JPH0678782A - リゾスフィンゴ糖脂質の製造法及びこれに用いる新規ロドコッカス属微生物 - Google Patents

リゾスフィンゴ糖脂質の製造法及びこれに用いる新規ロドコッカス属微生物

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JPH0678782A
JPH0678782A JP23731292A JP23731292A JPH0678782A JP H0678782 A JPH0678782 A JP H0678782A JP 23731292 A JP23731292 A JP 23731292A JP 23731292 A JP23731292 A JP 23731292A JP H0678782 A JPH0678782 A JP H0678782A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 ロドコッカス属に属し、中性スフィンゴ糖脂
質をリゾ化する酵素を生産する能力を有する微生物の菌
体又は菌体処理物で、中性スフィンゴ糖脂質を処理する
ことを特徴とするリゾスフィンゴ糖脂質の製造法、及び
これに用いる新規ロドコッカス属微生物。 【効果】 リゾスフィンゴ糖脂質を生物学的な方法によ
り製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、中性スフィンゴ糖脂質
のリゾ体を生物学的に製造する方法に関するものであ
る。更に詳細には、本発明は、ロドコッカス属に属する
放線菌を用いて、酵素的に、中性スフィンゴ糖脂質から
脱アシル化し、リゾスフィンゴ糖脂質を製造する方法、
及び該方法に用いる新規ロドコッカス属微生物に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】一般に、リゾスフィンゴ糖脂質の製造法
は、ヒドラジン分解法やアルコール系溶媒中でのアルカ
リ加水分解法が適応される。これらの方法では、アミノ
糖を有するスフィンゴ糖脂質、例えばグロボシドからリ
ゾ体のグロボシドの製造を行うとき、脂質部分とアミノ
糖の両方に作用を受け、デ−Ｎ−アセチルリゾグロボシ
ドが第一に製造されるので、次いで脂質部分を保護した
後、再アセチル化、脱保護を行う必要があり、多くの手
間と熟練を要する。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、リゾスフィ
ンゴ糖脂質を生物学的な方法により製造する方法を提供
することを目的とする。本発明者らは、リゾスフィンゴ
糖脂質を生物学的な方法で製造する方法を開発するため
に、リゾスフィンゴ糖脂質生成酵素を産生する細菌を鋭
意探索したところ、全く新規で、新種と認められる放線
菌を単離することに成功し、該放線菌を利用することに
よって、本発明を完成するに至った。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明のリゾスフィンゴ
糖脂質の製造法は、ロドコッカス属に属し、中性スフィ
ンゴ糖脂質をリゾ化する酵素を生産する能力を有する微
生物の菌体又は菌体処理物で、中性スフィンゴ糖脂質を
処理することを特徴とするものである。従来、リゾスフ
ィンゴ糖脂質を生成できる微生物は、ノカルディア属放
線菌に属する一菌株 (Nocardia sp. 285株) のみである
が、この菌は酸性スフィンゴ糖脂質に作用し、中性スフ
ィンゴ糖脂質には作用しない。
【０００５】本発明に用いる微生物としては、ロドコッ
カス属に属し、中性スフィンゴ糖脂質をリゾ化する酵素
を生産する能力を有する微生物であれば、特に制限はな
く、例えば、ロドコッカス(Rhodococcus) sp. stain GL
-26が挙げられる。本菌株は、本発明者らにより、北海
道の道北地方の土壌中から分離されたものであり、工業
技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１３１２１
号として寄託されている。
【０００６】ロドコッカス(Rhodococcus) sp. stain GL
-26の菌学的性質は次の通りである。 ａ. 桿菌であり、生育時間によって菌体の大きさを変化
させる。その大きさは、0.5×３〜７μm から 0.5×１
μm である。 ｂ. グラム陽性であり、胞子を作成しない。 ｃ. 運動性なし。鞭毛なし。 ｄ. 抗酸性を示す。 ｅ. 偏性好気性である。 ｆ. Ｏ−Ｆテストは陰性である。 ｇ. ペプチドグリカン層にメソ−ジアミノピメリン酸を
有する。
【０００７】本菌株の属する分類学的位置をバージェイ
ズ・マニュアル・オブ・システマチック・バクテリオロ
ジー(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)に
より求めると、ロドコッカス属に属することは明らかで
ある。ロドコッカス属に属する放線菌ではリゾスフィン
ゴ糖脂質を生成する能力は知られていない。ロドコッカ
スsp. stain GL-26は、リゾスフィンゴ糖脂質を生成で
きる点で全く相違し、ロドコッカス属に属する新株であ
ると認められるものである。
【０００８】本発明の対象となる中性スフィンゴ糖脂質
としては、例えばグロボシド、フォルスマン抗原が挙げ
られる。本発明の製造法は、中性スフィンゴ糖脂質を水
又は緩衝液等の水性媒体に分散又は懸濁させ、前述した
ロドコッカス属に属し、中性スフィンゴ糖脂質をリゾ化
する酵素を生産する能力を有する微生物の菌体又は菌体
処理物で処理することにより行うことができる。
【０００９】本発明に用いる菌体処理物としては、例え
ば、菌体の破砕物、粗・精製酵素、固定化菌体・酵素が
挙げられる。中性スフィンゴ糖脂質を水又は緩衝液等の
水性媒体に分散又は懸濁させるためには、タウロデオキ
シコール酸等の界面活性剤を用いることが好ましい。反
応液中の中性スフィンゴ糖脂質の濃度は、通常0.05〜1m
g/mL、好ましくは0.1〜0.5mg/mLであり、菌体又は菌体
処理物の使用量は、0.001〜0.1g/mL、好ましくは0.005
〜0.05g/mLであり、反応温度は、通常25〜40℃、好まし
くは30〜37℃、反応ｐＨは、通常５〜７、好ましくは5.
5〜6.5、反応時間は、通常16〜72時間、好ましくは24〜
48時間である。
【００１０】ロドコッカスsp. stain GL-26の菌体又は
菌体処理物に含まれる、中性スフィンゴ糖脂質をリゾ化
する酵素は、以下に示す理化学的性質を有する新規な酵
素である。 (1) 作用及び基質特異性：下記の式に示すように、グロ
ボシドのセラミド部分を構成するスフィンゴシン塩基と
脂肪酸の間の酸アミド結合を切断し、リゾグロボシドを
生成する。
【００１１】
【化１】
【００１２】(2) 至適ｐＨ：５〜７、好ましくは 5.5〜
6.5 長い糖鎖を有する糖脂質に作用しリゾ体の糖脂質を生成
する酵素は、放射性同位元素を用いたレベルで A431 細
胞にわずかにその存在が示唆された［J. Biol.Chem., 2
63, 10915-10921(1988)］ほか、ノカルディア属に属す
る微生物に見いだされている［J. Biochem.(Tokyo), 10
3, 1-4(1988)］。しかし、これらの酵素はいずれも酸性
糖脂質であるガングリオシドに作用する酵素でグロボシ
ドには作用しない。
【００１３】本発明の製造法により得られたリゾスフィ
ンゴ糖脂質は、例えば、以下のようにして分離・精製す
ることができる。反応液、又は反応液にクロロホルム−
メタノール（２：１）混液４容を添加し、二相に分配し
た上層をセップ−パック(Sep-Pak) Ｃ18カートリッジ
(ウォータース社製) に添加し脂質画分を吸着させた
後、蒸留水で脱塩する。脂質画分は、メタノール（100
％）、続いてクロロホルム−メタノール−水 (60：30：
4.5)の混合溶媒で溶出させる。更に、逆相高速液体クロ
マトグラフィー（ＨＰＬＣ）等を用いてリゾグロボシド
を精製する。
【００１４】以上のようにして得られたリゾスフィンゴ
糖脂質は、アミノ基に再びカルボキシル基を有する化合
物を導入することにより有効に利用することができる。
利用例を下記の式に示す。
【００１５】
【化２】
【００１６】上記式中、（Ａ）はリゾグロボシド、
（Ｂ）は放射性同位元素で標識された脂肪酸、（Ｃ）は
蛍光を有する脂肪酸、（Ｄ）はビオチン、（Ｅ）は樹脂
(Resin)に結合している脂肪酸を表す。例えば、脂肪酸
を導入することにより、天然では混合物であるものを単
一にそろえたり、長さを変えたりもできる。また、蛍光
を有する脂肪酸やビオチン等の標識化合物を導入するこ
とにより、細胞表面の糖鎖認識蛋白質の存在を調べた
り、糖転移酵素等の糖受容体として利用した簡便な活性
測定法の開発も期待される。更に、リゾスフィンゴ糖脂
質を用い、糖脂質を樹脂等に固定することもできる。こ
れにより、１）糖脂質と細胞表層の相互作用、２）抗糖
脂質抗体の精製、３）糖脂質に特異的なグルコシダー
ゼ、糖転移酵素の精製の可能性、４）抗原としての利用
研究が著しく進展されることが期待できる［Methods En
zymol., 50, 137-140(1978)］。
【００１７】
【実施例】以下、調製例及び実施例により本発明を更に
具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定され
るものではないことはいうまでもない。 （調製例１） グロボシドの調製 ブタ血液を0.85％塩化ナトリウム水溶液で３回洗浄し
た。得られたブタ赤血球を0.1％酢酸水溶液中で破裂さ
せた後、0.1％酢酸水溶液で洗浄し、凍結乾燥した。得
られたブタ赤血球膜を熱エタノールで抽出し、溶媒を留
去して粗抽出物を得た。粗抽出物をクロロホルム−メタ
ノール−水（８：４：３）の混合溶媒で二相に分配して
得られた下層（Folch Lower Layer ）を蒸発させ、イア
トロビーズ(Iatrobeads)（6RS 8060、ヤトロン製、カラ
ムサイズ１cm×100cm)にかけ、ヘキサン−イソプロパノ
ール−水（Ａ＝40：55：５、Ｂ＝10：60：30）でＡ 100
％からＡ 50 ％、Ｂ 50 ％まで60分で直線濃度勾配的に
変化させ、その後、同じ比率で60分溶出させた。薄層ク
ロマトグラフィー（メルク社製）で溶出パターンをモニ
ターし、グロボシド画分を集めた。グロボシドが精製さ
れるまで同様のクロマトグラフィーを繰り返し、精製グ
ロボシドを得た。
【００１８】（調製例２） 菌の集積及び単離 菌の集積及び単離は、以下に示すウシ脳抽出物をタウロ
デオキシコール酸で懸濁させた培地を用いて行った。 菌の単離培地の組成 ウシ脳抽出物(TypeVIII)（シグマ社製） 0.2 ％ タウロデオキシコール酸（シグマ社製） 0.01％ リン酸二水素カリウム 0.68 g/L 硝酸アンモニウム 0.40 g/L 塩化ナトリウム 0.29 g/L （寒 天 1.5 ％） ｐＨ 7.0-7.4 （実施例１） リゾグロボシドの製造 精製グロボシド５mgをタウロデオキシコール酸10mgを含
む50mM MES（２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン
酸）緩衝液(pH6.5) 20mL中に懸濁させた。これに、ロド
コッカス sp. stain GL-26の菌体懸濁液（10％懸濁液）
又は膜画分懸濁液（10mg蛋白／mL）２mLを添加し、30℃
で48時間攪拌した。途中、薄層クロマトグラフィー（メ
ルク社製）で基質の消費を確認した。反応液、又は反応
液にクロロホルム−メタノール（２：１）混液88mLを添
加し、二相に分配した上層をセップ−パック(Sep-Pak)
Ｃ18カートリッジ (ウォータース社製) に添加し脂質画
分を吸着させた後、蒸留水で脱塩し、少量のメタノール
と充分量のクロロホルム−メタノール−水 (60：30：4.
5)混合溶媒で生成物を溶出させた。
【００１９】反応生成物を同定するため、反応液をセッ
プ−パック(Sep-Pak) Ｃ18カートリッジ (ウォータース
社製) に添加し脂質画分を吸着させた後、蒸留水で脱塩
した。脂質画分は、クロロホルム−メタノール−水 (6
0：30：4.5)の混合溶媒で溶出させた。得られた脂質画
分を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）（メルク社製）
にて分析したところ、ニンヒドリン陽性の糖脂質が生成
していた。
【００２０】更に、得られた糖脂質をSTR ODSHカラム
（島津製作所製、4.6×250mm)を用いて高速液体クロマ
トグラフィーにかけ、メタノール−水（60：40）の混合
溶媒で非吸着画分を溶出後、メタノール(100％) からク
ロロホルム−メタノール−水 (60：30：4.5)の直線的濃
度勾配で溶出させた。溶出パターンを薄層クロマトグラ
フィー（メルク社製）でモニターし、リゾグロボシド画
分を得た。
【００２１】このリゾグロボシド画分について、グリコ
シダーゼによる逐次分解法、500MHz 1Ｈ−ＮＭＲ、高速
原子衝撃質量分析法（ＦＡＢ−ＭＳ）による機器分析法
によって構造解析を行った。これらの結果、反応生成物
はリゾグロボシドと同定された。リゾグロボシドの 1Ｈ
−ＮＭＲスペクトル及びＦＡＢ−ＭＳスペクトルを、そ
れぞれ、図１及び図２に示す。
【００２２】
【発明の効果】本発明によれば、リゾスフィンゴ糖脂質
を生物学的な方法により製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の製造法により得られたリゾグロボシド
の 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示す図である。
【図２】本発明の製造法により得られたリゾグロボシド
のＦＡＢ−ＭＳスペクトルを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ロドコッカス属に属し、中性スフィンゴ
    糖脂質をリゾ化する酵素を生産する能力を有する微生物
    の菌体又は菌体処理物で、中性スフィンゴ糖脂質を処理
    することを特徴とするリゾスフィンゴ糖脂質の製造法。
  2. 【請求項２】 ロドコッカス属に属し、中性スフィンゴ
    糖脂質をリゾ化する酵素を生産する能力を有する微生物
    がロドコッカス(Rhodococcus) sp. stain GL-26である
    請求項１記載の製造法。
  3. 【請求項３】 中性スフィンゴ糖脂質をリゾ化する酵素
    を生産する能力を有するロドコッカス(Rhodococcus) s
    p. stain GL-26。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0707063A1 (en) * 1994-07-21 1996-04-17 Takara Shuzo Co. Ltd. Glycolipid ceramide deacylase
US6428999B1 (en) 1994-07-21 2002-08-06 Takara Shuzo Co., Ltd. Sphingolipid ceramide N-deacylase, methods for producing sphingolipids and sphingolipid derivatives, and spingolipid ceramide N-deacylase gene
US7045322B1 (en) 1998-03-31 2006-05-16 Takara Shuzo Co., Ltd. Process for producing lysosphingolipids
US7101699B2 (en) 2000-09-26 2006-09-05 Takara Bio Inc. Sphingolipid ceramide deacylase gene

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0707063A1 (en) * 1994-07-21 1996-04-17 Takara Shuzo Co. Ltd. Glycolipid ceramide deacylase
US6428999B1 (en) 1994-07-21 2002-08-06 Takara Shuzo Co., Ltd. Sphingolipid ceramide N-deacylase, methods for producing sphingolipids and sphingolipid derivatives, and spingolipid ceramide N-deacylase gene
CN1090236C (zh) * 1994-07-21 2002-09-04 宝酒造株式会社 糖脂神经酰胺脱酰酶
US6821761B2 (en) 1994-07-21 2004-11-23 Takara Bio, Inc. Sphingolipid ceramide N-deacylase, methods for producing sphingolipids and sphingolipid derivatives, and sphingolipid ceramide N-deacylase gene
US7364787B2 (en) 1994-07-21 2008-04-29 Takara Bio, Inc. Sphingolipid ceramide N-deacylase, methods for producing sphingolipids and sphingolipid derivatives, and sphingolipid ceramide N-deacylase gene
US7045322B1 (en) 1998-03-31 2006-05-16 Takara Shuzo Co., Ltd. Process for producing lysosphingolipids
US7101699B2 (en) 2000-09-26 2006-09-05 Takara Bio Inc. Sphingolipid ceramide deacylase gene

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