JPH0659237B2 - β―ガラクトシダーゼの酵素反応性を高める方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はβ−ガラクトシダーゼの酵素的反応性を高める
方法並びに、β−ガラクトシダーゼ及びβ−ガラクトシ
ダーゼにより変換されうる基質を含有するテストキット
に関する。

［従来の技術］ β−ガラクトシダーゼは、免疫学的試験法で使用される
慣用のマーカー酵素である。しかしながら、多くの場合
に、このような試験法の実施のためにはかなりの測定時
間が必要であり、これは、例えば事故後の迅速に実施す
べき測定の場合かつ医学上の緊急事態において、治療上
必要な手段の開始の生命に危険な遅延をもたらしうる。
従って、この反応時間を短縮する必要性は大きい。

更に、このような免疫学的試験法に必要な抗体は−大
抵、きわめて経費のかかる方法を用いてのみ製造でき、
従って、同様に、このような試験に必要な抗体量をでき
るだけ少なくすることが試みられている。しかしなが
ら、抗体量を減少させると、酵素−免疫−試験における
マーカー酵素も少なくなるから、検出反応の感度も低下
する。

他方、このような免疫学的試験法の感度を高めることに
よって、被検物質の量を少なく使用することもできる。
このことは、特に、限られた量のみの被検物質が提供さ
れ、それで多くの分析検査を行なうべき場合に重要であ
る。

［発明が解決しようとする課題］ 従って、本発明は、先に記載の欠点を克服し、高い感度
の試験法を提供することを課題とする。

［課題を解決するための手段］ この課題は、本発明により、β−ガラクトシダーゼの酵
素的反応性を高める方法により解決され、これは、反応
混合物に、アジド、ローダニド、シアネート及び／又は
チオスルフエートの塩を添加することを特徴とする。即
ち、意外にも、このような塩の添加により、β−ガラク
トシダーゼの酵素的反応性が促進され、これが、この酵
素を使用するような酵素的試験法の感度を高めることが
明らかになった。前記の促進性塩を用いて達成されるβ
−ガラクトシダーゼ反応の酵素反応性の上昇、殊にこの
酵素の加水分解活性の上昇は、特に意想外である。それ
というのも、他のヒドロラーゼ例えばグルコシダーゼ又
はアルカリ性ホスフアターゼは、この促進性塩の同じ量
（β−Ｇａ１−検出に対し）の使用の際にも促進され
ず、むしろ僅かに抑制されるからである。

これら促進性塩のうち、チオホスフエート−、シアネー
ト−及びローダニド塩が有利である。それというのも、
これらは少量で本発明による作用効果をもたらすからで
ある。特に好適な範囲は０．５〜１０ｍモル／であ
る。より多い添加量は更に改良をもたらすわけではな
い。０．８〜５ｍモル／１が有利である。アジドで
は、好適な範囲は５０〜２００ｍモル／である。ここ
でも、より高い濃度は有効であるが、より良好なわけで
はない。８０〜１５０ｍモル／を使用するのが有利で
ある。これらの塩中に存在するカチオンの種類は、本発
明による作用効果を高めるためには重要ではない。しか
しながら、通例生化学的反応で存在するカチオンである
リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネ
シウム及びアンモニウムを使用するのが好適であると立
証された。

本発明の方法では、β−ガラクトシダーゼ分解のため
に、通例当業者に公知の基質が使用される。殊に、分光
法で測定可能であるか又は放射性の基１個を有するよう
な基質を使用するのが有利である。基質としては、レゾ
ルフイン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、クロルフエノ
ールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、２−ニトロ
フエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及び／又は２−
クロル−４−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド並びに２−シアノ−４−ニトロフエニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシド及び２−トリフルオロメチル−４−
ニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（西ドイ
ツ特許出願第Ｐ４０２１０６３．４号により製造）を使
用するのが有利であると立証された。

意外にも、β−ガラクトシダーゼの酵素的反応性の本発
明による上昇は、できるだけ少量の酵素を使用する際に
最も顕著に現れ、従って、促進剤なしでは基質は極めて
ゆっくり分解さる。最後に、この促進性塩の添加は、こ
の基質の非酵素的加水分解をもたらさず、従って、本発
明の作用効果は、背景反応（Hintergrundrea-ktion）に
よって惹起されるのではないし又は、それにより重ねら
れるのではないことも明かになっている。

マーカー酵素としてβ−ガラクトシダーゼ、β−ガラク
トシダーゼにより変換される基質、並びにアジド−、ロ
ーダニド−、シアネート−及び／又はチオスルフエート
塩の形の促進剤を含有するテストキットも本発明の目的
物である。

［実施例］ 次の例で本発明を詳述する。

例１ 基質としての２−クロル−４−ニトロフエニル−β−Ｄ
−ガラクトピラノシド（ＣＮＰＧ）を用いるβ−ガラク
トシダーゼの測定 試薬： 緩衝液Ｉ中のＣＮＰＧ０．１ｍモル／ 緩衝液Ｉ： 燐酸カリウム緩衝剤、pH7.0 0.05モル／ 塩化マグネシウム 0.16mモル／ 試料： 「β−ガラクトシダーゼ（３７℃で基質としての２−ニ
トロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼとの特異活性
約６００Ｕ／mg蛋白質、ＥＣ３．２．１．２３，Boehri
nger Mannheim GmbH社製、製品 No．７４５７３１）。

測定の実施は、試薬及び試料を、場合により促進剤の添
加のもとに、緩衝液Ｉ中で一緒にし、４０５ｎｍでの吸
光度の時間的経過を測定する方法で行なう。結果を第１
表、第２表、第３表、第３ａ表及び第３ｂ表に示す。

例２ 基質としてレゾルフイン−β−ガラクトシドを用いるβ
−ガラクトシターゼの測定 試薬：緩衝液Ｉ中のＲＧ０．０４ｍモル／ 測定の実施は例１の記載と同様に行なう。

結果を第４表〜第６表に示す。

例３ 基質としてのクロルフエニールレッド−β−ガラクトシ
ド（ＣＯＧ）を用いるβ−ガラクトシダーゼの測定 試薬：緩衝液Ｉ中のＣＰＧ０．１ｍモル／ 測定の実施は例１の記載と同様に行なう。

結果を第７表、第８表及び第９表に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マルチナ・ユニウス―コマー ドイツ連邦共和国イツフエルドルフ・ア ム・ボーデン バツハ ５

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】β−ガラクトシダーゼの酵素反応性を高め
   るために、反応混合物にアジド、ローダニド、シアネー
   ト及び／又はチオスルフエートを添加することを特徴と
   するβ−ガラクトシダーゼの酵素反応性を高める方法。
2. 【請求項２】リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシ
   ウム、マグネシウム及び／又はＮＨ_４−塩を添加する、
   請求項１記載の方法。
3. 【請求項３】β−ガラクトシダーゼ基質として、レゾル
   フイン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、クロルフエノー
   ルレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド、２−ニトロフ
   エニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド及び／又は２−ク
   ロル−４−ニトロフエニル−β−Ｄ−ガレクトピラノシ
   ドを使用する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 【請求項４】β−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダ
   ーゼで変換されうる基質及びアジド、ローダニド、シア
   ネート及び／又はチオスルフエート塩を含有するテスト
   キット。