JPH0671439B2

JPH0671439B2 - コレステロ−ル分析要素

Info

Publication number: JPH0671439B2
Application number: JP11114087A
Authority: JP
Inventors: 文規新井
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1986-05-09
Filing date: 1987-05-07
Publication date: 1994-09-14
Anticipated expiration: 2009-09-14
Also published as: JPS63119697A

Description

【発明の詳細な説明】［利用分野］血液等の生物体液その他の液体試料中に含まれるコレス
テロールを定量する分析要素に関する。

［解決しようとする技術課題］コレステロールを定量分析する有用な方法として、例え
ばコレステロールオキシダーゼの存在下にコレステロー
ルを酸化し生ずる過酸化水素又はコレステノンを定量す
る方法が特公昭54−8318号（出願人：ナショナルリサ
ーチアンドディベロプメントコーポレイション）
で知られている。

また結合コレステロールを含めた総コレステロールの定
量に適用するために、この方法をコレステロールエステ
ラーゼによるコレステロールの遊離と組みあわせること
も、米国特許3,925,164号（ベーリンガー・マンハイム
社）によって知られている。上記方法はコレステロール
から生じるコレステノンとH₂O₂のいずれかを公知の方法
で定量するものである。H₂O₂を定量するにはトラインダ
ー試薬が有用であるが、共存するビリルビンが分析結果
に誤差を与える。このビリルビンの干渉を防ぐ方法とし
て、フェロシアン塩を共存させることが、米国特許4,29
1,121号（マイルズ・ラバラトリーズ社）で知られてい
るが、コレステロールエステラーゼ、コレステロールオ
キシダーゼ、ペルオキシダーゼ及びトラインダー試薬
（または類似の過酸化水素検出試薬系）を含む乾式分析
要素にフェロシアン塩を含有させると、分析要素の保存
安定性を著しく損なわれることが判明した。

本発明の目的は、コレステロールエステラーゼ、コレス
テロールオキシダーゼ、ペルオシダーゼ及びトラインダ
ー試薬を含む乾式分析要素に比べて実用的に劣らないコ
レスロール分析感度を有し、かつ保存安定性の良好なコ
レステロール分析要素を提供することである。

本発明の上記目的は、少なくとも一つの液体透過性かつ
液体保持性の層から成る乾式液体分析要素であって、コ
レステロールエステラーゼまたはリパーゼと、デオキシ
コール酸またはその塩と、コレステロールデヒドロゲナ
ーゼとをそれぞれ該層の少なくとも一つに含み、該層の
少なくとも一つは多孔性液体展開層である、液体中のコ
レステロールを定量するための分析要素（コレステロー
ルエステラーゼまたはリパーゼを含む層，デオキシコー
ル酸又はその塩を含む層、コレステロールデヒドロゲナ
ーゼを含む層は同じ層でも互いに異なる層でもよい）に
よって達成された。

本発明の前記目的は、また多孔性液体展開層にリパー
ゼ、デオキシコール酸又はその塩、コレステロールデヒ
ドロゲナーゼのいずれか少なくとも一つを含むことを特
徴とする前記（少なくとも一つの液体透過性かつ液体保
持性の層にリパーゼ、デオキシコール酸又はその塩、コ
レステロールデヒドロゲナーゼを含む）コレステロール
定量用分析要素によって、より好ましく達成された。

本発明に用いられるコレステロールエステラーゼは、種
々の起源のものを用いることができる。すなわち、動物
臓器から得られたものでもよいし、微生物（例えば米国
特許3,925,164号に記載されたカンジダルゴサ、アクチ
ノミセス属、ストレプトミセス属、ペニシリウム属等）
から得られらものでもよい。

本発明に用いられるリパーゼは、種々の起源のものを用
いることができるが、特にChromobacterium viscosumか
ら得られたものが有用である。

本発明においてはデオキシコール酸デ又はデオキシコー
ル酸の塩が用いられる。デオキシコール酸の塩としては
ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等を用いること
ができる。デオキシコール酸のかわりにコール酸、リト
コール酸、ケノデオキシコール酸、タウロコール酸、グ
リコール酸、タウロデオキシコール酸、グリコデオキシ
コール酸及びこれらのナトリウム塩、カリウム塩、リチ
ウム塩等を用いることができる。

本発明に用いられるコレステロールデヒドロゲナーゼ
は、種々の起源のものを用いることができるが、Nocard
ia属のバクテリアから得られたものなどが有用である。

本発明の分析要素においては、コロステロールエステラ
ーゼまたはリパーゼおよびデオキシコール酸またはその
塩の作用下に遊離のコレステロールが生成し、コレステ
ロールデヒドロゲナーゼの作用下にコレステロールから
コレステノンが生成する。この際、NADまたはNADPを共
存させると、NADHまたはNADPHが生成するので、生成し
たNADHまたはNADPHを定量することにより、コレステロ
ールを定量することができる。

NADHまたはNADPHを定量する方法としては、電子伝達剤
の存在下に電子受容性の色素前駆体から可視域に吸収ス
ペクトルを有するフォルマザン染料を形成させる比色分
析法が、特開昭49−11395号等で知られている。この反
応系を用いれば可視域の分光測光によりNADHまたはNADP
Hの定量ができる。

電子伝達剤としては、ヂアホラーゼ、N-methyl phenazo
nium methosulfate等を用いることができる。

フォルマザン染料前駆体としては、INTすなわち２−（p
-iodophenyl）−３−（p-nitrophenyl）−５−phenylte
trazolium chloride、BTすなわち3,3′−（3,3′−dime
thoxy−4,4′−biphenylene）−bis［2,5−diphenyltet
rzolium chloride］、3,3′−（4,4′−biphenylen）−
bis［2,5−diphenyltetrazolium chloride］等を用いる
こともできるが、ニトロテトラゾリウムブルー（NTBま
たはNBT）すなわち3,3′−3,3′−dimethoxy−4,4′−b
iphenylene）−bis［２−（p-nitrophenyl）−５−phen
yltetrazolium chloride］が好ましい。

本発明の要素に用いられる試薬組成物の各成分の要素中
の含有量（要素1m²当たり被覆量）は次の通りである。

コレステロールエステラーゼ；約500〜50000IU、好ましくは約1000〜30000IU リパーゼ；約5000〜300000IU 好ましくは10000〜200000IU デオキシコール酸又はその塩；約0.2〜10g 好ましくは0.5〜5g （デオキシコール酸のかわりに用いられる酸又は塩の場
合も同量）コレステロールデヒドロゲナーゼ;200〜30000 IU、好ましくは300〜2000IU NADまたはNADP;約10mg〜50g、好ましくは30mg〜20g 電子伝達剤;1〜1000mg、好ましくは５〜500mg ジアホラーゼの場合500〜20000IU、好ましくは700〜10000IU フォルマザン染料前駆体；約5mg〜10g、好ましくは 25
mg〜5g 本発明は公知の多種の乾式分析要素に適用することが出
来る。特に検出試薬系と被検液がいずれも透過し得る固
体担体を含む要素に適用することが出来る。要素は光透
過性・液不透過性の支持体上に、多孔性液体展開層のほ
かに下塗り層、吸水層、接着層、反応試薬層、光遮蔽
層、濾過層、および公知のその他の層を有する多孔構造
であってもよい。このような分析要素は例えば、米国特
許第3,992,158号および特開昭55−164356号に記載され
ている。

支持体を用いる場合、本発明の分析要素の実用的に採り
うる構成は（１）支持体上に液体展開層を有するもの。支持体と液
体展開層の間に吸水層を有してもよい。

（２）支持体上に試薬層、液体展開層をこの順に有する
もの。支持体と試薬層の間に吸水層を有してもよい。こ
の場合、コレステロールエステラーゼまたはリパーゼは
液体展開層または試薬層に含まれるが、液体展開層に含
まれるのが好ましい。

（３）支持体上に第二試薬層、第一試薬層、液体展開層
をこの順に有するもの。支持体と第二試薬層の間に吸水
層を有してもよい。この場合、コレステロールエステラ
ーゼまたはリパーゼは液体展開層、第二試薬層または第
一試薬層に含まれるが、第一試薬層または液体展開層に
含まれるのが好ましい。

（４）支持体上に試薬層、光遮へい層、液体展開層をこ
の順に有するもの。支持体と試薬層の間に吸水層を有し
てもよい。この場合、コレステロールエステラーゼまた
はリパーゼは液体展開層または試薬層に含まれるが、液
体展開層に含まれるのが好ましい。

（５）支持体上に第二試薬層、光遮蔽層、第一試薬層、
液体展開層をこの順に有するもの。支持体と第二試薬層
の間に給水層を有してもよい。この場合、コレステロー
ルエステラーゼまたはリパーゼは液体展開層、第二試薬
層または第一試薬層に含まれるが、第一試薬層または液
体展開層に含まれるのが好ましい。

上記（１）ないし（５）の態様において吸水層と試薬層
または液体展開層の間、試薬層と液体展開層の間、第二
試薬層と第一試薬層の間、または光遮蔽層と試薬層もし
くは液体展開層の間に、過層を設けてもよい。

本発明の乾式分析要素に用いることができる光透過性・
水不透過性支持体の例としては、ポリエチレンテレフタ
レート、ビスフェノールＡのポリカルボネート、ポリス
チレン、セルロースエステル（例、セルローストリアセ
テート、セルロースアセテートプロピオネート等）等の
ポリマーからなる厚さ約50μｍから約1mm、好ましくは
約80μｍから約300μｍの範囲のフイルムもしくはシー
ト状の透明支持体をあけることができる。

これら支持体の表面には必要により下塗層を設けて、支
持体の上に設けられる検出層あるいはその他の層と支持
体との接着を強固なものにすることができる。また、下
塗層の代りに、支持体の表面に物理的（たとえばグロー
放電、コロナ放電）あるいは化学的な活性化処理を施し
て接着力の向上を図ってもよい。

本発明の分析要素には、光透過性・水不透過性支持体の
上に（場合によっては下塗層等の他の層を介して）吸水
層を設けることができる。吸水層は一般に、被検成分の
存在下で生成する色素が実質的に拡散しない層で、水を
吸収して膨潤する親水性ポリマーから成る。吸水層に用
いられる親水性ポリマーは、一般には水吸収時の膨潤率
が30℃で約1.5から約20、好ましくは約2.5から15の範囲
の天然または合成親水性ポリマーである。例として、ゼ
ラチン（例、アルカリ処理ゼラチン、酸処理ゼラチン、
脱イオンゼラチン等）、ゼラチン誘導体（例、フタル化
ゼラチン等）アガロース、ポリアクリルアミド、ポリビ
ニルアルコール、ポリビニルピロリドン等をあげること
ができる。

吸水層の乾燥時の厚さは通常約１μｍから約100μｍの
範囲、好ましくは約３μｍから30μｍの範囲である。吸
水層には、必要に応じて界面活性剤（カチオン性、アニ
オン性、両性、又は非イオン性）や緩衝剤を含有させる
こともできる。

本発明の分析要素には、光透過性・水不透過性支持体の
上に（場合によっては下塗層等の他の層を介して）検出
層を設けることができる。検出層は一般に、被検成分の
存在下で生成する色素が拡散し、光透過性支持体を通し
て光学的に検出され得る層である。検出層は、吸水層と
同種の親水性ポリマーにより構成することができる。検
出層には、硬膜剤、界面活性剤（カトン性、アニオン
性、両性、又は非イオン性）、緩衝剤、光遮蔽性（反射
性または吸収性）微粒子を必要に応じて含有させること
ができる。

吸水層、光遮蔽層、過層、試薬層等の層の上には、展
層を接着し積層するための接着層を設けてもよい。接着
層は水で湿潤しているとき、または水を含んで膨潤した
ときに展開層を接着することができるような親水性ポリ
マーからなることが好ましい。接着層に用いることがで
きる親水性ポリマーの例としては、吸水層に用いられる
と同様な親水性ポリマーがあげられる。これらのうちゼ
ラチン、ゼラチン誘導体、ポリアクリルアミド等が好ま
しい。接着層の乾燥膜厚は一般に約0.5μｍから約20μ
ｍ、好ましくは約１μｍから約10μｍの範囲である。接
着層は親水性ポリマーと、必要によって加えられる界面
活性剤等を含む水溶液を公知の方法で、試薬層等の上に
塗布する方法により設けることができる。

本発明の分析要素の試薬層その他の層に含有させること
ができる緩衝剤の例としては、炭酸塩、ホウ酸塩、燐酸
塩やBiochemistry誌第５巻（第２号）、467ページよ
り477ページ（1966年）に記載されているグッド（Goo
d）の緩衝剤などがある。これらの緩衝剤は『蛋白質・
酵素の基礎実験法』（堀尾武一、他著、南江堂、1981
年）等の公知文献を参考にして選択し、使用することが
できる。

光遮蔽層は、親水性ポリマーをバインダーとして、光反
射性微粒子が分散されている水浸透性の層であることが
好ましい。光反射性微粒子は、試薬層（または吸水層）
に生じた検出可能な変化（色変化、発色等）を光透過性
を有する支持体側から反射側光にする際に、展開層に点
着供給された水性液体の色、特に試料が全血である場合
のヘモグロビンの赤色等を遮蔽するとともに光反射層ま
たは背景層としても機能する。光反射性を有する微粒子
の例としては、顔料微粒子たとえば二酸化チタン微粒子
（ルチル型、アナターゼ型またはブルッカイト型の、粒
子径が約0.1μｍから約1.2μｍの微結晶粒子等）、硫酸
バリウム微粒子等を挙げることができる。好ましいのは
ルチル型二酸化チタン微粒子である。

親水性ポリマーバインダーの例としては、前述の吸水層
に用いられる種類の親水性ポリのほか、弱親水性の再生
セルロース等を挙げることができる。これらのうちゼラ
チン、ポリアクリルアミド等が好ましい。なおゼラチ
ン、ゼラチン誘導体には公知の硬膜剤を添加することが
できる。

光遮蔽層は、光遮蔽性微粒子と親水性ポリマーとの水性
分散液を公知の方法により吸水層、試薬層等の上に塗布
し乾燥することにり設けることができる。本発明の分析
要素には、必要に応じ展開層中にも上記のごとき光遮蔽
性微粒子を含有させてもよい。

展開層は、液体計量作用を有する展開層であるとが好ま
しい。液体計量作用を有するとは、その表面に点着供給
された液体試料を、その中に含有している部分を実質的
に偏在させることなく、層の面方向に単位面積当りほぼ
一定量の割合で広げる作用を有することである。

展開層のマトリックスを構成する材料としては、紙、
不織布、織物生地（例えばブロード等の平織等）、編物
生地（例、トリコット編、ダブルトリコット編等）、ブ
ラッシュポリマーより形成されるメンブランフイルタ
ー、あるいはポリマーミクロビーズ等がらなる三次元格
子状構造物等を用いることができる。これらのうちで
は、織物生地および編物生地に代表される繊維質層が好
ましい。これらの詳細については特開昭55−164356号、
同57−66359号および同60−222769号を参照すればよ
い。

本発明の分析要素に用いる織物生地または編物生地は水
洗等の脱脂処理により糸、織物あるいは編物の製造時等
に付着した油脂類が実質的に除去されていることが好ま
しい。

本発明で製造される一体型多層分析要素は、一辺約15mm
から約30mmの正方形またはほぼ同サイズ円形等の小片に
裁断し、特開昭57−63452号、特開昭54−156079号、実
開昭56−125424号、実開昭55−32350号および特表昭58
−501144号公報等に開示のスライド枠等に納めて分析ス
ライドとして用いるのが製造、包装、輸送、保存および
測定操作等の全ての観点で好ましい。

本発明で製造される乾式分析要素は、約５μｌから約30
μｌ、好ましくは約８μｌから約15μｌの水性液体試料
を展開層に点着供給し、必要に応じて約20℃から約45
℃、好ましくは35℃から40℃の範囲の実質的に一定の温
度でインキュベーションする。その後、一方の側から
（一体型多層分析要素においては光透過性支持体側か
ら）乾式分折要素内の色変化、発色等の検出可能な変化
を反射測光し比色法の原理により液体試料中の測定対象
成分を分析する。

以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明す
る。

［実施例１］下塗りされている厚さ180μｍのポリエチレンテレフタ
レート無色透明平滑フィルム上に下記の組成（a₀）の水
溶液を、乾燥膜厚から15μｍになるよう塗布し、乾燥し
た（発色層）。

（a₀）アルカリ処理ゼラチン 12g 界面活性剤（オリン社 Surfactant 10G） 0.1g NAD 0.8g ジアホラーゼ 2800IU NTB（＊） 0.2g 水 95ml ＊3,3′−（3,3′−dimethoxy−4,4′−biphenylene）
−bis［２−（p-nitrophenyl）−５−phenyl−2H tetra
zolium chloride］次に上記発色層上に、下記の組成（b₀）の水溶液を乾燥
膜厚が７μｍになるよう塗布し、乾燥した（光遮へい
層）（b₀）アルカリ処理ゼラチン 14g ルチル型酸化チタン 70g 水 100ml 上記光遮へい層上に、ゼラチン水溶液を乾燥膜厚が２μ
ｍになるよう塗布し、乾燥した。

上記ゼラチン層上に約30g/m²の割合で水を全面に供給し
て湿潤させた後、グロー放電により親水化したポリエス
テル製トリコット編み物（厚さ0.25mm）を，軽く圧力を
かけながらラミネートし、乾燥して接着させた（展開
層）。

次にこの布（展開層）上に、下記の組成（d₀）の懸濁液
を200cc/m²の割合でほぼ均一に塗布し、乾燥させ、コレ
ステロール定量用一体型多層分析要素を作製した。

（d₀）エタノール 500ml ポリビニルピロリドン（10％エタノール溶液） 18g ポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（ｎ＝40） 6g ２−アミノ−２−エチル−1,3−プロパンジオール 11g ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（ｎ＝1
0） 3g デオキシコール酸ナトリウム 7g 上記エタノール溶液に下記酵素液を添加し、懸濁させ
た。

リパーゼ（＊） 15000U コレステロールデヒドロゲナーゼ 5000U 水 5ml ＊Chromobacterium viscosumから産生こうして完成した分析用フィルムを15×15mmの正方形に
切断し、プラスチック製マウントに収めて、コレステロ
ール定量用分析スライドを完成した。

コレステロール濃度の異なる人血漿10μｌを分析スライ
ドに点着し、37℃で６分間保った後、波長600nmで、支
持体側から反射光学濃度を測定した。その結果を第１表
に示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】少なくとも一つの液体透過性かつ液体保持
性の層から成る乾式液体分析要素であって、コレステロ
ールエステラーゼまたはリパーゼと、デオキシコール酸
またはその塩と、コレステロールデヒドロゲナーゼとを
それぞれ該層の少なくとも一つに含み、該層の少なくと
も一つは多孔性液体展開層である、液体中のコレステロ
ールを定量するための分析要素（コレステロールエステ
ラーゼまたはリパーゼを含む層，デオキシコール酸又は
その塩を含む層、コレステロールデヒドロゲナーゼを含
む層は同じ層でも互いに異なる層でもよい）。
【請求項２】多孔性液体展開層にコレステロールエステ
ラーゼを含むことを特徴とする特許請求の範囲１に記載
の分析要素。
【請求項３】多孔性液体展開層にリパーゼを含むことを
特徴とする特許請求の範囲１に記載の分析要素。
【請求項４】多孔性液体展開層にChromobacterium visc
osumから得られたリパーゼを含むことを特徴とする特許
請求の範囲１に記載の分析要素。
【請求項５】多孔性液体展開層にコレステロールデヒド
ロゲナーゼを含むことを特徴とする特許請求の範囲１に
記載の分析要素。
【請求項６】多孔性液体展開層にデオキシコール酸又は
その塩を含むことを特徴とする特許請求の範囲１に記載
の分析要素。
【請求項７】多孔性液体展開層にリパーゼ及びデオキシ
コール酸又はその塩を含むことを特徴とする特許請求の
範囲１に記載の分析要素。
【請求項８】多孔性液体展開層にリパーゼ、デオキシコ
ール酸又はその塩およびコレステロールデヒドロゲナー
ゼを含むことを特徴とする特許請求の範囲１に記載の分
析要素。
【請求項９】多孔性液体展開層にChromobacterium visc
osumから得られたリパーゼを含むことを特徴とする特許
請求の範囲７又は８に記載の分析要素。