JPH06507064A - アミロペクチン型デンプンを形成するためのジャガイモの遺伝子工学的変性 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 アミロペクチン型デンプンを形成するためのジャガイモの遺伝子工学的変性 この発明は、ジャガイモ中に事実上アミロペクチン型デンプンのみを形成する結 果となる、ジャガイモの遺伝子工学的変性（ｇｅｏｅｔｉｃａｌｌｙ　ｅｎｇｉ ｎｅｅｒｅｄ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　）に関する。

この遺伝子工学的変性にはジャガイモへの遺伝子断片の挿入が含まれる。挿入さ れる遺伝子断片には、アンチセンス方向に挿入された、顆粒結合デンプンシンタ ーゼ（ｇｒａｎｕｌｅ−ｂｏｕｎｄ　５ｔａｒｃｈ　５７ｎｔｈａｓｅ　）の遺 伝子のコードおよび非コード（すなわち、エクソンおよびイントロン）部の他に 、リーダー配列、翻訳開始、翻訳終止およびトレーラ−配列が含まれる。

発明の背景 種々の形態のデンプンが、食品および紙産業において非常に重要である。また、 将来的には、デンプンは、例えば包装材料として用いられる自然界で分解可能な ポリマーを製造するための大きな潜在力であろう。とりわけトウモロコシおよび ジャガイモに由来する天然のままのデンプンの誘導体形成（ｄｅｒｉｖａｔｉｓ ａｊｉｏｎ）によって製造される多くの異なるデンプン製品が知られている。ジ ャガイモおよびトウモロコシの各々からのデンプンは、多くの市場域で競合して いる。

ジャガイモの塊茎においては、デンプンは固体物質の最も大きな部分を占める。

ジャガイモにおけるデンプンの約１／４ないし１１５はアミロースであり、デン プンの残りはアミロペクチンである。デンプンのこれら２成分は異なる適用分野 を有しており、そのため、純粋アミロースまたは純粋アミロペクチンのいずれか を生成する可能性に最も関心が集まる。この２種のデンプン成分は通常のデンプ ンから生成することができる。これは多くの処理工程を必要とし、その結果とし て、高価で複雑なものである。

今や、塊茎が主としていずれか一方の型のデンプンのみを生成するようにジャガ イモを変性することが可能であることが、遺伝子工学によって立証された。その 結果として、今日ジャガイモデンプンが通常使用されない領域において競合し得 る品質のデンプンが得られる。遺伝子工学的方式で変性されたジャガイモからの デンプンは、いかなる化学的変性処理をも受けていないので、食品添加物として 大きな潜在力を有デンプンの合成およびそれらの調節は、現在、基礎研究のレベ ルおよび産業利用の両面で、非常な興味をもって研究されている。ショ糖のデン プンへの変換における特定の酵素の助力については多くが知られているにもかか わらず、デンプンの生合成はいまだ明らかにされていない。しかしながら、とり わけトウモロコシの研究を行なうことにより、合成経路の一部およびこれらの反 応に関与する酵素を明らかにすることが可能になっている。デンプン顆粒を生成 するための最も重要なデンプン合成酵素は、デンプンシンターゼおよび分枝酵素 である。トウモロコシにおいては、現時点では、３形態のデンプンシンターゼが 示され、研究されている。３種のうち２種は説明可能であるが、１種は説明不可 能な形でデンプン顆粒に関与している。分枝酵素もまた、おそらく３種の異なる 遺伝子によってコードされる３種の形態からなる（ＭｌＣＤｏｎａｌｄ　＆　Ｐ ｒ！ｉｓｓ、１９８５；　Ｐｔｅｉｓｓ、１９８８　）。

トウモロコシにおけるワクシ−遺伝子 デンプン成分アミロースの合成は、増殖細胞中のデンプン顆粒に関連するデンプ ンシンターゼα−１，４−Ｄ−グルカン−４−α−グルコシルトランスフェラー ゼ（ＥＣ２，４，１，２１）の作用により本質的に起こる。この顆粒結合酵素を コードする遺伝子は、酵素が“ＧＢＳＳ”　（ｇｒａｎｕｌｅ−ｂｏｕｎｄ　５ ｊａｒｃｈ　５７ｎＩｈａｓｅ　）と呼ばれるのに対して、“ワクシ−（ｗａｇ ）”トウモロコシにおけるワクシ−遺伝子位置は、遺伝学的および生化学的のい ずれにおいても完全に特徴付けられている。

第９染色体上のワクシ−遺伝子は、内胚乳、花粉および胚嚢中のアミロースの生 成を制御する。ＷＸ＋対立遺伝子を有する正常トウモロコシにおける内胚乳中に 形成されるデンプンは、２５％のアミロースと７５％のアミロペクチンとからな る。

内胚乳がＷＸ＋遺伝子に位置する変異を含み、そのため機能するＧＢＳＳが合成 されないトウモロコシの変異体が見出されている。このため、この変異トウモロ コシからの内胚乳は、デンプン成分としてアミロペクチンのみを有する。したが って、このいわゆるワクシ−変異体は、ＧＢＳＳもアミロースをも含まない（Ｅ ｃｈｔ　＆　Ｓｃｈｗａｒｊｘ、１９８１　）。

ＧＢＳＳタンパク質は、細胞核中でＷＸ＋遺伝子によってコードされるが、アミ ロブラストに移送されて活性化する。

このため、プレタンパク質は２種の成分、すなわちアミロプラスト膜を横切って タンパク質を移送する？ｋｂの移行ペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ 　）と、５８ｋｂの真のタンパク質とからなる。トウモロコシにおけるＷＸ　遺 伝子のコード領域は３．７ｋｂの長さであり、１４のエクソンおよび１３のイン トロンを含む。プロモーター領域における多くの調節シグナルが知られており、 ２種の異なるポリアデニル化配列が記述されている（Ｋｌｏｓｇｅ＋＋　ら、１ ９８６　；　Ｓｃｈｗａｒｔｘ−５ｏｍｍｅｒら、１９８４　；５ｈｕｒｅ　ら 、１９８３）。

ジャガイモにおけるアミロース酵素 ジャガイモにおいては、主要な顆粒結合タンパク質を構成する６０ｋＤのタンパ ク質が同定されている。このジャガイモ酵素に対する抗体がトウモロコシからの ＧＢＳＳと交差反応することから、これが顆粒結合シンターゼであることが推測 される（Ｖｏｓ−Ｓｃｈｅｐｅｒｋｅｕｊｅｒ　ら、１９８６）　、しかしなが ら、ジャガイモＧＢＳＳの遺伝子は、現時点では、位置および構造のいずれに関 しても、トウモロコシにおけるワクシ−遺伝子と固定度にまでは特徴付けられて いない。

トウモロコシのみならず、大麦、米およびモロコシ属の植物について、自然界に 発生するワクシ−変異体が記述されている。ジャガイモにおいては天然変異体は 見出されてはいないが、モノハブロイド（ｎ＝！２）植物からの葉のＸ線放射に より変異体が作製されている（Ｖｉｓｓｅｒら、１９８７）。この変異体の塊茎 から単離されたデンプンは、ＧＢＳＳタンパク質およびアミロースのいずれも有 していない。この変異体は、単純劣性遺伝子により決定され、ａｍｆと呼ばれる 。これは、ＧＢＳＳタンパク質およびアミロースを欠くことから他の植物種のツ クシー変異体になぞらえることができる。しかしながら、この変異体の染色体数 が天然の数（ｎ−４８）の４倍であるため、染色体数の安定性が弱く、これはジ ャガイモ植物体に対して否定的な効果を及ぼし得る（Ｊａｃｏｂｓｅｎら、１９ ９０）。

アミロース生成の阻害 アミロースの形成を触媒する顆粒結合デンプンシンターゼ、ＧＢＳＳ、の阻害に より、アミロースの合成を激烈に減少させることができる。この阻害は、主とし てアミロペクチンであるデンプンに帰結する。

酵素形成の阻害は、数通りの方法、例えば、−酵素の構成をコードする遺伝子配 列の変性に帰結する変異原処理 一酵素をコードする遺伝子配列へのトランスポゾンの組み込み −酵素をコードする遺伝子が発現しないような遺伝工学的変性、例えば、アンチ センス遺伝子阻害 により達成することができる。

図１は、正常な遺伝子発現の特定の抑制を示し、ここでは相補的アンチセンスヌ クレオチドが標的遺伝子のｍＲＮＡとハイブリダイズすることができる。したが って、アンチセンスヌクオチドは、イン・ビボで“逆”遺伝子配列から転写され るアンチセンスＲＮＡである（Ｉｘａｎｔ、１９８９　）。

アンチセンス技術を用いることにより、植物における種々の遺伝子機能が阻害さ れている。カルコン（ｃｈａｌｃｏｎｅ）シンターゼ、ポリガラクツロナーゼ（ ｐｏ１７ｇａｌｘｃｔｕｒｏｎａｓｅ）およびホスフィノトリシンアセチルトラ ンスフェラーゼ（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｒｉｃｉｎ　ａｃＮ７Ｈｒａｎｓｆｅｒ ａｓｅ　）のアンチセンス構築物が、植物種ペチュニア、トマトおよびタバコに おいて、対応する酵素を阻害するために用いられている。

ジャガイモにおけるアミロースの阻害 ジャガイモにおいては、従来、顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳタンパク 質）を阻害するために、ＧＢＳＳをコードする遺伝子（以後、この遺伝子を“Ｇ ＢＳＳ遺伝子”と称する）に対応するアンチセンス構築物を用いて実験が行なわ れている。Ｂｅｒｇｓｒｓｂｅｒｇｅｔ　（１９８８）はある方法を記述してお り、それによりトウモロコシのＷＸ＋遺伝子のｃＤＮＡクローンによってジャガ イモのＧＢＳＳ遺伝子のｃＤＮＡクローンが単離されている。ｃＤＮＡクローン 全体に基づくアンチセンス構築物は、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（ Ａｇｒｏｂａｃｌｅｒｉｕｍ　ｌｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　）によりジャガイモの リーフ・ディスク（ｌｅａｆ　ｄｉｓｃｓ）に移送される。再生されたジャガイ モの芽からイン・ビトロで誘導された微小塊茎においては、アミロース含有量の 変化し、かつ弱い減少が観察され、図に示されている。ＧＢＳＳ遺伝子の完全な 特徴付けは提示されていない。

ジャガイモ中のＧＢＳＳタンパク質の遺伝子はさらに特徴付けられており、そこ ではゲノムＷＸ＋クローンが制限分析により調べられている。しかしながら、こ のクローンのＤＮＡ配列は決定されていない（ｖｉｓｓｅｒら、１９８９）。

ジャガイモ中のＧＢＳＳ遺伝子に対応するアンチセンス構築物を用いるさらなる 実験が報告されている。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに加えてｃＤＮＡクローン に基づくアンチセンス構築物が、アグロバクテリウム・リゾケンス（Ａｇｒｏｂ ｘｃｊｒｒｉｕｍ　ｒｈｉｘｏｇｅｎｓ　）により形質転換されている。情報に よると、この形質転換はジャガイモ中のアミロース含量をより低下させる結果と なったが、評価はなされていない（ＦＬａｖｅｌｌ　。

１９９０）。

ジャガイモの遺伝子工学的変性に現時点で用いられる方法は、事実上アミロース を含有しない型のデンプンを有するジャガイモに帰結してはいない。

したがって、この発明の目的は、ジャガイモ塊茎におけるアミロース形成の事実 上完全な抑制を提供することにある。

発明の要約 この発明によると、ジャガイモにおけるＧＢＳＳ遺伝子の機能および、それ故に 、アミロース生成が、全く新規のアンチセンス構築物により阻害される。この発 明によるアンチセンス断片の形成に対しては、ＧＢＳＳおよび、その結果として 、アミロース生成の可能な限り有効な阻害を達成するために、ゲノムＧＢＳＳ遺 伝子が基礎として用いられる。この発明によるアンチセンス構築物は、アンチセ ンス方向に、リーダー配列、翻訳開始、翻訳終止およびトレーラ−配列の他にプ ロモーターを含む領域の配列に対応するＧＢＳＳ遺伝子のコードおよび非コード 両部分を有する。組織特異的な発現のために（すなわち、アミロース生成はジャ ガイモ塊茎のみで阻害されるべきである）、ジャガイモ塊茎において特異的に活 性なプロモーターが用いられる。その結果、他の方法では否定的な副作用を受け るであろう植物体の他の部分のデンプン組成は影響を受けない。

したがって、この発明は、配列番号１、配列番号２または配列番号３に記載され るヌクレオチド配列の１つを本質的に有する断片を含む。しかしながら、この配 列は、この断片の機能に影響を及ぼすことなく、１以上の非隣接塩基対において 、記載された配列から逸れてもよい。

また、この発明は、この発明による顆粒結合デンプンシンターゼをコードする遺 伝子に属する９８７ｂｐを含む、ジャガイモ塊茎特異的プロモーターをも包含す る。このプロモーターも対応する遺伝子も従来特徴付けられてはいない。９８７ ｂｐのプロモーター配列は配列番号４に記載されており、遺伝子配列は配列番号 ５に記載されている。また、プロモーターおよび遺伝子配列は、それらの機能に 影響を及ぼすことなく、１以上の非隣接塩基対において、記載された配列から逸 れてもよい。

また、この発明は、この発明によるアンチセンス断片およびアンチセンス構築物 を含むベクターをも包含する。

他の面においては、この発明は、アンチセンス方向に挿入されたこの発明による 断片を含むゲノムを有する細胞、植物、塊茎、微小塊茎および種子を包含する。

さらなる面においては、この発明は、天然のままの、および誘導体が形成された （ｄｅｒｉｖａｔｉｓｅｄ　）アミロペクチン型デンプンを包含する。

最後に、この発明は、ジャガイモにおけるアミロース形成を抑制し、それにより ジャガイモ中に主としてアミロペクチン型デンプンを形成させる方法を包含する 。

以下、添付の図面を参照してこの発明をより詳細に説明する。添付の図面におい て、 図１はアンチセンス遺伝子阻害の原理を説明し、図２はジャガイモＧＢＳＳ遺伝 子の制限分析の結果を示し、図３は２種の新規バイナリ−ベクターｐＨｏ３およ びｐＨｌｏ４を示し、 図４はアンチセンス構築物ｐＨｏｘｗＡ　ＳｐＢｏｗｗＢおよびｐＨｏｘｗＤを 示し、 図５はアンチセンス構築物１１ＢＯＸＷＦおよびｐＨｏｘｗＧを示し、および 図６はアンチセンス構築物ｐＨｏｘｔＫおよびｐＨｏｘｗＬを示す。

さらに、この発明による異なるＤＮＡ断片の配列が、配列接塩基対におけるこれ らの配列からの逸脱が存在してもよい。

材料 この発明を実施するにあたり、以下の材料を用いた。

ｍｎ：　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５ａｌｆａおよびＤ］１１５ａｌｆａＦ’　ＩＱ　 （ＢＲＬ　）。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０５　（Ｐｈａｒｍｘｃｉａ　）　。Ａ、ツメファシェ ンス（（ＩｏｎよびｐＢ１１２１　（ＣＩｏｎｌｅｃｈ）　。ｐＢ１２４０．７ 　（Ｍ、Ｖｌ、Ｂｅｖａｎ　）　。ｐＨｃプラスミド（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　） 　０ＤＮＡライゲーシヨン・キット（ＣＩｏｎ　ｊｅ　ａｈ）。シークエナーゼ Ｔ！′（ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭ）　ＤＮＡシークエンシング・キ・ソト（ＵＳ Ｂ　）　。Ｔ４−　ＤＮＡリガーゼ（Ｉ’ｈａｒｍａｃｉａ　）。

上述の材料は、製造者によって定められた仕様に従って用ＥＭＢＬ３中のゲノム ・ライブラリーは、ジャガイモＢｉｎｊｉｅの葉を出発物質として用いて、出願 人のためにＣ１ｏｎｔｅｃｈによって作製されている。

ＧＢＳＳ遺伝子の同定および単離 ＣＩｏｎｊｅｃｈからのプロトコルに従い、遺伝子の５′　および３′両末端の ｃＤＮＡクローン（このｃＤＮＡクローンは、ＬＩｌｅｒｇｅｒｓｂｅｒｇｅ＋ 、　Ｍａｔ　Ｐｌａｎｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｉｎ　Ｃｏｌｏｇｎｅより人手 した）によって、ゲノム・ライブラリーがジャガイモＧＢＳＳ遺伝子についてス クリーニングされている。

ジャガイモＧＢＳＳ遺伝子、ｗ　ｘ　３１１の完全長クローンが、ゲノム・ライ ブラリーから同定され、単離されている。ＧＢＳＳ遺伝子の開始点が、断片Ｗ（ ３，９５ｋｂ）と呼ばれるＥｃｏＲＩ断片で決定されている。また、ＧＢＳＳ遺 伝子の終止点も、断片Ｘ　（５，０ｋｂ）と呼ばれるＥｃｏＲ１断片で決定され ている。断片ｍ　（３，９ｋｂ）と呼ばれるＢｇｌｌｌ−Ｓｐｅ！断片も単離さ れ、これは断片Ｗおよび断片Ｘからの配列を共有している。断片ｗ、ｍおよびＸ はｐＵｃ１３　（Ｖｉｅｒａ、　１９８２　；Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｏｎら、 １９８５）にサブクローニングされ、それぞれｐＳｗ、ｐＳｍおよびｐＳｘと呼 ばれる（図２）。

ジャガイモにおけるＧＢＳＳ遺伝子の特徴付はジャガイモにおけるＧＢＳＳ遺伝 子が、制限分析およびＣＤＮＡプローブによって特徴付けられている。ここでは 、ＧＢＳＳ遺伝子の５′および３′末端がより正確に決定されている（図２）　 。５ａｎＢｒら、１９７７によるＧＢＳＳ遺伝子の配列決定が、ｐ　Ｕ　Ｃ１９ と同様にＭ１３ｍｐ１８およびｍｐ１９中のｐＳＷおよびｐＳｘからのサブクロ ーンに対して、５′末端付近から開始して行なわれている（配列番号５参照）。

プロモーター領域が、Ｂｇｌｌｌ−Ｎｓｉｌ断片（配列番号４参照）で決定され ている。転写および翻訳開始点が、重複ＢｇｌｌＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌ断片で決定 されている。ターミネータ−領域が、５ｐｅｌ−Ｂｉｎｄｌｌｌ断片で順に決定 されている。

この発明によるＧＢＳＳ遺伝子断片（配列番号１．２および３、並びに図２参照 ）が、以下の方法で決定されている。

ｐＳｗをＮ５ｉｌおよびｌ１ｉｎｄｌｌｌで制限することにより断片Ｉ　（配列 番号１）が得られ、ｐ　Ｕ　Ｃ１９にサブクローニングされたこの断片を１９Ｎ Ｂ３５と称する。１９Ｎ１１３５をｌ１ｐｘｌ−５ｓｊｌでさらに制限すること により、この発明によるＧＢＳＳ遺伝子の３４２ｂｐを有する断片が得られる。

この断片は、リーダー配列、翻訳開始およびコード領域の最初の１２５ｂｐを含 む。

ｐｓｍをＥｐａｌおよびＮ５ｉｌで制限することにより断片■（配列番号２）が 得られ、ｐＪＲＤ１８４　（Ｈ＊ｕｓｊｅｒｓｐｔｅｕｔｅら、１９８７）にサ ブクローニングされたこの断片をｐＪＲＤｍｉｔｔと称する。ｐＪＲＤｍｉｔｊ をＨｐａｌ−３ｓｔｌでさらに制限することにより、この発明によるＧＢＳＳ遺 伝子の２５４９ｂｐを有する断片が得られる。この断片は、遺伝子の中間からの エクソンおよびイントロンを含む。

ｐＳｘを５ｓｆｌおよび５ｐｅｌで制限することにより断片■（配列番号３）が 得られ、ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　（Ｍｅｌｔｏｎら、１９８４）にサブクロー ニングされたこの断片をｐＢｌｕｅ３’と称する。

ｐＢｌｕｅ３’　をＢａｍ１ｌｌ−５ｓｔｌでさらに制限することにより、この 発明によるＧＢＳＳ遺伝子の４９２ｂｐを有する断片が得られる。この断片は、 最後のイントロンおよびエクソン、翻訳終止およびトレーラ−配列の２７８ｂｐ を含む。

断片Ｉを有するアンチセンス構築物（図４）：アンチセンス構築物ｐＨｏｘｗＡ のために、１９Ｎ１１３５からのＨｐａｌ−５ｓＮ断片が、Ｓｍａｌ−５ｓＮで 開裂したパイナリー−ベクターｐＢ１１２１　（ＪｅｆｆｅｒｓＯｎら、１９８ ７）にアンチセンス方向に挿入されている。次いで、このアンチセンス断片の転 写を、Ｃ！Ｍｖ３５Ｓプロモーターにより開始し、ＳＯＳターミネータ−（ＮＯ ３−ツバリン・シンターゼ（ｎｏｐａｌｉｎｅ　５ｙｎｔｈａｓり　）によって 終了させる。

アンチセンス構築物ｐＨｏｘｗＢのために、１９Ｎ１１１３５からのＨｐａｌ− ５ｓＮ断片が、Ｓｍａｌ−５ｓＮで開裂させたバイナリ−・ベクター　ｐＨｌｏ ４　（図３）にアンチセンス方向に挿入されている。ジャガイモにおいて塊茎特 異的なパタチンＩ　（ｐａｊａｊｉｎ　Ｉ　）　フロモーターを、Ｍ、Ｂｅｖａ ｎ　５Ｉｎｒｔ自ｕｊｅ　ｏ［Ｐｌａ＋ｕ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｒｅ５ｅａｒＣｈ より入手したベクターｐＢ１２４０．７から得る。次いで、アンチセンス断片の 転写を、パテチン■プロモーターにより開始し、ＮＯＳターミネータ−によって 終了させる。

アンチセンス構築物ｐＨｏｘｗＤのために、１９Ｎ１１３５からのＨｐａｌ−９ ｓｔｌ断片が、Ｓｍａｌ−Ｓｓ口で開裂させたバイナリ−・ベクター　ｐＨｏ３ 　（図３）にアンチセンス方向に挿入されている。

ｐＨｏ３は、ｐＢｌｌｏｌを基に構築された新規のバイナリ−ベクターである。

今や特徴付けがなされたこの発明によるジャガイモＧＢＳＳ遺伝子のこの発明に よるプロモーター（配列番号４を参照）（ＧＢＳＳプロモーター）を有するこの ベクターは、Ｓｍａｌおよび５ｓｊｌで制限開裂され、１９ＮＨ３５からのＨｐ ａｌ−Ｓｓｊｌ断片がアンチセンス方向に挿入されている。次いで、このアンチ センス断片の転写をそれ自身のＧＢＳＳプロモーターによって開始し、ＮＯＳタ ーミネータ−により終了させる。これは、パタチンＩプロモーターのようなＧＢ ＳＳプロモーターが塊茎特異的であるため、アンチセンス断片がジャガイモ塊茎 のみにおいて転写されることを意味する。

断片■を有するアンチセンス構築物（図５）：アンチセンス構築物＋１ＨＯＸＷ Ｆのために、ｐＪＲＤｍｉｔｔからのＢｐａｌ−５ｓｔｌ断片が、Ｓｍａｌ−５ ｓＮで開裂されたバイナリ−〇ベクターｐＨｏ４にアンチセンス方向に挿入され ている。次いで、このアンチセンス断片の転写を、パテチンＩプロモーターで開 始し、ＮＯＳターミネータ−で終了させる。

アンチセンス構築物ｐＨｏｘｗＧのために、ｐＪＲＤｍｉ目からのＨｐａｌ−３ ｓＮ断片が、Ｓｎ＋ａｌ−５ｓＮで開裂されたバイナリφベクターｐｒｏ　３に アンチセンス方向に挿入されている。次いで、このアンチセンス断片の転写を、 それ自身のＧＢＳＳプロモーターによって開始し、ＮＯＳターミネータ−により 終了させる。

断片■を有するアンチセンス構築物（図６）：アンチセンス構築物ｐＨｏｘｗｌ ：のために、ｐＢＩｕｅ３’　からのＢａｔｎＢＩ−５ｓ目断片が、ＢａｍＨＩ −５ｓｊｌで開裂されたバイナリー−ベクターｐＨｏ４にアンチセンス方向に挿 入されている。次いで、このアンチセンス断片の転写を、バタチンＩプロモータ ーで開始し、ＮＯＳターミネータ−で終了させる。

アンチセンス構築物ｐＨｏｘｗｌ、のために、ｐＢＩｕξ３′からのＢａｍＨＩ −５ｓｊｌ断片が、ＢａｍＨＩ−５ｓ目で開裂されたバイナリ−・ベクターｐＨ ｏ３にアンチセンス方向に挿入されている。次いで、このアンチセンス断片の転 写をそれ自身のＧＢＳＳプロモーターで開始し、ＮＯＳターミネータ−で終了さ せる。

形成されたアンチセンス構築物（図４．５．６）は、“凍結溶解”法（Ｈｏｅｋ ｅｍａら、１９８３　；　Ａｎら、１９８８）を用いる直接形質転換により、ア グロバクテリウム拳ツメファシェンス株ＬＢＡ４４０４に形質転換されている。

形質転換 アンチセンス構築物は、適切には“凍結溶解”法（Ａｎら、１９８８）により細 菌に移入される。組換え細菌のジャガイモ組織への移入は、ジャガイモ組織にあ る種の損傷を与えた後、適切な培地中でジャガイモ組織を組換え細菌と共にイン キュベートすることにより起こる。インキュベーションの間に、細菌からのＴ− ＤＮＡが宿主植物のＤＮＡに入り込む。インキュベーションの後細菌を殺し、カ ルス誘導のためにジャガイモ組織を固体培地に移し、カルスを成長させるために インキュベートする。

さらに適切な培地に通した後に芽が形成され、これはジャガイモ組織から切り離 される。

アンチセンス構築物の発現を試験するための検査およびそれらのジャガイモゲノ ムへの移入を、例えば、サザーンおよびノーザン・ハイブリダイゼーション（Ｍ ａｎｉａ目Ｓら（１９８２）　）により行なう。移入されているアンチセンス構 築物のコピー数を、サザーン争ハイブリダイゼーションにより決定する。

タンパク質レベルでの発現の試験は、イン・ビトロで形質転換された芽に誘導さ れる微小塊茎に対して行なわれる。これにより、試験をできる限り迅速に行なう ことが可能となる。

ＧＢＳＳタンパク質の特徴付け ＧＢＳＳタンパク質の活性に関するＧＢＳＳ遺伝子の機能に対するアンチセンス 構築物の効果を、微小塊茎からデンプンを抽出し、それをＧＢＳＳタンパク質の 存在に関して分析することにより調べる。ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動 （Ｂｏｖ！ｎｋｔｍｐ−Ｈｅｒｍｅｌｉｎｋら、１９８７）において、ＧＢＳＳ 遺伝子が機能する場合には、ＧＢＳＳタンパク質は６０ｋＤに明瞭なバンドを形 成する。ＧＢＳＳ遺伝子が発現しない場合、すなわち、アンチセンスＧＢＳＳ遺 伝子が十分に発現する場合には、それによりＧＢＳＳタンパク質の形成が阻害さ れ、ゲル上には６０ｋＤのバンドは現われない。

デンプンの特徴付は 微小塊茎におけるデンプンの組成は、通常のジャガイモ塊茎の組成と同一である 。このため、アミロース生成に対するアンチセンス構築物の効果を微小塊茎で調 べる。アミロペクチンに対するアミロースの割合は、（例えば、Ｂｏｖｅｎｋａ ｍｐ−Ｂｅｒｍｅ　Ｉ　ｉｎｋら、１９８８による）分光分析法によって決定す ることアミロペクチンは、公知の方法により、いわゆるアミロペクチン・ポテト （アミロース形成がこの発明によるアンチセンス構築物の挿入によって抑制され ているジャガイモ）から抽出する。

アミロペクチンの誘導体形成 アミロペクチンの最終用途により、誘導体形成（ｄ６ｒｉｖａｊｉｓａｌｉｏｎ ）によってその物理的および化学的な質を変性させることができる。ここで、誘 導体形成は、化学的、物理的および酵素的処理並びにそれらの組み合わせを意味 する（変性ジャガイモ）。

化学的誘導体形成、すなわち、アミロペクチンの化学的修飾は、異なる方法、例 えば、酸化、酸加水分解、デキストリン化、異なる形態のエーテル化（例えば、 カチオン化、ヒドロキシプロピル化、およびヒドロキシエチル化）、異なる形態 のエステル化（例えば、酢酸ビニルにより、無水酢酸により、または−リン酸化 、ニリン酸化およびオクチルスクシン化により）、およびそれらの組み合わせに より行なうことができる。

アミロペクチンの物理的変性は、例えば、シリンダー乾燥または押出しにより行 なうことができる。

酵素的誘導体形成においては、現存の酵素系によって、アミロペクチンの分解（ 粘性の減少）および化学的修飾が行なわれる。

誘導体形成は、所望の最終生成物により、異なる温度で行なわれる。使用される 通常の温度範囲は２０−４５℃であるが、１８０℃までの温度が可能である。

この発明を、下記実施例においてより詳細に記述する。

例１ この発明によるアンチセンス構築物が挿入されている微小塊茎の作製 アンチセンス構築物（図４．５および６参照）を、“凍結溶解”法（Ａｎら、１ ９８８）により、アグロバクテリウム・ツメファシェンスＬＢＡ　４４０４に移 入する。ジャガイモ組織への移イン・ビトロで培養したジャガイモ植物体からの リーフ・ディスクを、暗所で、３％ショ糖および０．５％ＭＥＳを有する液体Ｍ Ｓ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆　Ｓｋｏｏｇ；　１９６２　）において、培地１ ０ｍ１当り組換えアグロバクテリウムの懸濁液１００μｌと一緒に２日間インキ ュベートする。これら２日間の後、細菌を殺す。カルス誘導のためにリーフ・デ ィスクを固体培地に移し、カルスの成長に応じて４−６週間インキュベートする 。

この固体培地は以下のような組成を有する：ＭＳ＋３％　ショ糖 ２ｍｇ／ｌ　ゼアチン−リボシド ０、０２　ｍ　ｇ／　１　ＮＡＡ” ５００ｍｇ／ｌ　”クラフォラン（Ｃｌａｆｏｒａｎ）　”５０ｍｇ／ｌ　カナ マイシン ０．２５％　“ゲラン（Ｇｅｌｌａｎ）　”続いて、リーフ・ディスクをホルモ ンの異なる組成を有し、ＭＳ＋３％　ショ糖 ５ｍｇ／ｌ　ＮＡＡ’ ０．１ｍｇ／ｌ　ＢＡＰ” ５００ｍｇ／ｌ　“クラフォラン“ ５０ｍｇ／ｌ　カナマイシン ０．２５％　“ゲラン” を含む培地に移す。

リーフ・ディスクを約４週間この培地に保存し、４週間後に“クラフオラン”濃 度が２５０ｍｇ／ｌに減じられている培地に移す。必要であれば、その後、リー フ・ディスクを４または５週間毎に新鮮な培地に移す。芽が形成された後、これ らをリーフ・ディスクから切り離し、同様の培地に移す。

アンチセンス構築物がリーフ・ディスクに移入されている状態は、まず、再生さ れた芽からのリーフ抽出物を、グルクロニダーゼ活性をＪｅｆｆｅｒｓｏｎら（ １９８７）によって記述された基質により分析することによって検査する。この 活性は、視認評価によって示される。

アンチセンス構築物の発現およびそれらのジャガイモゲノムへの移入のさらなる 試験は、Ｍｉｎｉａｊｉｓら（１９８１）によるサザーンおよびノーザン・ハイ ブリダイゼーションによって行なわれる。移入されているアンチセンス構築物の コピー数は、サザーン・ハイブリダイゼーションによって決定する。

アンチセンス構築物がジャガイモゲノムに移入され、かつ発現していることが立 証された場合には、タンパク質レベルでの発現の試験を開始する。この試験は、 形質転換された芽を基にしてイン・ビトロで誘導された微小塊茎に対して行なう 。これにより、ジャガイモ塊茎を有する完全なジャガイモ植物体の成長を待つ必 要性が避けられる。

ジャガイモの芽のステム（ｓｔｅｍ）片を節で切り離して変更ＭＳ培地上に置く 。それらは、暗所において、１９℃でインキュベートすることにより、２−３週 間後に微小塊茎を形成する（Ｂｏｕｒｑｕｅら、１９８７）。培地は下記のよう な組成を有する二ＭＳ＋６％　ショ糖 ２．５％　カイネチン ２．５％　“ゲラン” ＧＢＳＳタンパク質の活性に関するＧＢＳＳ遺伝子の機能に対するアンチセンス 構築物の効果をポリアクリルアミドゲル電気泳動（１１ｏｖｅｎｋｉｍｐ−Ｈｅ ｒｍｅｌｉｎｋら、１９８７）により分析する。微小塊茎からデンプンを抽出し 、ＧＢＳＳタンパク質の存在について分析する。ポリアクリルアミドゲルにおい て、ＧＢＳＳ遺伝子が機能する場合には、ＧＢＳＳタンパク質は６０ｋＤに明瞭 なバンドを形成する。ＧＢＳＳ遺伝子が発現しない場合、すなわち、アンチセン スＧＢＳＳ遺伝子が十分発現１．てＧＢＳＳタンパク質の形成を阻害する場合に は、ゲル」二１こ６０ｋＤバンドを認めることはできない。

デンプンの組成、すなわち、アミロペクチンに対するアミロースの割合を、Ｂｏ ｖｅｎｋａｍｐ−１１ｅｒｍｅｌｉｎｋら（１９８８）に従って分光分析法によ り１］定する。この方法では、各デンプン成分の含量は標準曲線に基づいて決定 する。

例２ アミロペクチン・ポテトからのアミ０ペクチンの抽出上なデンプン族う）がアミ ロペクチンであり（以下、アミロペクチン・ポテトと称する）、この発明による 遺伝子工学的方法で変性されたジャガ・イモをすりおろＬ２、それによりデンプ ンを細胞壁から解放する。

細胞壁（繊維）は遠心スクリーン（ｅｅａｔｒｉｓｉｌｅ＋　）で果汁およびデ ンプンから分離する。果汁は２工捏、すなわち最初にハイドロサイクロン（ｈｙ ｄｒｏｃｙｃｌｏｎｅ）　、続いて特別に設計されたバンド型青空フィルターで デンプンから分離する。

次いで、ハイドロサイクロン中で最終精製を行ない、果汁および線維の残留物を 分離する。

生成物を、最初の真空フィルター上での予備乾燥、続く熱気流中での最終乾燥の ２工程により乾燥させる。

例３ アミロペクチンの化学的誘導体形成 アミロペクチンを、水中で、濃度２０−５０％のスラッジにする。ｐＨを１０． ０−１２．０に調整し、最終生成物の置換度が０、００４−０．２となるような 量の４級アンモニウム化合物を添加する。反応温度は２０−４５°Ｃに設定する 。反応が完了したときに、ｐＨを４−８に調整し、そのうえで生成物を洗浄して 乾燥させる。この方法においては、カチオン性デンプン誘導体２−ヒドロキシ− ３−トリメチルアンモニウムプロピルエーテルが得られる。

例４ アミロペクチンの化学的誘導体形成 アミロペクチンを、水中で、水分含量が１０−２５重量％のスラッジにする。ｐ Ｈを１０．０−１２．０に調整し、最終生成物の置換度が０．００４−０．２と なるような量の４級アンモニウム化合物を添加する。反応温度は２０−４５℃に 設定する。反応が完了したときに、ｐＨを４−８に調整する。最終生成物は、２ −ヒドロキシ−３−トリメチルアンモニウムプロピルエーテルである。

例５ アミロペクチンの化学的誘導体形成 アミロペクチンを、水中で、濃度２０−５０重量％のスラッジにする。ｐＨを５ ．０−１２．０に調整し、最終生成物が所望の粘性を得るように次亜塩素酸ナト リウムを添加する。反応温度は２０−４５℃に設定する。反応が完了したときに 、ｐＨを４−８に調整し、そのうえで最終生成物を洗浄して乾燥させる。

この方法においては、酸化デンプンが得られる。

アミロペクチンの物理的な誘導体形成 アミロペクチンを、水中で、２０−５０重量％の濃度のスラ・ソジとし、そのう えでこのスラッジを加熱したシリンダー上に塗布する。スラッジはシリンダー上 で乾燥してフィルムとなる。

例７ アミロペクチンの化学的および物理的な誘導体形成化学修飾するために、アミロ ペクチンを例３ないし５のいずれかに記載の方法によって処理し、次いで物理的 な誘導体形成のために、例６に従ってさらに処理する。

ｍ鳳ニ ー　ＭａＣＤｏｎａｌｄ、Ｆ、Ｄ、ａｎｄ　Ｐｒａｉｓｓ、、１７．．１９８５ ．Ｐｌａｎｔ、Ｐｈｙｓｉｏｌ。

７８：８４９−８５２ −　Ｐｒａｉｓｓ、Ｊ、、１９８Ｂ、工ｎ　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ 　ｏｆ　Ｐｌａｎｔｓ　１４（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔａｓ）、Ｅｄ、Ｊ、Ｐｒ ａｉｓｓ、入ｃａｄａｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　１８１−２５４−　ＥＣｈｔ、ｃ 、ｓ、ａｎｄ　Ｓｃｈｗａｒｚ、ｏ、、１９８１．Ｇａｎａｔｉｃｓ　９９：２ ７５−２８４−　Ｋ１５ｓｇａｎ、Ｒ，Ｅ、、Ｇｉａｒｌ、Ａ、、Ｓｃｈｗａｒ ｚ−５ｏｍｍａｒ、Ｚ、ａｎｄＳａａｄｌａｒ、Ｈ，，１９８６，Ｍｏｌ、Ｇａ ｎ、Ｇａｎａｔ、２０３：２３７−２４４−　Ｓｃｈｗａｒｚ−５ｏｍｍａｒ、 Ｚ、、Ｇｉｅｒｌ、Ａ、、Ｋ１５ｓｇａｎ、Ｒ，Ｂ、、ｌ’、１ａｎａｎｄ。

υ、、Ｐａｔａｒｓｏｎ、Ｐ、Ａ、ａｎｄ　５ａｅｄｌ＠ｒ、Ｈ，，１９８４， ＥＭＢＯＪ。

３（５）：１０２１−１０２８ −５ｈｕｒｅ、Ｍ−、Ｗａｓｓｌａｒ、ｓ、ａｎｄ　Ｆａｄｏｒｏｆｆ、Ｎ、、 １９８３．Ｃａ１１３５：２２５−２３３ −　Ｊａｃｏｂｓａｎ、Ｅ、、Ｋｒ１ｇｇ５ｈａｌｄ、Ｈ，Ｔ、、Ｈｏｖａｎｋ ａｍｐ−Ｈｅｒｍａｌｉｎｋ。

Ｊ、Ｈ，Ｍ、、Ｐｏｎ５ｔａｉｎ、Ａ、Ｓ、、Ｗｉｔｈｏｌｔ、３．ａｎｄ　ｒ ｅａｎｓｔｒａ、ｗ。

Ｊ、、１９９０．Ｐｌａｎｔ、Ｓｃｉ、６７：１７７−１８２−　Ｖｉｓｓａｒ 、Ｒ，Ｇ、Ｆ、、Ｈｏｖａｎｋａｍｐ−ＨａｒｍａＬｉｎｋ、Ｊ、Ｈ，Ｍ、。

Ｐｏｎ５ｔｅｉｎ、Ａ、Ｓ、、Ｖｏｓ−５ｃｈａｐａｒｋａｕｔａｒ、Ｇ、Ｈ， 、Ｊａｃｏｂｓａｎ、Ｅ、。

Ｆｅａｎｓｔｒａ、Ｗ、Ｊ、ａｎｄ　Ｗｉｔｈｏｌｔ、３．．１９８７．Ｐｒｏ ｃ、４ｔｈ　ＥｕｒｏｐａａｎＣｏｎｇｒａｓｓ　ｏｎ　Ｂｉｏｔａｃｈｎｏｌ ｏｇｙ　１９８７．　Ｖｏｌ、２．　Ｅｌｓａｖｉａｒ。

入ｍｓｔａｒｄａｍ；　４３２−４３５−　Ｖｏｓ−５ｃｈｅｐａｒｋａｕｔａ ｒ、Ｇ、Ｈ，、Ｄａ　Ｂｏａｒ、Ｗ、、Ｖｉｓｓａｒ、Ｒ，（ｙ。

Ｆ、、Ｆｅ＠１ｎｓｔｒａ、Ｗ、Ｊ、ａｎｄ　Ｗｉｔｈｏｌｔ、Ｂ、、１９８６ ．Ｐｌａｎｔ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、８２：４１１−４１６−　Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓａｎ、Ｍ、、１ ９８９．Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｓ。

１７（１Ｂ）ニア２０３−７２０９ −　工ｚａｎｔ、Ｊ、　Ｇ、、１９８９．Ｃａｌ工Ｍｏｔｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　 Ｃｙｔｏｓｃａｌａｔｏｎ１４：８１−９１ −５ｈａａｈｙ；　Ｒ，Ｅ、、Ｋｒａｒｎａｒ、Ｍ、、Ｈｉａｔｔ、Ｗ、Ｒ，， １９８Ｂ、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ−ＬＩＳＡ、８５（２３）：８８０５−８８０９− 　Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｋｒｏｌ、八、Ｒ，、Ｍｕｒ、Ｌ、Ａ、、ｄａ　Ｌａｎｇａ 、Ｐ、、Ｇｅｒａｔｓ。

Ａ、Ｇ、Ｍ、、　Ｍｏｉ、Ｊ、Ｎ、Ｍ、ａｎｄ　５ｔｕｉｔｊｅ、Ａ、Ｒ，、１ ９６０，Ｍｏｌ。

Ｇａｎ、Ｇｅｎｅｔ、２２０：２０４−２１２−　Ｈａｒｇａｒｓｂａｒｇａｒ 、Ｍ、、１９８８．Ｍｏ１ａｋｕｌａｒａ　Ａｎａｌｙｓａ　ｄｅｓ　ｗａｘｙ Ｇｉｎｓ　ａｕｓ　Ｓｏｌａｎｕｍ　ｔｕｂａｒｏｓｕｍ　ｕｎｄ　Ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ　ＶＯｎ　ＷａＸ／ＡｎｔｉＳ＠ｎｓａ　ＲＮＡ　ｉｎ　ｔ＝ａｎｓ ｇｅｎａｎ　Ｋａｒｔｏｆｆａｌｎ、Ｔｈｅｓｉｓ　ｆ口ｒａｄｏｃｔｏｒａｔ ａ　ｆｒｏｍ　：ｈａ　Ｕｒ＋１ｖａｒｓｉｔｙ　ｉｒｚ　Ｃｏｌｏｇｎａ−ｖ ｉｓｓｅｒ、　Ｒ，Ｇ、　Ｆ、、　Ｈａｒｇｅｒｓｂｅｒｇａｒ、Ｍ、、ｖａｎ 　ｄｅｒ　Ｌｅｉｊ、Ｆ。

Ｒ，、Ｊａｃｏｂｓａｎ、Ｅ、、Ｗｉｔｈａｌｔ、３．ａｎｄ　Ｆａａｎｓｔｒ ａ、Ｗ、Ｊ−，１９Ｂ９゜Ｐｌａｎｔ、Ｓｃｉ、６４：１８５−１９２Ａｎ、Ｇ 、、Ｅｂａｒｔ、？、Ｒ，，Ｍｉｔｒａ、Ａ、ａｎｄ　Ｈａ、Ｓ、Ｂ、、１９８ ７゜Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、Ｍａｎｕａｌ　Ａ３：ｌ−１９−Ｈｏａｋ ａｍａ、　Ａ、、　Ｈｉｒｓｃｎ、？、　Ｒ，、Ｈｏｏｙｋａａｓ、Ｐ、　Ｊ、 Ｊ、ａｒｉｄＳｃｈｉｌｐａｒｏｏｒｔ、Ｒ，入、、１９８３．Ｎａ−、ｕｒａ 　３０３：１７９−１８０−　Ｊａｆｆｅｒｓｏｎ、　Ｒ，Ａ、、Ｋａｖａｎａ ｇｈ、Ｔ、　Ａ、ａｎｄ　Ｂｅｖａｎ、Ｍ、Ｗ、。

：Ｌ９８７．ＥＭＢＯＪ、６：３２０１−３２０７−　Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ、、　 Ｎ１ｃｋｌａｒｚ、Ｓ、　ａｎｃｉ　Ｃｏｕｌｓｏｎ、　Ａ、　Ｒ，、１９７７ 、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４：５４６３−５４６７−　ＶｉＱｒ ａ、Ｊ、ａｎｄ　Ｍａｓｓｉｎｇ、Ｊ、、１９８２．Ｇａｎｅ１９：２５９−２ ６８−　Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｒ＋、　ｃ、、　ＶＬｅ’Ｊ：ａ、Ｊ、ａ ｎｄ　Ｍａｓｓｉｎｇ、Ｊ、、１９８５゜−Ｈａｕｓｔａｒｓｐｒａｕｔｅ　ａ ｔ　ａｌ　（１９８７）Ｇａｎｅ５３：２９４−３００−　Ｍｅｌｔｏｎ、Ｄ、 Ａ、ａｔ　ａｌ　（１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｓ。

１２ニア０３５−７０５６　（ｔｈｅ　ｐｌａｓｍｉｄａ　ｉｓ　５ｏｌｃｉ　 ｂｙ　ｓｔｒａｔａｇａｎｅ）−Ｍｕｒａｓｈｉｇａ、　Ｔ、　ａｈｄ　Ｓｋｏ ｏｇ、Ｆ、、１９６２．　Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｐｌａｎｔ−Ｒｏｃｈａ−５ｏｓａ 、Ｍ、、Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ、Ｕ、、Ｆｒｏｍｍａｒ、Ｗ、、Ｓｔｒａｔｍａｎ ｎ。

Ｍ、、５ｈｅｌｌ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｗｉｌｌｍｉｔｚａｒ、Ｌ、、１９８９．　 ＥＭＢＯＪ、。

８（１）：２３−２９ −　Ｊａｆｆａｒｓｏｎ、　Ｒ，Ａ、、Ｋａｖａｎａｇｈ、Ｒ，Ａ、　ａｎｄ　 Ｂｅｖａｎ、Ｍ、　Ｗ、。

１９８７、ＥＭＢＯＪ、６：３９０１−３９０７−　Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、、 Ｆｒ１ｔＳｃｈ、Ｅ、Ｆ、ａｎｄ　Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ、、１９８２゜Ｍｏ１ ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｈａｎｄｂｏｏ ｋ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒλｎｇＶｉｔｒＯＣｅ１ｌｕｌａｒ　ｔｘ　ｏｅｖａｘ ｏｐｍａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２３（５）：３８１−３８６−　Ｈｏｖａｎｋ ａｍｐ−Ｈｅｒｍｅｌｉｎｋ、Ｊ、　Ｈ，Ｍ、、Ｊａｃｏｂｓｅｎ、Ｅ、、Ｐｏ ｎ５ｔｅｉｎ。

Ａ、　Ｓ、、　Ｖｉｓｓｅｒ、　Ｒ，Ｇ、　Ｆ、、　Ｖｏｓ−５ｃｈａｐａｒｋ ｅｕｔｅｒ、　Ｇ、　Ｈ，。

−Ｈｏｖａｎｋａｍｐ−Ｈｅｒｍｅｌｉｎｋ、Ｊ、　Ｈ−Ｍ、、ｄａ　Ｖｒｉａ ｓ、Ｊ、　Ｎ、、ｘａａｍｓａ。

Ｐ、、　Ｊａｃｏｂｓａｎ、　Ｅ、、　Ｗｉｔｈｏｌｔ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｆａ ｅｎｓｔｒａ、　Ｗ、Ｊ、、１９８Ｂ。

Ｐｏｔａｔｏ　Ｒａ５ａａｒｃｈ　３１：２４１−２４６−　ＭＯ（ｉｉｆユａ ｄ　５ｔａｒｃｈａｓ：　Ｐｒｏｐａｒｔｉａｓ　ａｎｄ　ｕｓａ　Ｄ、Ｂ、Ｗ ｕｒｚｂｕｒｇ−Ｂｅｖａｎ、Ｍ、Ｗ、、１９Ｂ４．　Ｎｕｃｌａｉｃ　入ａｉ ｄｓ　Ｒａｓ、１２二８７１１−８７２１゜配列の長さ：３４２ｂＤ （ジｌユ 配列分子：ｇｅｎｏｓ＋ｃ　ＯＮ＾ 名称：ジャガイモ由来のＧＢＳＳ遺伝子断片配列の長さ：　２５４９１１０ ｙｒ　Ｇ ；７．−７７　＝−７：　：　７　：；　λｚｚ７．：λＪ　；Ｉ＋１−７ここ 、ニー−こ丁　τ７：；Ｎ；＋こ：：：τ：″：；Ａ：コニF　二３−３ 幻ジＵユ 配列分子：　ｇｅｎｏｓｉｃ　ＯＮＡ 名林コジャガイモ由来のＧＢＳＳ遺伝子断片配烈盃立丘 配列分子　ｇｅｎｖｉｃ　ＤＮＡ 名称・ジャガイモ由来のＧＢＳＳ遺伝子の７０モ一ター配列の長さ＋９８７１） Ｄ Ｌ烈豊豆旦 配列分子：　ｇｅｗｉｃ　０１１＾ 名称：ジャガイモ由来のＧＢＳＳ遺伝子配列の長さ：４９６４ｂＤ ２五　百 早馬 ム　＝ ７　ｌ　中 国際調査報告 ＋−ｍ−−ｎ−−＋　１１＠＠１１ｃｅｌ−Ｉｔｓ、　ＰＣＴ／ＳＥ　９１１０ ０８９２国際調査報告 ρＣＴ／ＳＥ　９１１００８９２ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　９／４２　９ ３５９−４Ｂ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，ＤＥ、　ＤＫ。

ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、　ＭＧ 、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＳＤ、　ＳＥ、　ＳＵ、　ＵＳ ＦＩ （７２）発明者　ライクストロム、オーレスウェーデン国、ニス−２９１５３ク リスティアンスタツド、ワサガタン　１

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．ジャガイモにおけるアミロースの形成を抑制する方法であって、アンチセン ス方向に挿入された、顆粒結合デンプンシンターゼの形成をコードするジャガイ モ遺伝子（ＧＢＳＳ遺伝子）の断片を有する遺伝子構築体をジャガイモ組織のゲ ノムに導入することによるジャガイモの遺伝子工学的変性を特徴とし、該断片が 、ＣａＭＶ３５Ｓ、パタチンＩおよびＧＢＳＳプロモーターの中から選択される プロモーターと共に、配列番号１、配列番号２および配列番号３に記載のヌクレ オチド配列を本質的に有する断片の中から選択される方法。
2. ２．アミロース型デンプンの形成を抑制するために遺伝子工学的方法で変性され たジャガイモから得られることを特徴とするアミロペクチン型天然デンプン。
3. ３．アミロース型デンプンの形成を抑制するために遺伝子工学的方法で変性され たジャガイモから抽出され、続いて化学的、物理的および酵素的方法で誘導され たアミノペクチン型デンプンであることを特徴とする誘導アミノペクチン型デン プン。
4. ４．ジャガイモにおける顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）をコードする 遺伝子の断片であって、配列番号１、配列番号２および配列番号３に記載される ヌクレオチド配列を本質的に有する断片の中から選択される断片。
5. ５．ジャガイモにおける顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）の遺伝子のプ ロモーターであって、塊茎特異的であり、かつ配列番号４に記載されるヌクレオ チド配列を本質的に有するプロモーター。
6. ６．配列番号５に記載されるヌクレオチド配列を本質的に有する、ジャガイモに おける顆粒結合デンプンシンターゼをコードする遺伝子。
7. ７．ジャガイモにおける顆粒結合デンプンシンターゼの遺伝子の発現を阻害する アンチセンス構築物であり、ａ）プロモーター、 ｂ）アンチセンス方向に挿入された、顆粒結合デンプンシンターゼをコードする 遺伝子の断片であって、配列番号１、配列番号２および配列番号３に記載される ヌクレオチド配列を本質的に有する断片の中から選択される断片、を含む構築物 。
8. ８．プロモーターが配列番号４に記載される配列を本質的に有することを特徴と する請求の範囲第７項記載のアンチセンス構築物。
9. ９．プロモーターが、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターおよびパタチン１プロモータ ーの中から選択されることを特徴とする請求の範囲第７項記載のアンチセンス構 築物。
10. １０．ジャガイモにおける顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）をコードす る遺伝子の断片であって、配列番号１、配列番号２および配列番号３に記載され るヌクレオチド配列を本質的に有する断片の中から選択され、かつアンチセンス 方向に挿入される断片を含むベクター。
11. １１．請求の範囲第７項ないし第９項のいずれか１項に記載のアンチセンス構築 物を含むベクター。
12. １２．ゲノムが請求の範囲第７項ないし第９項のいずれか１項に記載のアンチセ ンス構築物を含むジャガイモ植物の細胞。
13. １３．ゲノムが請求の範囲第７項ないし第９項のいずれか１項に記載のアンチセ ンス構築物を含むジャガイモ植物。
14. １４．ゲノムが請求の範囲第７項ないし第９項のいずれか１項に記載のアンチセ ンス構築物を含むジャガイモ塊茎。
15. １５．ゲノムが請求の範囲第７項ないし第９項のいずれか１項に記載のアンチセ ンス構築物を含むジャガイモ植物由来の種子。
16. １６．ゲノムが請求の範囲第７項ないし第９項のいずれか１項に記載のアンチセ ンス構築物を含むジャガイモの微小塊茎。