JPH06506832A - 安定化酵素及び洗剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 安定化酵素及び洗剤 コードするヌクレオチド配列及びこの新規の安定化プロテアーゼをコードするヌ クレオチド配列を含む宿主生物に関する。

背景技術 ロチアーゼと、機能的にセゾンエンドプロテアーゼであり、ズブチいる（Ｗｈｉ ｔｅ、　ＨａｎｄｌｅｒとＳｍ１ｔｈ　（１９７３）　；　Ｐｒｊｎｃｉｐｌｅ ｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈａｖｉｓｔｒｙ；プロテアーゼは、ＰＩ（９，０から比０ に至る一部のセリンプロテアーゼ本発明との関連において、ズブチリシンはダラ ム陽性の細菌又はＭ類より生産されるセリンプロテアーゼである。別の定義に従 うと、ズブチリシンはセリンプロテアーゼであり、その触媒性トリアドにおける アミノ酸残基の相対順序はＡｓｐ−ｆ（ｉｓ−５ｅｒ（位置３２．６４及び２２ １）である０幅広い様々なズブチリシンが固定されており、そして数多くのズブ チリシンのアミノ酸配列が決定されている。これにはとりわけバチルス株に由来 する６種のズブチリシン、即ち、ズブチリシン１６８．ズブチリシンＢＰＮ’、 ズブチリシン　カールスバーグ、ズブチリシンＤＹ、ズブチリシンアミロサッカ リティカス及びメセンテリコペブチダーゼ（Ｋｕｒｉｈａｒａら（１９７２）　 ；　Ｊ、　８ｉｏ＋、　Ｃｈｅｍ、；　２４７５６２９−５６３１　；　Ｗｅｌ ｌｓら　（１９８３）　；　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、；　１１７ ９１１−７９２５　；５ｔａｈｌ　とＦｅｒｒａｒｉ　（１９８４）　：　Ｊ、 　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、；　１５９８１１−８１９　；　Ｊａｃｏｂｓら（１９ ８５）　；　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　１ｉｅｓ、；　１３８９１３−８９２６ 　；　Ｎｅｄｋｏｖら（１９８５）Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　）Ｉｏｐｐｅ−５ ｅｙｌｅｒ　；　３６６４２１−４３０　Ｈ５ｖｅｎｄｓｅｎら（１９８５）　 ；ＦＥＢＳ　ＬＥ丁丁ＥＲ３；　１９６２２Ｂ−２３２３、アクチノミセス目由 来の１種のズブチリシン、即ち、サーモアクチノマイセス　バルガリス（Ｔｈｅ ｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）由来のサーミターゼ（Ｍｅ ｌｏｕｎら（１９５）　、　ＦＥＢＳ　ＬＥＴＴＥＲ５；　１９８３１９５−２ ００）　、及び１種の菌類ズブチリシン、即ち、トリチラキウム　アルブム（Ｔ ｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ　ａｌｂｕ＋＋＋）由来のプロテアーゼＫ　（Ｊａｎｙ とＭａｙｅｒ　（１９８５）　；　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅａ＋、　Ｈｏｐｐｅ−５ｅ ｙｌｅｒ　；　３６６５４８−４９２）が含まれる。

ズブチリシンのようなプロテアーゼは工業、特に洗剤配合物においてかなりの有 用性が見い出されており、なぜならそれらはタンパク質性の染みを除去するのに 有用であるからである。

タンパク質の構造 プロテアーゼは球状タンパク質であり、そしてその長いポリペプチド鎖の折りた たみが相当量の程度あることに基づいてかなりコンパクトである。そのポリペプ チド鎖は「生ｔａＪ及びその「側鎖基Ｊより本質的に構成される。ペプチド結合 は平面性であるため、Ｃα−Ｎ軸及びＣα−Ｃ″軸を中心とする回転のみが可能 である。ペプチド主鎖のＣα−Ｎ結合を中心とする回転はねじれ角φ（ファイ） で表わされ、Ｃα−Ｃ′結合を中心とする回転はψ（サイ）で表わされる［例え ば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、　Ｔ、　Ｅ、　（１９８４）　；　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ 　；　１４．　Ｈ。

Ｆｒｅｅｔｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　、を参照の こと〕、これらの回転き、たポリペプチド鎖において、Ｎ、Ｃα及びｃ１原子は 全て互い　−に対して「トランス」にある。Ｖシス」コンホメーションにおいて は、φ及びψのの角はＯ″の値と定める。この位置からのこれらの結合の回転、 即ち、この回転した結合の背後から見て原子が「反時計方向」に移動することを 定義により負の値と定め、「時計方向Ｊを正の値と定める。従って、ねじれ角の 値は一１８ｏ°〜＋１８ｏ°の範囲にある。

Ｃα一原子はこの鎖の回転点であるため、Ｃα一原子に結合している側鎖基（Ｒ 基）は分子のコンホメーションに関連して非常に重要となる。

「コンホメーション」なる語はタンパク質の全体構造を形成するうえでのポリペ プチド鎖の二次及び三次構造の関与を明らかにする。

タンパク質の適切なコンホメーションはタンパク質の特異的な構造にとって主に 重要であり、そして酵素の固有の触媒的性質（即ち、活性及び特異性）並びにそ の安定性に大いに寄与する。

ポリペプチドのアミノ酸は４種の一般的な群、即ち、非極性、非荷電、及び負又 は正荷電極性アミノ酸に分類することができる。タンパク質分子は、それが通常 見い出せるその水性環境に沈められると、周囲の環境に対してその最大数の極性 側鎖基をさらす傾向にあり、その際、大半のその非極性側鎖基は内側に配向する 。この状況における側鎖基の配向はタンパク質のコンホメーションの安定化につ ながる。

従って、タンパク質は、折りたたまれ、且つ、秩序のとれた状態と、はどかれ、 且つ、無秩序な状態との動力学的平衡状態において存在している。この平衡状態 は、タンパク質の全体構造を安定化せしめる傾向の、ポリペプチド鎖の様々なセ グメント間での近距離の相互作用にある程度反映する。同時に、熱力学的エネル ギーはほどかれた分子の無秩序化を助長する傾向にある。

安定化酵素を画策する方法は、ポリペプチド主鎖の柔軟性を下げることによりは どきの程度を下げ、そして同時にほどかれている鎖のエントロピーを下げること にある。現在まで、新規の安定化プロテアーゼの開発においてこの理論を証明す るのにわずかな試みしかなされていない。

タンパク質の熱的安定性を高める一般的な理論が提供されている（Ｓｕｚｕｋｉ 、　Ｙ、　（１９８９）　；　Ｐｒｏｃ、　Ｊａｐａｎ　Ａｃａｄ、；　６５　 Ｓｅｒ、　Ｂ’Ｊ　ｏ　この論文において５ｕｚｕｋｉは、球状タンパク質の熱 的安定性は、酵素の二次及び三次構造、並びに触媒的ｍ能を有意に変えることな く、β−ターンの第２部位におけるプロリンの存在率を高めることによって高い 程度にまで漸増的に高めることができると述べている。この理論は様々な事実及 び発見、特にプロリン残基がβ−ターンの第２部位にて優先的に存在する傾向が 強いことを示す事実に基づ（〔Ｌｅνｉｔｔ。

Ｍ　（１９７８）　；　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　；　１７４２７７−４２８ ５　；及びＣｈｏｕ、　Ｐ、　Ｙ、　＆Ｆａｓｔｘａｎ、　Ｇ、　Ｄ　（１９７ ７）　；　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、；　１１５１３５−１７５）　、この理 論はタンパク質におけるβ−ターンの第２部位へのプロリンの挿入に限定され、 その他の部位については述べられていない。

国際特許公開ＷＯ８９１０１５２０（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　 ＵＳＡ）は、タンパク質のほどきの形態的エントロピーを下げることによりタン パク質の安定性を高める方法を提供する。この方法はストレプトマイシンルビキ ノサス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｒｕｂｉｑｉｎｏｓｕｓ）キシロースイソ メラーゼに通用され、そしてこれはプロリンによるアミノ酸の１Ｆ換、又は予測 の位置でのグリシンのアラニンとの交換を包括する。

国際特許公開−０８９１０９８１９（Ｇｅｎｅｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　 ＵＳＡ）において、ズブチリシンの安定化のために突然変異を組入れる方法が提 供されている。この公開公報は熱的安定化性突然変異であると認められる数多く のアミノ酸突然変異を列挙している。このリストはズブチリシンの位置１８８　 （ＢＰＮ’　の番号付け）でのセリンのプロリンによる置換を含んで成る。

国際特許出願公開−０８７１０５０５０（Ｇｅｎｅｘ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ＋　ｔｌｓＡ）は突然変異誘発及びスクリーニングについての方法を述べている 。この方法により、１又は複数の突然変異が突然変異誘発側による処理によって 導入され、そしてこの方法は変更された性質を有する生成物についてのその後の スクリーニングを含んでいる。そのランダム突然変更誘発の結果、位置１８８　 （ＢＰＮ″番号付け）にプロリン残基を有するズブチリシンが提供される。

本発明の目的は、改善した安定性を存する新規のプロテアーゼの提供にある。

発明の概要 本発明は新規の安定化プロテアーゼを提供し、そのうちの天然のアミノ酸残基（ プロリンを除（）は１又は複数の位置にてプロリン残基に置き換えられ、その位 置にて二面角φ（ファイ）及びψ（サイ）は〔−９０°＜　φ＜−４０”及び− １８０’　＜ＩＪ／＜１８０　”　Ｅ　Ｃ）間隔以内、好ましくは〔−９０°〈 φ＜−４ｏゝ及び１２０　’　＜ψ＜Ｉ８ｏ　’　）又は〔−９０°くφ＜−４ ０”及び−５ｏ゛〈ψ＜１０”　）の間隔以内の値を構成し、そしてそれらの位 置は、α−ヘリックス又はβ−シート構造を保有することにより特徴付けられる このプロテアーゼにおける領域には位置していない。

別の観点において、本発明は該プロテアーゼをコードするヌクレオチド配列に関 連する。更なる観点において、本発明はプロテアーゼをコードするヌクレオチド 配列を含んで成る発現ベクター、及びこの発現ベクターを含む宿主生物に関する 。

ズブチリシン 本発明に関連して、ズブチリシンはダラム陽性のＩＩＩ菌又はｗ類により生産さ れるセリンプロテアーゼと定義する。別の定義によると、ズブチリシンはセリン プロテアーゼであり、ここでその触媒性トリアドにおけるアミノ酸残基の相対順 序はＡｓｐ−旧５−５ｅｒ（位置３２．６４及び２２１．　ＢＰＮ’番号付け） にある。

アミノ酸 下記の記号をアミノ酸の略語について用いた：Ｄ　＝　Ａｓｐ　＝　アスパラギ ン酸 Ｅ　＝　Ｇｌｕ　＝　グルタミン酸 Ｆ　＝　Ｐｈｅ　＝　フェニルアラニンＬ　＝　Ｌｅｕ　＝　ロイシン Ｍ　−Ｍｅｔ　＝　メチオニン Ｗ　＝　Ｔｒρ　−トリプトファン Ｙ　＝　丁ｙｒ＝　チロシン Ｂ　＝　Ａｓｘ　＝　Ａｓｐ（Ｄ）又はＡｓｎ　（Ｎ）Ｚ　＝　ＧＩｘ　＝　Ｇ ｌｕ　（Ｅ）又はＧｉｎ　（Ｑ）Ｘ＝　任意のアミノ酸 ４　＝　アミノ酸の欠失又は不存在 プロテアーゼ変異体 本発明の安定化プロテアーゼはプロテアーゼ変異体又は突然変異プロテアーゼで ある。プロテアーゼ変異体又は突然変異プロテアーゼとは、親遺伝子のＤＮＡヌ クレオチド配列又はその誘導体の変更により獲得できるプロテアーゼを意味とす る。このプロテアーゼ変異体又は突然変異プロテアーゼは、このプロテアーゼを コードするＤＮＡヌクレオチド配列を適当な宿主生物における適用ベクターの中 に挿入したときに発現して生成される。この宿主生物はこの親遺伝子が由来する 生物と同一である必要はない。

アミノ酸の番号付は 特別の番号付けを採用している。様々なズブチリシンのアミノ酸配（ｒＢＰＮ’ の番号付け」、例えば国際特許公開−〇　８９１０６２７９及び挿入）として表 わす。

多重突然変異はプラスで分けている。即ち：る。

酵素によるジメチルカゼイン（ＤＭＣ）の消化に基づく。ホルダーＡＰ　２２０ ／　１はノボ　ノルディスク　Ａ／Ｓ、デンマーク国から波間により入手でき、 このホルダーは引用することで本明細書に組入れる。

又は洗浄性能と呼ぶ。本明細書にわたっては、洗浄性能なる語をその性能を包括 するように利用している。

図面の簡単な説明 本発明を添付図面を参照しながら更に説明するが、ここで：図１　（図面１／２ ０〜１５／２０）は合成遺伝子の構築を示し；そして図２（図面１６／２０〜２ ０／２０）は、液体洗剤中で保存した後の、野生型酵素と比べたズブチリシン３ ０９変異体の残留活性を示す。

のアミノ酸残基（プロリンを除く）は１又は複数の位置にてブロリ構造を保有す ることにより特徴付けられるこのプロテアーゼにおけであるか又はそれと類似の 構造的特徴を有し、且つ、このプロテアーゼにおいて天然のアミノ酸残基（プロ リンを除く）は１又は複数の位置にてプロリン残基に１き換えられ、その位置に て二面角φ（ファイ）及びψ（サイ）は［−９０’　＜φ＜−４０”及び−１８ ０°くφ〈１８０°］の間隔以内、好ましくは〔−９０°〈φ＜−４０’及び１ ２０　’　＜Ｖ＜１８０°〕又は（−９０”　＜　φ＜−４０’及び−５０’＜ ｔＰ＜１０°］の間隔以内の値を構成し、そしてそれらの位置は、α−へリソシ ス又はβ−シート構造を保有することにより特徴付けられるこのプロテアーゼに おける領域には位置していないものである。

更に、本発明に関連して、安定化プロテアーゼは改善された安定性、例えば熱安 定性、貯蔵安定性等を、親酵素の比とべたときに有するプロテアーゼである。

タンパク質の二次構造の規定 本発明の安定化プロテアーゼは、課題のプロテアーゼを二次構造の分析に付して 、α−へリソシス又はβ−シート構造を保有することにより特徴付けられる該プ ロテアーゼにおける領域に位置する残基を除く、間隔〔−９０°＜　φ＜−４０ ａ及び−１８０’　＜ｔＰ＜１３Ｑ°〕、好ましくは間隔〔−９０°〈φ〈−４ ０°及び−１２０°くψ＜１８０°］又は〔−９０°くφ〈−４０°及び−５０ °くψ〈１０°〕に限定される二面角α（ファイ）及びψ（サイ）をそれぞれ有 する該プロテアーゼにおける残基を同定し、もしこの同定した位置にプロリンが 存在していないなら、この同定した位置において天然アミノ酸をプロリン残基に よって置換しく好ましくは課題のプロテアーゼをコードする大して遺伝子を発現 せさ、続いて適当な栄養培地の中で前記宿主生物の培養を行い、そして所望のプ ロテアーゼを回収することによって獲得できる。

この調製法は課題のプロテアーゼを二次構造についての分析に付することを含む 。かかる分析を行うには、このプロテアーゼの原子構造を明確にしなくてはなら ない。原子構造はＸ線回折技術により決定できる。ｘ１回折技術は例えばＩ（ｅ ｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、　Ｈ，Ａ　（Ｘ−ｒａｙｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ　：　Ｐ ｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　（Ｏｘｅｎｄｅｒ、Ｄ、Ｌ、　とＦｏ ｘ、Ｃ。

Ｆ、＆１ｉｉ）第１章；Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、　Ｉｎｃ、　（１８９７）　 〕及びＣｒｅｉｇｈｔｏｎ＋　Ｔ。

Ｅ、、前掲、第６章に説明されている。

ズブチリシン３０９の結晶構造は推定されており（Ｂｅｔｚｅｌ、　Ｂ−＋に１ ｕｐｓｃｈ＋　Ｓ、、Ｐａｐｅｎｄｏｌｆ、　Ｇ、＋Ｈｏ５ｔｒｕｐ＋　Ｓ、＋ Ｂｒａｎｎｅｒ、　Ｓ、及び−１１ｓｏｎ。

Ｋ、　Ｓ、（１９９２）　；　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２２３４２７−４ ４５　）　、そして同等物が寄与されており、そしてＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｐ ｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋより入手できる（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎら（１ ９７７）　；　Ｊ、門ｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１１２５３５−５４２１　。

原子構造が決定されたら、その原子配位がら二面角を計算することが可能となる 。更に、二次構造因子を決定することが可能となる。

この二次構造因子は水素結合に基づいて決定される。協調的二次構造は「ターン 」及び「ブリッジ」の基本的な水素結合パターンの反復として認識される。反復 ターンは「ヘリックス」であり、反復ブリッジは「ラダー」であり、連結ラダー は「シート」である。

二次構造因子についての分析は、構造設定と原子配位がら抽出した幾何学的特徴 とのコンピューター編集を必要とする。原子配位に基づくタンパク質の二次構造 を明らかにする常用の方法はＫａｂｓｃｈ＋−０と５ａｎｄｅｒ、　Ｃ，により 説明されているＣＢｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ　（１９８３）　２２２５７７−２６ ３７　）。この論文において、パターン認識プロセスによる、原子配位からの構 造的特徴についての計算法が提供されている。まず、Ｈ結合基のペアー間での静 電的相互作用を基礎としてＨ結合を同定する０次に、Ｈ結合のパターンを二次構 造因子、例えばターン（Ｔ）、ヘッド（Ｓ）、ブリッジ（Ｂ）、ヘリックス（Ｇ 、Ｈ。

■）、β−ラダー（Ｅ）及びβ−シート（Ｅ）を規定するために利用する。

Ｋａｂｓｃｈ　＆　５ａｎｄｅｒフアイルの計算を可能とし、そして基本書ＰＡ ＳＣＡＬに記載のコンピュータープログラムＤＳＳＰ　（タンパク質の二次構造 規定）ばＰｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａ　Ｂａｎｋ、　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　Ｄｅｐ ｔ、、ＢｒｏｏｋｈａｖｅｎＮａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、υｐｔ ｏｎ、　Ｎ、　Ｙ、　１１９７３より入手できる。

結晶性プロテアーゼにおける原子構造に基づいてアミノ酸についての二面角φ（ ファイ〕及びψ（サイ）を計算した後、プロリン残基による置換にとって好適な 二面ファイ及びプサイ角を有する位置コンホメーションとは適合しない。Ｃα− Ｎ結合を中心とする同じ回転的拘束及び鎖における所定のアミノ酸が乱れない条 件に基づき、二面角ファイ及びサイ（特にファイ）の程度はポリペプチドにおけ るプロリン残基に関して一定の間隔で限定される。ポリペプチドにおけるプロリ ン残基についての二面角はほぼ排他的に間隔〔−９０゜くφ〈−４０°及び−ｉ ｇｏ　’　＜中＜１８０　”　）　、好ましくは間隔〔−９０゜くφ＜−４０’ 及び１２０　’　＜ψ＜１８０　’　）又は〔−９０″〈φ〈−４０゜及び−５ ０°〈ψ＜１０°〕以内にある。関連して、シス−及びトランス−プロリン残基 の両方が考えられる。

前記の手法により１又は複数の位置にプロリンが既に存在していることが認めら れることがあり、そしてこの場合はむろん置換は不適切である。そうでなければ 、この方法は天然アミノ酸のプロリン残基による置換を含む。

しかしながら、予測位置全てでのプロリンへの置換は常にプロテアーゼの熱的安 定性の改善をもたらすわけではない。この方法により表示されるい（つかの位置 では、天然アミノ酸残基のプロリン残基への置換は予測し得ない因子、例えば本 質的な柔軟性の欠失、Ｈ結合の可能性の欠失、予測し得ない立体障害等に基づい て不安定の原因となりうる。かかる「臨界部位」は予測できない。

個別の置換の安定化性（又は不安定化性）効果は付加的であると予測される。例 えばＷｅｌｌｓ＋　Ｊ、　Ａ、　ＣＢｒｏｃｈｅｍｒｓｔｒｙ　（１９９０）こ の（３７）８５１０−８５１７　）及び下記の表４を参照のこと。

ズブチリシン３０９とは異なるズブチリシンをこの方法に付するとき（たとえこ の２種のズブチリシンが非常に類似しているときでさえも）、この方法より同じ 位置番号又は特に同じ位置が得られるとは限らない。いくつかの位置は同一であ りうる傾向にあり、そして位置の番号はほぼ同じ傾向にあるが、それを予測する ことはできなしかしながら、任意の特定のプロテアーゼに適用した上記の方法に 由来する安定化性プロリン置換は、任意のその他のプロテアーゼに対して、前者 のプロテアーゼに適用した上記の方法の結果とは異なる安定化性効果を有してい ることもある。

ズブチ’Ｊ　シ：／３０９分子（国際特許比ＭＰＣＴ／ＤＫ８８１００００２を 参照ノコと）に本方法を実施したとき、表１及び２に記載の一連のデーターが得 られた。表１には、ファイ及びサイ角に関連する、第１基準に合う一連の位置、 及び他の基準に合う一連の位置を示す。

１−上 ファイ及びプサイ角に基づくズブチリシン３０９に企てたプロリン突然変異。

ＩＪ＝　ニー９ｏ１＜ファイ＜−４０’及び１２０　”　＜プサイ〈１８０ｍ又 は−９０°くファイ〈−４０°及び−５０＠＜プサイ＜１０°。

表１に記載の基準に対するがサイ角における拘束を緩和することにより、４種の 更なる突然変異が企てらる０表２を参照のこと。

表−叉 ファイ及びサイ角に基づくズブチリシン３０９に企てたプロリン突然変異。

塁超ｌ準ニー９０°〈ファイ〈−４０°及び−１８０’　＜−サイ〈１８０゜ア ルファーヘリックス又はベーターシート構造を除く好ましい安定化プロテアーゼ 好ましくは、本発明のプロテアーゼは安定化ズブチリシンプロテアーゼである。

より特別な観点において、本発明の好ましいプロテアーゼはズブチリシンであり 、ここでこの獲得される安定化ズブチリシンは表１及び２に記載の１又は複数の 位置（ＢＰＮ’番号）又はそれに４以の位置でのプロリン残基への置換を含んで 成る任意のズブチリシンである。

９８、１７２．１８８．１９４．２４２及び２５９（ＢＰＮ’番号）の１又番よ 複数の（立置にているズブチリシンである。更に好ましし１態様におし）て、こ のズブチリシンは下記の置換のうちの１又番よ複数の置換を更に含んで成る：２ ７Ｒ，３６Ｄ、　７６Ｄ、　９７Ｎ、　９８Ｒ，１０４Ｙ、　１２００．１２８ Ｇ、　１９５Ｅ、　２０６Ｃ，２１８５゜ブチリシン３０９、安定化ズブチリシ ン１４７、安定イヒズフ′チＩＪシンＰＣＴ／Ｄに８８１００００２に記載され 、ズブチリシンＢＰＮ’　４よ―ａｌｌら（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ 、　（１９８３）　１１７９１１−７９２５）に記載され；ズフ゛チＩＪシンカ ールスバーグはＳ＋＋　ｉ　Ｌｈら（Ｓ＋＋ｉｔｈ、　Ｅ、　Ｌ、；　Ｄｅｌａ ｎｇｅ、　Ｒ，Ｊ　；　Ｅｖａｎｓ、　Ｗ。

Ｈ，；　Ｌａｎｄｏｎ、　Ｗ、：門ａｒｋｌａｎｄ、　Ｆ、　Ｓ、　（１９６８ ）　；　５ｕｂｔｉｌｉｓｎ　ＣａｒｌｓｂｅｒｇＶ、　Ｔｈｅ　ｃｏｍｐｌｅ ｔｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　：　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｗｉｔｈ　５ｕｂｔｉｌ ｉｓｉｎ　ＢＰＮ’　；Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　５ｈｉ ｐｓ　；　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、２４３　（９）　２１８４−２１９１ ）及びＪａｃｏｂｓら（Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒｅｓ、　（１９８５）　 １３８９１３−８９２６　〕び５２５９Ｐ　（ＢＰＮ”番号）。更に好まししＮ ｕ様にお（１て、このズブチリシンは下記の置換のうちのｌ又しま複数を更に含 んで成る：　Ｋ２７Ｒ。

”３６Ｄ、Ｎ７６Ｄ、Ｇ９７Ｎ、Ａ９８Ｒ，Ｖ１０４Ｙ、Ｈ１２０Ｄ、５１２８ Ｇ、Ｇ１９５Ｅ、ロ２０６Ｃ。

Ｎ２１８Ｓ、　Ｋ２３５Ｌ、に２３５Ｒ，Ｋ２３７Ｒ，Ｋ２５１Ｅ及びＹ２６３ Ｆ　（ＢＰＮ’番号）。

更なる別の特別な観点において、本発明のプロテアーゼは安定化ズブチリシン３ ０９であって下記の置換のうちの１又は複数が導入されているものである：　Ｔ ３８Ｐ、　５５７Ｐ、　Ａ９８Ｐ、　Ａ１７２Ｐ、　Ａ１９４Ｐ、　５２４２Ｐ 及び５２５９Ｐ　（ＢＰＮ’　番号）。更に好ましい態様において、このズブチ リシン３０９は下記の置換のうちの１又は複数を更に含んで成る：　Ｋ２１Ｒ。

”３６Ｄ、　Ｎ７６Ｄ、　Ｇ９７Ｎ、　Ａ９８Ｒ，Ｖ１０４Ｙ、　）１１２００ ．５１２８Ｇ、　Ｇ１９５Ｅ、　Ｑ２０６Ｃ。

Ｎ２１８Ｓ、　Ｋ２３５Ｌ、に２３５Ｒ，Ｋ２３７Ｒ，Ｋ２５１Ｅ及びＹ２６３ Ｆ　（ｅＰＮ’番号）。

本発明の最好ましいプロテアーゼは：ズブチリシン３０９／に２７Ｒ＋”３６Ｄ ＋Ｇ９７Ｎ＋Ａ９８Ｒ＋Ａ１９４Ｐ＋に２３５Ｒ＋に２３７Ｒ＋に２５１Ｅ＋Ｙ ２６３Ｆ　、ズブチリシン３０９／に２７Ｒ＋　’″３６Ｄ＋Ｇ９７Ｎ＋Ａ１９ ４Ｐ＋に２３５Ｒ＋に２３７Ｒ＋に２５１ε＋Ｙ２６３Ｆ、ズブチリシン３０９ ／に２７Ｒ＋　−３６０＋Ｇ９７Ｎ＋Ａ１９４Ｐ＋に２３５Ｒ＋に２３７Ｒ＋Ｙ ２６３Ｆ、ズフ′チリシン３０９／”３６Ｄ＋Ｎ７６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋＾１９４ Ｐ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２３５Ｌ、ズブチリシン３０９／”３６Ｄ十Ｇ９７Ｎ＋Ｖ１ ０４Ｙ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｇ１９５Ｅ、ズブ＋　’）　’ｉ　７３０９ ／　”３６Ｄ＋Ｇ９７Ｎ＋Ｖ１０４Ｙ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｇ１９５Ｅ＋ に２３５Ｌ、ズフ″チ’Ｊ　シフ３０９／　”３６Ｄ＋Ｇ９７Ｎ＋Ｈ１２０口＋ Ａ１９４Ｐ＋Ｇ１９５Ｅ、ズフ′チリシン３０９／　”３６Ｄ＋Ｇ９７Ｎ＋Ｈ１ ２０Ｄ十Ａ１９４Ｐ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２３５Ｌ　、ズブチ’Ｊ　シフ３０９／　 ”３６Ｄ＋Ｖ１０４Ｙ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｇ１９５Ｅ　、ズブチリシフ ３０９／　”３６Ｄ＋Ｖ１０４Ｙ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｇ１９５Ｅ＋に２ ３５Ｌ、ズブチリシン３０９／“３６Ｄ＋）１１２０Ｄ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｇ１９５ Ｅ　、ズブチリシン３０９ノ′″３６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｇ１９５Ｅ ＋に２３５Ｌ及びズブチリシン３０９／＾１９４Ｐ（ＢＰＮ’番号）である。

プロリン安定化の効果 本発明に従って獲得できた精製変異体は野生型ズブチリシン（ズブチリシン３０ ９）に比べて少な（とも同等に良好に洗浄をもたらすことが試験された。実験デ ーターについては実施例５を参照のこと。

貯蔵安定性は一般に熱安定性に反映する、即ち、改善された熱安定性は改善され た貯蔵安定性に対応する。精製変異体の熱安定性における改善を、示差熱量（Ｄ ＳＣ）法により試験した。実験データーについては実施例３を参照のこと。これ らの試験の結果を下記の表３に示す。貯蔵安定性はミニ　ストーレッジテストに より試験しく実験データーについては、実施例４を参照のこと）、そして貯蔵安 定性の結果を図２に示す。

表３ ズブチリシン３０９に対する安定比 表３から、野生型酵素に比にて構築した変異体のうちの３種が有意に改善された 熱安定性を有し、変異体のうちの２種が若干改善された熱安定性を有し、変異体 のうちの４種が熱安定性において存意な変化を有さす、そして変異体のうちの３ 種が有意に下がった熱安定性を有することが示された。

これらの結果は、本明細書に記載のファイ−プサイ−概念によるタンパク質のプ ロリン残基の導入による安定化について明確な理論が存在するにもかかわらず、 個別の変異体の安定化効果についての結論は立てられない。

しかしながら、改善された熱安定性を有する変異体が獲得されるとき、個別の突 然変異の安定化効果は一般に付加的と考えられる。

これは、野生型酵素に対比しての、ズブチリシン３０９変異体の示差熱量（ＤＳ Ｃ）により決定される熱変性温度を示している下記の表４において実証されてい る。

従って、挿入した安定化性プロリン残基の他に、本明細書記載の１又は複数の付 加安定化性突然変異を含む安定化プロテアーゼ変異体は本発明の範囲に属すると 考えられる。

ｌ−土 ズブチリシン３０９　・　における・　ｔかっこ内の数字は個別に試験した変異 体についてのΔＤＳＣ温度の今度異体　ΔＤＳＣ （°Ｃ） プロテアーゼをコードする遺伝子において突然変異を供する方法遺伝子の中へと 突然変異を導入する多くの方法が当業界によく知られている。ズブチリシン遺伝 子をクローニングする簡単な説明の後に、このズブチリシン遺伝子内の特定の部 位に突然変異を発生せしめる方法を説明する。

ズブチリシン遺伝子のクローニング ズブチリシンをコードする遺伝子は当業界によく知られている様々な方法により 任意のゲノム陽性菌又は菌類からクローンされうる。

まずゲノム及び／又はＤＮＡのｃＤＮＡライブラリーを、課題のズブチリシンを 生産する生物に由来する染色体ＤＮＡ又はメソセンジャーＲＮ＾を用いて構築す る。次に、ズブチリシンのアミノ酸配列がわかっているなら、相同性のオリゴヌ クレオチドプローブを合成し、ラヘルし、そして細菌ＤＮＡのゲノムライブラリ ーに由来する、又は菌類ｃＤＮＡライブラリーに由来するズブチリシンコードク ローンを同定するのに用いることができる。他方、別の細菌又は菌類の株に由来 するズブチリシンに相同性の配列を含むラヘル化オリゴヌクレオチドプローブを 、低緊縮のハイブリダイゼーション及び洗浄条件を用いてズブチリシンコードク ローンを同定するプローブとして利用できる。

ズブチリシン生産性クローンを同定する更に別の方法は、プラスミドのような発 現ベクターへのゲノムＤＮへのフラグメントの挿入、例えばスキムミルクを含む アガー上でのブレーティングを包括する。

ズブチリシン保有プラスミドを含む細菌は、分泌したズブチリシンによるスキム ミルクの消化により、透明なアガーの輪により囲まれたコロニーをもたらすであ ろう。

ズブチリシン遺伝子における部位特異的突然変異誘発の発生ズブチリシン遺伝子 がクローンでき、そして突然変異誘発にとって所望される部位が同定されたら、 合成オリゴヌクレオチドを用いて突然変異を導入することができる。これらのオ リゴヌクレオチドは所望の突然変異部位にフランクしたヌクレオチド配列を含ん でおり、突然変異ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成中に挿入される。好ま しい方法において、ズブチリシン遺伝子を橋渡しする一末鎖ギャソプのＤＮＡを 、ズブチリシン遺伝子を抱えるヘクターの中に作る。次に所望の突然変異を抱え る合成ヌクレオチドをこの一本鎖ＤＮＡの相同性領域とアニールさせる。残留ギ ャップを次にＤＮＡポリメラーゼＩ　（フレノウ　フラグメント）により補完し 、そしてその構築体をＴ４リガーゼを用いてリゲートさせる。本方法の特定の例 はＭｏｒｉｎａｇａら（１９８４）　；　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　２６ ４６−６３９に記載されている。

Ｍｏｒｉｎａｇａらに従うと、遺伝子内のフラグメントは制限エンドヌクレアー ゼを用いて除去している。ギヤノブを含んでいるベクター／遺伝子を次に変性さ せ、次いでギャップを含む代わりに、このギャップに包括される領域外の部位に て別の制限エンドヌクレアーゼで切断されているベクター／遺伝子とハイブリダ イズさせる。この遺伝子の一本鎖領域はこれにより突然変異オリゴヌクレオチド とのハイブリダイゼーションにとって有用となり、残留ギャップはＤＮＡポリメ ラーゼ■のフレノウフラグメントにより補完し、挿入体はＴ４　ＤＮＡリガーゼ によりリゲートし、そして１サイクルの複製の後、所望の突然変異を抱える二本 鎖プラスミドを作る。Ｍｏｒｉｎａｇａの方法は新しい制限部位を構築する付加 操作を回避しており、従って複数の箇所での突然変異の発生を助長する。１９８ ８年７月２６日に認められたＥｓ　ｔｅ　ｌ　ｌらの米国特許第４，７６０，０ ２５号は、カセットのマイナー変更を実施して複数の突然変異を抱えるオリゴヌ クレオチドを導入することを可能としているが、しかしながら、Ｍｏｒｉｎａｇ ａの方法は、様々な長さの多重のオリゴヌクレオチドを導入することができるた め、同時により多くの突然変異を導入することさえもできる。

ズブチリシン変異体の発現 本発明に従い、上記の方法により、実施例１に記載の方法により、又は当業界に 知られる任意のそれらに代わる方法により生産された突然変異ズブチリシンは、 発現ベクターを用いることで酵素形態で発現されうる０発現ベクターは一般にク ローニングベクターの定義のもとに属し、なぜなら発現ベクターは通常典型的な りローニングベクターの構成要素、即ち、微生物のゲノムとは独立して微生物に おけるベクターの自己複製を可能とする因子、及び選別目的のための１又は複数 の表現型マーカーを含むからである。発現ベクターはプロモーター、オペレータ ー、リポソーム結合部位、翻訳開始シグナルをコードするコントロール配列、及 び任意的にレプレッサー遺伝子又は欅々な活性化遺伝子を含む。

発現タンパク質の分泌を可能とするため、「シグナル配列」をコードするヌクレ オチドを遺伝子のコード配列の前に挿入することができる。コントロール配列の 指示のもとての発現のため、本発明に従って処理すべき標的遺伝子は適切なリー ディングフレーム中のコントロール配列と作動連結している。プラスミドベクタ ーの中に含ませることができ、且つ、突然変異ズブチリシン遺伝子の転写を助け ることのできるプロモーター配列には原核系β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖ ｔｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら　（１９７８）　；　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　、　７５３７２７−３７３１）及びｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ ら（１９８３）　；Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　［ｌＳＡ 　：　８０２１−２５　）が含まれるが、それらに限定されない。更なる参考は ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　（１９８０）　；　２４２７４−９ ４のｒＵｓｅｆｕｌ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　 ｂａｃｔｅｒｉａ　Ｊにおいても見い出せる。

一態様に従うと、Ｂ、スブチリスを突然変異ＤＮＡを保有する発現ベクターによ り形質転換させる。発現を分泌性微生物、例えばＢ、スブチリスの中で行うとき 、シグナル配列は翻訳開始シグナルの後方、且つ、課題のＤＮＡ配列の前方にあ ってよい、シグナル配列は発現生成物を細胞壁へと輸送するのに働き、ここでそ れらは分泌によってこの生成物から切断される。「コントロール配列」なる語は シグナル配列が存在するならそれを含むことを意図する。

本発明の安定化酵素を生産することの可能な微生物は、同化炭素及び窒素をその 他の必須栄養物と一緒に含む栄養培地の中での常用の培養法により培養でき、こ の培地は当業界の原理に従って構成される。

ヌクレオチド配列及び微生物 本発明はまた、本発明の安定化プロテアーゼをコードするＤＮＡヌクレオチド配 列及び安定化プロテアーゼをコードするＤＮＡヌクレオチド配列を含む発現ベク ターに関連する。

この安定化プロテアーゼは、このプロテアーゼをコードするＤＮＡヌクレオチド 配列を適当な宿主生物における適当な発現ベクターの中に挿入したときに発現さ れて生産される。この宿主生物は親遺伝子が由来する生物と同一である必要はな い、突然変異遺伝子、ベクター、並びに突然変異及び形質転換微生物の構築は当 業界に知られる任意の適切な組換ＤＮＡ技術により実施されうる。

本発明は安定化プロテアーゼをコードするＤＮＡヌクレオチド配列を保有する発 現ベクターを含む宿主生物にも関連する。

洗剤 本発明は更に、洗浄及び洗浄組成物における本発明の安定化プロテアーゼの利用 、並びに安定化プロテアーゼを含んで成るかかる組成物を含んで成る。

かかる組成物は本発明の任意の１又は複数のプロテアーゼを単独で、又はかかる 組成物の中に含まれている当業者によく知られている任意の通常の成分と組合さ れて含んで成る。

かかる成分はビルダー、例えばホスフェートもしくはゼオライトビルター、界面 活性剤、例えばアニオン、カチオン、非イオンもしくは両性イオン型界面活性剤 、ポリマー、例えばアクリルもしくは等価（ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）ポリマー、 ブリーチ系、例えばパーボレートもしくはアミノ含存ブリーチ前駆体もしくは活 性剤、構成剤（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｎｔ）、例えばシリケート構成剤、ｐＨｍ整 のためのアルカリもしくは酸、保湿剤、及び／又は中性無機塩を含んで成る。

本発明の洗剤は任意の常用の形態、例えば粉末、液体等に処方されうる。

該酵素は洗浄中でのよく知られたＩ［車量において利用されうる。

その量は非常に広範囲、例えば約０．０００２〜０．０１、例えば約０．００５ 〜０、０５アンソン単位／洗浄ｇでありうる。他の単位で表わすと、このプロテ アーゼは組成物の中に、約０．１〜１００　ＧＯ／洗剤Ｂ　（例えば１〜５０、 特に５〜２０　Ｇ口／ｍｇ　）の桁の量、又は約０．０１〜４、例えば０．１〜 ０．４　ＫＮＰＵ／洗剤ｇを中心とする広範囲における任意の量において含まれ る。

ＫＮＰＵは既に定義した。　Ｇｔｌはグリシン単位であり、標準条件のもとで、 ４０’Ｃでの１５分間のインキュベーションの際に、基質としてＮ−アセチルカ ゼインを用い、１マイクロモルのグリシンに相当するＮＬ基の量を供するタンパ ク質分解酵素活性として定義する。

例えば本酵素を１リツトルの洗浄液当り約０．２５ｍｇの酵素タンパク質の割合 で利用することが適切であり、これは０．０８ＫＮＰ［Ｉ／　ｌ程度の酵素活性 に相当する。関連の洗浄組成物は例えば０．１〜０．４　ＫＮＰＵ／ｇの量にお ける酵素を含みうる。

この洗剤は更なる酵素も含みうる。

例えば、リパーゼが、担体材料を有する脂質分解酵素の顆粒組成物（又は溶液も しくはスラリー）の形態において有利に加えられうる（例えばＥＰ特許公開第２ ５８．０６８号（ノボ　ノルディスクＡ／Ｓ）　：更にはＬｉｐｏｌａｓｅ　（ 商標）及びその他のノボ　ノルディスクの酵素組成物）。

加えるリパーゼの量は幅広い限界内、例えば５０〜３０，０ＯＯＬＵ／　ｇ　／ 界面活性剤もしくは洗剤ｇ、例えば通常は少なくとも１００　ＬＵ／　ｇ、非常 に有用には少なくとも５ＯＯＬＵ／ｇ、時折り好ましくは１００ＯＬＵ／ｇ以上 、２０００ＬＵ／　ｇ以上又は４０００ＬＵ／　ｇ以上又はそれより多くの範囲 内で選ぶことができ、従ってたいていは５０〜４０００ＬＵ／　ｇの範囲、そし て可能としては２００〜１００ＯＬＩＪ／　ｇの範囲にある０本明細書における リパーゼの単位はＥＰ特許公開第２５８．０６８号に定義されている通りである 。

脂質分解酵素は広範囲にわたるリパーゼから選ばれうる。詳しくは、例えば下記 の特許明細書：ＥＰ特許公開第２１４，７６１号（ノボ　）゛ルディスクＡ／Ｓ ）　、第２５８，０６８号に記載のリパーゼ、そして特に、サーモマイセス　ラ ヌギノサス（Ｔｈｅｒｓｏｍｙｃｅｓ　Ｉａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）由来のリパー ゼに対して発生させた抗血清と免疫学的に交差反応性を示すリパーゼ（ＥＰ特許 公開第２０５．２０８号及び第２０６，３９０号）、そして特に、クロモバクタ ー　ビスコサム　バー　リボリチカム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ　ｖｉｓｃｏ ｓｕ＋ｗ　ｖａｒ　Ｉｉｐｏｌｙｔｉｃｕｍ）　ＮＲＲＬ　Ｂ−３６７３に由来 のリパーゼ又はアルカリジーンズ（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）　ＰＬ−６７９， ＡＴＣＣ３１３７１及びＦＥＲＭ−Ｐ　３７８３由来のリパーゼに対して発生さ せた抗血清と免疫学的に交差反応性を示すリパーゼ、更には−０８７１００８５ ９（Ｇｒｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ）及びＥＰ特許公開第２０４　、２８４号（サ ラポロビール）に記載のリパーゼである。特に適切なのは例えば下記の市販のリ パーゼ調製物である；リブラーゼ　ノボ　ノルディスクＡ／Ｓ、アマノリバーゼ ＣＥ、　Ｐ、　Ｂ、　ＡＰ、　Ｍ−ＡＰ、　Ａ肚及びＣＢＳ　、並びにメイト− リパーゼＭＹ−３０，ＯＦ　、及びＰＬ、更にはエステラーゼ問、リボザイム、 ＳＰ　２２５゜５Ｐ２８５　、サイケンリパーゼ、エンゼコリバーゼ、トーヨジ ョーゾーリパーゼ及びディオノンス（Ｄｉｏｓｙｎｔｈ）　リパーゼである（商 標）。

所望するならば例えばアミラーゼを、約１〜約１００　ＭＵ　（マルトース単位 ）／洗剤ｇ（又は０．０１４〜１．４、例えば０．０７〜０．７　ＫＮＩＪ／ｇ （ノボ単位））の範囲の量で利用できる。所望するならば例えばセルラーゼを、 約０．３〜約３５　ＣＥＶ［Ｉ単位／洗剤ｇの範囲の量で利用できる。

本発明の洗剤の中に通常の量で存在しうる通常の洗剤成分は下記の通りである： この組成物はビルダー入り又はビルダーなしでよく、そしてゼローＰ−型であり うる（即ち、リン含有ビルダーを全く含まない）。従って該組成物は例えば１〜 ５０重量％、例えば少なくとも約重Ｉ５％、そして通常は約３５〜４５重量％の １又は複数の有機及び／又は無機ビルダーを凝集物の中に含みうる。典型的なビ ルダーには前記したものが含まれ、そして更に広くは、アルカリ金属オルト、ピ ロ及びトリポリホスフェート、アルカリ金属カルボネートが含まれ、それらは単 独で、又は方解石、アルカリ金属シトレート、アルカリ金属ニトリロトリアセテ ート、カルボキシメチルオキシスクシネート、ゼオライト、ポリアセタルカルボ キシレート等と混合されていてよい。

更に、該洗剤は１〜３５％のブリーチング剤もしくはブリーチング体、又はブリ ーチング剤及び／もしくは前駆体とそれらの活性剤とを含んで成る系を含みうる 。更なる任意的な成分には、泡ブースター、発泡低下剤、腐蝕防止剤、土壌懸濁 剤、封鎖剤、耐汚染付着剤、香料、着色料、酵素のための安定剤等である。

該組成物は繊維材料、特に、限定はしないが綿及びポリエステルヘース繊維並び にその複合物の洗浄のために利用できる。例えば洗浄工程は約６０〜６５゛Ｃ又 はそれより低い、例えば約３０〜３５°Ｃ又はそれより低い温度で実施されるの が特に好ましい。該組成物を約例えば０．４〜０．８ｇ／Ｉの洗浄液中の界面活 性剤を供するのに十分な割合で利用することが非常に適切でありうるが、より低 い又はより高い濃度を利用することも必要であるならばむろん可能である。限定 はしないが、約１〜１０ｇ／ｌ、例えば約３〜６ｇ／ｌの洗剤の利用率が、この 洗剤が実質的に実施例の通りである場合は適切である。

いくつかの有用な態様において、洗剤は下記の通りに処方されうる： 洗剤■： ゼオライトビルダーを含む本発明の態様に従う洗剤粉末は以下のものを含むよう に配合される： 約１６％の全活性洗剤、約９％のアニオン洗剤、約６％の非イオン洗剤、約２０ ％のゼオライト含有ビルダー、約３．５％のアクリル又は等価ポリマー、約６〜 １８％のパーボレードブリーチ前駆体、約２％のアミノ含有ブリーチング剤、約 ３．５％あるいは下は約２．５％までのシリケート又は他の構成剤、約８（ある いは約１５）グリシン単位Ｚｍｇ級の酵素と、使用時に所望のｐＨに合わせるた めのアルカリ、及び中性無機塩、並びに酵素（約０．５％の各酵素）。

アニオン洗剤はドデシルーヘンゼンスルホン酸ナトリウムあるいは線形アルキル ヘンゼンスルホン酸ナトリウム６％と、第一アルキルスルフェート３％との混合 物である。非イオン洗剤は、モル当り７個のエトキンレート残基を有するおよそ Ｃ１３〜Ｃ１５の第一アルコールのエトキンレートである。ゼオライトビルダー はＡ型ゼオライトである。ポリマーはポリアクリル酸である。パーボレードブリ ーチ前駆体は四硼酸ナトリウム・４水和物又はｌ水和物である。活性剤はテトラ アセチル−エチレンジアミンである。構成剤は珪酸ナトリウムである。中性無機 塩は硫酸ナトリウムである。

洗剤■ 本発明の態様にかかわる水性洗剤液は下記のものを含むように配合される： １６％のドデシルベンゼンスルホン酸、７％の７　ｍｏｌ／ｍｏｌ　のエチレン オキサイドと縮合したＣ１３〜Ｃ１５の線形アルコール、２％のモノエタノール アミン、６．５％のクエン酸、６％のキシレンスルホン酸ナトリウム、約４．１ ％の水酸化ナトリウム、０．５％のプロテアーゼ、１００％に至る水。ｐ＋＋は ９と１０との間の値に合わせる。

他の有用な態様において、該洗浄は例えば国際特許公開ＷＯ９１１００３３４、 Ｗｏ　９１１００３３５及び国際特許出願ＰＣＴ／ＤＫ９１１００３９９に記載 の通りに配合されうる。

本発明を下記の実施例で更に説明するが、これらは本発明の範囲を限定すること は意図していない。

実施例１ 調製例 野生型及び本発明の態様に従う変異プロテアーゼについてコートする遺伝子を構 築及び発現するための現状好ましい方法を示している下記の実施例において、材 料は下記の通りである：Ｂ、スブチリス３０９及び１４７はバチルス　レンタス の変異体であり、ＮＣＩＢに寄託されて寄託番号ＮＣＩＢ　１０１４７及びＮＣ ＩＢ　１０３０９が付され、そして引用することで本明細書に組入れる米国特許 第３，７２３，２５０号に記載しである。

Ｅ、コリＭＣ１００（Ｍ、　Ｊ、　Ｃａ５ａｄａｂｅｎとＳ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅ ｎ　（１９８０）　；　Ｊ、　Ｍｏ１−Ｂｉｏｌ、；　１３８１７９−２０７） は、常用の方法により７−、ｍ＋とされ、そして米国特許出願第０３９．２９８ に記載されている。

ズブチリシン及びその突然変異体をコードする合成遺伝子に適するヘクターを構 築した。これは本質的にｐｃｔｌ１９プラスミド（Ｃ３Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒ ｏｎ　とＪ、　Ｍｅｓｓｉｎｇ　（１９８５）　：　Ｇｅｎｅ　；　３３１０３ −１１９　）であり、その多重クローニング部位は、この遺伝子を構成する５つ のサブフラグメントを分けるのに利用する制限部位を含むリンカ−で置き換えら れている。この新しいリンカ−はＥｃｏ　Ｒ１−Ｈｌｎｄ　ｍ切断ｐｃＩ１１９ の中に挿入され、これによりそれらの部位は破壊される。

（ＲＩ）Ｋｐｎｌ　Ｐｓｔｌ　ＥｃｏＲＩ　Ｈ４ｎｄ３　Ｃ１ａｌ　５ｐｈｌ　 Ｒａｍ　（Ｈ３）５　’　−ＡＡＴＴＧＧＴＡＣＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡ ＡＧＣＴＴＡＴＣＧＡＴＧＧＣＡＴＧＣＧＧＡＴＣＣ−３’３　°　−ＣＣＡＴ ＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＡＡＧＴＴＣＧＡＡＴＡＧＣＴＡＣＣＧＴＡＣＧＣＣＴ ＡＧＧＴＣＧＡ　−５’ズブチリシン３０９の成熟部についてコードする合成遺 伝子を下記の詳細及び添付図面の図１　（図面１／７〜７／７）の図式により示 す通りに構築した。合成遺伝子の構造は図面１／７〜４／７にまとめてあり、こ れはこの構築において用いたフラグメントも示している。各サブフラグメントは ６〜１２のオリゴヌクレオチドより成る。

このオリゴヌクレオチドは制御型ガラス支持体の上でホスホラミジット化学を用 い、自動ＤＮＡ合成装置で合成した［５．　Ｌ、　ＢｅａｕｃａｇｅとＭ、　Ｈ ，Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓ　（１９８１）　；　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔ ｔｅｒｓ　；　２２１８５９−１８６９）。

図中のオリゴヌクレオチドの５”末端における点は、これらのオリゴヌクレオチ ドがリン酸化されていることを示す。オリゴヌクレオチドの対応の組より二量体 （図面１／７〜４／７に示す）を、９０’Ｃで５分熱し、続いて７５分かけて室 温に冷やすことによって形成せしめた。この二量体を７４　ＤＮＡリガーゼと混 ぜ合わせ、そして処理した。

５つのサブフラグメントを２％のアガロースゲルで単離し、そしてρ５Ｘ１９１ に挿入した。この配列をジデオキシヌクレオチドシーケンシングにより確認した 。フラグメントＡ−Ｅが単離され、そして−緒にＫｐｎ　Ｉ−Ｂａａ　Ｈ１切断 ｐｓＸ１９１にリゲートさせた。このリゲーション混合物をアンピシリン耐性に ついての選別用のコンピテントＥ、コリＭＣ１００Ｏｒ　−、ｍ＋に形質転換せ しめるために用いた。該酵素の成熟部についてコードするズブチリシン３０９の 部分を構成する８５０　ｂｐのＫｐｎ　ｌ−Ｂａ−旧フラグメントを次に、ｐｓ Ｘ２１２上の野生型遺伝子と置き換えるために用いてｐｓＸ２２２を作り、次に これをコンピテントＢスブチリス５Ｈａ２７３に形質転換させた。この形質転換 性の培養及び酵素の精製を経て、この生成物は野生型生成物とは異なることが示 された。

合成遺伝子に由来するプロテアーゼ変異体は、突然変異が所望される箇所（例え ば以下に示す配列を有する箇所）にて変更された配列を有するオリゴヌクレオチ ドを用い、次いでそれをこの合成遺伝子に適する残りのオリゴヌクレオチドと混 ぜ合わせることによって作った。変異遺伝子の集成は、前述の方法にＩｆｆした 方法で、変異材料を用いて実施した。合成遺伝子の更なる情報はＡｇａｒｖａｌ 　ら（１９７０）　；　Ｎａｔｕｒｅ　；　２２７２７−３４において得られる 。

Ｋｐｎ　ｒ部位を、この酵素の成熟部をコードするズブチリ２フ３０９合成遺伝 子の起源に導入した。利用した方法はいわゆるオリゴヌクレオチド誘導二本鎖破 損修復突然変異誘発であり、そして−１ｏｄｅｋＭａｎｄｅｃｋｉ　（１９８６ ）　；　Ｐｒｏｃ、　Ｈａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　；　８３７１ ７７−７１８１に記載されている。　ｐｓＸ１７２をＮｃｏ　Ｉにより、ズブチ リシン３０９遺伝子の成熟部の起源で開き、そしてオリゴヌクレオチド）１０Ｒ ７８９（図１（７／７）に配列を示す）と混ぜ、１００’Ｃに熱し、０°Ｃに冷 やし、そしてＥ、コリに形質転換させた。再形質転換の後、この組換体は３２− Ｐ−ラヘル化Ｎ０Ｒ７８９を用いるコロニーハイブリダイゼーションによってス クリーンできる。このスクリーングで陽性と認められる組換体は、アミノ酸配列 を変えずに２個の塩基が変わることによる、Ｎｃｏ　ｌのすぐ前に導入されたＫ ｐｎ　１部位を存していた。ｐｓＸ１７２はＢＰ特許公開第４０５．９０１に記 載されている。このようにして作られたＫｐｎ　［部位を４００　ｂｐのＰｖｕ 　Ｉ−Ｎｈｅ　ｒフラグメント上のｐｓｌｌ’１２０に挿入して、ｐＳχ２１２ を作った。ｐｓχ１２０もＥＰ特許公開第４０５．９０１号に記載されている。

合成遺伝子をｐｓＸ２１２上のＫｐｎ　Ｉ　とＢａｇ　Ｈｌとの間に挿入してｐ ＳＸ２２２を作った。

オリゴヌクレオチドの突然変異及び対応の配列は以下の通りであこれらのオリゴ ヌクレオチドを、合成遺伝子の変化していない残りのオリゴヌクレオチドと合わ せた。

実施例２ 精製例 この手順はズブチリノン１４７酵素、ズブチリシン３０９酵素又はそれらの突然 変異体の１０リンドルスケール培養の精製に関する。

約８１の培養培地を１す、トルのビーカーの中で３５分間５０００ｒｐｍで遠心 した。その上清液を１０％の酢酸を用いてｐＨ６，５に合わせ、そしてＳｅ：ｔ ｚ　５ｕｐｒａ　５１００フイルタープレートで濾過した。

その濾液を、Ａｍ１ｃｏｎ　５ＩＹＩＯＩＪＦカートリッジの付いたＡｍ１ｃｏ ｎ　ＣＨ２ＡＯＦユニットを用いて約４００ｗ　Ｉ　に濃縮した。このＩＰ濃縮 物を遠心し、次いで濾過し、そしてＢａｃ　ｉ　ｔｒａｃ　ｉ　ｎアフィニティ ーカラムに室温でｐＨ７にて吸収させた。このプロテアーゼを、０．０１のジメ チルグルタルせた緩衝液中の２５％の２−プロパツール及びＩＭの塩化ナトリウ ムを用いて室温でこのＢａｃ　ｉ　Ｌｒａｃ　ｉ　ｎカラムからｆ４離させた。

このＢａｃ　ｉ　ｔｒａｃ　ｉ　ｎ精製工程由来のプロテアーゼ活性を有する両 分を合わせ、そして０．０１のジメチルグルタル酸、０．２Ｍの硼酸及び０．０ ２Ｍの塩化カルシウムを含むＰ）１６．５に合わせた緩衝液で平衡にしたした１ ５０ｍ１のＣＭ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ　６Ｂ陽イオン交換カラム（径５ｃ ｍ）に化ナトリウム勾配（ｓｕｂ　１４７の場合は０〜０．２Ｍの塩化ナトリウ ム）を合わせ、そしてＧＲＰ８１ＰＰ膜（Ｄａｎｉｓｈ　Ｓｕｇａｒ　Ｆａｃｔ ｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、より）の付いたＡｇ１（ｏｎ限外７！１過セルで濃縮した 。

実施例３ 接続されたＳｅｔａｒａｍ　ｍ１ｃｒｏ　ＤＳＣ装置とした。　Ｓｅｔａｒａｍ のソフトウニ２ｓ＋ｇ／ｍｌの濃度に希釈した： へε１（Ｃ１□−１４ン　、ＥＯ６１５％ＬＡＳ２（Ｃ１ｚ）　１０％ ココナツツ脂酸　９％ オレイン酸（Ｃ，、）　１％ トリエタノールアミン（ｐＫＡ７．９）　９％クエン酸ナトリウム　８％ ２）線形アルキルベンゼンスルホネート加熱率は２５°Ｃから９０’Ｃに至るま で０．５°Ｃ／分とした。

この方法により測定した、野生型酵素に対するズブチリノン３０９変異体の安定 化を上記の表３に示している。

実施例４ 貯蔵安定性 本発明の酵素の貯蔵安定性を決定し、そしてズブチリノン３０９（野生型）の貯 蔵安定性と比較した。この安定性試験はミニ　ストーレッジテストで行った。各 チューブの中で１００　μｌのサンプルを用いた。

酵素用量は０．２５＋ｉｇの酵素／洗剤ｇとした。この試験において液状し、そ して残留活性を決定した。

残留活性決定法はタンパク質分解酵素によるジメチルカゼイン（ＤＭＣ）ｉＳ液 の消化に基づく。このプロセスで形成される第一アミノ基はトリニトロベンゼン スルホン酸（ＴＮＢＳ）と反応して、着色錯体を形成する。この反応をその場で 追って、単位時間当りの吸収の変化を計算する。

この洗剤は第一アミノ基を有する化合物を含みうるため、これを調べ、そして清 浄効率の補正を行うことが必要である。補正は純粋な洗浄剤のブラインド値を測 定し、そしてこの値を前述の通りに測定した値から差し引くことによって行われ る。

活性は、調製後直ちに凍結して分析するまで一１０℃の温度に保存したサンプル と対比させて決定した。このサンプルの活性を１００％に設定した。貯蔵試験か らの対応のサンプルの活性を１００％のサンプルの対比させて決定した。

反応条件は； 温度　：　４０’Ｃ １Ｈ・　８．３ 波長　：　４２０ｎｍ 反応時間　二　９分 測定時間　：　３分 装　置　：　＜Ｃ０ＢＡＳ　＞　ＦＡｌｉＡＩＩ遠心分析器（Ｒｏｃｈｅより） とした。

全ての活性は二重測定した。

この分析法を説明しているホルダーＡＰ　２８５／　１　（又は後板）しよノボ 　ノルディスクＡ／Ｓデンマークより受量により入手でき、これ器また熱安定性 と貯蔵安定性はよく相関する。

実施例５ 洗浄性能 洗浄性能試験は２０″Ｃで等温で１０分間の標準洗浄において、草汁で汚した綿 に基づいて行った。

洗剤として５ｇ／Ｉの粉末洗剤を用いた。前掲の洗剤Ｉを参照のこと、　ＮａＯ Ｈ／ＨＣＩの添加によってｐＨを１０．２に合わせた。表５に示す試験について は約９°ｄＨ（ドイツ硬度）の水を使用した。表６に示す試験については６°ｄ Ｈの水を使用した。繊維／洗浄液の比は洗浄液のリットル当り６ｇの繊維とした 。

試験は０．０．０２５　、０．０５．　０．１．　０．５．　１．０及び２．０ ｍｇ酵素タンパク質／１の酵素濃度で行った。２通りの個別セットの試験を各酵 素について行った。表５〜６に示す結果はこれらの試験の平均値である。

洗浄に続いて、布帛を流水通水ですすぎ、そして風乾した。プロテアーゼ性能は Ｄａｔａｃｏｌｏｒ　Ｅｌｒｅｐｈｏｍｅｔｅｒ　２０００で測定した４６０ｎ ｍでの規約反射率（％Ｒ）の変化（ΔＲ）によって決定し、ΔＲは加えたプロテ アーゼによる洗浄後の規約反射率から、プロテアーゼを加えない洗浄後の規約反 射率を差し引いたものである。

洗浄性能試験由来の結果を表５〜６に示す。ズブチリシン３０９／５２５６Ｐを 除く全ての変異体はズブチリシン３０９（野生−型）と少なくとも同程度に機能 することが認められた。

示ｍ弾え舷渾−ｊシ衿り尺 六゛　・　・率、デルタＲ で− ＫｐＮＩの導入 国際調査報告 ＋−ｍ−１＋：　ｗｓｌＡｐｍｌｃ＋＋ｌｌ＋ｍｊｌ　−ＰＣＴｌｏＫ　９２１ ００１３８国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （Ｃ１２Ｎ　１５１５７ Ｃ１２Ｒ１：０１） （７２）発明者　スベンゼン、アラン デンマーク国、デーニー−３４６０ビルケロエズ、バッケレゼト　２８ （７２）発明者　ヘデゴールド、リスベトデンマーク国、デーイー−２１００コ ペンハーゲン　ニー０．クラッセンスガゼ　３５゜５、チー、ホー。

Ｉ （７２）発明者　エリクセン、ニナ デンマーク国、デーゴー−２０００フレデリクスベルウ、マチイルデバイ　１５ ．イー。

チー、ベー。

（７２）発明者　エグモント、マールテン　ロベルトオランダ国、エヌエル−３ ４６１ヘーデーリンスホーテン、デ　ネス　あ （７２）発明者　力ステレエイン、エリクオランダ国、　２９０７　セーヘー　 カベレ　アー／デー　エイッセル、パレティエルブルク１０５

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．安定化プロテアーゼであって、天然アミノ酸（プロリンを除く）が１又は複 数の位置においてプロリン残基で置換されており、その位置における二面角ψ（ ファイ）及びΨ（サイ）が間隔（−９０＜ψ＜−４０°及び−１８０°＜Ψ＜１ ８０°〕以内、好ましくは間隔〔−９０°＜ψ＜−４０°及び１２０°＜Ψ＜１ ８０°〕又は〔−９０°＜φ＜−４０°及び−５０°＜Ψ＜１０°〕以内の値を 構成し、そしてその位置が、α−ヘリックス又はβ−シート構造を保有すること により特徴付けられるこのプロテアーゼにおける領域にはない、安定プロテアー ゼ。
2. ２．安定化ズプチリシンである、請求項１に記載のプロテアーゼ。
3. ３．獲得した前記の安定化ズプチリシンが、表１及び２に記載の１又は複数の位 置（ＢＰＮ′番号）又はそれに近い位置でのプロリン残基への置換を含んで成る 任意のズプチリシンである、請求項２に記載のズプチリシン。
4. ４．天然アミノ酸（プロリンを除く）が位置：３８，５７，９８，１７２，１８ ８，１９４，２４２及び２５９（ＢＰＮ′番号）の１又は複数の位置にてプロリ ン残基により置換されている、請求項３に記載のズプチリシン。
5. ５．１又は複数の下記の置換：２７Ｒ，３６Ｄ，７６Ｄ，９７Ｎ，９８Ｒ，１０ ４Ｙ，１２０Ｄ，１２８Ｇ，１９５Ｅ，２０６Ｃ，２１８Ｓ，２３５Ｌ，２３５ Ｒ，２３７Ｒ，２５１Ｅ及び２６３Ｆ（ＢＰＮ′番号）を更に含んで成る、請求 項４に記載のズプチリシン。
6. ６．安定化ズプチリシン３０９、安定化ズプチリシン１４７、安定化ズプチリシ ンＢＰＮ′又は安定化ズプチリシンカールスバーグである、請求項４〜５のいづ れかに記載のズプチリシン。
7. ７．１又は複数の下記の置換：Ｔ３８Ｐ，Ｓ５７Ｐ，Ａ９８Ｐ，Ａ１７２Ｐ，Ｓ １８８Ｐ，Ａ１９４Ｐ，Ｓ２４２Ｐ及びＳ２５９Ｐ（ＢＰＮ′番号）が導入され ている、ズプチリシン３０９。
8. ８．１又は複数の下記の置換：Ｋ２７Ｒ，＊３６Ｄ，Ｎ７６Ｄ，Ｇ９７Ｎ，Ａ９ ８Ｐ，Ｖ１０４Ｙ，Ｈ１２０Ｄ，Ｓ１２８Ｇ，Ｇ１９５Ｅ，Ｑ２０６Ｃ，Ｎ２１ ８Ｓ，Ｋ２３５Ｌ，Ｋ２３５Ｒ，Ｋ２３７Ｒ，Ｋ２５１Ｅ及びＹ２６３Ｆ（ＢＰ Ｎ′番号）を更に含んで成る、請求項７に記載のズプチリシン３０９。
9. ９．１又は複数の下記の置換：Ｔ３８Ｐ，Ｓ５７Ｐ，Ａ９８Ｐ，Ａ１７２Ｐ，Ａ １９４Ｐ，Ｓ２４２Ｐ及びＳ２５９Ｐ（ＢＰＮ′番号）が導入されているズプチ リシン３０９。
10. １０．１又は複数の下記の置換：Ｋ２７Ｒ，＊３６Ｄ，Ｎ７６Ｄ，Ｇ９７Ｎ，Ａ ９８Ｒ，Ｖ１０４Ｙ，Ｈ１２０Ｄ，Ｓ１２８Ｇ，Ｇ１９５Ｅ，Ｑ２０６Ｃ，Ｋ２ １８Ｓ，Ｋ２３５Ｌ，Ｋ２３５Ｒ，Ｋ２３７Ｒ，Ｋ２５１Ｅ及びＹ２６３Ｆ（Ｂ ＰＮ′番号）を更に含んで成る、請求項９に記載のズプチリシン３０９。
11. １１．ズプチリシン３０９／Ｋ２７Ｒ＋＊３６Ｄ＋Ｇ９７Ｎ＋Ａ９８Ｒ＋Ａ１９ ４Ｐ＋Ｋ２３５Ｒ＋Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｅ＋７２６３Ｆ（ＢＰＮ′番号）。
12. １２．ズプチリシソ３０９／Ｋ２７Ｒ＋＊３６Ｄ＋Ｇ９７Ｎ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｋ２ ３５Ｒ＋Ｋ２３７Ｒ＋Ｋ２５１Ｅ＋Ｙ２６３Ｆ（ＢＰＮ′番号）。
13. １３．ズプチリシン３０９／Ｋ２７Ｒ＋＊３６Ｄ＋Ｇ９７Ｎ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｋ２ ３５Ｒ＋Ｋ２３７Ｒ＋Ｙ２６３Ｆ（ＢＰＮ′番号）。
14. １４．ズプチリシン３０９／＊３６Ｄ＋Ｎ７６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｇ １９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ（ＢＰＮ′番号）。
15. １５．ズプチリシン３０９／＊３６Ｄ＋Ｇ９７Ｎ＋Ｖ１０４Ｙ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ａ １９４Ｐ＋Ｇ１９５Ｅ（ＢＰＮ′番号）。
16. １６．ズプチリシン３０９／＊３６Ｄ＋Ｇ９７Ｎ＋Ｖ１０４Ｙ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ａ １９４Ｐ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ（ＢＰＮ′番号）。
17. １７．ズプチリシン３０９／＊３６Ｄ＋Ｃ９７Ｎ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｇ １９５Ｅ（ＢＰＮ′番号）。
18. １８．ズプチリシン３０９／＊３６Ｄ＋Ｇ９７Ｎ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｇ １９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ（ＢＰＮ′番号）。
19. １９．ズプチリシン３０９／＊３６Ｄ＋Ｖ１０４Ｙ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ａ１９４Ｐ＋ Ｇ１９５Ｅ（ＢＰＮ′番号）。
20. ２０．ズプチリシン３０９／＊３６Ｄ＋Ｖ１０４Ｙ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ａ１９４Ｐ＋ Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ２３５Ｌ（ＢＰＮ′番号）。
21. ２１．ズプチリシン３０９／＊３６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ａ１９４Ｐ＋Ｇ１９５Ｅ（ ＢＰＮ′番号）。
22. ２２．ズプチリシン３０９／＊３６Ｄ＋Ｈ１２０Ｄ＋Ａ９４Ｐ＋Ｇ１９５Ｅ＋Ｋ ２３５Ｌ（ＢＰＮ′番号）。
23. ２３．ズプチリシン３０９／Ａ１９４Ｐ（ＢＰＮ′番号）。
24. ２４．請求項１〜２３のいづれか１項に記載の安定化プロテアーゼをコードする ヌクレオチド配列。
25. ２５．請求項１〜２３のいづれか１項に記載の安定化プロテアーゼをコードする ヌクレオチド配列を含んで成る発現ベクター。
26. ２６．請求項１〜２３のいづれか１項に記載の安定化プロテアーゼをコードする ヌクレオチド配列を保有する発現ベクターを含む宿主生物。