JPH0672149B2 - 芳香族置換グリコシド - Google Patents
芳香族置換グリコシドInfo
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- JPH0672149B2 JPH0672149B2 JP62250840A JP25084087A JPH0672149B2 JP H0672149 B2 JPH0672149 B2 JP H0672149B2 JP 62250840 A JP62250840 A JP 62250840A JP 25084087 A JP25084087 A JP 25084087A JP H0672149 B2 JPH0672149 B2 JP H0672149B2
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- amylase
- formula
- substituent
- azide
- chloro
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
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- C07H15/20—Carbocyclic rings
- C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
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- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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- C12Q1/40—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving amylase
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- C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
-
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- C12Q2334/10—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases p-Nitrophenol derivatives
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Description
【発明の詳細な説明】 〔発明の背景〕 発明の技術分野 本発明は、芳香香族置換グリコシド、そしてより詳細に
は、α−アミラーゼを直接測定するための基質として有
用であるようなグリコシドに関する。また本発明は、そ
れら基質および関連のグリコシドの改良された合成方法
にも関する。
は、α−アミラーゼを直接測定するための基質として有
用であるようなグリコシドに関する。また本発明は、そ
れら基質および関連のグリコシドの改良された合成方法
にも関する。
従来技術の説明 臨床化学においても最も広く研究され受け入れられてい
る手順の一つに、膵臓病の診断に用いられる血清および
尿中α−アミラーゼ測定がある。
る手順の一つに、膵臓病の診断に用いられる血清および
尿中α−アミラーゼ測定がある。
過去25年の間に、臨床検査室において用いるための様々
なアミラーゼ測定法が開発されてきている。それら方法
のうちのあるもの、すなわち、サツカロジエニツク法、
は複雑な手法を伴うためそれらのルーチン使用が妨げら
れている。その他の方法、すなわち濁度測定および粘度
測定によるα−アミラーゼ活性測定方法は、血清中に存
在する他の因子により相当程度影響され得る基質の物性
変化に依存する。今日、最も汎用されているα−アミラ
ーゼ測定法の一つはデンプン−沃素法である。この方法
では基質の特定の一部が測定されるに過ぎず、また基質
飽和条件下では酵素は働かない。。更に、血清タンパク
の存在によりデンプン−沃素反応が干渉される可能性も
ある。
なアミラーゼ測定法が開発されてきている。それら方法
のうちのあるもの、すなわち、サツカロジエニツク法、
は複雑な手法を伴うためそれらのルーチン使用が妨げら
れている。その他の方法、すなわち濁度測定および粘度
測定によるα−アミラーゼ活性測定方法は、血清中に存
在する他の因子により相当程度影響され得る基質の物性
変化に依存する。今日、最も汎用されているα−アミラ
ーゼ測定法の一つはデンプン−沃素法である。この方法
では基質の特定の一部が測定されるに過ぎず、また基質
飽和条件下では酵素は働かない。。更に、血清タンパク
の存在によりデンプン−沃素反応が干渉される可能性も
ある。
以上の前述の方法に伴う難点のほかに、前述の方法はど
ちらかというと限られた範囲のα−アミラーゼ活性の測
定に用い得るのみであるという問題もある。更にまた、
それら方法の一部は、正常より低いまたは極めて高まつ
たα−アミラーゼレベルの正確な測定には用いることが
できない。
ちらかというと限られた範囲のα−アミラーゼ活性の測
定に用い得るのみであるという問題もある。更にまた、
それら方法の一部は、正常より低いまたは極めて高まつ
たα−アミラーゼレベルの正確な測定には用いることが
できない。
ニトロ芳香族グリコシドより成る合成基質がα−アミラ
ーゼ測定に用いられている（米国特許第4,145,527号参
照）。α−アミラーゼは内部（endo）結合に優先的に作
用してより小さな断片を形成し、従つて発色団（chromo
phore）、例えばニトロフエノールを発生させるための
完全な作用を得るには付加的な支援酵素を用いなければ
ならない。
ーゼ測定に用いられている（米国特許第4,145,527号参
照）。α−アミラーゼは内部（endo）結合に優先的に作
用してより小さな断片を形成し、従つて発色団（chromo
phore）、例えばニトロフエノールを発生させるための
完全な作用を得るには付加的な支援酵素を用いなければ
ならない。
付加的な支援酵素を用いることなく芳香族グリコシドを
直接使用することも報告されているが、これによつて得
られる結果は、反応速度（kinetics）が低いおよび／ま
たは色の放出速度が低いために実用的でないことが分つ
ている。
直接使用することも報告されているが、これによつて得
られる結果は、反応速度（kinetics）が低いおよび／ま
たは色の放出速度が低いために実用的でないことが分つ
ている。
合成基質の関与するアツセイが報告されており（Natur
e,182（1958）525〜526）、そこではマルトースのｐ−
ニトロフエノール誘導体が用いられる。このｐ−ニトロ
フエノールはマルトースのアノマーヒドロキシル基にと
つて代わる。アミラーゼにより基質は分裂を受けて、41
0nmでモニターできるｐ−ニトロフエノールを生成す
る。しかしながら、このアツセイは16時間を要し、また
マルターゼによつても基質が分裂してしまう。この点に
ついて、Wallenfels,et.al.,Carbohydrate Research,6
1,359（1978）には４−（ｐ）−ニトロフエニル−α−
マルトリオースを膵α−アミラーゼ直接アツセイ用基質
として用いることも報告された。さらにWallenfels,et,
al,Fresenius Z.Anal.Chem.,301,169（1980）には、２
−（ｏ）−ニトロフエニル−α−アルトトリオシドの使
用も報告された。しかしながら、これらの基質も前述の
理由から臨床アツセイに用いるには非実用的であること
が分つている。Wallenfels,et,al.,supra（前掲書），6
1,359（1978）にはグリコシルドナーとしてα−シクロ
デキストリン、グルコシルアクセプターとしてｐ−ニト
ロフエニル−α−グルコシドおよび酵素剤としてクレブ
シエラニユモニエ（Klebsiella pneumoniae）シクログ
ルカノトランスフエラーゼを用いた酵素的変換によるｐ
−ニトロフエニル−α−マルトオリゴサツカライドの同
族混合物の合成も記載された。同様に、L.M.Hall,米国
特許第4,225,672号はバチルス（Bacillus）属菌株から
のシクログルカノトランスフエラーゼを用いた芳香族置
換−α−マルトオリゴサツカライドの調製を報告してい
る。これらの方法は、ポリマー鎖中に典型的には２〜14
個、そして時にはそれ以上の、グルコース単位を有する
マルトシド混合物を与え、従つて、所望のマルトシドお
よびマルトトリオシドを得るには面倒な分離技術を必要
とし、そして一般的に収率も低い。マルトオリゴサツカ
ライドの混合物の複雑さを減じて主に低級なマルトオリ
ゴサツカライド、例えばα−マルトシド、マルトトリシ
ドおよびマルトテトラオシドを含むものとするために多
重的グルコース単位を有するポリマー、例えば５個また
はそれ以上のかかる単位を有するものの非還元末端に作
用するホスホリラーゼ・クラスのトリミング酵素が用い
られている（例えば、Wallenfels,et.al.,西独特許出願
公開第2752501号明細書参照）。今般、シクログルカノ
トランスフエラーゼ混合物の化合物数を取扱い可能な水
準にまで減じそして所望の低級マルトオリゴサツカライ
ドの、特にニトロフエニル−およびクロロニトロフエニ
ルマルトシドおよび−マルトトリオシドへの分離を容易
にするには、高級マルトシドをアミラーゼクラスの酵素
でトリムした方が効率的でありコスト的に効果的である
ことが見出された。
e,182（1958）525〜526）、そこではマルトースのｐ−
ニトロフエノール誘導体が用いられる。このｐ−ニトロ
フエノールはマルトースのアノマーヒドロキシル基にと
つて代わる。アミラーゼにより基質は分裂を受けて、41
0nmでモニターできるｐ−ニトロフエノールを生成す
る。しかしながら、このアツセイは16時間を要し、また
マルターゼによつても基質が分裂してしまう。この点に
ついて、Wallenfels,et.al.,Carbohydrate Research,6
1,359（1978）には４−（ｐ）−ニトロフエニル−α−
マルトリオースを膵α−アミラーゼ直接アツセイ用基質
として用いることも報告された。さらにWallenfels,et,
al,Fresenius Z.Anal.Chem.,301,169（1980）には、２
−（ｏ）−ニトロフエニル−α−アルトトリオシドの使
用も報告された。しかしながら、これらの基質も前述の
理由から臨床アツセイに用いるには非実用的であること
が分つている。Wallenfels,et,al.,supra（前掲書），6
1,359（1978）にはグリコシルドナーとしてα−シクロ
デキストリン、グルコシルアクセプターとしてｐ−ニト
ロフエニル−α−グルコシドおよび酵素剤としてクレブ
シエラニユモニエ（Klebsiella pneumoniae）シクログ
ルカノトランスフエラーゼを用いた酵素的変換によるｐ
−ニトロフエニル−α−マルトオリゴサツカライドの同
族混合物の合成も記載された。同様に、L.M.Hall,米国
特許第4,225,672号はバチルス（Bacillus）属菌株から
のシクログルカノトランスフエラーゼを用いた芳香族置
換−α−マルトオリゴサツカライドの調製を報告してい
る。これらの方法は、ポリマー鎖中に典型的には２〜14
個、そして時にはそれ以上の、グルコース単位を有する
マルトシド混合物を与え、従つて、所望のマルトシドお
よびマルトトリオシドを得るには面倒な分離技術を必要
とし、そして一般的に収率も低い。マルトオリゴサツカ
ライドの混合物の複雑さを減じて主に低級なマルトオリ
ゴサツカライド、例えばα−マルトシド、マルトトリシ
ドおよびマルトテトラオシドを含むものとするために多
重的グルコース単位を有するポリマー、例えば５個また
はそれ以上のかかる単位を有するものの非還元末端に作
用するホスホリラーゼ・クラスのトリミング酵素が用い
られている（例えば、Wallenfels,et.al.,西独特許出願
公開第2752501号明細書参照）。今般、シクログルカノ
トランスフエラーゼ混合物の化合物数を取扱い可能な水
準にまで減じそして所望の低級マルトオリゴサツカライ
ドの、特にニトロフエニル−およびクロロニトロフエニ
ルマルトシドおよび−マルトトリオシドへの分離を容易
にするには、高級マルトシドをアミラーゼクラスの酵素
でトリムした方が効率的でありコスト的に効果的である
ことが見出された。
本発明による基質および方法は、（１）本発明の基質は
α−アミラーゼの作用によつて直接分解（分裂）を受け
て所望の発色団基を生じることからα−アミラーゼ分析
を行うのに付加的な支援酵素を必要としない；および
（２）反応速度が好適であり、使い勝手のよい色放出速
度が得られるという２点の組合せにより従来技術よりも
優れたものである。
α−アミラーゼの作用によつて直接分解（分裂）を受け
て所望の発色団基を生じることからα−アミラーゼ分析
を行うのに付加的な支援酵素を必要としない；および
（２）反応速度が好適であり、使い勝手のよい色放出速
度が得られるという２点の組合せにより従来技術よりも
優れたものである。
例えば、本発明の２−クロロ−４−ニトロフエニル−α
−マルトトリオシドは、アミラーゼアツセイのための至
適条件下に従来の基質４−ニトロフエニル−α−マルト
トリオシドよりも10倍速く加水分解されることが分つ
た。更に、本発明の発色原はアミラーゼアツセイのため
の至適pHにおけるモル吸光係数が比較的高いことからモ
ノ置換ニトロフエノールよりも改良されたスペクトル特
性を有することが分つた。また、アジ化水素（トリアゾ
酸）およびそのアルカリ金属およびアルカリ土類金属
は、発色原部分の主発色団のモル吸光度に影響すること
なくα−アミラーゼによる本発明のマルトオリゴサツカ
ライドの加水分解速度を高めることも分つた。すなわ
ち、アジ化ナトリウムおよびアジ化リチウムはα−アミ
ラーゼを活性化し、そして膵および唾液α−アミラーゼ
の酵素誘導加水分解を促進する。
−マルトトリオシドは、アミラーゼアツセイのための至
適条件下に従来の基質４−ニトロフエニル−α−マルト
トリオシドよりも10倍速く加水分解されることが分つ
た。更に、本発明の発色原はアミラーゼアツセイのため
の至適pHにおけるモル吸光係数が比較的高いことからモ
ノ置換ニトロフエノールよりも改良されたスペクトル特
性を有することが分つた。また、アジ化水素（トリアゾ
酸）およびそのアルカリ金属およびアルカリ土類金属
は、発色原部分の主発色団のモル吸光度に影響すること
なくα−アミラーゼによる本発明のマルトオリゴサツカ
ライドの加水分解速度を高めることも分つた。すなわ
ち、アジ化ナトリウムおよびアジ化リチウムはα−アミ
ラーゼを活性化し、そして膵および唾液α−アミラーゼ
の酵素誘導加水分解を促進する。
本発明は芳香族置換グリコシド、より詳細には、α−ア
ミラーゼの直接測定のための基質として有用なかかるグ
リコシドに関する。
ミラーゼの直接測定のための基質として有用なかかるグ
リコシドに関する。
こ芳香族置換グリコシドは、式 〔式中、アノマー炭素における置換分−ORの立体配置は
α−であり、ｎは０または１の整数であり、またＲは （式中、R1、R5およびR6は独立的にハロゲン、NO2、 である） より成る群より選択される置換芳香族基である〕 で示され、そして立体異性体、光学異性体および幾何異
性体および前記異性体の混合物を包含する。本発明は、
置換フエニル−またはナフチル−α−グリコシドをシク
ログルカノトランスフエラーゼによりシクロデキストリ
ンでホモローグ化し、該高級ホモローグの非還元末端を
アミラーゼでトリミングし、そして所望の低級ホモロー
グを分離することより成る、前記基質および関連物質の
酵素合成に関する。
α−であり、ｎは０または１の整数であり、またＲは （式中、R1、R5およびR6は独立的にハロゲン、NO2、 である） より成る群より選択される置換芳香族基である〕 で示され、そして立体異性体、光学異性体および幾何異
性体および前記異性体の混合物を包含する。本発明は、
置換フエニル−またはナフチル−α−グリコシドをシク
ログルカノトランスフエラーゼによりシクロデキストリ
ンでホモローグ化し、該高級ホモローグの非還元末端を
アミラーゼでトリミングし、そして所望の低級ホモロー
グを分離することより成る、前記基質および関連物質の
酵素合成に関する。
詳細な説明 本発明は、主として化合物Ｉにおいてｎが１でありそし
てＲが であものについて説明される。しかしながら、かかる説
明が例示的なものにすぎず、説明を目的とするものでは
あつても限定を目的とするのではないことは理解されよ
う。説明される発明概念がその他ｎ値およびＲ置換分を
有する化合物Ｉおよび各種立体異性体および構造異性体
にも等しく適用可能であることも容易に理解されよう。
てＲが であものについて説明される。しかしながら、かかる説
明が例示的なものにすぎず、説明を目的とするものでは
あつても限定を目的とするのではないことは理解されよ
う。説明される発明概念がその他ｎ値およびＲ置換分を
有する化合物Ｉおよび各種立体異性体および構造異性体
にも等しく適用可能であることも容易に理解されよう。
本発明のグリコシドＩの説明において、その−OR置換分
はα−立体配置をとる。
はα−立体配置をとる。
本明細書中に用いられる用語「ハロゲン」は、Ｆ、Cl、
BrおよびＩより選択されるハロゲン類の一員を包含す
る。用語「低級アルキル」は６個までの炭素原子を含む
直鎖状または分枝鎖状飽和炭化水素より成る一価置換
分、例えばメチル、イソプロピル、第３級ブチル、ヘキ
シルなどのことである。
BrおよびＩより選択されるハロゲン類の一員を包含す
る。用語「低級アルキル」は６個までの炭素原子を含む
直鎖状または分枝鎖状飽和炭化水素より成る一価置換
分、例えばメチル、イソプロピル、第３級ブチル、ヘキ
シルなどのことである。
本発明のグリコシドＩの調製において、式II （式中、Acは である） で示されるアンヒドロイドが選択される。かかるアンヒ
ドロ化合物IIは、後述の如き手順を用いて製造すること
ができる。
ドロ化合物IIは、後述の如き手順を用いて製造すること
ができる。
かかるアンヒドロ誘導体（化合物II）は、当該技術分野
においてBrigl無水物として通常知られる（P. Brigl,
Z. Physiol. Chem.,112,245（1922））1,2−アンヒドロ
−α−Ｄ−グルコピラノーストリアセテートのグルコー
ス伸長アナローグである。かかる誘導体の製造は、L. L
emieuxおよびJ. Howardが「Methods in Carbohydrate C
hem.」,Vol. II, WhistlerおよびWolfrom編,P400（196
3）にBrigl無水物について報告したものと同様の化学的
方法によつて行われる。すなわち、マルトースまたはマ
ルトトリオースを触媒例えば酢酸ナトリウムの存在下に
無水酢酸を120〜140℃で１〜２時間用いてペルアセチル
化する。得られたアノマー炭素における立体配置がβで
あるペルアセテートを少量の支援溶媒を用いまたは用い
ずに３〜10当量の五塩化燐と共に加熱する。好ましく
は、塩素化炭化水素例えば四塩化炭素またはクロロホル
ムなどを用いる。得られる溶融物を次に70〜90℃（還流
温度）で３〜８時間加熱すると式 で示される１−β−クロロ−２−トリクロロアセチル誘
導体が得られる。
においてBrigl無水物として通常知られる（P. Brigl,
Z. Physiol. Chem.,112,245（1922））1,2−アンヒドロ
−α−Ｄ−グルコピラノーストリアセテートのグルコー
ス伸長アナローグである。かかる誘導体の製造は、L. L
emieuxおよびJ. Howardが「Methods in Carbohydrate C
hem.」,Vol. II, WhistlerおよびWolfrom編,P400（196
3）にBrigl無水物について報告したものと同様の化学的
方法によつて行われる。すなわち、マルトースまたはマ
ルトトリオースを触媒例えば酢酸ナトリウムの存在下に
無水酢酸を120〜140℃で１〜２時間用いてペルアセチル
化する。得られたアノマー炭素における立体配置がβで
あるペルアセテートを少量の支援溶媒を用いまたは用い
ずに３〜10当量の五塩化燐と共に加熱する。好ましく
は、塩素化炭化水素例えば四塩化炭素またはクロロホル
ムなどを用いる。得られる溶融物を次に70〜90℃（還流
温度）で３〜８時間加熱すると式 で示される１−β−クロロ−２−トリクロロアセチル誘
導体が得られる。
化合物IIIをジエチルエーテル中10分間〜１時間０゜〜1
0℃で飽和アンモニアを用いて処理することにより選択
的に脱トリクロロアセチル化して式（IV） で示される１−β−クロロ−２−ヒドロキシ誘導体とす
る。
0℃で飽和アンモニアを用いて処理することにより選択
的に脱トリクロロアセチル化して式（IV） で示される１−β−クロロ−２−ヒドロキシ誘導体とす
る。
化合物IIは、化合物IVを第２アミン好ましくはジエチル
アミンを用いて、あるいはアンモニアを用いて芳香族炭
化水素例えばベンゼンまたはトルエン中８〜24時間15〜
30℃で処理することにより形成される。
アミンを用いて、あるいはアンモニアを用いて芳香族炭
化水素例えばベンゼンまたはトルエン中８〜24時間15〜
30℃で処理することにより形成される。
Brigl無水物と同様に、この延長されたアンヒドロ化合
物IIは、R.D.Guthrie「The Carbohydrates」,Vol.IA. P
igmanおよびHorton編,P.424（1972）に報告されたもの
と同様の方法により、還流芳香族炭化水素溶媒例えばト
ルエン中でフエノール系発色原と立体選択的に反応して
式Ｖ で示されるα−グリコシドを高収率で与える。
物IIは、R.D.Guthrie「The Carbohydrates」,Vol.IA. P
igmanおよびHorton編,P.424（1972）に報告されたもの
と同様の方法により、還流芳香族炭化水素溶媒例えばト
ルエン中でフエノール系発色原と立体選択的に反応して
式Ｖ で示されるα−グリコシドを高収率で与える。
典型的には、この反応には、発色原とアンヒドロ誘導体
IVとをほぼ等モル濃度で混合し、そしてトルエンまたは
ベンゼン中で４〜24時間還流する。
IVとをほぼ等モル濃度で混合し、そしてトルエンまたは
ベンゼン中で４〜24時間還流する。
化合物Ｖは当該技術分野において周知の酸性または塩基
性条件で脱アセチル化されるが、一般的にグリコシド結
合における反応に伴う副生物形成の少い酸性条件下に脱
アセチル化するのが好ましい。特に酸の最終濃度が1M以
下となるような濃塩酸、アルコールおよび塩素化炭化水
素の化合物が見事な脱アセチル化を与えることが分つて
いる。すなわち、好ましい一態様においては１部の濃塩
酸、10部のメタノールおよび４部のクロロホルムの混合
物を化合物Ｖと20〜25℃で２〜４日間反応させて化合物
Ｉとする。
性条件で脱アセチル化されるが、一般的にグリコシド結
合における反応に伴う副生物形成の少い酸性条件下に脱
アセチル化するのが好ましい。特に酸の最終濃度が1M以
下となるような濃塩酸、アルコールおよび塩素化炭化水
素の化合物が見事な脱アセチル化を与えることが分つて
いる。すなわち、好ましい一態様においては１部の濃塩
酸、10部のメタノールおよび４部のクロロホルムの混合
物を化合物Ｖと20〜25℃で２〜４日間反応させて化合物
Ｉとする。
化合物Ｉは、その酸を中和し、残留有機溶媒を除きそし
て凍結乾燥することによつて単離される。精製は、当該
技術分野において周知の様様な方法、例えばゲル過、
逆相高速液体クロマトグラフイ（HPLC）または分配クロ
マトグラフイなどによつて行うことができる。特に、混
合有機および水性溶媒混合物を用いた微結晶セルロース
での分配クロマトグラフイが特に有用であることが分つ
ている。
て凍結乾燥することによつて単離される。精製は、当該
技術分野において周知の様様な方法、例えばゲル過、
逆相高速液体クロマトグラフイ（HPLC）または分配クロ
マトグラフイなどによつて行うことができる。特に、混
合有機および水性溶媒混合物を用いた微結晶セルロース
での分配クロマトグラフイが特に有用であることが分つ
ている。
別法として、式Ｉ（式中ｎは０または１から０〜２に拡
張され、またR1、R5およびR6は前記のとおりであるほか
に水素であつてもよい）で示されるマルトオリゴサツカ
ライドを製造するために、 式VI （式中、アノマー炭素原子における置換分−ORの立体配
置はαであり、そしてＲは前記のとおりである） で示されるフエニル−またはナフチル−α−グリコシド
をシクログルカノトランスフエラーゼの存在下にグリコ
シルドナー用いてホモローグ化、すなわちグリコシル転
移を受けさせて主に前駆物質グリコシドVIを含むα−マ
ルトオリゴサツカライドと式Ｉ（式中、アノマー炭素原
子における置換分−ORの立体配置はαであり、Ｒはすぐ
前に記載したとおりの意味を表わし、そしてｎは主に０
〜７である）で示されるα−マルトオリゴサツカライド
との混合物（少量のより高級なマルトオリゴサツカライ
ドを含む）とし、次いで得られた混合物をアミラーゼで
トリミングして主として低級マルトオリゴサツカライ
ド、すなわちｎが０〜２であるマルトシド、を含む複雑
度の低下した混合物とし、そしてこのトリミング工程で
得られた低級ホモローグ混合物を分離する。前記グルコ
シル転移工程は常法により行われる。例えば式VIのグリ
コシドアクセプター（その調製については前述したとこ
ろであり、また更にA.F.BahkovおよびG.E.Zaikov,「Che
mistry of the O−Glycosidic Bond:Formation and Cle
avage」,Pergamon Press,オクスフオード、英国、1979
年、などレビユー書に説明されている）をシクログルカ
ノトランスフエラーゼ〔例えばバチルス・アルカロフイ
リツク（Bacillus alkalophilic）〕および緩衝剤例え
ばクエン酸ナトリウム／塩化カルシウム緩衝剤の存在下
にグルコシルドナー例えばβ−シクロデキストリンと共
にインキユベートすると、典型的には、出発グリコシド
と主として２〜９グリコシド単位を含むα−マルトオリ
ゴサツカライドとの混合物が少量の更に高級なα−マル
トオリゴサツカライドと共に得られる。そのようにして
得られるα−マルトオリゴサツカライド混合物は、常
法、例えば選択的結晶化またはクロマトグラフイ、特に
高性能液体クロマトグラフイなどにより単離することが
できる。トリミング工程は反応系内で行つてもよい。後
者の方法が好ましい。
張され、またR1、R5およびR6は前記のとおりであるほか
に水素であつてもよい）で示されるマルトオリゴサツカ
ライドを製造するために、 式VI （式中、アノマー炭素原子における置換分−ORの立体配
置はαであり、そしてＲは前記のとおりである） で示されるフエニル−またはナフチル−α−グリコシド
をシクログルカノトランスフエラーゼの存在下にグリコ
シルドナー用いてホモローグ化、すなわちグリコシル転
移を受けさせて主に前駆物質グリコシドVIを含むα−マ
ルトオリゴサツカライドと式Ｉ（式中、アノマー炭素原
子における置換分−ORの立体配置はαであり、Ｒはすぐ
前に記載したとおりの意味を表わし、そしてｎは主に０
〜７である）で示されるα−マルトオリゴサツカライド
との混合物（少量のより高級なマルトオリゴサツカライ
ドを含む）とし、次いで得られた混合物をアミラーゼで
トリミングして主として低級マルトオリゴサツカライ
ド、すなわちｎが０〜２であるマルトシド、を含む複雑
度の低下した混合物とし、そしてこのトリミング工程で
得られた低級ホモローグ混合物を分離する。前記グルコ
シル転移工程は常法により行われる。例えば式VIのグリ
コシドアクセプター（その調製については前述したとこ
ろであり、また更にA.F.BahkovおよびG.E.Zaikov,「Che
mistry of the O−Glycosidic Bond:Formation and Cle
avage」,Pergamon Press,オクスフオード、英国、1979
年、などレビユー書に説明されている）をシクログルカ
ノトランスフエラーゼ〔例えばバチルス・アルカロフイ
リツク（Bacillus alkalophilic）〕および緩衝剤例え
ばクエン酸ナトリウム／塩化カルシウム緩衝剤の存在下
にグルコシルドナー例えばβ−シクロデキストリンと共
にインキユベートすると、典型的には、出発グリコシド
と主として２〜９グリコシド単位を含むα−マルトオリ
ゴサツカライドとの混合物が少量の更に高級なα−マル
トオリゴサツカライドと共に得られる。そのようにして
得られるα−マルトオリゴサツカライド混合物は、常
法、例えば選択的結晶化またはクロマトグラフイ、特に
高性能液体クロマトグラフイなどにより単離することが
できる。トリミング工程は反応系内で行つてもよい。後
者の方法が好ましい。
グリコシル転移工程で得られたα−マルトオリゴサツカ
ライド混合物の非還元末端のトリミングは、そのマルト
オリゴサツカライド混合物を緩衝剤の存在下にアミラー
ゼと共にインキユベートすることによつて行われる。そ
れらアミラーゼは細菌、真菌または哺乳動物由来のいず
れであつてもよく、そしてそれぞれの例として様々なα
−アミラーゼ類、例えばバチルス・ズブチルス（Bacill
us subtilus）α−アミラーゼ、ピー．シユテユツエリ
（P. stutzeri）α−アミラーゼ、またはアスペルギル
ス・オリゼ（Aspergillus oryzae）α−アミラーゼ、ア
スペルギルスα−グルコアミラーゼまたはリゾープス
（rhyzopus）α−アミラーゼ、またはヒト唾液α−アミ
ラーゼまたは豚膵液α−アミラーゼを包含し、あるいは
植物由来のものであつてもよくそしてβ−アミラーゼ例
えばポテトβ−アミラーゼおよびモルトβ−アミラーゼ
などを包含する。β−アミラーゼは好ましい酵素トリマ
ー（trimmer）である。ポテトおよびモルトβ−アミラ
ーゼが最も好ましい。トリミング工程に用いられる前記
マルトオリゴサツカライド混合物の濃度およびアミラー
ゼの単位数は厳密に臨界的であるわけではないが、芳香
族−α−マルトオリゴサツカライド混合物の非還元末端
のトリミングは、マルトオリゴサツカライド濃度を約0.
05〜約0.5g/mlの範囲内とし、またアミラーゼ単位を約
0.1〜50u/ml（反応混合物）の範囲内として行うのが望
ましい。約0.1g/ml濃度の混合芳香族−α−マルトオリ
ゴサツカライドが好ましい。アミラーゼ単位は一般的
に、サツカロジエニツク活性、すなわち、可溶性デンプ
ンから単位時間あたりに放出されるマルトジオシドの量
から、あるいはデキストリノジエニツク活性、すなわ
ち、単位時間あたりにデキストリンに転化されるデンプ
ンの量から計算される。
ライド混合物の非還元末端のトリミングは、そのマルト
オリゴサツカライド混合物を緩衝剤の存在下にアミラー
ゼと共にインキユベートすることによつて行われる。そ
れらアミラーゼは細菌、真菌または哺乳動物由来のいず
れであつてもよく、そしてそれぞれの例として様々なα
−アミラーゼ類、例えばバチルス・ズブチルス（Bacill
us subtilus）α−アミラーゼ、ピー．シユテユツエリ
（P. stutzeri）α−アミラーゼ、またはアスペルギル
ス・オリゼ（Aspergillus oryzae）α−アミラーゼ、ア
スペルギルスα−グルコアミラーゼまたはリゾープス
（rhyzopus）α−アミラーゼ、またはヒト唾液α−アミ
ラーゼまたは豚膵液α−アミラーゼを包含し、あるいは
植物由来のものであつてもよくそしてβ−アミラーゼ例
えばポテトβ−アミラーゼおよびモルトβ−アミラーゼ
などを包含する。β−アミラーゼは好ましい酵素トリマ
ー（trimmer）である。ポテトおよびモルトβ−アミラ
ーゼが最も好ましい。トリミング工程に用いられる前記
マルトオリゴサツカライド混合物の濃度およびアミラー
ゼの単位数は厳密に臨界的であるわけではないが、芳香
族−α−マルトオリゴサツカライド混合物の非還元末端
のトリミングは、マルトオリゴサツカライド濃度を約0.
05〜約0.5g/mlの範囲内とし、またアミラーゼ単位を約
0.1〜50u/ml（反応混合物）の範囲内として行うのが望
ましい。約0.1g/ml濃度の混合芳香族−α−マルトオリ
ゴサツカライドが好ましい。アミラーゼ単位は一般的
に、サツカロジエニツク活性、すなわち、可溶性デンプ
ンから単位時間あたりに放出されるマルトジオシドの量
から、あるいはデキストリノジエニツク活性、すなわ
ち、単位時間あたりにデキストリンに転化されるデンプ
ンの量から計算される。
高級α−マルトオリゴサツカライド、例えばｎが３〜７
である式Ｉのマルトペンタ−〜−ノナオシドがアミラー
ゼにより非還元末端でトリミングを受ける速度は、グリ
コシル転移工程の低級α−マルトシド、例えばｎが０〜
２である式Ｉのマルトシド−〜マルトテトラシドに対す
るトリミング速度よりも著しく高い。従つてトリミング
工程の行われる時間は臨界的ではない。しかしながら、
アミラーゼ単位数が前記の範囲にありそしてトリミング
温度が約20゜〜約50゜の範囲にある場合には、約１時間
〜８時間の範囲のトリミング時間をとれば好都合であ
る、すなわわちトリミングが本質的に完了している、こ
とを見出した。約25℃のトリミング温度が好ましい。ト
リミング工程の進行は高性能液体クロマトグラフイによ
モニターすることができる。
である式Ｉのマルトペンタ−〜−ノナオシドがアミラー
ゼにより非還元末端でトリミングを受ける速度は、グリ
コシル転移工程の低級α−マルトシド、例えばｎが０〜
２である式Ｉのマルトシド−〜マルトテトラシドに対す
るトリミング速度よりも著しく高い。従つてトリミング
工程の行われる時間は臨界的ではない。しかしながら、
アミラーゼ単位数が前記の範囲にありそしてトリミング
温度が約20゜〜約50゜の範囲にある場合には、約１時間
〜８時間の範囲のトリミング時間をとれば好都合であ
る、すなわわちトリミングが本質的に完了している、こ
とを見出した。約25℃のトリミング温度が好ましい。ト
リミング工程の進行は高性能液体クロマトグラフイによ
モニターすることができる。
トリミング工程には、約４〜約８のpH範囲（好ましいpH
範囲は約4.5〜約６である）を与える緩衝剤を用いるこ
とができる。適当な緩衝剤としては例えば、アルカリ金
属の酢酸塩およびクエン酸塩、例えばナトリウムまたは
カリウムの酢酸塩およびクエン酸塩などが挙げられる。
ナトリウムの酢酸塩およびクエン酸塩が好ましい。ある
いはまた、トリミング工程のpHは滴定によつて調整して
もよい。
範囲は約4.5〜約６である）を与える緩衝剤を用いるこ
とができる。適当な緩衝剤としては例えば、アルカリ金
属の酢酸塩およびクエン酸塩、例えばナトリウムまたは
カリウムの酢酸塩およびクエン酸塩などが挙げられる。
ナトリウムの酢酸塩およびクエン酸塩が好ましい。ある
いはまた、トリミング工程のpHは滴定によつて調整して
もよい。
トリミング工程の生成物である低級芳香族置換α−マル
トオリゴサツカライドは常法により単離され分離され
る。例えば、トリミング反応が、例えば高性能液体クロ
マトグラフイモニタリングの示すところにより、完了し
たら、水と混和し得る有機溶媒例えばアセトンの添加に
より反応を止めて未反応β−シクロデキストリン、塩
類、酵素および遊離糖類を沈殿させ、次いでゲル過ま
たは分配クロマトグラフイを行うが、好ましくは高性能
液体クロマトグラフイ法を用いる。
トオリゴサツカライドは常法により単離され分離され
る。例えば、トリミング反応が、例えば高性能液体クロ
マトグラフイモニタリングの示すところにより、完了し
たら、水と混和し得る有機溶媒例えばアセトンの添加に
より反応を止めて未反応β−シクロデキストリン、塩
類、酵素および遊離糖類を沈殿させ、次いでゲル過ま
たは分配クロマトグラフイを行うが、好ましくは高性能
液体クロマトグラフイ法を用いる。
本発明の化合物Ｉは支援ないし補助酵素を用いる必要な
くしてα−アミラーゼを直接測定するための基質として
有用である。化合物Ｉは、ある量のα−アミラーゼを含
む検体、例えば血清に添加される。このα−アミラーゼ
が化合物Ｉと反応することによつてそこから−OR置換分
が分裂して発色団を形成するがこれは分光学的に固定で
きまたいかなる未反応グリコシドからも識別できるた
め、α−アミラーゼの量に関連づけることができる。
くしてα−アミラーゼを直接測定するための基質として
有用である。化合物Ｉは、ある量のα−アミラーゼを含
む検体、例えば血清に添加される。このα−アミラーゼ
が化合物Ｉと反応することによつてそこから−OR置換分
が分裂して発色団を形成するがこれは分光学的に固定で
きまたいかなる未反応グリコシドからも識別できるた
め、α−アミラーゼの量に関連づけることができる。
実施例１ A.β−マルトトリオースヘンデカアセテート 無水酢酸75ml中に酢酸ナトリウム7.5gを含む130℃の溶
液に15gのマルトトリオースを撹拌しながら少しずつ添
加した。その混合物を１時間還流した。得られた溶液を
室温まで冷却し、そして600mlの氷水に注入した。その
懸濁液を１時間撹拌した。固体を過し、水洗しそして
五塩化燐上で真空乾燥して26.1gのβ−マルトリオース
ヘンデカアセテートを得た。
液に15gのマルトトリオースを撹拌しながら少しずつ添
加した。その混合物を１時間還流した。得られた溶液を
室温まで冷却し、そして600mlの氷水に注入した。その
懸濁液を１時間撹拌した。固体を過し、水洗しそして
五塩化燐上で真空乾燥して26.1gのβ−マルトリオース
ヘンデカアセテートを得た。
B.1−β−クロロ−２−トリクロロアセチルマルトトリ
オースノナアセテート 3.0gのβ−マルトトリオースヘンデカアセテートを水分
から保護されたフラスコ中で5.5gの五塩化燐とよく混合
した。次いで5mlの四塩化炭素を添加し、そして固体を
加熱して流体混合物を得た。その溶液を３間還流し、次
いで室温にまで冷却した。その溶液を真空下に回転蒸発
させて油状物を得た。その油状物を200mlのエーテルに
溶解し、そして200mlずつの1M炭酸ナトリウムで３回洗
浄した。次にエーテル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥
し、過しそして蒸発させて3gの粗製固体生成物を得
た。その生成物をトルエンで平衡させた60gのMerckシリ
カゲル60のカラムにかけた。その生成物を2:1トルエン
／酢酸エチルで溶出し、50ml画分を集めた。2:1ベンゼ
ン／酢酸エチル中のの薄層クロマトグラフイ（TLC）に
より目的成分（Rf0.25）を純粋に含む画分を集め、そし
て回転蒸発させてガラス状固体を得た。石油エーテルと
共に磨砕すると0.54gの１−β−クロロ−２−トリクロ
ロアセチルマルトトリオースノナアセテート、m.p.129
〜131℃が得られた。
オースノナアセテート 3.0gのβ−マルトトリオースヘンデカアセテートを水分
から保護されたフラスコ中で5.5gの五塩化燐とよく混合
した。次いで5mlの四塩化炭素を添加し、そして固体を
加熱して流体混合物を得た。その溶液を３間還流し、次
いで室温にまで冷却した。その溶液を真空下に回転蒸発
させて油状物を得た。その油状物を200mlのエーテルに
溶解し、そして200mlずつの1M炭酸ナトリウムで３回洗
浄した。次にエーテル層を無水硫酸マグネシウムで乾燥
し、過しそして蒸発させて3gの粗製固体生成物を得
た。その生成物をトルエンで平衡させた60gのMerckシリ
カゲル60のカラムにかけた。その生成物を2:1トルエン
／酢酸エチルで溶出し、50ml画分を集めた。2:1ベンゼ
ン／酢酸エチル中のの薄層クロマトグラフイ（TLC）に
より目的成分（Rf0.25）を純粋に含む画分を集め、そし
て回転蒸発させてガラス状固体を得た。石油エーテルと
共に磨砕すると0.54gの１−β−クロロ−２−トリクロ
ロアセチルマルトトリオースノナアセテート、m.p.129
〜131℃が得られた。
C.1−β−クロロ−２−ヒドロキシマルトトリオースノ
ナアセテート 1.25gの１−β−クロロ−２−トリクロロアセチルマル
トトリオースノナアセテートを25mlのアンモニア飽和エ
ーテルに０℃で溶解した。その混合物を０℃で15分間撹
拌したところその間に無色結晶性生成物が沈殿した。そ
の生成物を別しそして酢酸エチル／エーテルから再結
晶して0.34gの１−β−クロロ−２−ヒドロキシマルト
トリオースノナアセテート、m.p.121〜130℃を得た。
ナアセテート 1.25gの１−β−クロロ−２−トリクロロアセチルマル
トトリオースノナアセテートを25mlのアンモニア飽和エ
ーテルに０℃で溶解した。その混合物を０℃で15分間撹
拌したところその間に無色結晶性生成物が沈殿した。そ
の生成物を別しそして酢酸エチル／エーテルから再結
晶して0.34gの１−β−クロロ−２−ヒドロキシマルト
トリオースノナアセテート、m.p.121〜130℃を得た。
D.1,2−アンヒドロ−α−Ｄ−マルトトリオースノナア
セテート 200mgの１−β−クロロ−２−ヒドロキシマルトトリオ
ースを35μｌのジエチルアミンを含有する15mlの無水ベ
ンゼンに溶解した。その溶液を室温で一夜（約16時間）
撹拌した。次にその懸濁液を約1gのシリカ床を通して
過し、そして澄明な液を回転蒸発させて油状物を得
た。その油状物を20mlの温エーテルに溶解し、その溶液
を微量の不溶性物質から別しそして石油エーテルを用
いて濁り始るまで希釈した。冷蔵して得られた結晶性生
成物を集めそして乾燥して100mgの1,2−アンヒドロ−α
−Ｄ−マルトトリオースノナアセテート、m.p.158〜162
℃を得た。
セテート 200mgの１−β−クロロ−２−ヒドロキシマルトトリオ
ースを35μｌのジエチルアミンを含有する15mlの無水ベ
ンゼンに溶解した。その溶液を室温で一夜（約16時間）
撹拌した。次にその懸濁液を約1gのシリカ床を通して
過し、そして澄明な液を回転蒸発させて油状物を得
た。その油状物を20mlの温エーテルに溶解し、その溶液
を微量の不溶性物質から別しそして石油エーテルを用
いて濁り始るまで希釈した。冷蔵して得られた結晶性生
成物を集めそして乾燥して100mgの1,2−アンヒドロ−α
−Ｄ−マルトトリオースノナアセテート、m.p.158〜162
℃を得た。
実施例２ ２−クロロ−４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトトリ
オシド 121mgの２−クロロ−４−ニトロフエノールおよび500mg
の1,2−アンヒドロ−α−Ｄ−マルトトリオースノナア
セテートを12mlのトルエンに共に溶解しそしてその溶液
を16時間還流した。そのトルエンを回転蒸発させて得ら
れた油状残渣を酢酸エチルに再溶解し、そして20mlずつ
の0.5M水性重炭酸ナトリウムで４回抽出した後20mlずつ
の飽和水性塩化ナトリウムで２回抽出した。酢酸エチル
層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、過しそして蒸発さ
せて油状物を得た。その油状物を50mlのエーテルに再溶
解し、そして20mlの石油エーテルで希釈して沈殿を得
た。４℃に冷却後、沈殿を集め、乾燥させて得られた37
0mgの目的とするα−グリコシドノナアセテートのうち3
52mgを8mlのクロロホルム、20mlのメタノールおよび2ml
の濃塩酸の混合物に溶解した。その溶液に栓をして室温
で72間撹拌した。次にその溶液を25mlの水で希釈しそし
て有機相を分解した。水性相を低度の真空下に回転蒸発
させてメタノールを除去した。次にその水性酸溶液を約
6.6のpHとなるまでDowex50（OH型）を用いてバツチ処理
した。その樹脂を過しそして水洗した。その液を凍
結乾燥して175mgの粗製生成物を得た。その生成物物を2
mlの水、2mlのメタノールおよび12mlのアセトンの混合
物に溶解し、そしてアセトンで平衡させた15gの微結晶
セルロース（FMC Avicel ）のカラムにかけることによ
り精製した。そのカラムをアセトン／水混合物の段階的
濃度勾配を用いて溶出した。画分に対する分析用高速液
体クロマトグラフイ（HPLC）（EconosphereTMＣ−8,20
％メタノール/80％水;310nmにおけるUV検出）によりモ
ニターしたところ、純粋な生成物はアセトン中８〜12％
水のところに溶出された。集められた画分を回転蒸発さ
せてアセトンを除去し、そして残留水性溶液を凍結乾燥
して全部で33mgの２−クロロ−４−ニトロフエニル−α
−Ｄ−マルトトリオシドを得た。
オシド 121mgの２−クロロ−４−ニトロフエノールおよび500mg
の1,2−アンヒドロ−α−Ｄ−マルトトリオースノナア
セテートを12mlのトルエンに共に溶解しそしてその溶液
を16時間還流した。そのトルエンを回転蒸発させて得ら
れた油状残渣を酢酸エチルに再溶解し、そして20mlずつ
の0.5M水性重炭酸ナトリウムで４回抽出した後20mlずつ
の飽和水性塩化ナトリウムで２回抽出した。酢酸エチル
層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、過しそして蒸発さ
せて油状物を得た。その油状物を50mlのエーテルに再溶
解し、そして20mlの石油エーテルで希釈して沈殿を得
た。４℃に冷却後、沈殿を集め、乾燥させて得られた37
0mgの目的とするα−グリコシドノナアセテートのうち3
52mgを8mlのクロロホルム、20mlのメタノールおよび2ml
の濃塩酸の混合物に溶解した。その溶液に栓をして室温
で72間撹拌した。次にその溶液を25mlの水で希釈しそし
て有機相を分解した。水性相を低度の真空下に回転蒸発
させてメタノールを除去した。次にその水性酸溶液を約
6.6のpHとなるまでDowex50（OH型）を用いてバツチ処理
した。その樹脂を過しそして水洗した。その液を凍
結乾燥して175mgの粗製生成物を得た。その生成物物を2
mlの水、2mlのメタノールおよび12mlのアセトンの混合
物に溶解し、そしてアセトンで平衡させた15gの微結晶
セルロース（FMC Avicel ）のカラムにかけることによ
り精製した。そのカラムをアセトン／水混合物の段階的
濃度勾配を用いて溶出した。画分に対する分析用高速液
体クロマトグラフイ（HPLC）（EconosphereTMＣ−8,20
％メタノール/80％水;310nmにおけるUV検出）によりモ
ニターしたところ、純粋な生成物はアセトン中８〜12％
水のところに溶出された。集められた画分を回転蒸発さ
せてアセトンを除去し、そして残留水性溶液を凍結乾燥
して全部で33mgの２−クロロ−４−ニトロフエニル−α
−Ｄ−マルトトリオシドを得た。
実施例３ ４−クロロ−２−ニトロ−１−ナフチル−α−マルトト
リオシド 酢酸100ml中の9gの４−クロロ−１−ナフトールを15℃
に冷却し、酢酸20ml中の3.25mlの濃硝酸を15分間かけて
滴加した。１時間後、その反応混合物を600mlの冷水に
注入した。沈殿を取し、水洗しそして乾燥して粗製生
成物を得た。その生成物を弗騰ヘキサンで抽出すること
により部分的に精製して3.5gを得た。10mlのクロロホル
ムに溶解し、15gのシリカに吸着し、そしてヘキサンで
平衡させた90gのシリカゲルのカラムにかけることによ
り更に精製した。その生成物をヘキサン中５％酢酸エチ
ルで溶出し蒸発後0.8gの４−クロロ−２−ニトロ−１−
ナフトール、m.p.142〜３゜（ｄ）を得た。
リオシド 酢酸100ml中の9gの４−クロロ−１−ナフトールを15℃
に冷却し、酢酸20ml中の3.25mlの濃硝酸を15分間かけて
滴加した。１時間後、その反応混合物を600mlの冷水に
注入した。沈殿を取し、水洗しそして乾燥して粗製生
成物を得た。その生成物を弗騰ヘキサンで抽出すること
により部分的に精製して3.5gを得た。10mlのクロロホル
ムに溶解し、15gのシリカに吸着し、そしてヘキサンで
平衡させた90gのシリカゲルのカラムにかけることによ
り更に精製した。その生成物をヘキサン中５％酢酸エチ
ルで溶出し蒸発後0.8gの４−クロロ−２−ニトロ−１−
ナフトール、m.p.142〜３゜（ｄ）を得た。
500mlの1,2−アンヒドロマルトトリオースノナアセテー
トおよび155mgの４−クロロ−２−ニトロ−１−ナフト
ールを12mlのトルエンに共に溶解し、そしてその溶液を
18時間還流した。その溶液を室温にまで冷却しそして回
転蒸発させて固体残渣を得た。その残渣を30mlの酢酸エ
チルに溶解し、そして0.5M水性炭酸ナトリウム（15ml）
で４回抽出後、飽和水性塩化ナトリウム（30ml）で２回
抽出した。酢酸エチル相を無水硫酸マグネシウムで乾燥
し、過しそして蒸発させて粗製固体生成物を得た。そ
の生成物をクロロホルム（20ml）に溶解し、不溶物質か
ら別し、そしてその液を2gのシリカゲルと混合し、
再び蒸発させて粉末を得た。生成物を吸着したシリカ
を、ｎ−ヘキサンで平衡させた13gのMerckシリカゲル60
のカラムにかけた。そのカラムをクロロホルムで、次に
4:1クロロホルム／酢酸エチルで溶出した。画分をTLCに
よりモニターしたところ、生成物は後者の混合物に溶出
した。適切な画分を濃縮し、そして生成物をヘキサンで
沈殿させた。過し乾燥して得られた234mgの粉末のう
ち200mgをクロロホルム／メタノール／濃塩酸の4:10:1
混合物10mlに溶解し、栓しそして室温で72時間撹拌し
た。その溶液を25mlの水および25mlのクロロホルムで希
釈しそして相分離した。その水性相を3.8のpHが得られ
るまでDowex2（OH-）でバツチ処理した。その懸濁液を
過し、そして樹脂を20mlの水で洗浄した。その液を
凍結乾燥して83mgの粗製生成物を得た。精製のために、
粗製生成物を1mlの水、1mlのメタノールおよび8mlのア
セトンの混合物に溶解した。その溶液をアセトンで平衡
させた1gの微結晶セルロース（FMC Avicel ）のカラム
にかけた。90％アセトン/10％水で溶出して得られた生
成物を濃縮し凍結乾燥して15mgの４−クロロ−２−ニト
ロ−１−ナフチル−α−マルトトリオシドを得た。
トおよび155mgの４−クロロ−２−ニトロ−１−ナフト
ールを12mlのトルエンに共に溶解し、そしてその溶液を
18時間還流した。その溶液を室温にまで冷却しそして回
転蒸発させて固体残渣を得た。その残渣を30mlの酢酸エ
チルに溶解し、そして0.5M水性炭酸ナトリウム（15ml）
で４回抽出後、飽和水性塩化ナトリウム（30ml）で２回
抽出した。酢酸エチル相を無水硫酸マグネシウムで乾燥
し、過しそして蒸発させて粗製固体生成物を得た。そ
の生成物をクロロホルム（20ml）に溶解し、不溶物質か
ら別し、そしてその液を2gのシリカゲルと混合し、
再び蒸発させて粉末を得た。生成物を吸着したシリカ
を、ｎ−ヘキサンで平衡させた13gのMerckシリカゲル60
のカラムにかけた。そのカラムをクロロホルムで、次に
4:1クロロホルム／酢酸エチルで溶出した。画分をTLCに
よりモニターしたところ、生成物は後者の混合物に溶出
した。適切な画分を濃縮し、そして生成物をヘキサンで
沈殿させた。過し乾燥して得られた234mgの粉末のう
ち200mgをクロロホルム／メタノール／濃塩酸の4:10:1
混合物10mlに溶解し、栓しそして室温で72時間撹拌し
た。その溶液を25mlの水および25mlのクロロホルムで希
釈しそして相分離した。その水性相を3.8のpHが得られ
るまでDowex2（OH-）でバツチ処理した。その懸濁液を
過し、そして樹脂を20mlの水で洗浄した。その液を
凍結乾燥して83mgの粗製生成物を得た。精製のために、
粗製生成物を1mlの水、1mlのメタノールおよび8mlのア
セトンの混合物に溶解した。その溶液をアセトンで平衡
させた1gの微結晶セルロース（FMC Avicel ）のカラム
にかけた。90％アセトン/10％水で溶出して得られた生
成物を濃縮し凍結乾燥して15mgの４−クロロ−２−ニト
ロ−１−ナフチル−α−マルトトリオシドを得た。
実施例４ ２−ホルミル−４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトト
リオシド 100mgの２−ホルミル−４−ニトロフエニルおよび500mg
の1,2−アンヒドロマルトトリオースノナアセテートを1
5mlのトルエンに溶解し、そして18時間還流した。その
トルエンを蒸発させ、そして残渣を酢酸エチルに溶解
し、50mlずつの10％水性重炭酸ナトリウムで４回洗浄し
た。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、過しそし
て蒸発させて固体残渣を得た。その残渣をエーテル／酢
酸エチル（50/0.5）からヘキサン添加により結晶させて
270mgの生成物、m.p.89〜104℃を得た。
リオシド 100mgの２−ホルミル−４−ニトロフエニルおよび500mg
の1,2−アンヒドロマルトトリオースノナアセテートを1
5mlのトルエンに溶解し、そして18時間還流した。その
トルエンを蒸発させ、そして残渣を酢酸エチルに溶解
し、50mlずつの10％水性重炭酸ナトリウムで４回洗浄し
た。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、過しそし
て蒸発させて固体残渣を得た。その残渣をエーテル／酢
酸エチル（50/0.5）からヘキサン添加により結晶させて
270mgの生成物、m.p.89〜104℃を得た。
得られた生成物（270mg）を6mlのクロロホルム、15mlの
メタノールおよび1.5mlの濃塩酸の溶液中で撹拌するこ
とにより脱アセチル化した。その反応混合物を50mlの水
で希釈しそして相分離した。水相を濃縮し、そしてDowe
x2−（OH-）樹脂の添加によりpH6.9まで中和した。その
懸濁液を過し、そして液を凍結乾燥して112mgの粗
製生成物を得た。その生成物をアセトン／水濃度勾配を
用いて2gの微結晶セルロース（FMC Avicel ）のカラム
で精製した。88％アセトン/12％水で溶出して得たプー
ルを濃縮しそして凍結乾燥して31mgの２−ホルミル−４
−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトトリオシドを得た。
メタノールおよび1.5mlの濃塩酸の溶液中で撹拌するこ
とにより脱アセチル化した。その反応混合物を50mlの水
で希釈しそして相分離した。水相を濃縮し、そしてDowe
x2−（OH-）樹脂の添加によりpH6.9まで中和した。その
懸濁液を過し、そして液を凍結乾燥して112mgの粗
製生成物を得た。その生成物をアセトン／水濃度勾配を
用いて2gの微結晶セルロース（FMC Avicel ）のカラム
で精製した。88％アセトン/12％水で溶出して得たプー
ルを濃縮しそして凍結乾燥して31mgの２−ホルミル−４
−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトトリオシドを得た。
実施例５ ２−クロロ−４−ニトロフエニル−α−Ｄ−グルコシド 4.23gの1,2−アンヒドロ−α−Ｄ−グルコピラノースト
リアセテートと3.06gの２−クロロ−４−ニトロフエノ
ールを350mlのトルエンに溶解した。その溶液を16時間
還流し、室温まで冷却しそして50mlの葉量となるまで蒸
発させるとその時点で生成物が結晶し始めた。その混合
物を０℃に冷却し、そして結晶をフイルタ上に集め、冷
トルエンおよびヘキサンで洗浄しそして真空乾燥して4.
41g（収率65％）の２−クロロ−４−ニトロフエニル−
α−Ｄ−グルコシド3,4,5−トリアセテート、m.p.191〜
195゜を得た。そのグリコシドをクロロホルム、メタノ
ールおよび濃塩酸（4:10:1）の混合物130mlに溶解し、
次いで室温で60時間撹拌した。その反応混合物を92mlの
水で希釈し、層分離し、そして水性層を77mlのクロロホ
ルムで抽出した。水性層を154mlの容量となるまで蒸発
させた。その水性濃縮液を水で平衡させた96mlのDiaion
HP−20樹脂（Mitsubishi）のカラムにかけた。このカ
ラム約1.5の水で、または流出液のpHが約６となるま
で洗浄した。次に生成物を577mlのメタノールを用いて
樹脂から溶出し、等しい６画分を集めた。（高性能液体
クロマトグラフイの示すところにより）生成物を含有す
る画分２〜５を合一し、蒸発乾固させて得られた2.5g
（78％）の生成の純度は約94％であつた〔高性能液体ク
ロマトグラフイ（Alltech Econosphere C−8;20％メタ
ノール／水；λ＝300nmにおいてUV検出）による〕。
リアセテートと3.06gの２−クロロ−４−ニトロフエノ
ールを350mlのトルエンに溶解した。その溶液を16時間
還流し、室温まで冷却しそして50mlの葉量となるまで蒸
発させるとその時点で生成物が結晶し始めた。その混合
物を０℃に冷却し、そして結晶をフイルタ上に集め、冷
トルエンおよびヘキサンで洗浄しそして真空乾燥して4.
41g（収率65％）の２−クロロ−４−ニトロフエニル−
α−Ｄ−グルコシド3,4,5−トリアセテート、m.p.191〜
195゜を得た。そのグリコシドをクロロホルム、メタノ
ールおよび濃塩酸（4:10:1）の混合物130mlに溶解し、
次いで室温で60時間撹拌した。その反応混合物を92mlの
水で希釈し、層分離し、そして水性層を77mlのクロロホ
ルムで抽出した。水性層を154mlの容量となるまで蒸発
させた。その水性濃縮液を水で平衡させた96mlのDiaion
HP−20樹脂（Mitsubishi）のカラムにかけた。このカ
ラム約1.5の水で、または流出液のpHが約６となるま
で洗浄した。次に生成物を577mlのメタノールを用いて
樹脂から溶出し、等しい６画分を集めた。（高性能液体
クロマトグラフイの示すところにより）生成物を含有す
る画分２〜５を合一し、蒸発乾固させて得られた2.5g
（78％）の生成の純度は約94％であつた〔高性能液体ク
ロマトグラフイ（Alltech Econosphere C−8;20％メタ
ノール／水；λ＝300nmにおいてUV検出）による〕。
実施例６ バチルスシクログルカノトランスフエラーゼによる２−
クロロ−４−ニトロフエニル−α−Ｄ−グリコシドの転
移 0.32gの２−クロロ−４−ニトロフエニル−α−Ｄ−グ
リコシドおよび0.96％のβ−シクロデキストリンを9.6m
lの0.05Mクエン酸ナトリウム/0.005M塩化カルシウム緩
衝剤（pH5.0）中に共に溶解した、次に、バチルス・ア
ルカロフイリツクシクログルカノトランスフエラーゼ
〔Mitsubishi、5.5mg:20,000単位/g、ここで該単位は単
位時間あたり代謝される可溶性デンプンの量に基づいて
定義される（T.E.Barman, Enzyme Handbook, Vol. 1, S
pringer−Verlag,ニユーヨーク，ニユーヨーク州,1969
年,320頁参照）〕を添加し、そしてその混合物を室温で
20時間撹拌した後、その混合物を高性能液体クロマトグ
ラフイ（Alltech Econosphere RP−8;15％メタノール／
水：λ＝305nmでUV検出）にかけたところ次のパターン
を示した： α−グリコシド29.2％；α−マルトシド15.3％；α−マ
ルトトリオシド12.1％；α−マルトテトラオシド8.2
％；α−マルトペンタオシド8.4％＝α−マルトヘキサ
オシド9.0％；α−マルトヘプタオシド3.5％；α−マル
トオクタオシド2.5％；α−マルトノナオシドおよびよ
り高級物6.0％。
クロロ−４−ニトロフエニル−α−Ｄ−グリコシドの転
移 0.32gの２−クロロ−４−ニトロフエニル−α−Ｄ−グ
リコシドおよび0.96％のβ−シクロデキストリンを9.6m
lの0.05Mクエン酸ナトリウム/0.005M塩化カルシウム緩
衝剤（pH5.0）中に共に溶解した、次に、バチルス・ア
ルカロフイリツクシクログルカノトランスフエラーゼ
〔Mitsubishi、5.5mg:20,000単位/g、ここで該単位は単
位時間あたり代謝される可溶性デンプンの量に基づいて
定義される（T.E.Barman, Enzyme Handbook, Vol. 1, S
pringer−Verlag,ニユーヨーク，ニユーヨーク州,1969
年,320頁参照）〕を添加し、そしてその混合物を室温で
20時間撹拌した後、その混合物を高性能液体クロマトグ
ラフイ（Alltech Econosphere RP−8;15％メタノール／
水：λ＝305nmでUV検出）にかけたところ次のパターン
を示した： α−グリコシド29.2％；α−マルトシド15.3％；α−マ
ルトトリオシド12.1％；α−マルトテトラオシド8.2
％；α−マルトペンタオシド8.4％＝α−マルトヘキサ
オシド9.0％；α−マルトヘプタオシド3.5％；α−マル
トオクタオシド2.5％；α−マルトノナオシドおよびよ
り高級物6.0％。
実施例７ スイートポテトβ−アミラーゼによる２−クロロ−４−
ニトロフエニル−α−マルトデキストリンのトリミング 実施例６と同様にして生成させた9.6mlの２−クロロ−
４−ニトロフエニル−α−マルトデキストリン混合物を
0.05Mクエン酸ナトリウム/0.005M塩化カルシウム緩衝剤
（pH5.0）中、室温で５時間、0.01mlのスイートポテト
β−アミラーゼの硫酸アンモニウム懸濁液（Behring Di
agnostics,10,000単位/ml;1単位は、37゜で１分間あた
りにデンプンから1.0μmoleを生じる酵素の量である）
を用いて処理した。この時点で、混合物を高性能液体ク
ロマトグラフイを実施例６と同様に行つたところ、次の
組成が示された：α−グリコシド31.9％；α−マルトシ
ド19.9％；α−マルトトリオシド30.1％；α−マルトテ
トラオシド13.1％；およびより高級なα−マルトデキス
トリン2.1％。
ニトロフエニル−α−マルトデキストリンのトリミング 実施例６と同様にして生成させた9.6mlの２−クロロ−
４−ニトロフエニル−α−マルトデキストリン混合物を
0.05Mクエン酸ナトリウム/0.005M塩化カルシウム緩衝剤
（pH5.0）中、室温で５時間、0.01mlのスイートポテト
β−アミラーゼの硫酸アンモニウム懸濁液（Behring Di
agnostics,10,000単位/ml;1単位は、37゜で１分間あた
りにデンプンから1.0μmoleを生じる酵素の量である）
を用いて処理した。この時点で、混合物を高性能液体ク
ロマトグラフイを実施例６と同様に行つたところ、次の
組成が示された：α−グリコシド31.9％；α−マルトシ
ド19.9％；α−マルトトリオシド30.1％；α−マルトテ
トラオシド13.1％；およびより高級なα−マルトデキス
トリン2.1％。
実施例８ バチルスシクログルカノトランスフエラーゼによる４−
ニトロフエニル−α−Ｄ−グリコシドに転移 0.5gの４−ニトロフエニル−α−Ｄ−グルコシドおよび
5.0gのβ−シクロデキストリンを10mlの5mM水性塩化カ
ルシウムに溶解した。バチルス・アルカロフイリツク・
シクログルカノトランスフエラーゼ（20mg）を添加し、
そしてその混合物を40℃で18時間インキユベートした。
その混合物の試料を高性能液体クロマトグラフイ（Unim
etrics Lichrosorb RP−8;15％メタノール／水;UV検出
器λ＝305nm）にかけたところ次の組成が示された：α
−グリコシド7.6％；α−マルトシド7.7％；α−マルト
トリオシド6.9％；α−マルトテトラオシド9.3％；α−
マルトペンタオシド8.6％；α−マルトヘキサオシド7.5
％；α−マルトヘプタオシド5.8％；α−マルトオクタ
オシド5.3％；α−マルトノナオシドおよびより高級物3
8.0％。
ニトロフエニル−α−Ｄ−グリコシドに転移 0.5gの４−ニトロフエニル−α−Ｄ−グルコシドおよび
5.0gのβ−シクロデキストリンを10mlの5mM水性塩化カ
ルシウムに溶解した。バチルス・アルカロフイリツク・
シクログルカノトランスフエラーゼ（20mg）を添加し、
そしてその混合物を40℃で18時間インキユベートした。
その混合物の試料を高性能液体クロマトグラフイ（Unim
etrics Lichrosorb RP−8;15％メタノール／水;UV検出
器λ＝305nm）にかけたところ次の組成が示された：α
−グリコシド7.6％；α−マルトシド7.7％；α−マルト
トリオシド6.9％；α−マルトテトラオシド9.3％；α−
マルトペンタオシド8.6％；α−マルトヘキサオシド7.5
％；α−マルトヘプタオシド5.8％；α−マルトオクタ
オシド5.3％；α−マルトノナオシドおよびより高級物3
8.0％。
実施例９ バチルス・ズブチルスα−アミラーゼによる４−ニトロ
フエニル−α−マルトデキストリンのトリミング 実施例８からの1mlの４−ニトロフエニル−α−マルト
デキストリン類の混合物を0.1mgのバチルス・ズブチル
スα−アミラーゼ（Behring Diagnosticg、1,800U/mg;1
単位は沃素を用いて測定される１分あたりの酵素のデン
プン液化能に基づいて定義される）を用いて40℃で１時
間処理した。その混合物を実施例６に記載のものと同様
のシステムを用いて高性能液体クロマトグラフイにより
アツセイしたところ次の組成を有することがみとめられ
た：α−グリコシド11.9％；α−マルトシド23.8％；α
−マルトトリオシド28.9％；α−マルトテトラオシド1
3.4％；α−マルトペンタオシド1.6％；α−マルトヘキ
サオシド10.0％；α−マルトヘプタオシド5.5％；α−
マルトオクタオシドおよびより高級物、検出できず。
フエニル−α−マルトデキストリンのトリミング 実施例８からの1mlの４−ニトロフエニル−α−マルト
デキストリン類の混合物を0.1mgのバチルス・ズブチル
スα−アミラーゼ（Behring Diagnosticg、1,800U/mg;1
単位は沃素を用いて測定される１分あたりの酵素のデン
プン液化能に基づいて定義される）を用いて40℃で１時
間処理した。その混合物を実施例６に記載のものと同様
のシステムを用いて高性能液体クロマトグラフイにより
アツセイしたところ次の組成を有することがみとめられ
た：α−グリコシド11.9％；α−マルトシド23.8％；α
−マルトトリオシド28.9％；α−マルトテトラオシド1
3.4％；α−マルトペンタオシド1.6％；α−マルトヘキ
サオシド10.0％；α−マルトヘプタオシド5.5％；α−
マルトオクタオシドおよびより高級物、検出できず。
実施例10 アスペルギルス・オリゼα−アミラーゼによる４−ニト
ロフエニル−α−マルトデキストリンのトリミング 実施例８からの1mlの４−ニトロフエニル−α−マルト
デキストリン類の混合物を、0.1mgのアスペルギルス・
オリゼα−アミラーゼ（Amano ATE 1200U/mg;1単位は37
゜、pH5.5で１分間あたり1mgの（可溶性）デンプンをデ
キストリン化する酵素量として定義される）を用いてpH
4.5、10℃で１時間処理した。その混合物を実施例６に
記載のシステムを用いて高性能液体クロマトグラフイに
よりアツセイしたところ、次の組成を有することがみと
められた：α−グリコシド８％；α−マルトシド29％；
α−マルトトリオシド24％；α−マルトテトラオシド21
％；α−マルトペンタオシド７％；α−マルトヘキサオ
シド４％；α−マルトヘプタオシド２％；α−マルトオ
クタオシドおよびより高級物、検出できず。
ロフエニル−α−マルトデキストリンのトリミング 実施例８からの1mlの４−ニトロフエニル−α−マルト
デキストリン類の混合物を、0.1mgのアスペルギルス・
オリゼα−アミラーゼ（Amano ATE 1200U/mg;1単位は37
゜、pH5.5で１分間あたり1mgの（可溶性）デンプンをデ
キストリン化する酵素量として定義される）を用いてpH
4.5、10℃で１時間処理した。その混合物を実施例６に
記載のシステムを用いて高性能液体クロマトグラフイに
よりアツセイしたところ、次の組成を有することがみと
められた：α−グリコシド８％；α−マルトシド29％；
α−マルトトリオシド24％；α−マルトテトラオシド21
％；α−マルトペンタオシド７％；α−マルトヘキサオ
シド４％；α−マルトヘプタオシド２％；α−マルトオ
クタオシドおよびより高級物、検出できず。
実施例11 モルトβ−アミラーゼによる２−クロロ−４−ニトロフ
エニル−α−マルトデキストリンのトリミング 実施例６と同様にして92.2gのα−グリコシド、333gの
β−シクロデキストリンおよび1.2gのバチルス・アルカ
ロフイリツク・シクログルカノトランスフエラーゼを室
温で3.3の0.05Mクエン酸ナトリウム/0.005M塩化カル
シウム（pH5.0）中で反応させて、２−クロロ−４−ニ
トロフエニル−α−マルトデキストリン類の混合物を生
成させた。この時点での高性能液体クロマトグラフイ
は、次の混合物を示した：α−グリコシド18.1％；α−
マルトシド14.4％；α−マルトトリオシド12.15％；α
−マルトテトラオシド11.1g;α−マルトペンタオシド8.
3％；α−マルトヘキサオシド6.2％；α−マルトヘプタ
オシド4.9％；α−マルトオクタオシドおよびより高級
物18.4％。次に1.0g（4,000U）のモルトからのβ−アミ
ラーゼ（Amano;1単位は37゜で可溶性デンプンから１分
あたりに1.0μmlのマルターゼを生成する酵素量であ
る）を添し、そして反応系を２時間撹拌した。この時点
での高性能液体クロマトグラフイは次の分布を示した：
αグリコシド22.1％；α−マルトシド23.5％；α−マル
トトリオシド34.0％；α−マルトテトラオシド20％。
エニル−α−マルトデキストリンのトリミング 実施例６と同様にして92.2gのα−グリコシド、333gの
β−シクロデキストリンおよび1.2gのバチルス・アルカ
ロフイリツク・シクログルカノトランスフエラーゼを室
温で3.3の0.05Mクエン酸ナトリウム/0.005M塩化カル
シウム（pH5.0）中で反応させて、２−クロロ−４−ニ
トロフエニル−α−マルトデキストリン類の混合物を生
成させた。この時点での高性能液体クロマトグラフイ
は、次の混合物を示した：α−グリコシド18.1％；α−
マルトシド14.4％；α−マルトトリオシド12.15％；α
−マルトテトラオシド11.1g;α−マルトペンタオシド8.
3％；α−マルトヘキサオシド6.2％；α−マルトヘプタ
オシド4.9％；α−マルトオクタオシドおよびより高級
物18.4％。次に1.0g（4,000U）のモルトからのβ−アミ
ラーゼ（Amano;1単位は37゜で可溶性デンプンから１分
あたりに1.0μmlのマルターゼを生成する酵素量であ
る）を添し、そして反応系を２時間撹拌した。この時点
での高性能液体クロマトグラフイは次の分布を示した：
αグリコシド22.1％；α−マルトシド23.5％；α−マル
トトリオシド34.0％；α−マルトテトラオシド20％。
実施例12 β−アミラーゼによりトリミングされたマルトデキスト
リン混合物からの２−クロロ−４−ニトロフエニル−α
−マルトトリオシドの単離 実施例11と同様にして生成されたトリミングされたマル
トデキストリン混合物を、13.3のアセトンで希釈し
た。得られた懸濁液を３日間冷蔵した後、過した。そ
のフイルタケークを500mlの80％アセトン/20％水で洗浄
し、そして合一した液を２の容量となるまで蒸発さ
せた。その濃縮液を2.5の酢酸エチル/z−ブタノール
（85:15）で４回抽出した。マルトトリオシドおよびマ
ルトテトラオシドについて濃縮されているその水性溶液
を濃縮し、そして凍結乾燥した。その凍結乾燥生成物を
200mlのメタノール／水（5:2）に再び溶解しそして3gの
微結晶セルロース（Avicell FMC Corp.）および1Kgの
ウツトフロツク（woodflock）の混合カラム（アセトン
で平衡させる）にかけた。そのカラムを48の100％ア
セトン、124の95％アセトン/5％水、および84の90
％アセトン/10％水で順次溶出し、そして６〜12画分
を集めた。そのα−マルトトリオシドは主として90/10
画分に溶出された。これらの画分を蒸発させてアセトン
を除去し、そして残留水性濃縮液を凍結乾燥して得られ
た43.6gの生成物は高性能液体クロマトグラフイにより
均質であつた。
リン混合物からの２−クロロ−４−ニトロフエニル−α
−マルトトリオシドの単離 実施例11と同様にして生成されたトリミングされたマル
トデキストリン混合物を、13.3のアセトンで希釈し
た。得られた懸濁液を３日間冷蔵した後、過した。そ
のフイルタケークを500mlの80％アセトン/20％水で洗浄
し、そして合一した液を２の容量となるまで蒸発さ
せた。その濃縮液を2.5の酢酸エチル/z−ブタノール
（85:15）で４回抽出した。マルトトリオシドおよびマ
ルトテトラオシドについて濃縮されているその水性溶液
を濃縮し、そして凍結乾燥した。その凍結乾燥生成物を
200mlのメタノール／水（5:2）に再び溶解しそして3gの
微結晶セルロース（Avicell FMC Corp.）および1Kgの
ウツトフロツク（woodflock）の混合カラム（アセトン
で平衡させる）にかけた。そのカラムを48の100％ア
セトン、124の95％アセトン/5％水、および84の90
％アセトン/10％水で順次溶出し、そして６〜12画分
を集めた。そのα−マルトトリオシドは主として90/10
画分に溶出された。これらの画分を蒸発させてアセトン
を除去し、そして残留水性濃縮液を凍結乾燥して得られ
た43.6gの生成物は高性能液体クロマトグラフイにより
均質であつた。
実施例13 バチルス・ズブチルスα−アミラーゼによる２−クロロ
−４−ニトロフエニル−α−マルトデキストリンのトリ
ミング 実施例６と同様にして生成された２−クロロ−４−ニト
ロフエニル−α−マルトデキストリン混合物を0.05M酢
酸ナトリウム/0.005M塩化カルシウム緩衝剤（pH5.0）
中、室温で５時間かけて1.175Uのバチルス・ズブチルス
α−アミラーゼ（Behring Diagnostics）で処理した。
この時間経過後の混合物の高性能液体クロマトグラフイ
は次の組成を示した：α−グルコシド30.8％；α−マル
トシド20.8％；α−マルトトリオシド30.4％；α−マル
トテトラオシド8.7％；α−マルトペンタオシド6.2％；
α−マルトヘキサオシド3.0％；α−マルトヘプタオシ
ドおよびより高級物、検出できず。
−４−ニトロフエニル−α−マルトデキストリンのトリ
ミング 実施例６と同様にして生成された２−クロロ−４−ニト
ロフエニル−α−マルトデキストリン混合物を0.05M酢
酸ナトリウム/0.005M塩化カルシウム緩衝剤（pH5.0）
中、室温で５時間かけて1.175Uのバチルス・ズブチルス
α−アミラーゼ（Behring Diagnostics）で処理した。
この時間経過後の混合物の高性能液体クロマトグラフイ
は次の組成を示した：α−グルコシド30.8％；α−マル
トシド20.8％；α−マルトトリオシド30.4％；α−マル
トテトラオシド8.7％；α−マルトペンタオシド6.2％；
α−マルトヘキサオシド3.0％；α−マルトヘプタオシ
ドおよびより高級物、検出できず。
実施例14 ２−クロロ−４−ニトロフエニル−α−Ｄ−マルトトリ
オシドのアミラーゼ・アツセイ アツセイ・システムを51ミリモル／の塩化ニトリウ
ム、５ミリモル／の酢酸カルシウムおよび4.44ミリモ
ル／の２−クロロ−４−ニトロフエニル−α−マルト
トリオシドを含む0.055M2−（Ｎ−モルホリノ）−エタ
ンスルホン酸（MES）（pH＝6.0）から構成した。この緩
衝剤のpHは、MESの遊離酸とナトリウム塩を混合するこ
とによつて達成された。
オシドのアミラーゼ・アツセイ アツセイ・システムを51ミリモル／の塩化ニトリウ
ム、５ミリモル／の酢酸カルシウムおよび4.44ミリモ
ル／の２−クロロ−４−ニトロフエニル−α−マルト
トリオシドを含む0.055M2−（Ｎ−モルホリノ）−エタ
ンスルホン酸（MES）（pH＝6.0）から構成した。この緩
衝剤のpHは、MESの遊離酸とナトリウム塩を混合するこ
とによつて達成された。
0.5分〜6.0分の間、リニアな間隔をおいて吸光度変化を
Gilford分光光度計を用いて405nmでモニターし、そして
インキユベーシヨン温度を37℃とした。1:60の検体：試
薬比を用いた場合、428単位／（Pantrak Amylase T
estに基づく）の膵アミラーゼを含む対照血清は0.029の
△A/分を生じた。455単位／（Pantrak Amylase Test
に基づく）の唾液アミラーゼを含む別の対照血清は0.01
8の△A/分を生じた。
Gilford分光光度計を用いて405nmでモニターし、そして
インキユベーシヨン温度を37℃とした。1:60の検体：試
薬比を用いた場合、428単位／（Pantrak Amylase T
estに基づく）の膵アミラーゼを含む対照血清は0.029の
△A/分を生じた。455単位／（Pantrak Amylase Test
に基づく）の唾液アミラーゼを含む別の対照血清は0.01
8の△A/分を生じた。
前記の手順にならい、かつアジ化ナトリウムを152ミリ
モル／の濃度で用いて測定したところ、アジ化ナトリ
ウムを共存させた方が該塩が共存しない場合よりも膵α
−アミラーゼおよび唾液α−アミラーゼによる２−クロ
ロ−４−ニトロフエニル−α−マルトトリオシドの加水
分解速度が速い（膵α−アミラーゼの場合は３倍、唾液
アミラーゼの場合は６倍）ことが分つた。同様の条件下
に、膵または唾液α−アミラーゼによる２−クロロ−４
−ニトロフエニル−α−マルトトリオシドの加水分解速
度はアジ化リチウムによつてもアジ化ナトリウムと同様
上昇する。
モル／の濃度で用いて測定したところ、アジ化ナトリ
ウムを共存させた方が該塩が共存しない場合よりも膵α
−アミラーゼおよび唾液α−アミラーゼによる２−クロ
ロ−４−ニトロフエニル−α−マルトトリオシドの加水
分解速度が速い（膵α−アミラーゼの場合は３倍、唾液
アミラーゼの場合は６倍）ことが分つた。同様の条件下
に、膵または唾液α−アミラーゼによる２−クロロ−４
−ニトロフエニル−α−マルトトリオシドの加水分解速
度はアジ化リチウムによつてもアジ化ナトリウムと同様
上昇する。
同様に、前記手順を用いて、230ミリモルのアジ化ナト
リウムは膵α−アミラーゼおよび唾液α−アミラーゼに
よる基質加水分解速度をそれぞれ3.4倍および7.1倍増大
させることを見出した。前記システムにおけるアジ化ナ
トリウムのレベルを低下させるとそれらα−アミラーゼ
イソ酵素による２−クロロ−４−ニトロフエニル−α−
マルトトリオシド加水分解速度の低下が生じる。アジ化
ナトリウム濃度減少による速度低下は等しくなく、各イ
ソ酵素に特異的である。唾液α−アミラーゼによる２−
クロロ−４−ニトロフエニル−α−マルトトリオシド加
水分解速度は、膵α−アミラーゼによる加水分解速度よ
りもアジ化ナトリウム濃度に敏感である。このアジ化ナ
トリウム濃度では発色原のモル吸光係数は影響されなか
つた。
リウムは膵α−アミラーゼおよび唾液α−アミラーゼに
よる基質加水分解速度をそれぞれ3.4倍および7.1倍増大
させることを見出した。前記システムにおけるアジ化ナ
トリウムのレベルを低下させるとそれらα−アミラーゼ
イソ酵素による２−クロロ−４−ニトロフエニル−α−
マルトトリオシド加水分解速度の低下が生じる。アジ化
ナトリウム濃度減少による速度低下は等しくなく、各イ
ソ酵素に特異的である。唾液α−アミラーゼによる２−
クロロ−４−ニトロフエニル−α−マルトトリオシド加
水分解速度は、膵α−アミラーゼによる加水分解速度よ
りもアジ化ナトリウム濃度に敏感である。このアジ化ナ
トリウム濃度では発色原のモル吸光係数は影響されなか
つた。
実施例15 ４−クロロ−２−ニトロ−１−ナフチル−α−マルトト
リオシドによるアミラーゼアツセイ 実施例14と同じpH6アツセイ緩衝剤を用いて実施例３の
４−クロロ−２−ニトロ−１−ナフチル−α−マルトト
リオシドを2.0mg/ml（2.77mM）濃度となるように溶解し
た。478U/の膵アミラーゼを含む100μｌの対照血清を
添加後、450nm（すなわち遊離発色原の吸収極大）にお
ける吸光度変化をGilford分光光度計を用いて37℃でモ
ニターした。0.5分〜6.0分のリニア間隔にわたり、0.02
93の△A450/分が記録された。
リオシドによるアミラーゼアツセイ 実施例14と同じpH6アツセイ緩衝剤を用いて実施例３の
４−クロロ−２−ニトロ−１−ナフチル−α−マルトト
リオシドを2.0mg/ml（2.77mM）濃度となるように溶解し
た。478U/の膵アミラーゼを含む100μｌの対照血清を
添加後、450nm（すなわち遊離発色原の吸収極大）にお
ける吸光度変化をGilford分光光度計を用いて37℃でモ
ニターした。0.5分〜6.0分のリニア間隔にわたり、0.02
93の△A450/分が記録された。
実施例16 終点（end−point）α−アミラーゼ・アツセイ（２−ク
ロロ−４−ニトロフエニル−α−マルトトリオシドと４
−ニトロフエニル−α−マルトトリオシドの比較） 本発明の２−クロロ−４−ニトロフエニル−α−マルト
トリオシドと既知のα−アミラーゼ基質、４−ニトロフ
エニル−α−マルトトリオシドの直接比較を次の方法に
より行つた： ２−クロロ−４−ニトロフエニル−α−マルトトリオシ
ドと４−ニトロフエニル−α−マルトトリオシドを2.0m
lの実施例13のpH6アツセイ緩衝剤（1mg/mlアジ化ニトリ
ウム保存剤含有）中、4mg/mlの濃度となるようにそれぞ
れ溶解した。それらサンプル溶液を各々37℃に昇温さ
せ、そして428U/mlを含有する100μｌのヒト膵α−アミ
ラーゼ対照血清を各溶液に添加した。10分経過時に、そ
れら溶液の各々を2.0mlの停止試薬で希釈してpHを10.15
とした。アミラーゼを添加していない試薬ブランクを同
様に処理した。405nmにおける吸光度を直ちに記録し、
そしてサンプル溶液と試薬ブランクの間の△A405を算出
した。２−クロロ−４−ニトロフエニル−α−マルトト
リオシドサンプルに対しては、0.561の△A405がみとめ
られたが、これは、405nmおよびpH10.15における遊離発
色原のミリモル吸光度が16.60であることから、13.5×1
0-2μmoleに相当する。一方、４−ニトロフエニル−α
−マルトトリオシドサンプルの場合には、0.061の△A
405が得られたが、これは、405nmおよびpH10.15におけ
るミリモル吸光度が18.80であることから1.30×10-2μm
oleの遊離発色原に相当する。このように、２−クロロ
−４−ニトロフエニル−α−マルトトリオシドは、４−
ニトロフエニル−α−マルトトリオシドよりも10倍速く
加水分解される。
ロロ−４−ニトロフエニル−α−マルトトリオシドと４
−ニトロフエニル−α−マルトトリオシドの比較） 本発明の２−クロロ−４−ニトロフエニル−α−マルト
トリオシドと既知のα−アミラーゼ基質、４−ニトロフ
エニル−α−マルトトリオシドの直接比較を次の方法に
より行つた： ２−クロロ−４−ニトロフエニル−α−マルトトリオシ
ドと４−ニトロフエニル−α−マルトトリオシドを2.0m
lの実施例13のpH6アツセイ緩衝剤（1mg/mlアジ化ニトリ
ウム保存剤含有）中、4mg/mlの濃度となるようにそれぞ
れ溶解した。それらサンプル溶液を各々37℃に昇温さ
せ、そして428U/mlを含有する100μｌのヒト膵α−アミ
ラーゼ対照血清を各溶液に添加した。10分経過時に、そ
れら溶液の各々を2.0mlの停止試薬で希釈してpHを10.15
とした。アミラーゼを添加していない試薬ブランクを同
様に処理した。405nmにおける吸光度を直ちに記録し、
そしてサンプル溶液と試薬ブランクの間の△A405を算出
した。２−クロロ−４−ニトロフエニル−α−マルトト
リオシドサンプルに対しては、0.561の△A405がみとめ
られたが、これは、405nmおよびpH10.15における遊離発
色原のミリモル吸光度が16.60であることから、13.5×1
0-2μmoleに相当する。一方、４−ニトロフエニル−α
−マルトトリオシドサンプルの場合には、0.061の△A
405が得られたが、これは、405nmおよびpH10.15におけ
るミリモル吸光度が18.80であることから1.30×10-2μm
oleの遊離発色原に相当する。このように、２−クロロ
−４−ニトロフエニル−α−マルトトリオシドは、４−
ニトロフエニル−α−マルトトリオシドよりも10倍速く
加水分解される。
本発明の発色原のいくつかについての分光特性をアミラ
ーゼ・アツセイの至適pHにおけるモル吸光係数からモノ
置換ニトロフエノールと比較した。下記の表に示される
結果は、本発明の発色原の改良された分光特性を示して
いる。
ーゼ・アツセイの至適pHにおけるモル吸光係数からモノ
置換ニトロフエノールと比較した。下記の表に示される
結果は、本発明の発色原の改良された分光特性を示して
いる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アーネルト・ケイ・メツツナー アメリカ合衆国カリフオルニア州（92014) デルマー．デユランゴドライブ13745 (72)発明者 ジエラルド・エフ・シグラー アメリカ合衆国カリフオルニア州（92117) サンデイエゴ．セリストリート4126 (72)発明者 エミリー・エス・ウイン−デイーン アメリカ合衆国カリフオルニア州（92064) パウエイ．ウツドクリークプレイス13251
Claims (52)
- 【請求項１】式 〔式中、アノマー炭素における置換分−ORの立体配置は
α−であり、ｎは０または１の整数であり、またＲは （式中、R1、R5およびR6は独立的にハロゲン、NO2、 である）より成る群より選択される置換芳香族基であ
る〕 で示される化合物。 - 【請求項２】ｎが１であり、そしてＲが基（ａ）である
特許請求の範囲第１項記載の化合物。 - 【請求項３】R1がクロロである特許請求の範囲第２項記
載の化合物。 - 【請求項４】（ａ）式 〔式中、置換分−ORはそこから分裂して発色団を形成す
ることができ、そしてアノマー炭素における置換分−OR
の立体配置はα−であり、ｎは０または１の整数であ
り、またＲは （式中R1、R5およびR6は独立的にハロゲン、NO2、 である）より成る群より選択される置換芳香族基であ
る〕 で示される化合物を既測定量の検体に添加して該検体中
に含まれるα−アミラーゼを該化合物と反応させ、前記
−OR置換分を分裂させて前記発色団を形成し；そして （ｂ）その形成された発色団の量を測定する ことより成る、α−アミラーゼ含有検体のα−アミラー
ゼ含量の直接測定方法。 - 【請求項５】前記化合物のｎが１であり、そしてＲが
（ａ）である特許請求の範囲第４項記載の方法。 - 【請求項６】R1がクロロである特許請求の範囲第５項記
載の方法。 - 【請求項７】酵素活性剤が用いられる特許請求の範囲第
４項記載の方法。 - 【請求項８】酵素活性剤がアジ化水素である特許請求の
範囲第７項記載の方法。 - 【請求項９】酵素活性剤がアルカリ金属アジドまたはア
ルカリ土類アジドである特許請求の範囲第７項記載の方
法。 - 【請求項１０】アルカリ金属アジドがアジ化ナトリウム
である特許請求の範囲第９項記載の方法。 - 【請求項１１】アルカリ金属アジドがアジ化リチウムで
ある特許請求の範囲第９項記載の方法。 - 【請求項１２】（ａ）式 〔式中、置換分−ORはα−アミラーゼによってそこから
分裂して発色団を形成することができ、そしてアノマー
炭素における置換分−ORの立体配置はα−であり、ｎは
０または１の整数であり、はたＲは （式中R1、R5およびR6は独立的にハロゲン、NO2、 である）より成る群よりり選択される置換芳香族基であ
る〕 で示される、α−アミラーゼに対する芳香族置換グリコ
シド基質；および （ｂ）緩衝剤 より成る、α−アミラーゼ・アッセイのための試薬。 - 【請求項１３】ｎが１であり、そしてＲが（ａ）である
特許請求の範囲第12項記載の試薬。 - 【請求項１４】R1がクロロである特許請求の範囲第13項
記載の試薬。 - 【請求項１５】酵素活性剤が含まれる特許請求の範囲第
12項記載の試薬。 - 【請求項１６】酵素活性剤がアジ化水素である特許請求
の範囲第15項記載の試薬。 - 【請求項１７】酵素活性剤がアルカリ金属アジドまたは
アルカリ土類アジドである特許請求の範囲第16項記載の
試薬。 - 【請求項１８】アルカリ金属アジドがアジ化ナトリウム
である特許請求の範囲第17項記載の試薬。 - 【請求項１９】アルカリ土類アジドがアジ化リチウムで
ある特許請求の範囲第17項記載の試薬。 - 【請求項２０】式 〔式中、アノマー炭素原子における置換分−ORの立体配
置はα−であり、ｎは０〜２の整数であり、そしてＲは （式中、R1、R5およびR6は独立的に水素、ハロゲン、NO
2、 である）より成る群より選択される置換芳香族基であ
る〕 で示される化合物の製造方法であって、 （ａ）式 （式中、アノマー炭素原子における置換分−ORの立体配
置はαであり、そしてＲは前記の意味を有する） で示される化合物を、シクログルカノトランスフェラー
ゼの存在下にグルコシルドナーと接触させて式 および （式中、アノマー炭素原子における置換分−ORの立体配
置はαであり、Ｒは前記のとおりであり、またｎは０〜
７である） で示される化合物より成る混合物とし； （ｂ）（ａ）で得られた混合物を単離することなくアミ
ラーゼと接触させて および （式中、アノマー炭素原子における置換分−ORの立体配
置はαであり、Ｒは前記のとおりであり、そしてｎは０
〜２である） で示される化合物より成る第２の混合物とし；そして （ｃ）その第２の混合物を分離する ことより成る前記製造方法。 - 【請求項２１】ｎが１である特許請求の範囲第20項記載
の方法。 - 【請求項２２】Ｒが式 （式中R1は水素またはハロゲンである）で示される基で
ある特許請求の範囲第20項記載の方法。 - 【請求項２３】ハロゲンがクロロである特許請求の範囲
第22項記載の方法。 - 【請求項２４】シクログルカノトランスフェラーゼがバ
チルス・アルカロフィリック・シクログルカノトランス
フェラーゼである特許請求の範囲第20項記載の方法。 - 【請求項２５】シクログルカノトランスフェラーゼがク
レプシェラ・ニューモニエシクログルカノトランスフェ
ラーゼである特許請求の範囲第20項記載の方法。 - 【請求項２６】アミラーゼがα−アミラーゼである特許
請求の範囲第20項記載の方法。 - 【請求項２７】α−アミラーゼの由来が細菌である特許
請求の範囲第26項記載の方法。 - 【請求項２８】α−アミラーゼの由来が真菌である特許
請求の範囲第26項記載の方法。 - 【請求項２９】α−アミラーゼの由来が哺乳動物である
特許請求の範囲第26項記載の方法。 - 【請求項３０】細菌アミラーゼがバチルス・ズブチルス
α−アミラーゼである特許請求の範囲第27項記載の方
法。 - 【請求項３１】真菌アミラーゼがアスペルギルス・オリ
ゼα−アミラーゼである特許請求の範囲第28項記載の方
法。 - 【請求項３２】アミラーゼがβ−アミラーゼである特許
請求の範囲第20項記載の方法。 - 【請求項３３】β−アミラーゼが植物由来である特許請
求の範囲第32項記載の方法。 - 【請求項３４】植物アミラーゼがスイートポテトβ−ア
ミラーゼである特許請求の範囲第33項記載の方法。 - 【請求項３５】植物アミラーゼがモルトβ−アミラーゼ
である特許請求の範囲第33項記載の方法。 - 【請求項３６】グルコシル・ドナーがシクロデキストリ
ンである特許請求の範囲第20項記載の方法。 - 【請求項３７】シクロデキストリンがβ−シクロデキス
トリンである特許請求の範囲第36項記載の方法。 - 【請求項３８】工程（ａ）で得られた混合物を単離し、
次いで工程（ｂ）と同様に処理する特許請求の範囲第20
項記載の方法。 - 【請求項３９】式 〔式中、アノマー炭素における置換分−ORの立体配置は
αであり、ｎは０〜２の整数であり、またＲは、 （式中、R1、R5およびR6は独立的に水素、ハロゲン、NO
2、 である）より成る群より選択される置換芳香族基であ
る〕 で示される化合物の製造方法であって、 （ａ）式 および （式中、アノマー炭素原子における置換分−ORの立体配
置はαであり、Ｒは前記のとおりであり、またｎは０〜
７の整数である） で示される化合物より成る混合物をアミラーゼと接触さ
せて式 および （式中、アノマー炭素原子における置換分−ORの立体配
置はαであり、Ｒは前記のとおりであり、またｎは０〜
２の整数である） で示される化合物より成る第２の混合物とし；そして （ｂ）その第２の混合物を分離する ことより成る前記製造方法。 - 【請求項４０】ｎが１である特許請求の範囲第39項記載
の方法。 - 【請求項４１】Ｒが式 （式中R1は水素またはハロゲンである）で示される基で
ある特許請求の範囲第39項記載の方法。 - 【請求項４２】ハロゲンがクロロである特許請求の範囲
第41項記載の方法。 - 【請求項４３】アミラーゼがα−アミラーゼである特許
請求の範囲第39項記載の方法。 - 【請求項４４】α−アミラーゼの由来が細菌である特許
請求の範囲第43項記載の方法。 - 【請求項４５】α−アミラーゼの由来が真菌である特許
請求の範囲第43項記載の方法。 - 【請求項４６】α−アミラーゼの由来が哺乳動物物であ
る特許請求の範囲第43項記載の方法。 - 【請求項４７】細菌アミラーゼがバチルス・スブチルス
α−アミラーゼである特許請求の範囲第44項記載の方
法。 - 【請求項４８】真菌アミラーゼがアスペルギルス・オリ
ゼα−アミラーゼである特許請求の範囲第44項記載の方
法。 - 【請求項４９】アミラーゼがβ−アミラーゼである特許
請求の範囲第39項記載の方法。 - 【請求項５０】β−アミラーゼが植物由来である特許請
求の範囲第49項記載の方法。 - 【請求項５１】植物アミラーゼがスイートポテトβ−ア
ミラーゼである特許請求の範囲第50項記載の方法。 - 【請求項５２】植物アミラーゼがモルトβ−アミラーゼ
である特許請求の範囲第50項記載の方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US91626286A | 1986-10-07 | 1986-10-07 | |
| US07/091,861 US4963479A (en) | 1986-10-07 | 1987-09-04 | Reagent system for an alpha-amylase assay containing aromatic substituted glycoside |
| US916262 | 1987-09-04 | ||
| US91861 | 1987-09-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63183595A JPS63183595A (ja) | 1988-07-28 |
| JPH0672149B2 true JPH0672149B2 (ja) | 1994-09-14 |
Family
ID=26784410
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62250840A Expired - Lifetime JPH0672149B2 (ja) | 1986-10-07 | 1987-10-06 | 芳香族置換グリコシド |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US4963479A (ja) |
| EP (2) | EP0263435B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0672149B2 (ja) |
| AT (2) | ATE148501T1 (ja) |
| AU (1) | AU597731B2 (ja) |
| CA (1) | CA1336417C (ja) |
| DE (2) | DE3752015T2 (ja) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5158872A (en) * | 1986-10-07 | 1992-10-27 | Hoechst Celanese Corporation | Aromatic substituted glycoside |
| JPH0676431B2 (ja) * | 1988-06-17 | 1994-09-28 | 東洋紡績株式会社 | 糖エステル誘導体および加水分解酵素活性測定用試薬 |
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