JPH0720997B2 - 新規なトロンビン結合性物質及びその製法 - Google Patents

新規なトロンビン結合性物質及びその製法

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JPH0720997B2
JPH0720997B2 JP1202027A JP20202789A JPH0720997B2 JP H0720997 B2 JPH0720997 B2 JP H0720997B2 JP 1202027 A JP1202027 A JP 1202027A JP 20202789 A JP20202789 A JP 20202789A JP H0720997 B2 JPH0720997 B2 JP H0720997B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は新規なトロンビン結合性物質、更に詳細には、
血液の凝固に対する抗凝固系並びに線溶系に関与する医
薬品、特に血栓症等の治療剤として有用なトロンビン結
合性物質、及びその製法に関する。
〔従来の技術およびその課題〕
血液凝固系の中で、蛋白分解酵素としてのトロンビンの
果す役割については種々の研究が行われ、凝固系のメカ
ニズムに関してはほぼ解明されている。
近年、生体内において、線溶系及び抗凝固系に作用する
と言われているプロテインＣをトロンビンが活性化する
こと及びその機構に補酵素的に働く因子がウサギ肺組織
抽出物に存在していることが報告されており、このもの
はトロンボモジュリンと命名されている〔N.L.Esmon
ら、J.Biol.Chem.,257，（２）,859〜864（1982）〕。
また、本発明者の１人である青木らはヒト胎盤より分離
した同様の性質を有する分子量約71,000（非還元状態）
のヒト・トロンボモジュリンを報告した〔Thrombo.Res.
37,353〜364（1985）〕。
更に、I.Maruyamaらはヒト胎盤より分離した分子量約7
5,000のヒト・トロンボモジュリンと、上記ウサギ、ト
ロンボモジュリンの活性を比較し、両者の活性が等しい
ことを報告している〔J.Clin.Invest.,75,987〜991,（1
985）〕。
更に、H.Ishiiらはヒト血漿中及び尿中にトロンボモジ
ュリンと同じ活性を有する物質が存在すること、そして
血漿中の当該物質の分子量が約63,000と54,000であるこ
とを報告している〔J.Clin.Invest.,76,2178〜2181（19
85）〕。
更に、本発明者らはヒト尿中に上記物質とは異なる分子
量の小さい２種のトロンビン結合性物質（非還元状態の
分子量約39,000及び約31,000）を見出し、特許出願した
（特開昭63−146898号）。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者らは、更にヒト・トロンボモジュリンの有利な
取得、単離、精製方法に関し、鋭意研究を行ったとこ
ろ、ヒト尿中から上記物質とは異なる２種のトロンビン
結合性物質（Ａ）及び（Ｂ）を分離することに成功する
と共に、これらが新規物質であることを確認し、さらに
このトロンビン結合性物質の工業的に有利な分離採取方
法を提供せんと鋭意研究を行なった結果、ヒト組織由来
細胞の組織培養液中に尿中に存在するものと同じトロン
ビン結合性物質が存在すること、そしてこの培養液中か
ら簡単な操作で目的物を分離採取できることを見出し、
本発明を完成した。
従って、本発明は新規なヒト由来のトロンビン結合性物
質（Ａ）及び（Ｂ）、並びにその製法を提供するもので
ある。
本発明のトロンビン結合性物質は、トロンビンと結合し
てプロテインＣを特異的に活性化し、血液凝固時間を延
長することから、線溶促進剤、抗凝固剤等として有用で
ある。
本発明のトロンビン結合性物質は、（１）ヒト尿をカル
シウムイオンで処理したのち、トロンビン結合性物質の
カルシウムイオンによる構造変化を認識するモノクロー
ナル抗体を用いる免疫吸着カラムクロマトグラフィー、
次いで分子量分画法で分離、精製する方法、または
（２）ヒト組織由来細胞を組織培養し、その培養液から
前記と同様の手段で分離、精製する方法により製造され
る。
（１）の方法においてヒト尿としては、ヒト新鮮尿又は
濃縮尿が使用されるが、これらはイオン交換クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過法、トロンビン−担体結合物を用い
るアフィニティークロマトグラフィー等を適宜組合せて
前処理を行ってもよい。
前処理のイオン交換クロマトグラフィーは、pH8〜12に
調整した尿を、DEAE−セファデックスＡ−50（ファルマ
シア社製）、DEAE−トヨパール650C、同650M、同650S
（東洋曹達社製）、QAE−セファデックスＡ−50（ファ
ルマシア社製）等の樹脂と接触させて目的物を吸着さ
せ、低濃度の塩、例えば塩化ナトリウムを含有する緩衝
液で洗浄したのち、塩濃度を上げた同様の緩衝液で溶出
する方法を採用するのが好ましい。ゲル濾過は、セファ
デックスG150（ファルマシア社製）、ウルトロゲルAcA3
4（LKS社製）等の担体を用いて行うことができる。アフ
ィニティーカラムクロマトグラフィーにおけるトロンビ
ン−担体結合物としては、トロンビンを、例えばジイソ
プロピルフロロフォスフェイトで不活性化させ、不溶性
担体、例えばアガロースゲル、セファロースゲル、デキ
ストランゲル、ポリビニルゲル等に結合させたものを用
いるのが好ましい。
カルシウムイオン処理は、免疫吸着カラムクロマトグラ
フィーを行う直前もしくは前処理の何れかの段階におい
て、カルシウム化合物、例えば塩化カルシウム、炭酸カ
ルシウム、水酸化カルシウム等を添加することによって
行われる。一般には２〜10mM濃度になるような量を添加
すると、目的のカルシウム結合部位を有するトロンビン
結合性物質のみが、カルシウムと結合して構造変化をき
たす。
この構造変化を特異的に認識するモノクローナル抗体
は、例えば前記のヒト胎盤より抽出した分子量約71,000
のトロンビン結合性物質で免疫したマウス脾臓細胞とマ
ウス骨髄腫細胞P3−Ag8−γとを細胞融合し、抗体を産
生するハイブリドーマを選択し、更にEDTA（エチレンジ
アミン四酢酸）の存在下でトロンビン結合性物質とは免
疫反応を行わないもの、すなわちカルシウムイオンによ
る構造変化を認識する抗体を産生するハイブリドーマを
選択し、これにより常法によって製造することができる
（特開昭64−45398号）。免疫吸着剤としては、このモ
ノクローナル抗体とデキストランゲル、アガロースゲ
ル、ポリビニルゲル等の不溶性担体とを結合させたモノ
クローナル抗体結合担体を利用するのが好ましい。免疫
吸着カラムからの溶出は、例えばEDTAを含有する緩衝液
で行うことができる。
分子量分画法としては、イオン交換樹脂を用いる高速液
体クロマトグラフィー、電気泳動法等が採用される。高
速液体クロマトグラフィーに用いるイオン交換樹脂とし
ては、アニオン交換樹脂が好ましく、例えばTSKgel DEA
E−5PW、同2SW、同3SW（東洋曹達社製）、Mono Q HR5/5
（ファルマシア社製）などを例示できる。電気泳動法と
しては通常の方法、例えばSDS−ポリアクリルアミドゲ
ルを用いるLaemmliの方法〔Nature,227,680〜685（197
0）〕などを採用することができる。
本発明の方法（２）において用いられる細胞は、ヒトに
由来する細胞であって、本発明のトロンビン結合性物質
を産生する能力を有するものであれば何れでもよい。こ
のような細胞としては、例えばヒト胎児の腎臓、肺、小
腸、皮膚、心臓等に由来する細胞、ヒト成人の腎臓、
肺、包皮、胎盤、リンパ球等に由来する細胞が挙げられ
る。
細胞の組織培養は、通常の動物細胞の培養に用いられる
方法、例えば「Tissue Culture Methods and Applicati
ons」（P.K.Kruse and M.K.Patters−on,Academic Pres
s,1973）に記載の方法に準じて行なうことができる。
培養液からの本発明トロンビン結合性物質の分離精製
は、前記（１）の方法を利用することができる。
一般に、動物細胞を組織培養する際に用いられる培地は
カルシウムイオンを含有しているため、産生された培養
液中のトロンビン結合性物質は構造変化をきたしている
が、カルシウムイオンを含有していない培地を使用する
ときは、免疫吸着カラムクロマトグラフィーを行なう前
にカルシウムイオン処理を行なう必要がある。この処理
はカルシウム化合物、例えば塩化カルシウム、炭酸カル
シウム、水酸化カルシウム等を添加することによって行
なわれる。一般には２〜10mM濃度になるような量を添加
すると、目的のカルシウム結合部位を有するトロンビン
結合性物質のみが、カルシウムと結合して構造変化をき
たす。
このようにして得られるトロンビン結合性物質（Ａ）及
び（Ｂ）は次の性質を有する。
（ａ）分子量 （Ａ）還元状態で90,000〜92,000 非還元状態で55,000〜58,000 （Ｂ）還元状態で98,00〜105,000 非還元状態で60,000〜65,000 測定法:Laemmliの方法に準じて10％のアクリルアミド−
0.8％ビスアクリルアミドを用いるSDS−PAGEで測定し
た。標準蛋白として、バイオランドSDS−PAGEスタンダ
ード高分子用（日本バイオラッドラポラトリー社製）を
用いた。
（ｂ）等電点 （Ａ）pH6.0〜6.8 （Ｂ）pH5.8〜6.5 測定法:Pharmacia Phast System〔プレート:IEF（３−
９）〕を用い、等電点電気泳動法により測定した。
（ｃ）アミノ酸組成 スパックスマンらの方法〔Anal.Chem.,30,1190（195
8）〕に従い、ベックマン6300E型アミノ酸分析装置（ベ
ックマン社製）を用いてアミノ酸組成分析を行った結果
を第１表に示す。
なお、比較例として下記の文献に記載のトロンビン結合
性物質につき、各文献に記載のデーターより、同じ基準
で計算したものを併記した。
I.J.Biol.Chem.,259,12246（1984） II.国際公開公報WO87/00050 （ｄ）糖組成 糖自動分析装置を用いて糖組成分析を行った結果を第２
表に示す。
（ｅ）親和性 トロンビンに対し強い親和性を有する。
ジイソプロピルフォスフォロ−トロンビン−アガロース
〔J.Biol.Chem.,245,3059〜3065（1970）参照〕を用い
るクロマト処理で本物質（Ａ）及び（Ｂ）は何れも100
％吸着した。
（ｆ）活性 トロンビンと結合してプロテインＣを活性化する。
測定法：ヒト胎盤由来トロンボモジュリンまたは本物質
の0.02Mトリス−塩酸−0.15M塩化ナトリウム緩衝液（pH
7.5,以下TBSと称する）溶液（5ng/ml）10μｌ、ヒトプ
ロティンＣのTBS溶液（１μＭ）30μｌ並びに１％牛血
清アルブミン及び5mM塩化カルシウムを含有するTBS10μ
ｌを混合し、ヒトトロンビンのTBS溶液（5U/ml）50μｌ
を加えて37℃で30分間反応させた。反応液にヒトATIII
のTBS溶液（50μg/ml）100μｌを加え、37℃で10分間反
応させた。更にこの反応液Boc−Leu−Ser−Thr−Arg−M
CM基質のTBS溶液（200μＭ）200μｌを加えて37℃で10
分間反応させた。反応液に20％酢酸600μｌを加えて反
応を停止させ、生じたAMCの濃度を、蛍光光度計を用い
て励起波長380nm、発光波長460nmで測定した。この結果
を第３表に示す。
血縁の凝固時間を延長する。
測定法：ウシトロンビン（持田製薬製）の10mM塩化カル
シウム含有TBS溶液（0.05U/ml）200μｌに被験物質のTB
S溶液（10μg/ml）10μｌを加え、37℃で30分間反応さ
せた後、ヒト血漿200μｌを加え、直ちにフィブロメー
ターを用いて凝固時間を測定した。この結果を第４表に
示す。
（ｇ）安定性 変性剤（ドデシル硫酸ナトリウム，尿素）に対して安
定。
測定法：本物質（Ａ）又は（Ｂ）（45μｇ）を第５表に
示す条件下、37℃、60分処理した。処理後、TBSで100倍
に希釈し、活性を測定した。結果を第５表に示す。
〔発明の効果〕 本発明のトロンビン結合性物質（Ａ）及び（Ｂ）はカル
シウム結合部位が欠損していない高分子量のものである
ので、従来の尿由来の低分子量のトロンビン結合性物質
とは異って、ネイティブに近い薬理効果が期待できる。
更に、本発明によれば、斯かるトロンビン結合性物質を
大量に入手可能なヒト尿又は組織由来細胞を原料とし、
工業的に製造することができる。
〔実施例〕
次に実施例を挙げて説明する。
実施例１ 新鮮尿600lを6Nの水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH9.
0に調整し、４℃で一夜放置した。生じた沈澱を除去し
たのち、予めpHを9.0に調整したQAE−セファデックスＡ
−50を8l加え、４℃で２時間攪拌した。ガラスフィルタ
ーを用いて樹脂を濾過し、0.05M塩化ナトリウム含有0.0
2Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.6）10lで洗浄したのち、2M
塩化ナトリウム含有0.02Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.6）
20lで溶出した。溶出液に硫酸アンモニウムを80％飽和
になるように加えて４℃で一夜放置した。生じた沈澱を
遠心分離法で採取し、0.05M塩化ナトリウム含有0.02Mト
リス−塩酸緩衝液（pH7.6）10lに溶解して、同緩衝液10
0lで３回透析した。透析液に塩化カルシウムを5mMにな
るように加え、ジイソプロピルフォスフォロ−トロンビ
ン−アガロースのカラムに付した。0.05M塩化ナトリウ
ム及び5mM塩化カルシウムを含有する0.02Mトリス−塩酸
緩衝液（pH7.6）20lで洗浄したのち、0.05M塩化ナトリ
ウム及び5mMエチレンジアミン四酢酸を含有する上記緩
衝液5lと1M塩化ナトリウム及び5mMのエチレンジアミン
四酢酸を含有する上記緩衝液5lの間で濃度勾配法によっ
て溶出し、100mlずつ分取した。活性部分を集め、0.05M
塩化ナトリウム含有上記緩衝液100lに対して３回透析し
た。透析液をモノクローナル抗体（TM−A91）とアガロ
ースよりなる免疫吸着剤（特開昭64−45398号）500mlの
カラムに付し、1M塩化カルシウム含有上記緩衝液300lで
洗浄したのち、3Mチオシアン酸ナトリウム及び5mMエチ
レンジアミン四酢酸を含有する上記緩衝液5lで溶出し
た。溶出液を0.0.05M塩化ナトリウム含有上記緩衝液50l
で３回、次いで脱イオン水100lで透析したのち凍結乾燥
して10mgの粉末を得た。
この粉末10mgを１％ドデシル硫酸ナトリウム、0.5％グ
リセロール及び0.01％ブロムフェノールブルーを含有す
る0.02Mトリス−塩酸緩衝液80mlに溶解し、100℃で５分
間加熱した。加熱後10％アクリルアミド−0.8％ビスア
クリルアミドを用い、Lammliの方法〔Nature,227,680〜
685（1979）〕に準じてSDS−PAGEを行い、活性区分を切
り出した。得られた２つの活性区分を各々水洗後、１％
ドデシル硫酸ナトリウム含有0.02Mトリス−塩酸緩衝液
（pH7.5）に浸し、４℃で一夜静置して目的物を溶出し
た。溶出液を濃縮後凍結乾燥すると、（Ａ）が6mg、
（Ｂ）が2mg得られた。
実施例２ 新鮮尿１を0.05M塩化ナトリウム含有0.02Mトリス−塩
酸緩衝液（pH7.4）5lに対して３回透析したのち、塩化
カルシウムを5mMになるように加えて、実施例１と同様
の免疫吸着剤1mlのカラムに付した。0.05M塩化ナトリウ
ム、5mM塩化カルシウム及び0.05％Tween20含有上記緩衝
液100ml、次いで1M塩化ナトリウムおよび5mM塩化カルシ
ウム含有上記緩衝液100mlで洗浄したのち、3Mチオシア
ン酸ナトリウム及び5mMエチレンジアミン四酢酸含有上
記緩衝液100mlで溶出した。溶出液を0.05M塩化ナトリウ
ム含有上記緩衝液500mlに対して４℃で３回透析したの
ち、凍結乾燥して５μｇの粉末を得た。
以下実施例１の後半と同様にSDS−PAGEを行い、（Ａ）
３μｇ、（Ｂ）１μｇを得た。
実施例３ ヒト新鮮尿１トンをモノクローナル抗体（TM−A73）とQ
AE−セファデックスＡ−50よりなる免疫吸着カラム及び
ジイソプロピルフォスフォロ−トロンビン−アガロース
カラムで順次精製したのち、ミリポアイマーシブルCX−
10で5mlに濃縮した。濃縮液をウルトロゲルAcA34のカラ
ム（2.7×90cm）に付し、トリス−塩酸緩衝液で溶出し
た。24mlずつ分画し、第90〜97画分より本物質（Ｂ）5m
g、次いで第127〜145画分より本物質（Ａ）3mgが得られ
た。
実施例４ ヒト成人腎細胞２×105個を75cm3の平底容器に接種し、
56℃で30分間加熱処理したウシ胎児血清を10％含有する
MEM25mlを分注した。炭酸ガス培養装置を用い、37℃、
炭酸ガス５％の条件下で細胞が単層に増殖するまで培養
した。増殖を確認した後、培養液を除去し、細胞の表面
をリン酸緩衝液で充分に洗浄して、20mg/mlのプロテオ
−スペプトンを含有するMEM培地で更に７日間培養し
た。
培養上清液に含まれるトロンビン結合性物質をモノクロ
ーナル抗体Ａ−59及びＡ−73を用いるBLISA法によって
測定した結果は、10ng/mlであった。
ヒト成人包皮細胞を用いて上記と同様に培養した培養上
清中のトロンビン結合性物質の含量は、40ng/mlであっ
た。
実施例５ 実施例４と同様にして培養したヒト成人腎細胞の培養液
を１をモノクローナル抗体Ａ−73を結合したセファロ
ース（2mgIgG/ml樹脂）1mlのカラムに通した。1M塩化ナ
トリウム加0.02Mトリス−塩酸緩衝液（pH7.4）20mlでカ
ラムを洗浄した後、2Mチオシアン酸ナトリウム及び5mM
のEDTAを含む前記緩衝液5mlで溶出し、溶出液を0.1M塩
化ナトリウム加0.02Mトリス−塩酸緩衝液に対して透析
した。
透析液をウルトロゲルAcA34のカラム（1.7×90cm）に通
し、0.15M塩化ナトリウム加0.02Mトリス−塩酸緩衝液
（pH7.4）で0.1ml/分の流速で溶出し、2.4mlずつ分取し
た。フラクションNo.90〜95を合し（フラクション
Ｉ）、実施例４と同様のELISA法により測定してトロン
ビン結合性物質４μｇの存在を確認した。また、フラク
ションNo.125〜135（フラクションII）にトロンビン結
合性物質３μｇが確認された。
実施例６ 実施例５で得られたフラクションＩ及びII並びに実施例
１〜３の尿中トロンビン結合性物質（Ａ）及び（Ｂ）を
Laemmliの方法（Nature,227,680〜685）に従い、SDS−P
AGEを行なった。
ゲルをMatsudairaの方法〔J.Biol.Chem.,262（21）,100
35〜10038〕に従い、PVDF膜に転写した。次いでPVDF膜
を0.1％牛血清アルブミンを含有するTBS溶液中で室温に
て２時間反応させた。溶液を捨て、0.05％Tween20−TBS
で充分洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼで標識
したモノクローナル抗体Ａ−73を含有する0.05％Tween2
0−TBS中、室温で１時間反応させた。溶液を捨て、0.05
％Tween20−TBSで充分洗浄した後、３−アミノ−９−エ
チルエルバゾール5mg及び30％過酸化水素水25μｌを含
有する50mM酢酸緩衝液（pH5.0）50mlに入れて発色させ
た。フラクションＩは尿中トロンビン結合性物質（Ｂ）
と同じ位置に発色し、フラクションIIは尿中トロンビン
結合性物質（Ａ）と同じ位置に発色した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＣＢ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の性質、 （ａ）分子量；還元状態で90,000〜92,000、 非還元状態で55,000〜58,000 （ｂ）等電点;pH6.0〜6.8 （ｃ）親和性；トロンビンに対し強い親和性を有する。 （ｄ）活性；トロンビンと結合してプロテインＣを活
    性化する。 血液の凝固時間を延長する。 （ｅ）安定性；変性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、尿
    素）に対して安定。 （ｆ）アミノ酸組成；アスパラギン酸 9.59％ スレオニン 4.45％ セリン 5.42％ グルタミン酸 11.29％ プロリン 8.86％ グリシン 10.26％ アラニン 10.88％ 1/2シスチン 8.27％ バリン 5.54％ メチオニン 0.78％ イソロイシン 2.84％ ロイシン 7.15％ チロシン 2.25％ フェニルアラニン 3.50％ ヒスチジン 2.33％ リジン 1.12％ トリプトファン 1.18％ アルギニン 4.26％ を有するヒト尿由来のトロンビン結合性物質。
  2. 【請求項２】次の性質、 （ａ）分子量；還元状態で98,000〜105,000、 非還元状態で60,000〜65,000 （ｂ）等電点;pH5.8〜6.5 （ｃ）親和性；トロンビンに対し強い親和性を有する。 （ｄ）活性；トロンビンと結合してプロテインＣを活
    性化する。 血液の凝固時間を延長する。 （ｅ）安定性；変性剤（ドデシル硫酸ナトリウム、尿
    素）に対して安定。 （ｆ）アミノ酸組成；アスパラギン酸 8.88％ スレオニン 4.80％ セリン 5.78％ グルタミン酸 9.76％ プロリン 10.21％ グリシン 10.35％ アラニン 10.62％ 1/2シスチン 8.63％ バリン 5.71％ メチオニン 0.88％ イソロイシン 2.65％ ロイシン 7.38％ チロシン 2.12％ フェニルアラニン 3.53％ ヒスチジン 2.44％ リジン 1.02％ トリプトファン 1.06％ アルギニン 4.19％ を有するヒト尿由来のトロンビン結合性物質。
  3. 【請求項３】ヒト尿をカルシウムイオンで処理したの
    ち、トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる構
    造変化を認識するモノクローナル抗体を用いる免疫吸着
    カラムクロマトグラフィー、次いで分子量分画法で分
    離、精製することを特徴とする請求項１記載のトロンビ
    ン結合性物質の製法。
  4. 【請求項４】ヒト尿をカルシウムイオンで処理したの
    ち、トロンビン結合性物質のカルシウムイオンによる構
    造変化を認識するモノクローナル抗体を用いる免疫吸着
    カラムクロマトグラフィー、次いで分子量分画法で分
    離、精製することを特徴とする請求項２記載のトロンビ
    ン結合性物質の製法。
  5. 【請求項５】ヒト組織由来細胞を組織培養し、その培養
    液から分離採取することを特徴とする請求項１記載のト
    ロンビン結合性物質の製法。
  6. 【請求項６】ヒト組織由来細胞を組織培養し、その培養
    液から分離採取することを特徴とする請求項２記載のト
    ロンビン結合性物質の製法。
  7. 【請求項７】分離採取が、カルシウムイオンによるトロ
    ンビン結合性物質の構造変化を認識するモノクローナル
    抗体を用いる免疫吸着カラムクロマトグラフィー、次い
    で分子量分画法で、培養液を分離、精製することによる
    ものである請求項５または６記載の製法。
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