝３９）、ＥＭＢＩＮｌ　２４０ｎｇまでを使用した。小片４個の縁部で、無血管野帯域を観察することができ、小片６個で、微弱な血管新生が認められた。残りの胚の場合には、血管パターンに何等の変化を観察できなかった。

ＥＭＢＩＮ　＋　およびＡＮＥ１４ＩＮの含量を増大させる方法出発物質出発物質として、　ヘルツル社（Ｆａ、　Ｈｏｅｌｚｌ）　（ヴｒッサーブルクアム　イン（Ｗａｓｓｅｒｂｕｒｇ　ａｍ　Ｉｎｎ）　）の靜化卵を使用した。

卵の畔化の開始４〜１０日後に、前記の卵を、大きなベトリ皿上に開け、かつ胚を除去した争この胚力ゝら・羊膜皮（Ａｍｎｉｏｎｈａｕｔ　）および就中、尿膜を、胚の尿を製造する尿膜液からの影響゛を遮断するために、できるだけ完全に細切した。胚を、抽出するまで一２０℃で凍結乾燥して保存し、かつ調製の開始前に、−晩４℃で解凍した。

抽出液の調製１３８〜３ｋｇの湿式重態に相応する発育日Ｅ４〜Ｅ１０の鶏胚２５００〜３５００個を、３００ｇの少量ずつ、全体で１．５〜２１の抽出液緩衝液（ＭＯＰＳ　ｐＨ６，８２０ミリモル／ＮａＣｌ　１００ミリモル／ＰＭＳＦ　２ミリモル）を用いて、ブラウンこの均質物を、引続き、４℃で３０分間撹拌下に抽出し、かつ不溶成分を、２２０００Ｇで９０分間の遠心分離によって分離した（ゾルヴオール、ＧＳＡ−ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ、　ＧＳＡ−Ｒｏｔｏｒ）　）。

ＣＭ−セファロース　ファストフロー（Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）での陽イオン交換クロマトグラフィー処理第１工程で得られた抽出液を、プロット緩衝液（Ａｕｆｔｒａｇｓｐｕｆｆｅｒ）　（ＭＯＰ　Ｓ　ｐ　Ｈ６、８２０ミリモル／ＮａＣｌ　１００ミリモル）で平衡させておいたＣＭ−セファロース−カラム（ファルマツィカ／ＬＫＢ、７ラー（ブルク（Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＩＪＢ、　Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）　；　５０Ｘ　２５０ｍｍ）の上にポンプ輸送した。流速は、５゜Ｏｍ　Ｉ　／　ｈであった。抽出液のプロット後に、このカラムを、プロット緩衝液を用いて、２８０ｎｍでの吸収が最小量を達成するまでの間洗浄した。全蛋白質の８６％が、通過量中に存在していた。カラムに結合した蛋白質には、抑制因子の作用物質ＥＭＢＩＮ　＋　もしくは＾ＮＥＭＩＮもあり、更に、ＭＯＰＳ　ｐＨ６，８２０ミリモル中のＮａ１ｌ　７００ミリモルを用いる工程で溶離した。

水酸燐灰石によるクロマトグラフィー処理このためのゲル床を、５０　ｍ　ｌ　／　ｈの流速で包装し、次に、乾燥した水酸燐灰石粉末（バイオ−ゲルＨＴＰ。

パ、イオラート社、ミュンヘン（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ　ＨＴＰ、　Ｆａ、　Ｂｉ。

Ｒａｄ、　Ｍｕｅｎｃｈｅｎ）　）を、プロット緩衝液（Ｍ　ＯＰ　３２０ミリモル、ｐＨ６，８）中で、十分に膨潤させた。

次に、陽イオン交換クロマトグラフィー処理からの溶出液を、直接、２〜３回に分けて、４０　ｍ　ｌ　／　ｈで、ＭＯＰＳ　ｐｈ６．８　２０ミリモル中で平衡した水酸燐灰石カラム（２５Ｘ１００ｍｍ）の上にプロットし、引続き、２８０ｎｍでの吸収が最小量になるまでの間、平衡緩衝液で洗浄した。極めて少量の蛋白質含量（その中には、抑制因子の作用物質もある）だけが、水酸燐灰石マトリックスに結合せず、かつカラムの通過量中に存在していた。

可逆的に水酸燐灰石マトリックスに結合した物質を、リン酸カリウム緩衝液　ｐＨ６，８０，４モルによって溶離することができた。引続き、前記溶出液を、ＭＯＰＳ緩衝液　ｐ）（６，８２０ミリモル２×５１または０．５ｘＰＢＳ　ｐＨ７，２に対して透析した。

この場合、通常、ｌＯ〜１５ｋＤａの名目上の分離限界を有する透析セロファン膜（Ｖｉｓｋｉｎｇ−Ｄｉａｌｙｓｅｓｃｈｌａｅｕｃｈｅ　）を使用した。

限外濾過による脱塩および濃縮水酸燐灰石と結合しなかった物質を、ＹＣＯ５−限外濾過膜（アミコン社、ヴイツテン（Ａｍｉｃｏｎ　Ｇｎｂ）［、Ｗｉｔｔｅｎ）　、名目上の排除限界　５００Ｄａ）を介して、限外濾過細胞（アミコン社、ヴイツテン；タイプ８４００）中で、出発各員の約１０分の１に濃縮した。この溶液を、同じ小室中で、蒸留水を用いるダイアフィルトレージョン（Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって脱塩した。

ゲル濾過限外濾過からの十分に脱塩された濃厚液を、溶液容量を十分に減少させるために凍結乾燥した。０．２Ｍの酢酸それぞれ約４〜６　ｍ　ｌ中に収容された凍結乾燥物のゲル濾過のために、０．２Ｍの酢酸中で平衡させておいたパイオーゲル　Ｐ２　カラム（バイオラード社、ミュンヘン；２００〜４００メツシュ；名目上の排除重量：　１８００Ｄａ）を使用した。この試料を、螺動ポンプ（ＬＫＢ／ファルマツィア）を用いて、カラムの上にプロットし、かつゲル濾過を、カラムの上への展開剤のポンプ輸送によって行なった。ゲル濾過の間の流速は、６　ｍ　ｌ　／　ｈであり、分離された蛋白質およびペプチドを、２８０ｎｍで検出した。カラム通過量を、分別して捕集した（ＵｌｔｏｒｏＲａｃ　；　ＬＫＢ　；　４０分間／両分）６図１には、バイオゲル　Ｐ２−カラム上のゲル濾過クロマトグラフィ処理が記載されている。

プロットされた蛋白質およびペプチドの大部分を、カラムの排除各員中で溶離する（［ｌｔ分５〜１０）、画分１７〜２０は、更に存在する塩を含有し、同時に、カラムの低い遮断限界を標識する。ゲル濾過の画分を、酢酸の除去のために凍結乾燥させ、かつ２回蒸留したＨｌＯそれぞれ４　ｍ　ｌ中に入れた５図２には、ゲル濾過後の両分中の内皮細胞の増殖に対する抑制が記載されている。（Ｓ）および（Ｍ）で、試料プロットの時点および最大量の増殖後の細胞数を記載している０両分５〜２４からのアリコートによって触発された、内皮細胞増殖に対する作用は、相応するカラムの高さを通して製造される。

図３には、５ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび引続く銀着色による画分１１−１７〜のアリコートの分離が記載されている。多くのバンドが明白であり、その分子量は、２．５〜２０ｋＤａの間である。バンドパターンに基づいて、単離の他の進行のために、２〜６ｋＤａの間の幅広のバンド（ＥＭＢＩＮ　Ｉ）とともに、１３ｋＤａでの極めて鳳要なバンドおよびより弱いバンドを有する画分１１〜１３をまとめる。同様に、１３ｋＤａでのバンドとともに、１４〜２０ｋＤａの間の範囲内の幅広のバンド（ＡＮＥＭＩＮ）を示す画分１４および１５を用いて処理した。

逆相クロマトグラフィー処理全ての逆相クロマトグラフィー処理工程を、タイプ４２０のＨＰＬＣポンプ２個、検出器４３０１個およびデータシステム４５０を有するコントロン社（Ｆａ。

［０ｎｔｒＯｎ　）　（ｘヒング（Ｅｃｈｉｎｇ）　）のＨＰＬＣ装置上で実施した。このデータシステム４５０は、移植された制御ソフトウェアを有するＡＴ計算機並びに記録されたデータの記録および処理のためのソフトウェアからなる９分離された物質は、通常、同時に、２つの波長で検出した（ペプチド形成の吸収の領域では、２１４〜２２０ｎｍの間の波長並びにチロシンの吸収最大値では、２８０　ｎｍ）。

ＴＦＡ／アセトニトリル溶剤系溶剤用相（ＲＰ）クロマトグラフィー処理多数の製造業者の既に包装されたＲＰカラムを、ＥＭＢＩＮ　＋　の十分な精製のための該カラムの適性に関連して、ＴＦＡ／アセトニトリル溶剤系溶剤用下で試験した。このカラムを、緩衝液Ａ（ＴＦＡｏ、１％；ラードブルン社、スコツトランド（Ｒａｔｈｂｕｒｎ、　５ｃｈｏｔｔｌａｎｄ））中で平衡させ、かつ溶液Ｂ（９５％のアセトニトリル中のＴＦＡｏ、０９％；ラードブルン社、スコツトランド）の増大する濃厚液を有する線状勾配によって溶離した。実験の要旨は、表Ｉ中に記載されている。

表　ＩＥＭＢＩＮ　Ｉの単離のための逆相方式でのクロマトグラフィー処理の要旨、流速は、１ｍｌ／分、分別の大きさは、１分間であった。吸収を、２１４ｎｍおよび２８０ｎｍで記録した。

カラムの型／大きさ　確認物質　勾配Ａχ−Ｂχ・間Ｖｙｄａｃ２１４ＴＰ／４．６ｘ２５０　Ｃ４０−９０；５０Ａｑｕａｐｏｒｅ　３００／４．６　ｘ　１００　Ｃ８０−１００；　１５Ａｓａｈｉｐａｋ　０ＤＰ５０／６　ｘ　１５０　Ｃ１８０−７５；　３５Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ　０ＤＳ２／４．６ｘ２５０　Ｃ１８０−９５；　５５図４には、Ａｓａｈｉｐａｋ　０ＤＰ５０カラム（Ｃ１８確認物質）の例でのＲＰ−ＨＰＬＣの溶離線図が記載されている。

個々の両分のゲル電気泳動分析から、抑制因子の作用活性が、画分３（斜線で表示されている）中に存在することは、明らかであった。ゲル電気泳動分析は、ＥＭＢＩＮ　Ｉである２、５〜６．５ｋＤａの分子量を有するバンドを示している。

アルカリ性の条件下での逆相クロマトグラフィー処理緩衝液Ａ：５ＮのＮａＯＨでｐＨ１２，５に調節されたトリス１０ミリモル緩衝液Ｂ、トリス　ｐＨｌ０　１０ミリモル／アセトニトリル８０％Ａｓａｈｉｐａｋ　０ＤＰ５０カラムを５％の緩衝液Ｂ中で平衡にした後で、ＥＭＢＩＮ　１　のＹＣ５０−濃厚液５００μｌに、平衡緩衝液の同じ容量を添加し、かつカラム上にもたらした（１ｍｌ／分間；１分間／画分；２２０ｎｍおよび２８０ｎｍでの検出）、前記条件下で結合した物質を、２５分間で、緩衝液ＢＯ−１００％の線状勾配を用いて溶離した。この両分を、真空濃縮器中で溶剤から遊離し、かつ２回蒸留したＨ、Ｏそれぞれ２５０μｌ中に入れた。

図５には、ｐＨ１２，５でのＥＭＢＩＮ　＋含有試料の溶離が記載されている。

活性画分（ＢＡＥＣ試験による測定）は、斜線で表示されている。ポリアクリルアミドゲル中の電気泳動の場合には、抑制画分は、２゜５−６．２ｋＤａの分子量領域でのＥＭＢＩＮ　ｌ　を示した。

イオン対形成剤の使用下での逆相クロマトグラフィー処理ＥＭＢＩＮ　＋　の最終精製工程を、６Ｘ１５０ｍｍの大きさのＡｓａｈｉｐａｋ　ＯＤＰ　（：１８−カラムニヨリ実施シタ（アサヒケミカルインダストリー（Ａｓａｈｉ　Ｃｈｅｌｌｌｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）、日本）。ゲル濾過からのＥＭＢＩＮ　＋含有画分を、真空濃縮器中で乾燥させ、かつ５ミリモルのへブタンスルホン酸ｐＨ２，５中に入れた（レギスケミカルカンパニー、イリノイ州、モールトングローブ（Ｒａｇｉｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｍｏｒｔｏｎ　Ｇｒｏｖｅ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）、またはフルカ　ヒエミカーリエン、ウルム（Ｆｌｕｋａ　（：ｈｅ鳳１ｋａｌｉｅｎ、　Ｄｉｍ））＊　１　ｍ　ｌのアリコートを、カラム（５ミリモルのへブタンスルホン酸ｐＨ２，５中で平衡にされている）の上にもたらし、９０％のアセトニトリル中５ミリモルのへブタンスルホン酸ｐＨ２，５０〜ｌＯＯ％の線状勾配を用いて３５分間で溶離した。

分別された溶出液を、真空濃縮器中で、溶剤から遊離させ、かつ残分を、更に分析するために、２回蒸留した水の中に入れた。

図６には、イオン対形成剤としてのへブタンスルホン酸の存在下でのＲＰ−ＨＰＬＣの場合のＥＭＢＩＮ　Ｉ含有試料の溶離線図が記載されている。活性試験でプラスの画分（斜線の面として表示されている）は、ゲル電気泳動分離の場合にＥＭＢＩＮ　＋バンドを示した。

図７には、ヘプタンスルホン酸を用いるＲＰ−ＨＰＬＣの場合のＡＮＥＭＩＮの溶離線図が記載されている。

ＢＡＥＣ活性試験でプラスの画分は、斜線の面として表示されている。このために、ゲル濾過からの凍結乾燥した画分１４および１５を、平衡緩衝液２　ｍ　ｌ中に入れ、かつ上記と同じ条件下で分離した。前記の両分には、ＡＮＥＭＩＮとともにＥＭＢＩＮ　＋　も存在していた。

図８には、ＡＮＥＭＩＮのＲＰ　−ＨＰ　Ｌ　Ｃからの画分２２〜３７の５ＤＳ −ポリアクリルアミドゲルが記載されている。全ての画分からのアリコートを、ゲルの上で分離し、かつペプチドバンドを、鍛着色によって目に見えるようにした。この後、１６〜２０ｋＤａの間の範囲内での＾ＮＥＭＩＮ−バンドは、画分２５〜２９中に含有されており、他方、ＥＭＢＩＮ　＋　は、画分３１および３２中で、なお、明らかであった。

例　３ＥＭＢＩＮ　ｌ　の生化学的特性決定熱安定性内皮細胞の増殖に対する抑制作用を有する陽イオン交換溶出液それぞれ１００μ ｌを、２．５．１０および６０分間、水浴中で９０℃で加熱した。この後、この試料を、氷上に置き、かつ滅菌後に、増殖試験において、該試料のなお残留する抑制的佐賀について試験した。

プロテアーゼ耐性種々のプロテアーゼを用いる処理によってＥＭＢＩＮ　＋の失活化可能性の試験のために、支持体として、ダイアフィルトレージョンしたＹＣＯ５−滞留物を、バイオゲル　Ｐ２によるゲル濾過クロマトグラフィーの前後に使用した。次のプロテアーゼを用いて、ＥＭＢＩＮ　＋の抑制因子の活性の失活化を試験したニトリプシン、Ｓ、アウレウス　■８　プロテアーゼ、クロストリバイン、サーモリシン、ズブチリシン、プロナーゼ　Ｅ、プロテイナーゼ　Ｋ、カルボキシペプチダーゼ　Ｙ、パパイン、ペプシン（シグマ社）、キモトリプシン、ピログルタミン酸塩−アミノペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼ　＾ｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼ　Ｌｙｓ−（：　（ペーリンガー　マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　）　、プロリン特異性エンドペプチダーゼ（セイカガク　コウギョウ（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ　Ｋｏｇｙｏ）、日本）。

プロテアーゼを、それぞれのプロテアーゼのために必要とされた緩衝液中に溶解し、ＥＭＢＩＮ　Ｉ　−支持体のアリコート中で、当該の酵素のために記載された条件下で培養した。プロテアーゼ活性の対照のために、ＢＳＡまたはリソチームを、同時試験において、プロテアーゼと一緒に培養し、かつ蛋白質の分解を、５ＤＳＰＡＧＥによって試験した。培養時間の終わりに、このプロテアーゼを、９５℃で５分間の配合物の加熱によって失活化し、該配合物を滅菌濾過し、かつＥＭＢＩＮ　＋　の失活化についてＢＡＥＣ試験において試験した。

プラスの対照として、ＥＭＢＩＮ　＋　に相応するアリコートを、酵素なしにではあるが、しかし、種々の配合物中で使用された消化緩衝液と一緒に、同じ条件下で培養し、かつＢＡＥＣ試験において試験した。

ＲＮアーゼおよびＤＮアーゼに抗する耐性ダイアフィルトレージョンしたＹＣ５０−滞留物それぞれ２０μｌに、まずＩＭのトリス／ＨＣｌ溶液ｐＨ７，５１μ ｌを添加し、ＤＮアーゼ配合物に、付加的に、Ｏ，ＩＭの塩化マグネシウム溶液１μｌを添加した。酵素（ペーリンガー　マンハイム）、それぞれｌμｌの添加後に、３７℃で３０分間培養し、引続き、消化物を試料緩衝液１０μｍの添加によって分解し、かつ混合物を、ゲル電気泳動により試験した。

ノイラミニダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼを用いる連鎖的消化（Ｓｅｑｕｅｎｚｉｅｌｌｅｒ　Ｖｅｒｄａｕ）脱塩したＹＣ０５−滞留物５００μｉを、７００ミリモルの酢酸ナトリウム緩衝液２９μｌで、ｐＨ５゜０に調節し、かつＩＵのノイラミニダーゼ（タイプＸ：シグマ社）を用いて、３７℃で２４時間消化させた。

“スピードヴアク（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）　”中での凍結乾燥後に、残分を、５０ミリモルのトリス／ＭＣＩ！！衝液ｐＨ７゜３５００μｍ中に入れ、塩化マグネシウムを添加した（１０ミリモルの最終濃度）。

前記滞留物２５０μｍを、ゲル電気泳動分析および増殖試験のために除去し、残分を、ＩＯＵのβ−ガラクトシダーゼ（シグマ社）と−緒に、３７℃で１８時間培養した。凍結乾燥後に、蒸留水２５０μｌ中に込れ、かつ試料を増殖試験において試験した。

グリコペプチダーゼ　Ｆと一緒の培養ＹＣ５０−滞留物２０μｍを、“スピードヴアク“中で乾燥させ、この後、消化緩衝液の同じ容量中に入れた（２０ミリモルのリン酸カリウムｐＨ６，８，１０ミリモルのＥＤＴＡ　ｐ）（ｓ；ｏ、２％のトリトンＸ　１１４；Ｏ７１％（７）ＳＤＳおよび１％ノメルカブトエタノール）、前記配合物に、グリコペプチダーゼ　Ｆ溶液３μｍ　（グリコペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ；ペーリンガー　マンハイム）を、ピペットで移し、３７℃で一晩培養した。この消化を、ＳＤＳ試料緩衝液の添加によって中断し、かつＳＤＳ　ＰＡＧＥを用いて分析した。

“グリカン検出キット“の使用による糖分含量の検出ＥＭＢＩＮ　１分子中のＮ −またはＯ−グルコシド的に結合したグリカン基の検出のための選択的検出システムとして、グリコ蛋白質１ｎｇまでの検出をできるようにスル、ベーリンガー社（マンハイム）によって販売されている“グリカン検出キット”を使用した。

ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製されたＥＭＢＩＮ　Ｉ−試料１０μｌおよび２０μ ｍを、誘導およびイムノプロット検出のための製造業者の記載により使用し、同様にトランスフェリン１０μｌを対照蛋白質として使用した。ジゴキシゲニン誘導体を、５ＤＳ−ゲル１．５％中で、ラエムリ法（Ｌａｅｍｌｌｌｉ−Ｍｅｔｈｏｄｅ　）により分離した。ニトロセルロース上での転移（０，４５μｍ；シュライヒｙ　−（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ）およびシュエル（Ｓｃｈｕｅｌ第３１５頁以降（１９８６年）、ヴアインハイム、　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ中に記載）の方法により実施した。マーカー蛋白質および未処理のＥＭＢＩＮ　Ｉ−試料が分離されていた５ＤＳ−ゲルの部分を、銀で着色した。

フェノール抽出水酸燐灰石でのクロマトグラフィー処理による抑制因子の活性画分１ｍｌに、水で飽和しかつトリス／ＨＣ１緩衝液でｐＨ７，５に調節されたフェノール溶液の同じ容量を添加し、入念に混合し、かつ完−全な相分離のために短時間遠心分離した。その上更に、この水相を、３回、同じ容ｌのクロロホルムを用いて、フェノールの残分を除去するために振盪し、かつ相分離のために再度短時間遠心分離した。全ての３つの相（水、フェノール、クロロホルム）を、′スピードヴアクは中で乾燥させ、かつＢＡＥＣ試験のために、２０ミリモルのＭＯＰ　Ｓｏｌ衝液ｐＨ６，８それぞれ１　ｍ　ｌ中に入れた。

脂質抽出バイオゲル　Ｐ２上でのゲル濾過後の抑制因子の作用画分２０μｌに、メタノール５０μｌおよびクロロホルム２５μｌからなる混合物を添加し、入念に混合し、かつ４℃で一晩抽出した。翌日、相分離を開始するために、水／クロロホルム混合物（１：　１．ｖ：ｖ）４０μｌを添加した。短時間の遠心分離後に、２つの相を分離し、′スピードヴアク”中で回転させ、かつゲル電気泳動のために出発容量中に入れた。

ジエチルピロ炭酸塩による失活化ダイアフィルトレージョンしたＹＣＯ５−滞苗物１００μｌに、ジエチルピロ炭酸塩（シグマ社）１μｌを添加し、入念に混合し、かつ室温で一晩培養した。

この溶液を、真空濃縮器中で乾燥させ、かっ残分を初期容量の蒸留水中に入れた。不溶性の沈殿物を、遠心分離によって除去した。遠心分離の上清を、滅菌濾過し、かつ増殖試験において試験した。

対照配合物として、ＰＢ３　１００μｍを、全く同様に処理し、かつ同様にＢＡＥ細胞上で試験した。

ＥＭＢＩＮ　＋のアミノ酸分析アミノ酸組成物の分析を、ＫｎｅｃｈｔおよびＣｈａｎｇによって記載された方法による若干の改質物を用いて、４−ジメチルアミノアゾベンゾ−ルー４°−スルホニルクロリド（ダブシルクロリド（Ｄａｂｓｙｌｃｈｌｏｒｉｄ）　）を用いる加水分解でのアミノ酸の予備カラム誘導によって実施した（　Ｃｈａｎｇ他、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、第１９９巻（１９８１年）、第５４７〜５５５頁；　ＫｎｅｃｈｔおよびＧｈａｎｇ、　Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｗ、第５８巻（１９８６年）、第２３７５〜２３７９頁）。

ピアス社（Ｆａ、　Ｐｉｅｒｃｅ）のダブシルクロリドを、１゜３ｍｇ／ｍ＋の濃度で、アセトニトリル中に溶解し、アリコート化し、−２０℃で貯蔵した。この場合、ＲＴで溶解したダブシルクロリドの一部が晶出したが、これは、使用直前に注意深く加熱することによって、再度溶解させることができた。

加水分解このために、測定すべき試料それぞれ４０μｍを、ライ−トン社（Ｆａ、　Ｗｈｅａｔｏｎ）　（ウィートン、ミルヴイル、ニューシャーシー（Ｗｈｅａｔｏｎ、　Ｍｉｌｌｖｉｌｌｅ、　ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）　）の容量２ｍｌを有する灼熱したガラスアンプル中にピペットで移し、かつ真空濃縮器中で乾燥させた。

全てのアンプル中に６ＮのＭＣＩ（シグマ社一定沸点）それぞれ２００μｍの添加後に、前記アンプルを、水流ポンプによる真空中で溶封した。試料を、油浴中、１１０℃で加水分解した０通常、２４〜６０時間、加水分解した。加水分解の間に部分的に分解する個々のアミノ酸の場合の損失を顧慮するため、全ての実験の場合に、榎準化したアミノ酸混合物（シグマ社）５μｌを、同じ条件下で加水分解し、かつ誘導した。

誘導冷却後に、この氷解物を、エッペンドルフ容器（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆｇｅｆａｅｓｓｅ）　１　、　５　ｍ　ｌ中に移し、かつ真空濃縮器中で乾燥させた。この残分を、Ｏ，ＬＭの炭酸水素ナトリウムａ衝液ｐＨ８，３１００μｍ中に入れた。こうして、全ての誘導配合物に、ダブシルクロリド溶液２５０μｍをピペットで移し、この場合、淡赤色の沈殿物が生じた。水浴中で７０℃でのこの後に続く加熱の場合に（１２分間）、前記沈殿物は、再度溶解し、かつ淡赤色からオレンジ色を経て黄色への変色が観測される。カップリング反応後に、アミノ酸が加水分解物中で、クロモゲン誘導体として存在する前記の固有のカップリング反応に引続き、試料を、室温に冷却し、引続き、５０ミリモルのリン酸カリウム／エタノール緩衝液ｐＨ７，０（１：　１．ｖ：ｖ）６５０μｌの添加によって、１ｍｌの最終容量に調節した。

個々の使用中に存在していた、より小さなフレーク状の沈殿物を、ペックマン− 車上遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎｎ−Ｔｉｓｃｈｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　）中で５分間の遠心分離によって除去した。

アミノ酸誘導体のＨＰＬＣ分析誘導されたアミノ酸のクロマトグラフィー処理による分離を、タイプ４２０のＨＰＬＣポンプ２個、検出器４３０１個およびデータ処理システム４５０を有するコントロン社（Ｆｉｒｍａ　Ｋｏｎｔｒｏｎ）のＨＰＬＣ装置上で実施した。アミノ酸誘導体を、４３６ｎｍで検出した。設置された試料磨砕機（Ｐｒｏｂｅｎｓｃｈｌｅｉｆｅ　）の容量は、７５μｌであった０分離カラムとして、５μの粒子を包装しているペックマン社（Ｆａ、　Ｂｅｃｋｍａｎｎ）のＣＩ８限外濾過ＯＤＳカラム（４，６Ｘ２５０ｍｍまたは４．６Ｘ１５０ｍｍ）を使用した。

可動相ＡおよびＢの組成を、ベックマン社からその“ダップスーアミノ酸キット（Ｄａｂｓ−Ａｍｉｎｏ　Ａｃ１ｄ　Ｋｉｔ）″のだめに出された処理規則に倣って行なった。１モル／ｌを有するクエン酸母液から出発して、まず、ｐＨ値を５ＮのＮａＯＨで６．５に調節したＯ、ＩＭの母液を製造した。

緩衝液を次のように定めた：Ａｇｏ、ＬＭのクエン酸ナトリウムｐｉ（ｔｌｉ、５１５０　ｍ　１ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）　４０ｍ１Ｈ，０８１０Ｂ二緩衝液Ａ３００ｍ　ｌに、緩徐にかつ絶えず撹拌しながら、アセトニトリル中のＤＭＦの４％の溶液７００　ｍ　ｌを添加した。

アミノ酸を、分離カラムの溶離によって、多重線の勾配を用いて、１．４ｍｌ／分間の流速で分離した二分間　時間　Ａ％　Ｂ％開始　−７１２９３０クロマトグラムの終了全ての分析すべき試料のｌｏｍｌを使用した。

量的評価を、アミノ酸標準の同じ容量を用いる較正によりデータシステム４５０によって自動的に行なつた。

ＥＭＢＩＮ　Ｉ−試料のアミノ酸分析の結果を、ＲＰ−ＨＰＬＣに使用した緩衝液（５ミリモルのへブタンスルホン酸、ＴＦＡ　Ｏ，０４％）だけを含有した対照試料の結果と比較した。前記対照試料は、アミノ酸を有する展開緩衝液の場合による汚染を示さなければならない。

アミノ酸　滞留時間　量　対照に対する差異（分間）（ｐモル）（ｐモル）ＡＳＸ　５．１５　２．４５　２．４５ＧＬＸ　５．８４　５．３０　５．３０ＳＥＲ１０，３２１，４０− ＰＲＯ１２，６９２，０６２，０６ＶＡＬ　１３．３２　２，４０　０．８４ＬＥＵ　１５．６１　３．１８　３．１８ＰＨＥ　１７．１０　−　− ＣＹＳ−ＣＹＳ　１８．７９　−　− ＬＹＳ　２１．１３　２．８７　１．４１Ｈ１ｓ　２１．３５　２．６８　２．６８ＴＹＲ２２，３１−− アミノ酸の実測量は、前記方法の検出限界である。

例えば、セリン、トレオニン、アルギニン、グリシンおよびアラニンの特性決定的ピークは、クロマトグラム中に存在し、同様にイソロイシン、フェニルアラニンおよびチロシンのピークが存在する。それにも関わらず、インチグレーターの該ピークは、上記の理由から同定されなかった。その上更に、存在するクロマトグラムからは、希少量のアミノ酸の存在に関しては、得ることができなかった。

を図１１電図２１１図３１＋１　１２　１３　１４　１５　１６　１７画分区図４１を図５１監図６１１図７１滞留時間　（今）を図８１画介国際調査報告１１、−−＾−−−陶　ＰＣＴ／ＥＰ　９２１００４１９−１ｗ１１＠−＾−− に−Ｍ、ＰＣＴ／ＥＰ　９２１００４１９国際調査報告ＥＰ　９２００４１９Ｓ＾　５６６６０フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＤＳ　８３１４−４ＣＤＵＣ０７Ｋ　３／２０　８３１８−４Ｈ１５１０６８３１８−４ＨＩ

Claims

【特許請求の範囲】

１．脊椎動物の組織か弓の内皮細胞の増殖に対する抑制因子の含量を増大させるための方法において、（ａ）出発物質として選択された組織を均一化し、引続き遠心分離し、（ｂ）組織抽出液を陽イオン交換体上にもたらし、かっこの陽イオン交換体に結合している物質を分別し、（ｃ）工程（ｂ）からの活性画分をゲル濾過クロマトグラフィー処理により分離し、かつ（ｄ）工程（ｃ）からの活性面分をＨＰＬＣ逆相を介して精製することを特徴とする、内皮細胞の増殖に対する抑制因子の含量を増大させる方法。
２．鳥類または哺乳類からの胚組織を出発物質として使用する、請求の範囲１記載の方法。
３．鶏の胚を出発物質として使用する、請求の範囲２記載の方法。
４．鳥類または哺乳類からの成体の脳組織を出発物質として使用する、請求の範囲１記載の方法。
５．成体のウシの脳を出発物質として使用する請求の範囲４記載の方法。
６．陽イオン交換体を介しての分別後に、活性画分を水酸燐灰石カラム上にもたらし、かつ水酸燐灰石カラムの通過量を限外濾過する、請求の範囲１から５までのいずれか１項記載の方法。
７．限外濾過の場合に、５００Ｄａの分離限界を有する膜を使用し、かつ限外濾過の滯留物を更に加工する、請求の範囲６記載の方法。
８．ゲル濾過クロマトグラフィーによる分離を、約１〜２ｋＤａの標準排除限界を有する物質を用いて実施する、請求の範囲１記載の方法。
９．ＨＰＬＣ精製を、８を上廻るアルカリ性のｐＨ値で実施する、請求の範囲１記載の方法。
１０．ＨＰＬＣ精製を、１０〜１３．５のｐＨ値で実施する、請求の範囲１記載の方法。
１１．ＨＰＬＣ精製を、酸性のイオン対形成剤の存在下に実施する、請求の範囲１記載の方法。
１２．ＨＰＬＣ複製を、アルキル−またはアリールスルホン酸０．１〜５０ｍｍモル／１の存在下に実施する、請求の範囲１１記載の方法。
１３．請求の範囲１から１２までのいずれか１項記載の方法によって得られる内皮細胞の増殖に対する抑制因子において、該抑制因子が、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中でのゲル電気泳動の場合に、２．５〜６．２ｋＤａの範囲内で見かけの分子量を有するバンドを生じることを特徴とする、内皮細胞の増殖抑制剤。
１４．該抑制因子が、９０℃での６０分間の加熱、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼに抗して耐性であり、かつ検出可能な糖分および脂質分を含有しないが、しかし、該抑制因子の活性は、ジエチルピロ炭酸塩の添加によって抑制可能である、請求の範囲１３記載の抑制剤。
１５．請求の範囲１から１２までのいずれか１項記載の方法によって得られる内皮細胞の増殖に対する抑制因子において、該抑制因子が、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中でのゲル電気泳動の場合に、１６〜２０ｋＤａの見かけの分子量を有するバンドを生じる、内皮細胞の増殖に対する抑制因子。
１６．医薬品において、場合によっては常用の担持剤、助剤および／または充填剤を有する作用物質としての請求の範囲１３、１４または１５のいずれか記載の抑制因子を特徴とする、医薬品。
１７．血管成長の抑制を必要とする疾病状態の治療のための、請求の範囲１３、１４または１５のいずれか１項記載の抑制因子の使用。
１８．腫瘍、リウマチ様関節炎、糖尿病性網膜症および水晶体後繊維増殖症の治療のための、請求の範囲１３、１４または１５のいずれか１項記載の抑制因子の使用。
１９．血管の新たな形成を調節するための創傷治療のための、請求の範囲１３、１４または１５のいずれか１項記載の抑制因子の使用。
２０．血管成長の抑制を必要とする疾病状態の治療のための医薬品を製造するための方法において、請求の範囲１３、１４または１５のいずれか１項記載の１つまたはそれ以上の抑制因子を、製薬学的に認容性の形で処方することを特徴とする、医薬品の製造法。