JPH06508990A - Ｂｍｐ−９組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＢＭＰ−９組成物 本発明は、ＢＭＰ−９と命名された精製蛋白の新規な族およびその製法に関する 。これらの蛋白を、骨および／または軟骨の形成を誘導するために用いることが でき、さらに傷の治療ならびに組織の修復に用いることができる。

ネズミ・ＢＭＰ−９のＤＮＡ配列（配列番号：１）およびアミノ酸配列（配列番 号＝２）を図１に示す。ヒト・ＢＭＰ−９の配列を図３（配列番号：８および９ ）に示す。ＢＭＰ−９蛋白は、軟骨および／骨の形成を誘導しつると考えられて いる。ＢＭＰ−９蛋白を、以下に記載したラットの骨形成試験における軟骨およ び／または骨の形成活性を示す能力によってさらに特徴づけてもよい。

ネズミ・ＢＭＰ−９を、図１の３１９〜４２８番目からなるアミノ酸（配列番号 ＝２、アミノ酸１〜１１０番目）により特徴づける。ネズミ・ＢＭＰ−９を、図 １に示した６１０〜１８９３番目のヌクレオチドからなるＤＮＡ配列で形質転換 された細胞を培養することにより生成させ、培養基から、同時に生成される蛋白 性物質を実質的に含有しない図１（配列番号＝２）に示す３１９〜４２８番目の アミノ酸からなるアミノ酸配列により特徴づけられる蛋白を回収し、精製する。

ヒト・ＢＭＰ−９は、ネズミ・ＢＭＰ−９と相同的であると期待され、図３（配 列番号：　９）　１７）１番目のアミノ酸（Ｓｅｔ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）から１１ ０番目のアミノ酸（Ａ　ｒ　ｇ）に至るアミノ酸からなる配列により特徴づけら れる。本発明は、ヒト・ＢＭＰ−９をコードしているＤＮＡ配列を得る方法を包 含する。この方法は、ネズミ・ＢＭＰ−９のヌクレオチド配列またはその一部を 用いることを必要とし、標準的方法を用いて、ヒト・遺伝子またはその断片につ （１て、ライブラリーを検索するためのプローブを設計するものである。ヒト・ ＢＭＰ−９を、該ＢＭＰ−９のＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養すること により生成させ、培養基から回収して該ＢＭＰ−９を精製してもよい。発現した 蛋白を単離、回収し、培養基中から精製する。精製された発現蛋白は、他の汚染 源からの蛋白性物質のみならず同時に生成される他の蛋白性物質を実質的に含ま なしλ。該回収された精製蛋白は、軟骨および／または骨の形成能を示すと考え られる。さらに、本発明の蛋白を、以下に記載のラットの骨の形成試験における 軟骨および／骨の形成能によって特徴づけてもよい。

ヒト・ＢＭＰ−９を、配列番号：８に示した１２４〜４５３番目のヌクレオチド からなるＤＮＡ配列により形質転換した細胞を培養すること、および同時に生成 される他の蛋白性物質を実質的に含んでいない配列番号：９の１〜１１０番目の アミノ酸からなる配列により特徴づけられる蛋白を、培養基から回収し精製する ことにより得てもよい。

本発明のもう１つの態様は、治療に有効な量のＢＭＰ−９蛋白を医薬上許容され る担体または賦形剤中に含む医薬組成物を提供する。本発明のＢＭＰ−９組成物 を、軟骨の形成に用いてもよい。さらに、これらの組成物を、骨の形成に用いて もよい。ＢＭＰ−９組成物を、傷の治療および組織の修復に用いてもよい。本発 明組成物は、さらに、ＢＭＰ−１、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−３、ＢＭＰ−４、ＢＭ Ｐ−５、ＢＭＰ−６およびＢＭＰ−７（例えばＰＣＴ公開ＷＯ３８１００２０５ 号、ＷＯ３９／１０４０９号、Ｗ０９０／１１３６６号に開示）ならびにＢＭＰ −８蛋白（１９９１年１月１５日付は米国特許出願第０７／６４１，２０４号、 １９９０年５月１６日付は第０７１５２５，３５７号および１９９１年１１月２ ０日付は第０７／８００．３６４号に開示）のごとき治療上有用な薬剤を少なく とも１種含有していてもよい。

本発明組成物は、ＢＭＰ−９蛋白の他に、上皮成長因子（ＥＧＦ）　、繊維芽細 胞成長因子（ＦＧＦ）　、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）お よびインシュリン様成長因子（ＩＧＦ）のごとき成長因子を含む他の治療上有用 な薬剤からなっていてもよい。該組成物はまた、例えば、該組成物を支持し、骨 および／または軟骨成長のための表面を提供するための適当なマトリックスを含 有していてもよい。該マトリックスは、骨形成誘導性蛋白を徐々に遊離させ、モ して／またはその機能発現のための適当な環境を提供しうるものである。

ＢＭＰ−９組成物を、多くの骨および／または軟骨の欠損、歯周疾患および種々 の傷の治療方法に使用してもよい。本発明によれば、これらの方法は、骨および ／または軟骨の形成、傷の治療あるいは組織の修復を必要とする患者に、ＢＭＰ −９蛋白の有効量を投与することを必要とする。これらの方法はまた、上記共同 出願に開示された少なくとも１種の新規ＢＭＰ蛋白とともに本発明蛋白を投与す ることを必要とする。さらに、これらの方法はまた、ＥＧＦＳＦＧＦＳＴＧＦ− α、ＴＧＦ−βおよびＩＧＦを含む他の成長因子とともにＢＭＰ−９蛋白を投与 することを包含する。

本発明のさらにもう１つの態様は、ＢＭＰ−９蛋白の発現についてコードしてい るＤＮＡ配列である。かかる配列は、図１（配列番号＝１）および図３（配列番 号：８）に示した５°から３゛方向へのヌクレオチド配列あるいは図１または図 ３のＤＮＡ配列と緊縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列を含んでおり、軟 骨および／または骨の形成を誘導する能力のある蛋白をコードしている。結局、 図１または図３の配列の相同遺伝子あるいは他の変化は、かかる核酸の変化が該 ペプチド配列の変化を引き起こすか否かにかかわらず、本発明に包含される。

本発明のさらなる態様は、発現調節配列に作動可能に連結した上記ＤＮＡ配列か らなるベクターを包含する。これらのベクターを、本発明のＢＭＰ−９蛋白生成 のための新規方法に用いてもよい。該新規方法においては、ＢＭＰ−９蛋白の発 現調節配列に作動可能に連結したＢＭＰ−９蛋白配列をコードしているＤＮＡ配 列で形質転換された細胞系を適当な培地で培養し、ＢＭＰ−９蛋白を回収し、精 製する。この方法は多くの既知の原核細胞および真核細胞双方を、該ペプチド発 現用宿主細胞として用いることができる。

本発明の他の態様および利点は、以下の詳細な説明およびその好ましい具体例を 考慮すれば明白である。

図面の簡単な説明 図１は、以下にさらに記載されるＭＬ１４ａクローン由来のネズミ・ＢＭＰ−９ のＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。

図２は、ラムダＵ２Ｏ５−３ＡＴＣＣ４０３４２由来のヒト・ＢＭＰ−４のＤＮ Ａ配列および推定アミノ酸配列を示す。

図３は、λＦＩＸ／Ｈ６１１１ＡＴＣＣ７５２５２由来のヒト・ＢＭＰ−９のＤ ＮＡ配列および推定アミノ酸配列を示す。

発明の詳細な説明 ネズミ・ＢＭＰ−９のヌクレオチド配列（配列番号＝１）およびコードされるア ミノ酸配列（配列番号：２）を図１に示す。本発明の精製ネズミ・ＢＭＰ−９蛋 白を、図１（配列番号：１）の６１０〜１８９３番目のヌクレオチドからなるＤ ＮＡ暗号配列で形質転換された宿主細胞を培養することにより生成させ、培養基 から、当該アミノ酸配列または図１（配列番号＝２）の３１９〜４２８番目のア ミノ酸により表される配列と実質的に相同的な配列を有する蛋白を回収し精製す る。培養基から回収したＢＭＰ−９蛋白を、同時に生成する他の蛋白性物質およ び存在する他の汚染物質から単離することにより精製する。

ヒト・ＢＭＰ−９ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を配列番号：８および９に示 す。成熟したヒト−ＢＭＰ−９は、１　（Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）　〜１１０ 番目（Ａ　ｒ　ｇ）のアミノ酸からなると考えられる。

ヒト・ＢＭＰ−９を、配列番号・８に示した１２４〜４５３番目のヌクレオチド からなるＤＮＡ配列で形質転換された細胞を培養すること、および同時に生成さ れる他の蛋白性物質を実質的に含まない配列番号＝９の１〜１１０番目のアミノ 酸配列により特徴づけられる蛋白を培地から回収し精製することにより得てもよ い。

ＢＭＰ−９蛋白を、軟骨形成誘導能により特徴づけてもよい。ＢＭＰ−９を、さ らに、骨形成誘導能により特徴づけてもよい。さらに、ＢＭＰ−９を、下記のラ ットの骨形成試験における骨および／または軟骨形成活性を示す能力により特徴 づけてもよい。

また、本発明により提供されるＢＭＰ−９蛋白は、図１および図３（配列番号： １および８）の配列と同様の配列によりコードされている因子を含むが、その修 飾は、その中へ自然に導入されるか（例えば、ポリペプチド中のアミノ酸の変化 を生じるヌクレオチド配列中の相同的変異）または計画的に遺伝子操作により導 入される。例えば、合成ポリペプチドが、図１または図３（配列番号：２または ９）の全部または一部において重複した連続的なアミノ酸配列を有していてもよ い。これらの配列は、１次、２次または３次構造およびコンフォーメーション上 の特徴を図１および図３の骨成長因子のポリペプチドと共有することにより、そ れらに共通した骨成長因子の生物学的特性を持ちうる。よって、それらを、天然 に存在するＢＭＰ−９および他のＢＭＰ−９ポリペプチドの生物学的活性のある 代用物として、治療方法に用いてもよい。

本明細書記載のＢＭＰ−９蛋白配列の他の特異的突然変異は、糖鎖付加部位の修 飾を包含する。これらの修飾は〇−結合型またはＮ−結合型糖鎖付加部位を含ん でいてもよい。例えば、糖鎖付加がないこと、あるいはごく部分的な糖鎖付加は 、アスパラギン結合糖鎖付加認識部位におけるアミノ酸の置換または欠失による 。アスパラギン結合糖鎖付加認識部位は、細胞の適当な糖鎖付加酵素により特異 的に認識されるトリペプチド配列からなる。これらのトリペプチド配列は、アス パラギン−Ｘ−スレオニンまたはアスパラギン−Ｘ−セリンのいずれかであり、 ここにＸは通常いかなるアミノ酸であってもよい。糖鎖付加認識部位の１番目ま たは３番目のアミノ酸のうちの１個または両方における種々のアミノ酸置換ある いは欠失（および／または２番目のアミノ酸の欠失）は、当該修飾トリペプチド 配列において糖鎖付加を生じない。

本発明はまた、他の蛋白性物質をコードしているＤＡＮ配列に連結していない新 規ＤＮＡ配列を包含し、該配列は、ＢＭＰ−９蛋白の発現をコードしている。

これらのＤＮＡ配列は、図１または図３（配列番号：１および８）に５′から３ ′方向に示されたものを含み、緊縮条件下でそれらとハイブリダイズしくティー ・マニアティス（７，１Ｂ１ｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クローニング（ア ・ラボラトリ−・マニュアル）　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ａ　 Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバ−・ラ ボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ） 　（１９８２年）。

３８７〜３８９頁参照）、かつ軟骨および／または骨誘導活性を有する蛋白をコ −ドしている。

同様に、図１または図３の配列によりコードされたＢＭＰ−９蛋白についてコー ドしているが、遺伝暗号の縮重あるいは相同的変異（特定の遺伝子におけるアミ ノ酸変化を生じない自然に生じる塩基変化）によりコドンに相違を生じたＤＮＡ 配列もまた、本明細書記載の新規因子をコードしている。点突然変異または誘導 的修飾（挿入、欠失および置換を含む）を生じさせて、その活性、半減期あるい はコードされたポリペプチド生産を増加させた図１または図３（配列番号：ｌお よび８）のＤＮＡ配列の変化もまた本発明の範囲内である。

本発明の別の態様は、ＢＭＰ−９蛋白の新規製法を提供する。本発明方法は、既 知の調節配列の制御下、本発明のＢＭＰ−９蛋白をコードしているＤＮＡ配列に より形質転換された適当な細胞系を培養することを包含する。形質転換された細 胞を培養し、ＢＭＰ−９蛋白を培養基から回収し精製する。該精製蛋白は、他の 汚染物質のみならず同時に生成される他の蛋白を実賀的に含有しない。

適当な細胞または細胞系は、チャイニーズ・ハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）の ごとき哺乳動物細胞であってよい。適当な哺乳動物宿主細胞の選択および形質転 換、培養、増幅、検索、生成物の生産ならびに精製のための方法は、当該分野に おいて知られている。ゲシング（Ｇｅｔｈｉｎｇ）およびサムプルツク（Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ）、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、第２９３巻、６２０〜６２５頁 （１９８１年）あるいはその代わりにカウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら、モレキ ュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、 　）、第５巻、第７号、１７５０〜１７５９頁（１９５８年）またはハウソー（ Ｈｏｖｌｅｙ）らの米国特許第４．４１９．４４６号参照。以下の実施例記載の もう１つの適当な哺乳動物細胞系は、サル・ＣＯ３−１細胞系である。

哺乳動物細胞ＣＶ−１もまた適当である。

細菌細胞もまた適当な宿主である。例えば、種々のイー・コリ（Ｅ、　ｃｏｌｉ ）株（例えば、ＨＢＩＯＩ株、ＭＣ１０６１株）は、バイオテクノロジーの分野 ではよく知られた宿主細胞である。種々のバシルス・ズブチリス（Ｂ、　５ｕｂ ｔｉｌｉｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、他のバシルス属お よびそれに類する菌株もまた本方法に使用できる。

当業者に知られた多くの酵母細胞菌株もまた、本発明ポリペプチド発現用宿主細 胞として入手可能である。さらに、所望であれば、昆虫細胞も本発明方法の宿主 細胞として用いることができる。ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、ジェネティック・ エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、第８巻、２２ ７〜２９８頁（プレナム・プレス（Ｐｒｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）　（１９８６年 ））およびその中で引用された文献参照。

本発明のもう１つの態様は、これらの新規ＢＭＰ−９ポリペプチドの発現方法に 用いるベクターを提供する。好ましくは、該ベクターが、本発明の新規因子をコ ードしている上記新規ＤＮＡ配列全体を含むものとする。さらに、該ベクターも また、ＢＭＰ−９蛋白配列を発現させる適当な発現調節配列を含むものとする。

別法として、上述のごとき修飾配列を含むベクターもまた、本発明の具体例であ る。該ベクターを細胞系の形質転換に用いてもよく、該ベクターが、選択された 宿主細胞における複製および発現をつかさどることができる本発明のＤＮＡ暗号 配列に作動可能に連結した選択された調節配列を含んでいてもよい。かかるベク ターの調節配列は当業者に知られており、宿主細胞に応じて選択することができ る。かかる選択は通常のものであって、本発明の一部を形成するものではない。

骨が正常に形成されない環境において、軟骨および／または骨の形成を誘導する 本発明蛋白を、ヒトや他の動物における骨折および軟骨欠損の治療に適用する。

ＢＭＰ−９を用いたかかる組成物を、解放骨折のみならず閉鎖骨折ならびに人工 関節の固定化の改善において、予防的に利用してもよい。骨形成性物質により誘 導されるデ・ノボ（ｄｅ　ｎｏｖ□）骨形成は、先天的に、外傷によりあるいは 腫瘍切除により誘発される頭蓋と顔の中隔欠損の修復に貢献し、また整形・形成 外科においても有用である。ＢＭＰ−９蛋白を、歯周病の治療および他の歯の治 療方法に用いてもよい。かかる物質は、骨形成細胞を引き寄せ、骨形成細胞の成 長を刺激し、あるいは骨形成細胞の前駆細胞の分化を誘導するための環境を提供 しつる。

本発明のＢＭＰ−９ポリペプチドは骨粗髭症の治療にも有用である。種々の骨形 成性、軟骨誘導性および骨誘導性因子が記載されている。それを検討するには欧 州特許出願第１４８．１５５号および第１６９，０１６号を参照。

本発明蛋白を、傷の治療および関連組織の修復に用いてもよい。傷の形態は熱傷 、切開および潰瘍を含むが、これらに限定されない（例えば、傷の治療および関 連組織の修復の議論のためにはＰＣＴ公開ＷＯ３４１０１１０６号参照）。

さらに、本発明蛋白は、神経の生存を増加させ、それゆえ、移植および神経の生 存の減少を示す症状の治療に有用であると考えられている。

本発明のさらなる態様は、骨折および軟骨および／または骨の欠損あるいは歯周 病に関連する他の症状の治療のための方法ならびに組成物である。本発明はさら に、傷の治療および組織の修復のための治療方法および組成物を包含する。かか る組成物は、医薬上許容される担体、賦形剤またはマトリックスとの混合物とし ての少なくとも１種の本発明ＢＭＰ−９蛋白の治療的有効量からなる。

本発明蛋白が、他の関連蛋白および成長因子と関連しであるいはおそら（共同的 に作用しうると期待される。それゆえ、本発明のさらなる治療方法および組成物 は、上記共同出願に開示された他のＢＭＰ蛋白の治療的有効量を伴った少なくと も１種の本発明ＢＭＰ−９蛋白の治療的有効量からなる。かかる混合物が、ＢＭ Ｐ蛋白の個々の分子あるいは異なるＢＭＰ分子の一部分からなる異形分子からな っていてもよい。例えば、本発明方法および組成物が、ＢＭＰ−９蛋白サブユニ ツトおよび上記ｒＢＭＰＪ蛋白の１つに由来するサブユニットからなるジスルフ ィド結合した二量体からなっていてもよい。さらなる具体例は、ＢＭＰ−９の一 部分のへテロニ量体を包含する。さらに、対象となる骨／および／または軟骨欠 損、傷あるいは組織の治療に有益である他の薬剤とＢＭＰ−９蛋白とを組み合わ せてもよい。これらの薬剤は、上皮成長因子（ＥＧＦ）　、血小板由来の成長因 子（ＰＤＧＦ）　、形質転換成長因子（ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）およびイ ンシニリン様成長因子（ＩＧＦ）のごとき種々の成長因子を包含する。

ｐＨ，等損性、安定性等に関するかかる生理学的に許容される蛋白組成物の調製 および処方は、当該分野の技術的範囲内である。該治療用組成物は、ＢＭＰ蛋白 の種特異性が乏しいために、目下、獣医学的な応用にも重要となっている。ヒト の他には、特に、家畜およびサラブレッドの馬が、本発明ＢＭＰ−９蛋白でのか かる治療の望ましい対象である。

該治療方法は、移植片または器具による該組成物の局所的、全身的あるいは局部 的投与を包含する。投与の際には、本発明で使用する該治療用組成物は、勿論、 発熱源がなく生理学的に許容される形態である。さらに、該組成物を、望ましく は、カプセルに入れるか、または粘性のある形態として注入して骨、軟骨あるい は組織損傷部位に到達させる。局所的投与は傷の治療および組織修復に適するで あろう。ＢＭＰ−９以外の治療上有用な薬剤を、所望により上記組成物に含有さ せてもよ（、本発明方法において、別法としであるいは付加的に該ＢＭＰ組成物 とともに同時または連続的に投与してもよい。

好ましくは、骨および／または軟骨形成のためには、該組成物が、骨および／ま たは軟骨損傷部位にＢＭＰ−９あるいは他のＢＭＰ蛋白を送達し、骨および軟骨 の成長に適した構造を提供し、最適に体内に再吸収されるマトリックスを含有す るものとする。該マトリックスは、ＢＭＰ−９を徐々に放出し、モして／あるい はその機能発現に適した環境を提供しうるものである。かかるマトリックスを、 他の体内移植用外用薬に直ちに用いる材料の形態としてもよい。

マトリックス材料の選択を、生体適合性、生分解性、機械的特性、美容的外観お よび界面特性に基づいて行う。ＢＭＰ−９組成物の特殊な応用は、Ｒ当な処方を 決定するであろう。当該組成物に都合のよいマトリックスは、生分解性であり化 学的に性質の分かっている硫酸カルシウム、りん酸三カルシウム、ヒドロキシア パタイト、ポリ乳酸およびポリ無水物である。他の都合のよい材料は、骨または 皮膚コラーゲンのごとき生分解性であり生物学的に性質のよく分かっているもの である。さらに、マトリックスは純粋な蛋白または細胞外マトリックス成分から なる。他の都合のよいマトリックスは、焼結ヒドロキシアパタイト、バイオグラ ス、アルミン酸塩あるいは他のセラミックスのごとき非生分解性であり化学的に 性質の分かっているものである。マトリックスが、ポリ乳酸およびヒドロキシア パタイト、またはコラーゲンおよびりん酸三カルシウムのごとき上述したいずれ かの形態の材料の混合物からなっていてもよい。カルシウム−アルミン酸塩−り ん酸中のごとき組成物中においてバイオセラミックスを変更し、孔のサイズ、粒 子のサイズ、粒子の形態および生分解性を変化させてもよい。

担当医師は、ＢＭＰ−９蛋白の作用を調節する種々の因子、例えば、形成される ことが望まれる骨の重量、骨の損傷部位、損傷した骨の状態、傷の大きさ、損傷 組織の形態、患者の年令、性別、食事、何等かの感染症の重篤性、投薬期間およ び他の医療上の因子を考慮したうえで投薬規則を決定する。再構成に使用するマ トリックスの形態および組成物中のＢＭＰ蛋白の形態により薬用量を変更しても よい。最終組成物へのＩＧＦ−Ｉ　（インシュリン様成長因子工）のごとき他の 知られた成長因子の添加もまた、薬用量に影響しつる。骨の成長および／または 修復を、例えば、Ｘ線、組織形態的分析およびテトラサイクリン標識のごとき定 期的な分析により、経過をモニターする。

以下の実施例は、ネズミ・ＢＭＰ−９蛋白の回収ならびに特徴付け、およびネズ ミ・ＢＭＰ−９蛋白を用いてヒトおよび他のＢＭＰ−９蛋白を回収すること、そ して該蛋白を組換え手法により発現させることにおける本発明の詳細な説明する 。

実施例Ｉ ネズミ・ＢＭＰ−９ ラムダＺＡＰベクター（ストシタジーン社製／カタログ番号９３５３０２）中に 構築された７５０，０００個のマウス・肝臓ｃＤＮＡライブラリーをブレーティ ングし、複製ニトロセルロースレプリカを作成する。図２（配列番号：３）（ヒ ト・ＢＭＰ−４配列）の１３３０〜１６２７番目のヌクレオチドに相当するヒト ・ＢＭＰ−４ＤＮＡを、ランダムプライミング法（ファインベルブ（Ｆｅｉｎｂ ｅｒｇ）ら。

アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、第 １３２巻、６〜１３頁（１９８３年））によりｓａｐで標識し、６０℃のＳＨＢ 中で双方の組のフィルターに２〜３日ハイブリダイズさせる。双方の組のフィル ターを、緊縮条件下（４ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳ、６０℃）で洗浄する。多く の移し取られた種々の強度のハイブリダイズしている組み換え体（約９２個）が 観察される。５０個の最も強（ハイブリダイズしている組み換えバクテリオファ ージをプラーク精製し、その挿入物を、製造者（ストラタジーン社）により記載 されたインビボ切形法に従いブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）　Ｓ　 Ｋ　（＋／−）プラスミドに移行させる。数種の組み換え体のＤＮＡ配列分析は 、それらが他のＢＭＰ蛋白および他のＴＧＦ−β族の蛋白と相同性のある蛋白を コードしていることを示す。ＭＬ１４ａと命名した１個の組み換え体のＤＮＡ配 列および推定アミノ酸配列を図１（配列番号：１）に示す。

クローンＭＬ１４ａのヌクレオチド配列は、４２８個のアミノ酸からなるＢＭＰ −９蛋白をコードしている１２８４ｂｐのオーブン・リーディング・フレームを 有する。３つのリーディング・フレームすべてにおける終止コドンを伴う６０９ ｂｐの５°非非翻訳列が当該暗号配列の前に存在するために、コードされている ４２８個のアミノ酸からなるＢＭＰ−９蛋白は、１次翻訳産物であると考えられ る。該４２８個のアミノ酸配列は、４８，０００ダルトンの分子量のＢＭＰ−９ 蛋白を予測させる。

他のＢＭＰ蛋白およびＴＧＦ−β族の他の蛋白に関する知見に基づいて、前駆体 ポリペプチドが、提案されて意見が一致している蛋白分解プロセッシング配列Ａ 　ｒ　ｇ−Ｘ−Ｘ−Ａ　ｒ　ｇと一致した多重塩基性配列Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｙ ｓ−Ａｒｇにおいて開裂されるものと予測される。この位置でのＢＭＰ−９前駆 体ポリペプチドの開裂が、３１９番目のＳｅｒの位置から始まる１１０個のアミ ノ酸からなる成熟ペプチドを生じるのであろう。ＢＭＰ−９の成熟形態へのプロ セッシングは、関連蛋白ＴＧＦ−βのプライミング（エル・イー・ジエントリー （Ｌ、　Ｅ、　Ｇｅｎｔｒｙ）ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロ ジー（Ｍａｉｌ、　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　）、第８巻、４１６２頁（１９８８年）；アール・プリンク（Ｒ， Ｄｅｒｙｎｃｋ）ら。

ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、第３１６巻、７０１頁（１９８５年））と類似 の機構による二量体化およびＮ−末端領域の除去を含むものと考えられる。

それゆえ、ネズミ・ＢＭＰ−９の成熟活性種は、そのサブユニットのそれぞれが ３１９〜４２８番目のアミノ酸からなり、推定分子量約１２．０００ダルトンの ２個のポリペプチドサブユニットのホモ二量体からなると考えられる。さらなる 活性種は、１個目の保存されたシイスティン残基を含む３２６〜４２８番目のア ミノ酸からなると考えられる。ＢＭＰおよびＴＧＦ−β族の蛋白の他の構成種と 同様、ＢＭＰ−９蛋白のカルボキシ末端領域は、多くのアミノ末端部分よりも高 い配列保存性を示す。対応する他のヒト・ＢＭＰ蛋白および他のＴＧＦ−β族に 属する蛋白に対する、システィンに富むＣ末端領域（３２６〜４２８番目のアミ ノ酸）におけるネズミ・ＢＭＰ−９蛋白のアミノ酸の同一性のパーセント値は以 下のごとくである。ＢＭＰ−２５３％、ＢＭＰ−３４３％、ＢＭＰ−４５３％、 ＢＭＰ−５５５％、ＢＭＰ−６５５％、ＢＭＰ−７５３％、Ｖｇｌ　５０５％、 ＧＤＦ−１４３％、ＴＧＦ−β１３２℃％、ＴＧＦ−β２３４％、ＴＧＦ−β３ ３４％、インヒビンβ（Ｂ）　３４％、インヒビンβ（Ａ）４２％。

実施例ＩＩ ヒト・ＢＭＰ−９ ネズミおよびヒトの骨誘導因子遺伝子は、有意に相同性のあるものと推定される 。それゆえ、ネズミの暗号配列またはその一部をプローブとして用いて、類似の ヒト・軟骨および／または骨蛋白を合成するヒト・細胞系または組織を検索する 。ヒト・ゲノムライブラリー（トール（Ｔｏｏｌｅ）ら、上記）を、かかるプロ ーブで検索してもよく、推定上の可能性のある検体を単離し、ＤＮＡ配列を得て もよい。この組み換え体がヒト・ＢＭＰ−９の一部をコードしているという証拠 は、ネズミ／ヒト蛋白および遺伝子構造の相同性に基づく。

ヒト・軟骨および／または骨誘導因子分子の一部をコードしているＤＮＡを有す る組換えバクテリオファージを得たならば、該ヒト・暗号配列をプローブとして 用いて、ＢＭＰ−９を合成するヒト・細胞系または組織を確認できる。別法とし て、ネズミの暗号配列をプローブとして用いて、かかるヒト・細胞系または組織 を確認できる。簡単に記載すると、ＲＮＡを選択して細胞または組織から抽出し 、ホルムアルデヒドアガロースゲル上で電気泳動してニトロセルロース上に移行 させるかまたはホルムアルデヒドと反応させてニトロセルロース上に直接スポッ トする。ついで、ニトロセルロースを、ネズミまたはヒト・ＢＭＰ−９暗号配列 由来のプローブとハイブリダイズさせる。オリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグ ラフィーによりｍＲＮＡを選択し、ｃＤＮＡを合成し、確立されている手法（ト ール（Ｔｏｏｌｅ）ら、上記）により、ラムダｇｔｌＯまたはラムダＺＡＰ中に クローン化する。

当業者に知られたさらなる方法を用いて本発明のヒトあるいは他の種のＢＭＰ− ９蛋白を単離してもよい。

Ａ、ヒト・ＢＭＰ−９ＤＮＡの単離 λＦＩＸベクター（ストラタジーン社、カタログ番号９４４２０１）中に構築さ れた１００万個のヒト・ゲノムライブラリーの組み換え体をブレーティングし、 複製ニトロセルロースレプリカを作成する。図１（配列番号＝１）に示した１６ ６５〜１７０４番目および１８３７〜１８７６番目のヌクレオチド配列に基づく ２種のオリゴヌクレオチドプローブを、自動ＤＮＡ合成装置で合成する。これら ２種のオリゴヌクレオチド配列は以下のごとし。

これら２種のオリゴヌクレオチドプローブを７３”Ｐ−ＡＴＰで放射性標識し、 それぞれを、ＳＨＢ中、６５℃で、１組の移し取られたニトロセルロースレプリ カにハイブリダイズさせ、ついで、６５℃でｌＸ５ＳＣ，０，１％ＳＤＳにて洗 浄する。両方のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするこれらの組み換え体を 記録する。３種の可能性のあるハイブリダイズしている組み換え体すべてをプラ ーク精製し、バクテリオファージのプレート・ストックを調製し、それぞれから バクテリオファージＤＮＡを単離する。これらの組み換え体のうち１種のオリゴ ヌクレオチドにハイブリダイズする領域（ＨＧｌｌｌと命名）を、１．２ｋｂの Ｐｓ　ｔ　Ｉ／Ｘｂａ　Ｉ断片に挿入する。この断片をプラスミドベクター（ｐ ＧＥＭ−３）中にサブクローニングし、ＤＮＡ配列分析を行う。ＨＧｌｌｌを、 米国メリーランド州、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、パークローン・ドラ イブ（ＰａｒｋｌａｖｎＤｒｉｖｅ）　１２３０１番地のＡＴＣＣに、１９９２ 年６月１６日に、ブタペスト条約の要請に基づき寄託し、受託番号ＡＴＣＣ７５ ２５２を与えられた。このサブクローンをｐＧＥＭ−１１１と命名する。クロー ンｐＧＥＭ−１１１のＤＮＡ配列の一部を図３（配列番号：８／ヒト・ＢＭＰ− ９配列）に示す。この配列はヒト・ＢＭＰ−９の成熟領域全部とそのプロペプチ ドの一部をコードしている。この配列が予備的なデータからなることに注意すべ きである。詳細には、該プロペプチド領域をさらなる分析および特徴付けに供す る。例えば、１〜３番目のヌクレオチド（ＴＧＡ）は、該配列の予備的な性質で あるため正しくないかもしれない翻訳終止をコードする。ｐＧＥＭ−１１１（ｐ ＧＥＭ中にサブクローン化されたＨＧｌｌｌの１．２ｋｂのＰｓｔｌ／Ｘｂａｌ 断片）およびＨＧＩＩＩの両方に存在するさらなる配列が、ヒト・プロペプチド 領域のさらなるアミノ酸をコードしていると予想される。他のＢＭＰおよびＴＧ Ｆ−βに属する他の蛋白の関する知見に基づいて、該前駆体ポリペプチドが、提 案されている蛋白分解プロセッシング配列Ａ　ｒ　ｇ−Ｘ−Ｘ−Ａ　ｒ　ｇ　（ 配列番号・９の−４〜−１番目のアミノ酸）と一致した多重塩基性配列Ａｒｇ− Ａｒｇ−Ｌｙｓ−Ａｒｇにおいて開裂されるものと予測される。この位置でのヒ ト・ＢＭＰ−９前駆体の開裂は、配列番号＝９の１番目の５ｅｒ（配列番号、９ の１２４〜１２６番目のヌクレオチドによりコードされる）から始まる１１０個 のアミノ酸の成熟ペプチドを生じるであろう。

ヒト・ＢＭＰ−９の成熟形態へのプロセッシングは、関連蛋白ＴＧＦ−βのプロ セッング（エル・イー・ジエントリー（Ｌ、　Ｅ、Ｇｅｎｔｒｙ）ら、モレキュ ラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　 ）、第８巻、４１６２頁（１９８８年）：アール・プリンク（Ｒ，Ｄｅｒｙｎｃ ｋ）ら、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）、第３１６巻、７０１頁（１９８５年） ）と類似の機構による二量体化およびＮ−末端領域の除去を含むと考えられる。

それゆえ、ヒト・ＢＭＰ−９の成熟活性種は、それぞれが配列番号：９の１〜１ １０番目のアミノ酸からなり、推定分子量約１２．０００ダルトンの２個のポリ ペプチドサブユニットのホモニ量体からなると考えられる。さらなる活性種は、 １個目の保存されたシイスティン残基が含まれている８〜１１０番目のアミノ酸 からなると考えられる。ＢＭＰおよびＴＧＦ−β族の蛋白の他の構成種と同様、 ヒト・ＢＭＰ−９蛋白のカルボキシ末端領域は、多くのアミノ末端部分よりも高 い配列保存性を示す。対応する他のヒト・ＢＭＰ蛋白および他のＴＧＦ−β族に 属する蛋白に対する、システィンに冨むＣ末端領域（８〜１１０番目のアミノ酸 ）におけるヒト・ＢＭＰ−９蛋白のアミノ酸の同一性のパーセント値は以下のご とくである。ＢＭＰ−２５２％、ＢＭＰ−３４０％、ＢＭＰ−４５２％、ＢＭＰ −５５５％、ＢＭＰ−６５５％、ＢＭＰ−７５３％、ネズミ・ＢＭＰ−９９７％ 、Ｖｇｌ　５０％、ＧＤＦ−１４４％、ＴＧＦ−β１３２％、ＴＧＦ−β２３２ ％、ＴＧＦ−β３３２％、インヒビンβ（Ｂ）３５％、インヒビンβ（Ａ）４１ ％。

実施例ＩＩＩ ローゼン（Ｒｏｓｅｎ）改変サムパス（Ｓａｍｐａｔｈ）−レディ（Ｒｅｄｄｉ ）試験サムパス（Ｓａｍｐａｔｈ）およびレディ（Ｒｅｄｄｉ）、ブロシーデイ ンダス・オス・ナショナル・アカデミ−・オス・サイエンシズ・ニーニスエイ（ Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ）、第８０巻、６５９１〜６５９５頁（１９８３年）記載のラットの骨形 成分析の改変版を用いて、ＢＭＰ蛋白の骨および／または軟骨活性を評価する。

この改変法を、本明細書ではローゼン改変サムパスーレディ試験と称す。サムパ ス−レディ法のエタノール沈澱ステップを、分析すべきフラクションを水に対し て透析（成分が溶液ならば）または限外濾過（成分が懸濁液ならば）することに 置き換える。ついで、該溶液または懸濁液を０．１％ＴＦＡに再溶解し、得られ た溶液を２量ｍｇのラット・マトリックスに添加する。該蛋白で処理していない 処理をしたと見なしたラットのマトリックス試料が対照として役立つ。この物質 を凍結し、凍結乾燥し、得られた粉末を＃５ゼラチンカプセルに封入する。該カ プセルを、生後２１〜４９日目のオスのロング・エバンズ（Ｌｏｎｇ　Ｅｖａｎ ｓ）・ラットの胸腹部の皮下に移植する。７〜１４日目に日目物を除去する。そ れぞれの移植物の半分をアルカリホスファターゼ分析（エイ・エイチ・レディ（ Ａ、　Ｈ，Ｒｅｄｄｉ）ら、ブロンーデインダス・オス・ナショナル・アカデミ −・オス・サイエンシズ・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　ｌ１ｌａｔ１．　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ）、第６９巻、１６０１頁（１９７２年））に用いる 。

移植物のもう半分を固定し、形態学的分析用に処理する。１μｍのメタクリル酸 グリコール切片をフォノ・コツプ（Ｙｏｎ　Ｋｏｓｓａ）および酸性ツクシンで 染色し、各移植物中に存在する誘導された骨および軟骨形成量を記録する。＋１ ないし＋５なる記号は、新たな骨および／または軟骨細胞およびマトリックスに より占有された移植物の各形態学的切片の面積を表す。評点＋５は、移植物の５ ０％以上が、該移植物中の蛋白の直接的な結果として生産された新たな骨および ／または軟骨であることを示す。＋４、＋３、＋２および＋１は、それぞれ４０ ％、３０％、２０％および１０％以上の移植物が、新たな軟骨および／または一 部を含んでいることを示す。改変評点法においては、各植物からの３つの隣接し ていない切片を評価し、平均する。ｒ＋／−Ｊは、軟骨または骨がはっきりと確 認されないことを示す。「＋１」は、各切片の１０％以上が新たな軟骨または骨 であることを示し、「＋２」は２５％以上、「＋３」は５０９６以上、「＋４」 は７５％まで、「＋５」は８０％以上であることを表す。「−」は、移植物が回 収されないことを示す。

マトリックス試料に対するＢＭＰ−９含有試料の投薬応答特性は、形成された骨 および／または軟骨量が、試料中のＢＭＰ−９量に応じて増加するということを 示すと考えられる。対照試料は、何ら骨および／または軟骨を生じないと考えら れる。

上記ｒＢＭＰＪ蛋白のごとき他の軟骨および／または骨誘導蛋白によるのと同様 に、形成された骨および／または軟骨は、マトリックスによって占有される空間 により物理的に制限されると考えられる。試料を、オートラジオグラフィーによ り追跡するＳＤＳゲル電気泳動および等電点フォーカシングによっても分析する 。活性は蛋白バンドおよびｐＩに対応している。特定のフラクション中の蛋白の 純度を測定するために、吸光係数１０Ｄ／ｍｇ−ａｍを蛋白測定基準として用い 、蛋白をＳＤＳ　ＰＡＧＥ上で泳動し、ついで、銀染色あるいは放射ヨウ素化し てオートラジオグラフィーを行う。

実施例ＩＶ ＢＭＰ−９の発現 ネズミ、ヒトまたは他の哺乳動物のＢＭＰ−９蛋白を生産するために、該蛋白を コードしているＤＮＡを適当な発現ベクターに導入し、慣用的な遺伝子工学の手 法により、哺乳動物細胞または他の好ましい真核あるいは原核宿主に導入する。

生物学的に活性のある組換えヒト・ＢＭＰ−９のための好ましい発現系は、安定 に形質転換された哺乳動物細胞であると考えられている。

当業者は、図１（配列番号：１）もしくは図３（配列番号：８）またはＢＭＰ− ９あるいは他の修飾配列をコードしている他のＤＮＡ配列およびｐＣＤ（オカヤ マ（Ｏｋａｙａｍａ）ら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍ ｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　）、第２巻、１６１〜１７０頁（１９８２年））、ｐＪＬ３、ｐＪ Ｌ４　（ボウ（Ｇｏｕｇｈ）ら、エムポー・ジャーナル（ＥＩＩＩＢＯ，Ｊ、　 ）、第４巻、６４５〜６５３頁（１９８５年））ならびにｐＭＴ２　ＣＸＭのご とき既知ベクターを用いることにより、哺乳動物発現ベクターを構築できる。

崎乳動物発現ベクターｐＭＴ２　ＣＸＭは、ｐ９１０２３　（ｂ）（ウォン（ｌ ｏｎｇ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２２８巻、８１０〜８１５頁（ １９８５年））の誘導体であり、ｐ９１０２３　（ｂ）とは異なり、テトラサイ クリン耐性遺伝子のかわりにアンピシリン耐性遺伝子を有し、さらにｃＤＮＡク ローン挿入用にＸｈｏ１部位を有する。ｐＭＴ２　ＣＸＭの機能的構成要素が記 載されており（カウフマン、アール・ジェイ（Ｋａｕｆｍａｎ、　Ｒ，Ｊ、　） 、プロシーディンゲス・オス・ナショナル・アカデミ−・オス・サイエンシズ・ ニーニスニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、第８２巻、６８９〜６９３頁（１９８５年））、アデノウ ィルスＶＡ遺伝子、７２ｂｐのエンハンサ−を含むＳＶ４０複製開始点、５′ス プライシング部位を含むアデノウィルス大後期プロモーターならびにアデノウィ ルス後期ｍＲＮＡ上に存在するアデノウィルス三分節リーダー配列の大部分、３ ′−スプライス受容部位、ＤＨＦＲ挿入断片、ＳＶ４０初期ポリアゾニレ−ジョ ン部位およびイー・コリ中で増殖するのに必要なｐＢＲ３２２配列を含んでいる 。

プラスミドｐＭＴ２　ＣＸＭを、米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・ タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に受託番号ＡＴＣＣ６７１２２の下で寄託された ｐＭＴ２−ＶＷＦをＥｃｏＲＩ消化することにより得る。ＥｃｏＲＩ消化により ｐＮＴ−ＶＷＦに存在するｃＤＮＡ挿入断片が切除され、直鎖状のｌ）ＭＴ２が 得られ、これをライゲーションしてイー・コリＨＢＩＯＩまたはＤＨ−５を形質 転換するのに用い、アンピシリン耐性とすることができる。プラスミドｐＭＴ２ ＤＮＡを慣用的方法により調製できる。

ついで、ｐＭＴ２　ＣＸＭを、ループアウト／イン変異種生成法（モリナガαｏ ｒｉｎａｇａ）ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、第８ ４巻、６３６頁（１９８４年））により構築する。この方法で、ＳＶ４０複製開 始点およびｐＭＴ２エンハンサ−配列近傍のＨｉｎｄＩＩＩ部位に関連した１０ ７５〜１１４５番目の塩基を除去する。さらに以下の配列５’　ＰＯ−ＣＡＴＧ ＧＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧ−３／　（配列番号：５）を１１４５番目のヌクレオチ ド部位に挿入する。この配列は制限エンドヌクレアーゼＸｈｏｌの認識部位を有 する。ｐＭＴ２３と命名したｐＭＴ２ＣＸＭ誘導体は、制限エンドヌクレアーゼ Ｐｓ　ｔ　Ｉ、ＥｃｏＲＩ、５ａｌＩおよびＸｈｏＩの認識部位を有する。プラ スミドｐＭＴ２　ＣＸＭおよびｐＭＴ２３ＤＮＡを、慣用的方法で調製してもよ い。

ｐＭＴ２１から誘導されたｐ　ＥＭＣ２ｂ　１もまた本発明の実施に適当である 。

ｐＭＴ２１を、ｐＭＴ−ＶＷＦ由来（７）ｐＭＴ２　からＴＲ導ｔ；６゜上記ノ コトク、ＥｃｏＲＩ消化によりｐＭＴ−ＶＷＦ中に存在するｃＤＮＡ挿入断片を 切除し、直鎖状のｐＭＴ２を得、これをライゲーションしてイー・コリＨＢＩＯ ＩまたはＤＨ−５を形質転換するのに用い、アンピシリン耐性とすることができ る。プラスミドｐＭＴ２ＤＮＡを慣用的方法により調製できる。

ｐＭＴ２１を、以下の２つの修飾によりｐＭＴ２から誘導する。最初に、ｃＤＮ ＡクローニングのためにＧ／Ｃ尾部由来の一連の１９個のＧ残基を含むＤＨＦＲ ｃＤＮＡの７６ｂｐの５′非翻訳領域を欠失させる。この方法において、Ｘｈｏ １部位を挿入してＤＨＦＲのすぐ上流の下記配列５′−ｇ国Ｑ県Ｇ艶ＡＧＣＣ口 Ｔ笹−３′（配列番号二６）ＩＰｓｔ工　Ｅｃｏ　ＰＣＸｂａｌ を得る。次に、ＥｃｏＲＶおよびＸｂａｌによる消化、ＤＮＡポリメラーゼエの フレノウフラグメントによる処理およびＣ１ａＩリンカ−（ＣＡＴＣＧＡＴＧ） に対するライゲーションにより単−Ｃ１ａ１部位を導入する。この方法により、 アデノウィルス関連ＲＮＡ　（ＶＡＩ）領域から２５０ｂｐが除去されるが、こ の方法は、ＶＡＩ　ＲＮＡ遺伝子の発現または機能を妨害しない。ｐＭＴ２１を ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏｌで消化し、ｐＥＭｃ２Ｂ１を誘導するのに用いる。

ＥｃｏＲＩおよびＰｓｔＩ消化により、ｐＭＴ２−ＥＣＡＴＩ　（ニス・ケイ・ ジュング（Ｊｕｎｇ）ら、ジャーナル・オス・ウィロロジ−（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ ）、６３巻。

１６５１〜１６６０頁（１９８９年））からＥＭＣＶリーダーの一部を得、２７ ５２ｂｐの断片を生じさせる。この断片をＴａｑＩで消化し、５０８ｂｐのＥｃ ｏＲＩ−Ｔａｑｌ断片を得、これを低融点アガロースゲル電気泳動で精製する。

６８ｂｐのアダプターおよび５°側に突出したＴａｑＩ部位および３゛側に突出 したＸｈｏＩ部位を有するその相補的ストランド（下記配列）ＧυλμｃＡｃｃ ｍａΩ−３′（配列番号、７）Ｘｂａｌ を合成する。この配列は、７６３〜８２７番目のヌクレオチドのＥＭＣウィルス −リーダー配列に合致する。それは、ＥＭＣウィルスリーダー中の１０番目の位 置のＡＴＧをＡＴＴに変更し、ついで、Ｘｈｏ１部位を導入したものである。ｐ ＭＴ２１ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏｌ断片、ＥＭＣウィルスＥｃｏＲＩ−ＴａｑＩ断片 および６８ｂｐのオリゴヌクレオチドアダプターＴａｑｌ−ＸｈｏＩアダプター についての３種のライゲーションによりベクターｐＥＭＣ２β１を得る。

このベクターは、哺乳動物細胞における所望のｃＤＮＡの［接的高レベル発現に 適切に関連しているＳＶ４０複製開始点ならびにエンハンサ−、アデノウィルス 大後期プロモーター、アデノウィルス三分節リーダ配列の大部分のｃＤＮＡコピ ー、小さなハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアゾニレ−ジョンシグナルなら びにアデノウィルスＶＡ　Ｉ遺伝子、ＤＨＦＲならびにβ−ラクタマーゼマーカ ーおよびＥＭＣ配列を含んでいる。

ベクターの構築がＢＭＰ−９ＤＮＡ配列の修飾を包含してもよい。例えば、暗号 領域の５°および３°末端の非暗号ヌクレオチドを除去ることによりＢＭＰ−９ ｃＤＮＡを修飾できる。該欠失非暗号ヌクレオチドを、発現に有利であることが 知られている他の配列により置換してもよく、しなくてもよい。これらのベクタ ーを、ＢＭＰ−９蛋白発現のための適当な宿主細胞中に形質転換する。

当業者は、細菌の配列を伴う暗号配列の横にある哺乳動物の調節配列を除去ある いは置換することにより、図１または図３（配列番号：１および８）の配列を処 理し、細菌細胞による細胞内または細胞外発現用細菌ベクターを調製できる。

例えば、該暗号配列をさらに処理することができる（例えば、他の既知のリンカ −にライゲーションする、または他の知られた手法で、それより非暗号配列を除 去しあるいはその中のヌクレオチドを変更することにより修飾する）。ついで、 ティー・タニグチ（Ｔ、　Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ）ら、プロシーディンゲス・オス ・ナショナル・アカデミ−・オス・サイエンシズ・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、第７７巻、５２３０〜５２３３頁 （１９８０年）記載のごとき方法を用いて、既知の細菌ベクター中に該修飾した ＢＭＰ　９暗号配列を挿入できる。ついで、この代表的な細菌のベクターを細菌 宿主細胞中に形質転換し、それによりＢＭＰ−９蛋白を発現させることができる 。細菌細胞中のＢＭＰ−９蛋白を細胞外に発現させる方法に関しては、例えば、 欧州特許出願ＥＰＡ１７７．３４３号参照。

昆虫細胞における発現のための昆虫ベクターの構築のために、同様の処理を行う ことができる（例えば、公開された欧州特許出願１５５．４７６号記載の方法参 照）。酵母細胞による本発明因子の細胞内または細胞外発現のために、酵母の調 節配列を用いて酵母ベクターを構築することもできる（例えば、公開されたＰＣ Ｔ出願ＷＯ３６１００６３９号および欧州特許出願ＥＰＡ１２３，２８９号記載 の方法参照）。

哺乳動物における本発明ＢＭＰ−９蛋白の高レベルの生産方法は、異種のＢＭＰ −９遺伝子の多重コピーを有する細胞の構築を包含していてもよい。該異種遺伝 子は、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（Ｄ　ＨＦ　Ｒ）遺伝子のような増幅可 能なマーカーＩ；連結しており、そのマーカーに関しては、カウフマン（Ｋａｕ ｆｍａｎ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、ジャーナル・オス・モレキュラー・ バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　）、第１５９巻、６０１〜６２９頁（１９８２年）の方法に従い、 増加しつつある遺伝子のコピーを有する細胞を、メトトレキサン（ＭＴＸ）濃度 を増加させながら行う増殖に関して選択することができる。このアプローチを、 多くの異なる細胞形態に用いることができる。

例えば、その発現を可能ならしめている他のプラスミド配列と作動可能に連結し た本発明のＢＭＰ−９に関するＤＮＡ配列を有するプラスミドおよびＤＨＦＲ発 現プラスミドｐＡｄＡ２６ＳＶ　（Ａ）３　（カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）お よびシャープ（Ｓｈａｒｐ）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー （Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　）。

第２巻、１３０４頁（１９８２年））を、りん酸カルシウム共沈およびトランス フェクション、エレクトロポーレーションまたはプロトプラスト融合をはじめと する種々の方法により、ＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−ＢＩＩ中に同時 形質導入できる。ＤＨＦＲＨＦ形質転換体を、透析ウシ胎児血清を含有するアル ファ培地中での増殖に関して選択し、ついで、カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら 、モレキュラ−・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂ ｉｏｌ、　）、第５巻、１７５０頁（１９８３年）記載のごとく、ＭＴＸ　（例 えば、０．０２．　０．２．　１．０および５μＭと連続的段階で）濃度を増加 させていく場合の増殖による増幅に関して選択する。形質転換体をクローン化し 、生物学的に活性のあるＢＭＰ−９発現を、上記実施例ＩＩＩ記載のローゼン改 変サムバスーレディのラット・骨形成試験によりモニターする。ＢＭＰ−９発現 はＭＸＴ耐性レベルの上昇にともない増加するはずである。［Ｏ８］メチオニン またはシスティンによるパルスラベリングおよびポリアクリルアミドゲル電気泳 動のごとき当業者に知られた標準的手法を用いてＢＭＰ−９ポリペプチドを特徴 づける。同様の方法に従い、他の関連ＢＭＰ−９蛋白生産を行うことができる。

Ａ、ＢＭＰ−９ベクターの構築 本発明のヒト・ＢＭＰ−９蛋白を生産するために、ヒト・ＢＭＰ−９蛋白の成熟 領域をコードしているＤＮＡ配列を、ネズミ・ＢＭＰ−９蛋白のプロペプチド領 域をコードしているＤＮＡ配列に連結してもよい。このネズミ／ヒト・ハイブリ ッドＤＮＡ配列を適当な発現ベクター中に挿入し、慣用的遺伝子工学的手法によ り、動物細胞または他の好ましい真核または原核宿主中に導入する。このネズミ ／ヒト・ＢＭＰ−９を含む発現プラスミドの構築を以下に記載する。

１０５〜４７０番目のヌクレオチド配列からなるヒト・ＢＭＰ−９配列誘導体（ 配列番号　８）を特異的に増幅する。以下に示したオリゴヌクレオチドをプライ マーとして用いて上記クローンｐＧＥＭ−１１１由来のヒト・ＢＭＰ−９（配列 番号＝８）の１０５〜４７０番目のヌクレオチドを増幅する。この方法は、１０ ５番目のヌクレオチドのすぐ前のヌクレオチド配列ＡＴＣＧＧＧＣＣＣＣＴの挿 入および４７０番目のヌクレオチドのすぐ後のヌクレオチド配列ＧＡＡＴＴＣＧ ＣＴの挿入を生じさせる。これらの配列の付加は、特異的に増幅されるＤＮＡ断 片の個々の末端にＡｐａｌおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を生じ させる。得られた３７４ｂｐのＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ＡｐａＩおよびＥ ｃｏＲＩで消化したプラスミドベクターｐＧＥＭ−７Ｚｆ　（＋）（ブロゲマ（ Ｆ’ｒｏｇｅｍａ）社製、カタログ番号ｐ２２５１）中にサブクローニングする 。得られたクローンをｐｈＢＭＰ９ｍｅｘ−１と命名する。

ネズミ・ＢＭＰ−９配列（配列番号＝１）に基づいて以下に示したオリゴヌクレ オチド配列 ＃５ ＧＡＴＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧ’ｒＣＣＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧＴ ＣＴ八ＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＣＡＧＣＴにＴＧにＧＧＣＣ＃６ ＣＣＡＣＡＧＣ’ｌへＧＴＧＴ入ＴＣＣＡＴＣＴＡＧ入ＣＣＡＧＧＣＣＣＣＡＧ ＧＧＧＡＣ入ＴＧＧＴＧＧＴＣＧ入ＣＣを設計し、修飾して上述ネズミ／ヒト・ 発現プラスミドの構築を容易にする。これらのオリゴヌクレオチドは、互いに付 加すると該２つの個々の配列のアニーリングを容易にする相補的配列を含んでお り、下記のような合成二本鎖ＤＮＡリンカ−（ＬＩＮＫ−１と命名） を形成する。このＤＮＡリンカ−（ＬＩＮＫ−１）は、哺乳動物細胞発現系にお ける異種配列の最大発現のみならずネズミ／ヒト・発現プラスミドの構築に必要 なそれ以降の操作を容易にするのに必要な制限エンドヌクレアーゼの認識配列を 有している。より詳細には（ヌクレオチド＃５／ＬＩＮＫ−１の番号づけした配 列を参照）、１〜１１番目のヌクレオチドは制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩ および５ａｌＩ認識部位からなっており、１１〜１５番目のヌクレオチドは哺乳 動物細胞発現系において異種配列を最大発現させるものであり、１６〜３１番目 のヌクレオチドは、ネズミ・ＢＭＰ−９配列（配列番号＝１）の６１０〜６２５ 番目のヌクレオチドに対応しており、３２〜３３番目のヌクレオチドが２つの隣 接制限エンドヌクレアーゼ部位（ＥｃｏＯ１０９およびＸｂａｌ）の宵効な制限 的消化を容易ならしめるために挿入されている。３４〜６０番目のヌクレオチド は、合成ヌクレオチド＃５の５８番目のヌクレオチドが配列番号１の１５３９番 目にあるＡよりもむしろＧであることを除いては、ネズミ・ＢＭＰ−９配列（配 列番号：１）の１５１５〜１５４１番目のヌクレオチドに対応している。このヌ クレオチド変換は、コードすることが予期されるアミノ酸配列を変更することな く、ＡｐａＩ制限エンドヌクレアーゼ認識配列を生せしめ、さらなるネズミ／ヒ ト・ハイブリッド発現プラスミドの操作を容易ならしめる。ＬＩＮＫ−１（オリ ゴヌクレオチド＃５および＃６をアニーリングした二本鎖産物）を、制限エンド ヌクレアーゼＡｐａＩおよびＢａｍＨＩで消化したプラスミドベクターｐＧＥＭ −７Ｚｆ　（＋）中にサブクローニングする。これにより、通常はｐＧＥＭ−７ ２ｆ（＋）プラスミドポリリンカーのＡｐａＩおよびＢａｍＨＩ部位の間に存在 している配列が、上記ＬＩＮＫ−１配列に置き換わったプラスミドを得る。得ら れたプラスミドクローンをｐＢＭＰ−９１ｉ　ｎｋと命名する。

ｐＢＭＰ−９１ｉｎｋを、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂａＩで 消化し、ＬＩＮＫ−１の１〜３４番目のヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃５ の番号づけを参照）を除去する。クローンＭＬ１４ａは、配列番号＝１に示した 配列からなる挿入断片からなり、制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩおよびＸｂ ａＩで消化すると、配列番号・１（ネズミ・ＢＭＰ−９）の１〜１５１５番目の 配列が除去される。ネズミ・ＢＭＰ−９のこのＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ断片をＭＬ １４ａプラスミドクローンの残りの部分から単離し、上記のごとく合成リンカ− 配列を除去することにより生じたＢａｍＨＩ／Ｘｂａ　１部位中にサブクローニ ングする。得られたクローンをｐ３０２と命名する。

ｐ３０２クローンを制限エンドヌクレアーゼＥｃｏ○１０９Ｉで消化し、ネズミ ・ＢＭＰ−９配列（配列番号：１）の６２１〜１５１５番目のヌクレオチドおよ びＬＩＮＫ−１の３５〜５９番目のヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃５の番 号づけ参照）に対応するヌクレオチド配列を切形する。上記のごとくＡからＧへ の変換により作られたＡｐａＩ制限部位がＥｃｏＯ１０９Ｉ認識配列のサブセッ トであることに注意すべきである。それゆえ、ＥｃｏＯ１０９Ｉによるｐ３０２ の消化は、もともと存在するネズミのＥｃｏ○１０９１部位（配列番号：１の６ １９〜６２５番目に位置）のみならずＡｐａＩ部位をも開裂させ、上記配列から なる９２０ｂｐのＥｃｏＯ１０９Ｉ／Ｅｃｏ○１０９Ｉ（ＡｐａＩ）断片を切形 する。この９２０ｂｐのＥｃｏ０１０９Ｉ／ＥｃｏＯ１０９Ｉ（ＡｐａＩ）断片 を、ｐ３０２プラスミドクローンの残りの部分から単離し、同様にＥｃｏＯ１０ ９Ｉで消化したｐＢＭＰ−９１ｉｎｋ中にサブクローニングする。ＬＩＮＫ−１ の２つの隣接するＥｃｏＯ１０９ＩおよびＸｂａＩ制限部位の消化をより完全な ものにするために、ヌクレオチドＧＧ（オリゴヌクレオチド＃５の３２〜３３番 目）をはじめに作っておき、今度はこれをｐＢＭＰ−９ｌ　ｉｎｋの一部とし、 Ｄｃｍメチレーンヨン認識部位を生じさせることに注意すべきである。制限ヌク レアーゼＥｃｏＯ１０９１はＤｃｍメチレーションに感受性があり、それゆえ、 制限ヌクレアーゼＥｃｏＯ１０９Ｉによるこの配列（オリゴヌクレオチド＃５／ ＬＩＮＫ−１の２５〜３１番目のヌクレオチド）の開裂がこの部位において防止 される。

よって、プラスミドクローンｐＢＭＰ−９１ｉｎｋを、ＥｃｏＯ１０９Ｉ部位で はなくＡｐａ１部位において、上記のごとく制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＯ１ ０９Ｉで消化することにより開裂させ、ＬＩＮＫ−１のＥｃｏＯ１０９１とＸｂ ａＩ部位との間の配列（オリゴヌクレオチド＃５の番号づけにより定義された３ ２〜５５番目）の予期された除去を防止する。これにより、ｐＢＭＰ−９１ｉｎ ｋのＥｃｏＯ１０９Ｉ　（Ａｐａｌ）部位において、９２０ｂｐのＥｃ。

０１０９Ｉ／Ａｐａ　Ｉ断片の挿入が起こる。得られたクローンをｐ３１８と命 名する。

クローンｐ３１８を制限エンドヌクレアーゼ５ａｉｌおよびＡｐａＩで消化し、 ＬＩＮＫ−１の６〜５６番目のヌクレオチド（位置についてはオリゴヌクレオチ ド＃５参照）、ネズミ・ＢＭＰ−９（配列番号＝１）の６２１〜１５１５番目の ヌクレオチドおよびＬＩＮＫ−１（位置についてはオリゴヌクレオチド＃５参照 ）の３５〜６０番目のヌクレオチドからなる配列を切形する。得られた上記９７ ２ｂｐの５ａｉｌ／ＡｐａＩ断片を、ｐ３１８プラスミドクローンの残りの部分 から単離し、引き続いての操作に用いる。

ヒト・ＢＭＰ−９蛋白の全成熟領域およびそのプロペプチドをコードしているＤ ＮＡ配列を含むクローンｐｈＢＭＰ−９ｍｅｘ−１（上記）を、制限エンドヌク レアーゼＡｐａＩおよびＥｃｏＲｉで消化する。これにより、ヒト・ＢＭＰ−９ 配列（配列番号：８）の１０５〜４７０番目のヌクレオチドからなる３７４ｂｐ の断片と、制限エンドヌクレアーゼＡｐａｌならびにＥｃｏＲＩ認識配列を有す るオリゴヌクレオチドプライマー＃３および＃４のヌクレオチドとが切形される 。

この３７４ｂｐのＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩ断片を、ｐ３１８由来の９７２ｂｐの５ ａｌＩ／ＡｐａＩ断片（上記のごとく単離）に結合し、５ａｌＩおよびＥｃｏＲ Ｉで消化された哺乳動物細胞発現プラスミドｐＥＤ６　（ｐＥＭＣ２β１誘導体 ）に連結する。得られたクローンをｐ３２４と命名する。

クローンＭＬ１４ａ（ネズミ−ＢＭＰ−９）をＥｃｏＯ１０９ＩおよびＸｂａｌ で消化して、配列番号＝１の６２１〜１５１５番目のヌクレオチドからなる断片 を得る。

以下のオリゴヌクレオチドを自動ＤＮＡ合成装置にて合成して結合し、その相補 的配列を互いに塩基ペアーとしくアニーリングし）　、ＬＩＮＫ−２と命名され る合成二本鎖ＤＮＡリンカ− を得る。この合成二本鎖ＤＮＡリンカ−（ＬＩＮＫ−２）を、下記のようにして ５ａｌＩ（一方の末端）またはＥｃｏ○１０９１　（もう一方の末端）のどちら にも対応する一重鎖末端 を生じるようなやり方でアリ−リングする。

このＬＩＮＫ−２合成りＮＡクリンカを、上記ネズミ・ＢＭＰ−９（配列番号： １）の６２１〜１５１５番目のヌクレオチドからなる上記８９５ｂｐのＥｃｏＯ １０９Ｉ／ＸｂａＩ断片にライゲーションする。これにより、９１５ｂｐの５ａ ｌＩ／Ｘｂａｌ断片を得る。

りｏ−：ｚｐ３２４を５ａｌＩ／Ｘｂａｌで消化して、ＬＩＮＫ−１の６〜５６ 番目のヌクレオチドからなる配列（位置についてはオリゴヌクレオチド＃５参照 ）およびネズミ・ＢＭＰ−９（配列番号＝１）の６１２〜１５１５番目のヌクレ オチドからなる配列を除去する。Ｌ４ＮＫ−１の３５〜６０番目のヌクレオチド からなる配列（位置についてはオリゴヌクレオチド＃５参照）およびｐｈＢＭＰ −９ｍｅｘ−１由来の３７４ｂｐのＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩ断片（ヒトーＢＭＰ− ９配列）からなる配列はｐＥＤ６骨格に結合したままである。ＬＩＮＫ−２配列 およびネズミ・ＢＭＰ−９（配列番号＝１）の６２１〜１５１５番目のヌクレオ チドからなる該９１５ｂｐの５ａｌＩ／Ｘｂａｌ断片を、上記した５ａｌＩから ＸｂａＩまでの配列を除去したｐ３２４クローン中にライゲーションする。

得られたプラスミドをＢＭＰ９　ｆ　ｕ　ｓ　ｉ　ｏｎと命名する。該プラスミ ドは、ＬＩＮＫ−２、ネズミ・ＢＭＰ−９（配列番号、１）の６１２〜１５５１ 番目のヌクレオチド、ＬＩＮＫ−１の３５〜５９番目のヌクレオチドよりなる配 列（位置についてはオリゴヌクレオチド＃５参照）、および哺乳動物細胞発現ベ クターｐＥＤ６の５ａｌＩならびにＥｃｏＲ１部位の間に挿入されたクローンｐ 　ＢＭＰ９ｍｅｘ−１（上記）由来の３７４ｂｐのＡｐａＩ／ＥｃｏＲＩ断片か らナル。

ＢＭＰ９　ｆ　ｕ　ｓ　ｉ　ｏｎを、当業者に知られた標準的手法を用いてＣＨ Ｏ細胞中に形質導入し、ヒト・ＢＭＰ−９蛋白を発現できる安定な細胞系を造成 する。該細胞系を適当な培養条件下で培養し、ＢＭＰ−９蛋白を培養基から単離 、精製する。

実施例Ｖ 上記実施例ＩＶで得られた発現ＢＭＰ−９蛋白の生物学的活性を測定するために 、該蛋白を細胞培養基から回収し、他の汚染物質と同様に同時生成される他の蛋 白性物質からＢＭＰ−９蛋白を単離することにより精製する。該精製蛋白を、実 施例ＩＩＩ記載のラット・骨形成試験により分析してもよい。

当業者に知られた標準的な手法を用いて精製を行う。精製が、他のＢＭＰ蛋白に 関するのと同様に、ヘパリンセファ０−スの使用を包含していてもよいと考えら れる。

銀染色（アール・アール・オークリ−（Ｒ，Ｒ，０ａｋｌｅｙ）ら、アナリティ カル・バイオケミストリー（＾ｎａ１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、第１０５巻、３ ６１頁（１９８０年））と組み合わせた５ＤＳ−ＰＡＧＥアクリルアミド（ニー ・ケイ・ラエムリ（Ｕ、　Ｋ、　Ｌａｅｍｗｌｉ）。

ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）、第２２７巻、６８０頁（１９７０年））のごと き標準的手法およびイムノプロット（エイチ・トウビン（Ｈ，Ｔｏｖｂｉｎ）ら 、プロシーディンゲス・オス・ナショナル・アカデミ−・オス・サイエンシズ・ ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、第７６巻、４３５０頁（１９７９年））を用 いて、蛋白の分析を行う。

以上の記載は、本発明の好ましい具体例を詳説するものである。その実施におい て、当業者は、これらの記載を考慮して、多くの改変および変法を思い付くであ ろう。これらの改変および変法は、本明細書に付記した請求の範囲中に包含され ると確信する。

配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：ウォズニー、ジョン・エム（ｆｏｚｎｅｙ、　Ｊｏｈｎ　Ｍ、　 ）セレステ、アンソニー（Ｃｅｌｅｓｔｅ、　Ａｎｔｈｏｎｙ）（ｉ　ｉ）発明 の名称：ＢＭＰ−９組成物（ｉ　ｔ　ｉ）配列の数：９ （ｉｖ）連絡先： （Ａ）名称：ジエネティックス・インスティテユート・インコーホレイテッド（ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｉｎｃ、）（Ｂ）通り名：リーガル ・アフェアーズ（Ｌｅｇａｌ＾ｆｆａｉｒｓ）−ケンブリッジパーク・ドライブ （ＣａｍｂｒｉｄｇｅＰａｒｋ　Ｄｒｉｖｅ）　８７番（Ｃ）都市名：ケンブリ ッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ）（Ｄ）州名：マサチューセッツ州 （Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号：　０２１４０ （ｖ）コンピューター・リーダプル・フオーム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｒｅａｄａ ｂｌｅ　Ｆｏｒｕｍ）　＋（Ａ）媒体形態：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコンパチブル（Ｃ）オペレーティングシステ ム＝ＰＣ−ＤＯ８／ＭＳ−ＤＯ８（Ｄ）　ソフトウェア：パテントイン−リリー ス（ＰａｔｅｎｔＩｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ）　＃　１．　Ｏ。

バージョン＃１．２５ （ｖｉ）現在の出願データ： （Ａ）出願番号：ＵＳ （Ｂ）受理臼： （Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名：カピノス、エレン・ジエイ（Ｃａｐｉｎｏｓ、Ｅｌｌｅｎ　Ｊ）（ Ｂ）登録番号：３２，２４５ （Ｃ）代理人等における処理番号：ＧＩ　５１８６Ａ（ｉｘ）テレコミュニケー ションの情報：（Ａ）電話番号：　（６１７）８７６−１１７０（Ｂ）ファック ス番号：　（６１７）８７６−５８５１（２）配列番号＝１に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：　２４４７塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類＋ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ（ｉ　ｉ　ｉｌｌハイポセテ ィカル配列：なしくｉｖ）アンチセンス：なし くｖ　ｉ）起源： （Ａ）生物名：ハツカネズミ（Ｍｕｓ　ａ＋ｕｓｃｕｌｕｓ）（Ｂ）株名・Ｃ５ ７Ｂ４６ｘＣＢＡ （Ｆ）組織の種類：肝臓 （ｖｉｉ）直接の起源： （Ａ）ライブラリー：マウス・肝臓ｃＤＮＡ（Ｂ）クローン：ＭＬ１４Ａ （ｖｊｉｉ）ゲノム内での位置： （Ｃ）単位・塩基対 （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）存在位ｆｆ１Ｆ：１５６ ４．．１８９３（ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤ５ ＣＢ）存在位置：６１０．．１８９６ （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ｍＲＮＡ （Ｂ）存在位置：１．．２４４７ （Ｘｌ）配列の記載：配列番号：１ 里人ｒ　（ｌ入ｅ　ａｃｅ　’＋ｙｘ’ｒ　ａｈａ　’＋ｗ　ＡＡＡ　ｏｅａ　 ｗ！’ｓｅ　！ＩＣ！ＩＣｅｅ入τｆｆｌ　ＧＯＴ　ＧＡ？@１７０４ 学ＭＰ　１１１１　？Ｆ　Ｏｌｕ　ａｙｓ　Ｌｙ８　ＧＩＹ　ＱＬＹ　ａｙｓ　 ｐｈｔ　ｐｈｔ　ｔａ　ｕｎ　心ｌ即３６　４０　４！＋ （２）配列番号・２に関する情報 （１）配列の特徴； （Ａ）配列の長さ；４２８アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロン−直鎖状 （１１）配列の種類：蛋白 （ｘｌ）配列の記載：配列番号：２ Ｈａｔ　１ｉａｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＡＬａ　Ｐｈａ　碑Ｖａｎ　ＡｌａＬａｕ 　ＩＡｕ　酬シｌｕ　席＠　ＩＡｕ　Ｌａｕ−３１８−３！−コ’Ｊ、０−３０ ５ Ｖａｔ　ＣＹｍ　ＶＬＬ　ηＷＧｉｎ　Ｇｌｕｔ　ＴＪｆ＠　力℃−ｕ　Ｇ謙Ａ ｊｔｌ　ｔｌＧ：Ｌｕ　Ｇｉｎ　Ｊｉ！ａ　５ａｒ−３００−２５１！！　−２ ９０ Ｐｒ６　ＧＩＹ　Ｇｌｕ　Ａｊｎ　ＡＬａ　社ａ　Ｂａｒ　ｓａｒ　−ｕ　Ｇ１ ７　ｚａｕ　Ｂａｒ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ−２８Ｂ　−２８０−２ ７５ Ｐｈ＠　ｘＡｕ　Ａｒｇｗａｒ　シｕ　Ａｊｎ　−ｕ　ｇａｒ　ｃ１ｙ工１ｍ　 １？ｍ　ｌＪｗ　Ｇｉｎ　Ａｇｐ　Ｌｙｍ　Ｔｈｘに１Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ 　Ｐｒｏ　ＧＩＲＴ２ＣＫ＠ｔ　Ｈｌｓ　ａｍｐシｖｓ　’ｊ’ｙ　Ａｓｎ　ｈ ｘｑ　’Ｐｙ−Ｔｂｘ−２３５−２３Ｏ−２２５ ｋ　ＪＩＪｐ　Ｌ７ｇ　ｓａｒ　ｅａｒ　Ｔｈｒ　Ｘ’ＴＯＰｉｌａ　ｓａｒ　 Ａｓｎ　ｎ＠　Ｖａｔ　ｋηｓａｒ　）ｈ＠　５ａ？−２２０−２Ｌ５　−４Ｌ Ｏ Ｖ＆１Ｇｌｕ　ＪＩＪＰ　Ａｉａ工１＠　ｓａｒ　ＴｂＸ　Ｊｕａ　Ｊｕｔ　鵞 すＧｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｐｈａ　ＧｌｎＴｈｒ　ｋηＡＬａ　Ｇｌ ｕ　ｋｕ　Ａｒｇ　ｕｕ　Ｔｙ　Ｖａｎ　ｊａｒ　Ｃｙｍ　Ｇ３ｘ　Ｍｎ　Ａｓ ｐ　Ｖａｎ　ｕｐ−１フＯ−１６５−工６０ ８ｍ１：ａヨＨ１ｓ　Ｇｌｙ−ｕ　ＧＬｕ　Ｇｌｙ　Ｓ駁Ｍａｔ　Ｖａｌ　Ｖａ １５ＴＡｓｐ　Ｖａｎ　−ｕ　Ｇｌｕ人ｇｐ　ｌｉ＠ｒ　Ｇｌｕ　Ｔｂｒ　Ｔｒ ｐ　Ａｇｐ　Ｇｉｎ　入１ａ　’１ｌｈｒ　ａｌｙ　Ｔｂｒ　Ｌｙｇ　Ｔｂｒ　 ｐｈｅ　Ｌａｕ　魔≠■ −１４０−１１５−１コロ ８ｅｗ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　工１ａ　入ｒｇ　入Ｓｐ　ＧＬｕ　ＧＬｙ　’Ｉ’ｒ ｐ　ＧＬｕ　’ｊ’ｈｒ　Ｌａｕ　ｃｘｕ　Ｖａｌ　５ｓｌ秩@５ａｒ 人１ａ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　入１ａ　Ａｓｐ　 Ｂａｒ　Ｔｂｒ　Ｔｂｒ　入ｓｎ　Ｌｙｓ　入ｓｎ　Ｌｙｓ−１１０−Ｌｏｇ　 −Ｗｏｏ　−９５ Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｂａｒ　１（ｉｓ　入ｒｇ 　Ｇｌｕ　Ｓｉｒ　Ｃｙｓ　入＊ｐ　Ｔｈｒ　ｂａｕ　入５■ 工ｉｎ　ｓｉｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇａｙ　Ｂａｒ　Ｌｙｅ　Ａｓｎ　 Ｌａｕ　ｐｒｏ　Ｐｈａ　Ｐｈａ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ＰｈａＳａｒ　Ａｓｎ　Ａ ｓｐ　Ａｒｇ　Ｂａｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｘ、ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　 人ｒｑ　Ｌａｕ　ＧＬｕ　論ｕ　ＬｙｓＧｌｕ　Ｍ＠ｔ　工ｌａ　Ｇｌｙ　Ｈｉ ｓ　Ｇｌｕ　ＧｌｎＧｌｕ　Ｔｈｒ　Ｍ＠ｔ　Ｌ＋ｅｕ　Ｖａｌ　ｒ、、ｙｓ　 Ｔｈｒ　入１ａ　Ｌ凾■ 人ｓｎ　Ａ１ａ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｓａｒ　 Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｃ１ｙ　Ｌａｕ　Ａｓｐ−コ０−２５−２Ｏ −１５ ５１Ｙ　Ａｌａ　８ｇ　１ｉａｒ　ＩＬＬｓ　ＣＹＩＩ　ａｍ　１４ｇ　＝ｇａ ｒ　ｒｘｕ　Ｊ　Ｖａｎ　ａｎアｈａ　ＧＬｕ、　ＩＱ　Ｌ５ ＴＹ’ｒ　ＧＬｕ　ＣＹ＠　Ｌｙｅ　ＧｌｙＧｌｙＣ’ｊｍ　Ｐｈａ　Ｐｈａ　 Ｐｒｏ−ｕ川、　Ａ、Ｐ　４　Ｖａｎ　’ｒｈｒコＳ　４Ｑ　４５　５０ 諒ｌビｂｙｓ　Ｈｌｓ　ｕａ　ｕｓ　Ｖｄ　ＧＬｎ　Ｔｂｒ　ｋｎ　Ｗａｎ　Ｋ Ｍ　ｍ　ＧＬｕ　Ｐｈｓ　ＰａＴｈｒ　Ｌｙｇ　ＶａＬ　Ｇ１’ｆ　Ｌｙｇ　Ａ ｌａ　Ｃ７６Ｃｏｇ　ｖａｌ　ｐｒｏ　ＴｋＬｔ　ｚｙｇ　−ｕ　６ａｒ　ｐｒ ｏ　１１ｓ（２）配列番号：３に関する情報 （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１９５４塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数−二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：ｍＲＮＡ１二対するｃＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセテイカル 配列：なしくＡ）生物名：ヒト（Ｈｏａ＋ｏ　５ａｐｉｅｎｓ）（Ｇ）細胞型、 骨肉腫細胞系 （Ｈ）細胞系：Ｕ−２０Ｓ （ｖｉｉ）直接の起源： （Ａ）ライブラリー：ラムダ　ｇｔｌｏ中のり一２０Ｓ　ｃＤＮＡ（Ｂ）クロー ン：ラムダ　Ｕ−２Ｏ３−３（ｖ　ｉ　ｉ　ｉ）ゲノム内での位置。

（Ｃ）単位：塩基対 （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ＣＤ５ ＣＢ）存在位置：４０３．．１６２９ （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｃｌｅ（Ｂ）存在位置＋１２７９． ．１６２６（ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号＋ｍＲＮＡ 、（Ｂ）存在位置：９．．１９３４ （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝３ （２）配列番号：４に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・４０８アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー；直鎖状 （ｉ　ｊ）配列の種類・蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４ Ｍ自ｔ　エユａ　）ｒ。

−２，２−、、Ｇｌｙ　ＡＪ１２１　Ａｒｇ　Ｍａｔ　Ｚａｕ　Ｐｒａｔ　Ｖａ ｌ　ｈユ　ム。ｕ　ｂｕ　Ｃｙｓ　Ｇｈ　Ｍａｌ−−２Ｂ５　−２８０ Ａｒｇ　０ａ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ｋｒｑＸ＊ｒ　Ｐｈａ　Ｈｌｓ　Ｈｌ ｓ　Ｇｌｕ　ｃｚｕ　Ｈｌｓ　Ｌａｕ　Ｃ１ｕ　Ａｇｎλｒｑ　ｘｘ＊　ａｇｎ 　Ｈ＊　ｙ　ａｉｕ　ｖＩＬＬ　）ｋｔ　ｐｙｌ　！’ｗ　Ｐｇ　Ａｈ　ＧＬｕ 　ｖａｌ　ｖａｌ　’１？ｘ。

−Ｌｌ！Ｊ　−１１０−１０５ Ｇｌｙ　Ｉｕｓ−ｎａ　伽嬌Ｌａｕ　−碑Ｔｈｒ　ｈＺ’ｑ−”Ｆ社ＩＬＩＪ− −一λｏｏ　−ｓｓ　−９０ ８Ｓ Ｖｕ　Ｔｂｘ　Ａｒｇ　’ｊｒｐ　Ｏｌｕ　！ｊｈｒ　Ｐｈ嘴Ｗａｎ　ｒｊｕＸ ’ｍ　Ａｌａ　Ｗｄ　−鞠−Ｔｈｒ　ｈｘｇ　Ｇｌｕ　４ｓ　Ｇｉｎ　Ｐｒ。Ａ ｍ　箪！ＡＮ　Ｌａｕ　Ａｌａ　’Ｘｌ＊　ａＬｕ　Ｍａｌ−１＋６５ ＋５５ ｍｕ　Ｈｌｇ　Ｇｍ　’Ｂｗ　碑ｅｒｒＨｂ　Ｇｈ　Ｇｌｙ　Ｇｋ　論Ｙａｋ　 ＪＬｒｇ　ｎｔ　８ｗ−ｈｘｇ８釘＝　２７０　Ｇｉｎ　ａｌｙ　ｇａｒ　Ｇｌ ｙＡｇｎ　噂Ａｌａ　Ｇｉｎ　拠鞠士６−−−コＯ Ｖｄ　Ｔｈｒ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　！Ｅｌｓ　ｊｕｐ　Ｇｌｙｋｇ　Ｇ１３’Ｊｕ ｇ　Ａｌａ　ｋｎｋ　ｋｇ　Ａｒｇ　鞠−２０＋工５ ＋５ 嬌Ｉｑａ碑Ｂｙ社晴Ｇシー輪Ｇｉｎ鞠真鞠駒が５１　、　、。

Ａｓｎ　１Ｙ１１　Ａｓｎ　Ｃｙｇ　Ａｒｇ　ＪＬｒｇ　肛ｇ　Ｂａｒ　−ｕ　 箪Ｖａｌ　墳Ｐｈａ　！ｉｅｒ　Ａｓｐ　￥ａｌユ５　２０　２Ｍ ＧＩＹ　ＴｒｐＭｎ　ｋｓｐ　’ｈｐ工１爆Ｖａｎ　ｕａ　Ｘｋｒｏ　Ｐｒｏ　 Ｇｌｙ　歌Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｐｈ龜’ｔ’ｙｚ−コ０　コ５　４゜ Ｑｙａ　１１１＊　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｃｙｇ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　−ｕ　 Ａｌａ　Ａｇｐ　Ｈｌｔｓ　ｋｕ　Ａｓｎ　鹸皺５０　５”Ｊ　６Ｑ （２）配列番号：５に関する情報 （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・１５塩基対 （Ｂ）配列の型、核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載、配列番号 ：５ ＣＡＴＧＧＧＣＡＧｅ　ＴＣＧＡＣ （２）配列番号：６に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：３４塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数、二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （１１）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号 　６ ＣＴＧＱＡＧＧＣにＡ　ＧＣＣ％ＡＡｒＫＱ　ＣＴＣＧＡＧＣ（Ｊ’！’　（： Ａ’ｊＧ　３４（２）配列番号・７に関する情報 （］）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ・６８塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数　二本鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖状 （１１）配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ（ｘｉ）配列の記載：配列番号 ニア （２）配列番号＝８に関する情報 （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・４７０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ｊ　Ｄ配列の種順二ＤＮＡ　（ゲノム）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセティヵル配列 ：なしくＶ）フラグメント型：ｃ末端フラグメント（ｖｉ）起源： （Ａ）生物名：ヒト（ｌｌｏｉｏ　ｓａｐｉｅｎｓ）（Ｈ）ｍＰａ系：Ｗ１３８ 　Ｃ’ｆ）　ムＤＮＡ）（ｖｉｉ）！接の起源： （Ａ）ライブラリｍ：ヒト・ゲノム （Ｂ）クローン：ラムダ　１１１−１ （ｖｊｊｉ）ゲノム内での位置： （Ｃ）単位：塩基対 （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：　ｅｘｏｎ （Ｂ）存在位置：　１．、４７’０ （ＩＸ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置＋１．．４５６ （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ｍａｔ　ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｂ）存在位置：１２４．．４ ５３ （ｉｘ）配列の特徴 （Ａ）特徴を表す記号：ｍＲＮＡ （Ｂ）存在位置：１．．４７０ （Ｘｌ）配列の記載二配列番号：８ （２）配列番号、９に関する情報 （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ：１５１アミノ酸 （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・直鎖状 （ｉ　ｉ）配列の種類：蛋白 （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝９ ”　Ｔｈｒ　社ｅＪ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　ｓａｒ　−ｇａｒ　ＣＹＩＩ　ｐｒｏ　 ｈＸ’ｑ　シＡｌａ　Ｐ２℃Ｇｉｎ　ｘｒｇＧｉｎ　ｖｅＬＬ　λｒｑ　、Ａｌ ａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ入Ｍ人ｑ”ｎｓｘ　入Ｍ　＆ｔ　Ａｌａ　ＨＬｍ　Ｍａｌ　 入１ａＡ工ａ−２５−２Ｑ　→ｊ　−１０ Ｃｙａ　Ｇｉｎ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　Ｓａｒ　ｕｕ　Ａｒｇ　Ｖａｎ　Ａｓｎ　Ｐ ｈａ　Ｇｌｕ　ｕｐ　二＊　Ｇａｙ　’ｌ’ｒｐ　Ｊｕｍｐｌｏ　１５　２０ Ｓ・ｒＴｒｐエエ・工１４１　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　力５ＧＬｕ　 Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｑｙｓ　Ｌｙａ　Ｇｌｙ２５　コ０　コ５ ａｘｙ　ｃｙｇ　Ｐｈａ　Ｐｈａ　ｐｒｏ　Ｌａｕ　入１ａ入ｊｐ五ｓｐ　Ｖａ ｌ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　！！Ｈｌｓ　Ａｌａ工１ｍ　Ｍａｌ　Ｇ ｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌ＠ｕ　ＶａＩ　Ｈｌｓ　Ｉａｕ　Ｌｙｅ　Ｐｈａ　Ｐｒｏ　Ｔ ｈｒ　Ｌｙｓ　Ｍａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｙｇ６０　６５　フ０ Ｊｕａ　Ｃｙｇ　Ｃｙｓ　Ｖａｎ　Ｐｒｏ　ｒｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ｓａｒ　 Ｐｒｏ工１ａ　ｇａｒ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　？ｉ　Ｌｙｇ７５　ｇｏ　８５ λｇｐ　Ａ！Ｉｐ　Ｍａｔ　Ｇｌｙ　Ｍａｌ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｌｙｇ 　Ｔｙｒ　Ｈｌｓ　ＴｙＩｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｍａｔ　５≠■ ９０　夕５　１０゜ Ｆｉｇｕｒｅ　ＩＡ 負ｇｕｒｅ　ＩＢ ８４３　８５２　８６１　８７０　Ｉ＋７９　８８８薫面茫刀匡ゑ茫蔦瑠＝弯茫 改■δ！画ジ２　ＡＴＣ巧でか２預ジ茫譚に１ＧＸＱＤＫＴＲＡＥＰＰＱＹＭ　 工　ＤＬＹＮＲ８９７９０６９１５９２４９３コ　９４２ジでτＩ双ヨか茫ＭＡ 五石苦巧ξテ改茫弘茫薫富茫面面匠刊モ匠Ｙ’ｌ’ＴＤＫＳＳＴＰＡＳＮＩＶＲ ５Ｆ！９５１　９６０　９６９　９フ８　９８７　９９６Ｇ’ｌ’Ｇ　Ｇ五人　 ＧＡ丁　ＧＣＴ　入ＴＡ　ＴＣＣＡＣＡ　ＧＣＴ　ＧＣＣＡＣＧ　ＧＡＧ　ＣＡ ＣＴｒＣＣＣＣＴＴＴ　ＣＡＣＪＩＡf　ＣＡＣ ＶＥＤｋＸＳＴｋｋＴＺＤＦＰＦＱＫＨ１００５１０４４１０２コ　１０２ｍ　 １０４１　１０５ＧＡＴＣＣＴＣＡＴＣ’！ＴＣＪＬＡＣＡＴＣＴＣＣＡＴＣＣ ＣＧ　ＡＧＧ　ＣＡＣＣＡＧ　ＣＡＧ　ＡＴＣＡＣＣＡＧＧ　ＧＯＴ　ＣＡＣ工 　Ｌ　Ｘ　Ｆ　Ｎ　Ｉ　Ｓ　Ｘ　Ｐ　ＲＨＥ　Ｑ　Ｉ　Ｔ　ＲＡ　Ｅ１０５９　 １０６Ｂ　１０７７　１０８６　１０９５　工１０４ＣＴＣＣＧ入　ＣＴＣＴＡ Ｔ　ＧＴＣＴＣＣＴＧＣＣ五人λ入Ｔ　ＧＡ？　Ｇテｃ　ＧＡＣ丁ＣＣ入Ｃ？Ｃ 入Ｔ　ＧＧＧ　ＣＴＣＧλ入ＬＲＩ、ＹＶＳＣＱＮＤＶＤ５ＴＨＧＬＥ１工ｌコ 　１１２２　ｕ３１　１１４０　１１４９　１１５１１１１６フ　１１フロ　１ １８５　１１９４　１２０コ　１２１２１２７５　１２８４　１２９コ　１コ０ ２　１コ１１　１３２０Ｆｉｇｕｒｅ　ＬＣ ｌコ８コ　１コ９２　Ｌ４１　１４１０　１４１９　工４２８云だ蔚（Ｊ、Ｃ石 茫双茫）ご改２茫茫ＡＡＧ薫双茫ＡＧＡ己面に己蔚画ｋ（ＳＮＤＲ５ＮＧＴＫＥ ＴＲＬＥＬＫ！Ｍ１４ユフ　１４４ｇ　１４５５　１４６４　１４７１　１４１ １２ＡＴＣＧＧＣＣ入τ　Ｇ＾ＧＣ＾ＧＧ入Ｇ　入ＱＣ入？’Ｇ　Ｃｆｉ　ＧＴ Ｇ　五人Ｇ　λＣ入　ＧＣＣ五人入　λ入ＴＧＣ？　丁λＣＣ入f ＩＧＩ！！！ＱＥＴＭＬＶＫＴＡＫＮＡＹＱ１４９１　１５００　１５０９　１ ５１８　１５２７　１５コロ５τ玩■＆テシＺ双茫ｃｐｘａ石ｄ万ｄ石ＧＧＴ　 Ｃ’ｌデδπ改Ｎ　ＴＡＧ双■改汗面を瑠■ＶＡＧＥＳＱＥ！：ＥＧＬＤＧＹ’ ｒＡＶＧ１５４５　１５５４　１５６コ　１５）２　１５８１　１５９０ＡＣＴ 　’ｒＣＴ　ＣＴＣＬＧＧ　ＣＴＧ　ＡＡＣＴＴＴ　ＧＡＧ　にＡＣＡＴＣＧＧ ＣＴＧＧ　ＧＡＣＡＧＣＴＧＧ　ＡＴＣ入ＴＴ　ＧＣ■ Ｔ５ＬＲＶＮＦＥＤ、ＩＧＷＤＳＷエエ入Ｌ６５３　Ｌ６６’：Ａ　１６７１　 １６８０　１６１１９　１６９８１７０フ　Ｌ７Ｌ６　１７２５　Ｌ７３４　１ ７４）　ｌフッ２ＧＡＴ　ＧＡＧ　ＧＴＧ　ｋでＸＣＣＣＡＣＣＡＡＡ　ＣＡＴ 　ＧＣＣＡＴＣＧＴＧ　ＣＡＧ　ＡＣＣＣＴＧ　ＧＡＧ　（ＪＴ　ＣＴＣＧＡf ＤＤＶ　τ　ＰＴＫＨＡＩＶＱＴ’ＬＶＨＬ！１７６１　１７７０　エフ）９　 １７１１８　１７９７　１１１０６芒ミ双五℃ズｄモミフズ面し遅番ξ研で巧か ｄ刊で石だに聞ｙｐ　フ　ＫＶＧＫＡＣＣＶＰＴＫＬ５Ｐ１１８１５　１８２４ 　１８ココ　１Ｂ４２　１８５１　１１１６０ＴＣＣＡＴＣＣＴＣ：λＣＡＡＧ 　ＧＡＴ　ＧＡＣＡＴＧ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　ＣＣＡ　ＡＣＣＣ’ＴＣ入ＡＧ　Ｔ ＡＣＣＡＣＴＡＴ　ＧＡＧＳＸＬ’ｉＫＤＤＭＧＶＰＴＬＫＹＨＹ　ΣＦｉｇｕ ｒｅ　ＩＤ Ｆｉｇｕｒｅ　２ Ｆｉｇｕｒｅ　ＺＡ Ｆｉｇｕｒｅ四 １６６６　１６７６　１６８６　１５９６　１フ０６　１７１６　１７２６ＡＴ ＡＴＡ（ＪＣＡＣＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ　ＣＡＣＣＡＣＡＴＡＣＡ（：ＣＡｅＡ ＣＡＣＡ　ＣＡＣＧＴＴＣＣＣＡ　ＴＣＣＡＣＴＣＡＣbＣＡＣＡ（ＪＣ’ｒＡ Ｃ Ｆｉｇｕｒｅ　３ 一一−＾−−、＠ＰＣＴ／ｕｓ　９２１０５３７４フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　５／１０ １５／１２　ＺＮＡ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） Ｉ

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. １．図３（配列番号：９）に示す８〜１１０番目のアミノ酸配列からなるＢＭＰ −９ポリペプチド。
2. ２．図３（配列番号：９）に示す１〜１１０番目のアミノ酸配列からなるＢＭＰ −９ポリペプチド。
3. ３．各サブユニットが少なくとも図３（配列番号：９）の８〜１１０番目のアミ ノ酸配列からなる二量体である請求項１記載のＢＭＰ−９ポリベプチド。
4. ４．各サブユニットが少なくとも図３（配列番号：９）の１〜１１０番目のアミ ノ酸配列からなる二量体である請求項１記載のＢＭＰ−９ポリペプチド。
5. ５．（ａ）図３（配列番号：８）に示す１２４〜４５３番目のヌクレオチド配列 からなるｃＤＮＡで形質転換された細胞を培養すること；および（ｂ）図３（配 列番号：９）に示す１〜１１０番目のアミノ酸配列からなる蛋白を該培養基から 回収、精製することからなる段階により製造される精製ＢＭＰ−９蛋白。
6. ６．（ａ）図３（配列番号：８）に示す１２４〜４５３番目のヌクレオチド配列 からなるｃＤＮＡで形質転換された細胞を培養すること；および（ｂ）図３（配 列番号：９）に示す８〜１１０番目のアミノ酸配列からなる蛋白を該培養基から 回収し精製することからなる段階により製造される精製ＢＭＰ−９蛋白。
7. ７．軟骨および／または骨の形成を誘導する能力により特徴づけられるＢＭＰ− ９蛋白。
8. ８．ＢＭＰ−９蛋白をコードしているＤＮＡ配列。
9. ９．（ａ）１２４〜４５３番目のヌクレオチド（配列番号：８）；および（ｂ） 上記配列（ａ）と緊縮ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、軟骨 および／または骨を形成させる能力を発揮する配列からなる請求項８記載のＤＮ Ａ配列。
10. １０．（ａ）１４５〜４５３番目のヌクレオチド（配列舌号：８）；および（ｂ ）上記配列（ａ）と緊縮ハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、軟 骨および／または骨を形成させる能力を発揮する配列からなる請求項８記載のＤ ＮＡ配列。
11. １１．ＢＭＰ−８をコードしているＤＮＡ配列で形質転換された宿主細胞。
12. １２．（ａ）ＢＭＰ−９蛋白をコードしているヌクレオチド配列からなるｃＤＮ Ａで形質転換された細胞を培養すること；および（ｂ）該ＢＭＰ−９蛋白を該培 養基から回収し精製することの段階からなる精製ＢＭＰ−９蛋白の製法。
13. １３．医薬上許容される担体との混合物となっている有効量のＢＭＰ−９蛋白か らなる医薬組成物。
14. １４．さらに該組成物を支持し、骨および／または軟骨の成長のための表面を提 供するためのマトリックスからなる請求項１３記載の組成物。
15. １５．該マトリックスが、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン、ポリ乳酸および りん酸三カルシウムからなる群より選択される物質よりなる請求項１４記載の該 組成物。
16. １６．請求項１３記載の組成物の有効量を患者に投与することからなる骨および ／または軟骨の形成誘導を必要とする患者における骨および／または軟骨の形成 誘導方法。
17. １７．医薬上許容される担体中のＢＭＰ−９蛋白の有効量からなる傷の治療およ び組織の修復のための医薬組成物。
18. １８．請求項１７記載の組成物の有効量を患者に投与することからなる傷の治療 および／または組織の修復を必要とする患者における傷の治療および／または組 織の修復方法。