JPH07101875A - 膀胱ガンに対して高い抗腫瘍活性を有するカサガイヘモシアニン - Google Patents
膀胱ガンに対して高い抗腫瘍活性を有するカサガイヘモシアニンInfo
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- JPH07101875A JPH07101875A JP6104838A JP10483894A JPH07101875A JP H07101875 A JPH07101875 A JP H07101875A JP 6104838 A JP6104838 A JP 6104838A JP 10483894 A JP10483894 A JP 10483894A JP H07101875 A JPH07101875 A JP H07101875A
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- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 高い免疫原性、特に膀胱ガンに対して高い抗
腫瘍活性を有する安定化カサガイヘモシアニン組成物を
提供する。 【構成】 （ｉ）完全な非分解サブユニットのＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析に基づく分子量が約４００，０００であ
り、（ｉｉ）沈降平衡法及び／又は沈降速度法による超
遠心分析に基づいて少なくとも約５０％のダイデカマー
又はこれよりも大きいＫＬＨマルチマーが含まれている
安定化ＫＬＨ組成物を提供する。ＫＬＨ組成物は、好ま
しくはカルシウム及びマグネシウムを含む等張緩衝液に
溶解させて、貯蔵することによって４℃で安定化する。
ＫＬＨを調製又は貯蔵中に凍結も凍結乾燥もしなかった
ことは重要である。ＫＬＨ組成物は高い免疫原性、特に
高い抗腫瘍活性を示す。ＫＬＨを凍結するか又は凍結乾
燥すれば、この活性は低下する。本発明のＫＬＨ組成物
はマウス膀胱腫瘍モデルで高い抗腫瘍活性を示し、従っ
て膀胱ガンのための新規で、有用な抗腫瘍免疫治療薬と
なる。
腫瘍活性を有する安定化カサガイヘモシアニン組成物を
提供する。 【構成】 （ｉ）完全な非分解サブユニットのＳＤＳ−
ＰＡＧＥ分析に基づく分子量が約４００，０００であ
り、（ｉｉ）沈降平衡法及び／又は沈降速度法による超
遠心分析に基づいて少なくとも約５０％のダイデカマー
又はこれよりも大きいＫＬＨマルチマーが含まれている
安定化ＫＬＨ組成物を提供する。ＫＬＨ組成物は、好ま
しくはカルシウム及びマグネシウムを含む等張緩衝液に
溶解させて、貯蔵することによって４℃で安定化する。
ＫＬＨを調製又は貯蔵中に凍結も凍結乾燥もしなかった
ことは重要である。ＫＬＨ組成物は高い免疫原性、特に
高い抗腫瘍活性を示す。ＫＬＨを凍結するか又は凍結乾
燥すれば、この活性は低下する。本発明のＫＬＨ組成物
はマウス膀胱腫瘍モデルで高い抗腫瘍活性を示し、従っ
て膀胱ガンのための新規で、有用な抗腫瘍免疫治療薬と
なる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、高い免疫原性、特に膀
胱ガンに対して高い抗腫瘍活性を有するカサガイ（ｋｅ
ｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ）に
関する。本発明は特に、分子量が約８〜１０ミリオンの
ダイデカマー又はこれよりも大きいＫＬＨマルチマーを
５０％より多く含むように処方されたＫＬＨからなる免
疫原性剤に関する。免疫原性剤はガン治療薬として、ま
たアジュバント又はキャリヤータンパク質として有用で
ある。
胱ガンに対して高い抗腫瘍活性を有するカサガイ（ｋｅ
ｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン（ＫＬＨ）に
関する。本発明は特に、分子量が約８〜１０ミリオンの
ダイデカマー又はこれよりも大きいＫＬＨマルチマーを
５０％より多く含むように処方されたＫＬＨからなる免
疫原性剤に関する。免疫原性剤はガン治療薬として、ま
たアジュバント又はキャリヤータンパク質として有用で
ある。
【０００２】
【従来の技術】ヘモシアニンが最も重要な免疫原のひと
つであることは数十年来知られている。カサガイヘモシ
アニン（ＫＬＨ：軟体動物の原始腹足類、Ｍｅｇａｔｈ
ｕｒａｃｒｅｎｕｌａｔａに由来）は最も広範に使用さ
れているもののひとつであり、文献（１−４）で徹底的
に研究されている。従って、アジュバントを含まないＫ
ＬＨを一度皮下注射すると、実質的に１００％の動物
（例えばヒト）で強い抗体応答が認められる。
つであることは数十年来知られている。カサガイヘモシ
アニン（ＫＬＨ：軟体動物の原始腹足類、Ｍｅｇａｔｈ
ｕｒａｃｒｅｎｕｌａｔａに由来）は最も広範に使用さ
れているもののひとつであり、文献（１−４）で徹底的
に研究されている。従って、アジュバントを含まないＫ
ＬＨを一度皮下注射すると、実質的に１００％の動物
（例えばヒト）で強い抗体応答が認められる。
【０００３】ＫＬＨの精製については様々な方法（例え
ば分画遠心（５）、ゲル透過クロマトグラフィーの後に
イオン交換クロマトグラフィー（２）、及び分画遠心の
後にゲル透過クロマトグラフィー（６））がよく知られ
ている。市販の精製ＫＬＨは通常、精製後に凍結又は凍
結乾燥されたものである。
ば分画遠心（５）、ゲル透過クロマトグラフィーの後に
イオン交換クロマトグラフィー（２）、及び分画遠心の
後にゲル透過クロマトグラフィー（６））がよく知られ
ている。市販の精製ＫＬＨは通常、精製後に凍結又は凍
結乾燥されたものである。
【０００４】ＫＬＨ及び他の軟体動物ヘモシアニンの溶
液構造は詳しく研究されている（７−１０）。従って、
ＫＬＨが、分子量が４００〜５００，０００で、結合に
よってデカマー（１０量体）、ダイデカマー（２０量
体）及びこれよりも大きい粒子を生成するグリコシル化
ポリペプチドサブユニットを含んでいることは知られて
いる。これらのマルチマー構造の特性は超遠心技術によ
って分析されており、沈降係数は解離したサブユニット
で１１−１９Ｓ、ダイデカマーマルチマーで９２−１０
７Ｓである（１、２）。種々の要因が軟体動物ヘモシア
ニン（例えばＫＬＨ）の寸法分布に影響し得ることも知
られている（１１、１２）。これらの要因には、イオン
強度、ｐＨ、温度、ｐＯ2並びにある二価カチオン（特
にカルシウム及びマグネシウム）の利用可能性が含まれ
る。
液構造は詳しく研究されている（７−１０）。従って、
ＫＬＨが、分子量が４００〜５００，０００で、結合に
よってデカマー（１０量体）、ダイデカマー（２０量
体）及びこれよりも大きい粒子を生成するグリコシル化
ポリペプチドサブユニットを含んでいることは知られて
いる。これらのマルチマー構造の特性は超遠心技術によ
って分析されており、沈降係数は解離したサブユニット
で１１−１９Ｓ、ダイデカマーマルチマーで９２−１０
７Ｓである（１、２）。種々の要因が軟体動物ヘモシア
ニン（例えばＫＬＨ）の寸法分布に影響し得ることも知
られている（１１、１２）。これらの要因には、イオン
強度、ｐＨ、温度、ｐＯ2並びにある二価カチオン（特
にカルシウム及びマグネシウム）の利用可能性が含まれ
る。
【０００５】膀胱ガンは四番目に多いヒト悪性腫瘍であ
り、年間で新規症例約４９，０００件、死亡９，７００
件が報告されている（１３）。膀胱の腫瘍はしばしば外
科的切除によって除去され得るが、このような治療は常
に治効的というわけではない。腫瘍を外科的に除去した
患者のうち５０〜８０％が再発侵入性疾病にかかること
が報告されている（１４）。従って、原発性疾病を治療
するだけでなく、再発性悪性腫瘍を予防するための治療
方法が必要となる。
り、年間で新規症例約４９，０００件、死亡９，７００
件が報告されている（１３）。膀胱の腫瘍はしばしば外
科的切除によって除去され得るが、このような治療は常
に治効的というわけではない。腫瘍を外科的に除去した
患者のうち５０〜８０％が再発侵入性疾病にかかること
が報告されている（１４）。従って、原発性疾病を治療
するだけでなく、再発性悪性腫瘍を予防するための治療
方法が必要となる。
【０００６】Ｍｏｒａｌｅｓ等（１５）は、免疫治療薬
カルメット−ゲラン菌（ＢＣＧ）の小胞内（即ち膀胱
内）投与による膀胱ガン治療の成功を発表した最初の人
物である。過去１５年間に入念に行われた他の研究によ
って、原発性膀胱腫瘍及び再発性膀胱腫瘍は共に、一般
には免疫療法の治療法に対して、特にＢＣＧ治療に対し
て応答性があることが判明した（１６、１７）。
カルメット−ゲラン菌（ＢＣＧ）の小胞内（即ち膀胱
内）投与による膀胱ガン治療の成功を発表した最初の人
物である。過去１５年間に入念に行われた他の研究によ
って、原発性膀胱腫瘍及び再発性膀胱腫瘍は共に、一般
には免疫療法の治療法に対して、特にＢＣＧ治療に対し
て応答性があることが判明した（１６、１７）。
【０００７】ＫＬＨは、ＫＬＨの皮内注射を受けた初期
膀胱ガン患者の腫瘍再発率が統計学的にかなり低下する
ことを開示したＯｌｓｓｏｎ等による研究（１８）で初
めて膀胱ガンの潜在的免疫治療薬として登場した。その
後、他の研究者が、ＫＬＨを膀胱内投与すると、再発性
疾病の発生率の低下（１９−２１）又は原発性腫瘍の治
療（２２）に効果的であるとするヒト臨床実験を論文に
した。ＫＬＨの抗腫瘍活性は、実験動物モデル：Ｌａｍ
ｍ等の病巣内マウス膀胱腫瘍モデルでも実証された（２
３−２５）。この実験モデルでは、処理前に動物の皮下
にＫＬＨで免疫感作しなければ、抗腫瘍活性が失われる
ことが観察された（２５）。要するに、ＫＬＨはヒト臨
床実験及び動物モデルで共に、膀胱ガンに対して免疫治
療活性を有することが判明した。
膀胱ガン患者の腫瘍再発率が統計学的にかなり低下する
ことを開示したＯｌｓｓｏｎ等による研究（１８）で初
めて膀胱ガンの潜在的免疫治療薬として登場した。その
後、他の研究者が、ＫＬＨを膀胱内投与すると、再発性
疾病の発生率の低下（１９−２１）又は原発性腫瘍の治
療（２２）に効果的であるとするヒト臨床実験を論文に
した。ＫＬＨの抗腫瘍活性は、実験動物モデル：Ｌａｍ
ｍ等の病巣内マウス膀胱腫瘍モデルでも実証された（２
３−２５）。この実験モデルでは、処理前に動物の皮下
にＫＬＨで免疫感作しなければ、抗腫瘍活性が失われる
ことが観察された（２５）。要するに、ＫＬＨはヒト臨
床実験及び動物モデルで共に、膀胱ガンに対して免疫治
療活性を有することが判明した。
【０００８】
【発明が解決しようする課題】ＫＬＨの構造、免疫原性
及び抗腫瘍活性に関する文献及び従来技術は多岐にわた
るが、これら２つの特性の関連又はＫＬＨの免疫原性の
向上の問題に応える研究は行われていない。従って、Ｋ
ＬＨの免疫原性及び抗腫瘍活性を高めることが本発明の
目的である。
及び抗腫瘍活性に関する文献及び従来技術は多岐にわた
るが、これら２つの特性の関連又はＫＬＨの免疫原性の
向上の問題に応える研究は行われていない。従って、Ｋ
ＬＨの免疫原性及び抗腫瘍活性を高めることが本発明の
目的である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、（ｉ）完全な
非分解サブユニットのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく分
子量が約４００，０００であり、（ｉｉ）沈降平衡法及
び／又は沈降速度法による超遠心分析に基づいて少なく
とも約５０％のダイデカマー又はこれよりも大きいＫＬ
Ｈマルチマーが含まれている安定化ＫＬＨ組成物に関す
る。ＫＬＨ組成物は、カルシウム及びマグネシウムを含
む等張緩衝液に溶解させて、貯蔵することによって４℃
で安定化する。ＫＬＨを調製又は貯蔵中に凍結も凍結乾
燥もしなかったことは重要である。何故ならば、このよ
うな処理は恐らくＫＬＨマルチマーの寸法分布を変えて
抗腫瘍活性を低下させるからである。ＫＬＨ組成物は高
い免疫原性、特に高い抗腫瘍活性を示す。ＫＬＨを凍結
するか又は凍結乾燥すれば、この活性は低下する。本発
明のＫＬＨ組成物はマウス膀胱腫瘍モデルで高い抗腫瘍
活性を示し、従って新規で、有用な抗腫瘍免疫治療薬と
なる。
非分解サブユニットのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づく分
子量が約４００，０００であり、（ｉｉ）沈降平衡法及
び／又は沈降速度法による超遠心分析に基づいて少なく
とも約５０％のダイデカマー又はこれよりも大きいＫＬ
Ｈマルチマーが含まれている安定化ＫＬＨ組成物に関す
る。ＫＬＨ組成物は、カルシウム及びマグネシウムを含
む等張緩衝液に溶解させて、貯蔵することによって４℃
で安定化する。ＫＬＨを調製又は貯蔵中に凍結も凍結乾
燥もしなかったことは重要である。何故ならば、このよ
うな処理は恐らくＫＬＨマルチマーの寸法分布を変えて
抗腫瘍活性を低下させるからである。ＫＬＨ組成物は高
い免疫原性、特に高い抗腫瘍活性を示す。ＫＬＨを凍結
するか又は凍結乾燥すれば、この活性は低下する。本発
明のＫＬＨ組成物はマウス膀胱腫瘍モデルで高い抗腫瘍
活性を示し、従って新規で、有用な抗腫瘍免疫治療薬と
なる。
【００１０】本明細書では以下の略字を使用する。
【００１１】ｐ−ＫＬＨは、ＫＬＨが等張緩衝液中にあ
る精製ＫＬＨである。ＫＬＨは精製プロセス中に凍結も
凍結乾燥もしなかった。ｐ−ＫＬＨは凍結も凍結乾燥も
していない。
る精製ＫＬＨである。ＫＬＨは精製プロセス中に凍結も
凍結乾燥もしなかった。ｐ−ＫＬＨは凍結も凍結乾燥も
していない。
【００１２】ｄ−ＫＬＨは、ｐ−ＫＬＨ中に存在するマ
ルチマーを解離した解離ＫＬＨである。
ルチマーを解離した解離ＫＬＨである。
【００１３】ｆ−ＫＬＨは、ｐ−ＫＬＨを少なくとも２
４時間凍結した凍結ＫＬＨである。
４時間凍結した凍結ＫＬＨである。
【００１４】ｌ−ＫＬＨは、ｐ−ＫＬＨを凍結乾燥した
凍結乾燥ＫＬＨである。
凍結乾燥ＫＬＨである。
【００１５】本発明は膀胱ガンに対して高い抗腫瘍活性
を有するＫＬＨ組成物に関する。この組成物は、生理学
的に許容できる等張緩衝液中にＫＬＨを含んでいる。等
張緩衝液は好ましくはカルシウム及びマグネシウムを含
んでいる。本発明の組成物中のＫＬＨは、（ｉ）ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析に基づく分子量が約４００，０００の完
全な非分解サブユニットと、（ｉｉ）少なくとも約５０
％のダイデカマー又はこれよりも大きいＫＬＨマルチマ
ーを含んでいる。ダイデカマー又はこれよりも大きいＫ
ＬＨマルチマーは、分子量が約８〜１０ミリオン、沈降
係数が約９２−１０７Ｓである。存在するダイデカマー
又はこれよりも大きいＫＬＨマルチマーの量は沈降平衡
法及び／又は沈降速度法による超遠心分析に基づく。Ｋ
ＬＨの単離、調製若しくは精製中又はＫＬＨ組成物の調
製及び貯蔵中は常にＫＬＨを凍結も凍結乾燥もしないこ
とが重要である。ＫＬＨ組成物は２〜１０℃で、好まし
くは４℃で貯蔵する。ＫＬＨ組成物はこのような条件下
で非常に安定する。ＫＬＨ組成物中のＫＬＨ濃度は０．
１〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２〜１０ｍｇ／ｌ、最
も好ましくは５ｍｇ／ｍｌである。
を有するＫＬＨ組成物に関する。この組成物は、生理学
的に許容できる等張緩衝液中にＫＬＨを含んでいる。等
張緩衝液は好ましくはカルシウム及びマグネシウムを含
んでいる。本発明の組成物中のＫＬＨは、（ｉ）ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析に基づく分子量が約４００，０００の完
全な非分解サブユニットと、（ｉｉ）少なくとも約５０
％のダイデカマー又はこれよりも大きいＫＬＨマルチマ
ーを含んでいる。ダイデカマー又はこれよりも大きいＫ
ＬＨマルチマーは、分子量が約８〜１０ミリオン、沈降
係数が約９２−１０７Ｓである。存在するダイデカマー
又はこれよりも大きいＫＬＨマルチマーの量は沈降平衡
法及び／又は沈降速度法による超遠心分析に基づく。Ｋ
ＬＨの単離、調製若しくは精製中又はＫＬＨ組成物の調
製及び貯蔵中は常にＫＬＨを凍結も凍結乾燥もしないこ
とが重要である。ＫＬＨ組成物は２〜１０℃で、好まし
くは４℃で貯蔵する。ＫＬＨ組成物はこのような条件下
で非常に安定する。ＫＬＨ組成物中のＫＬＨ濃度は０．
１〜２０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは２〜１０ｍｇ／ｌ、最
も好ましくは５ｍｇ／ｍｌである。
【００１６】本発明のＫＬＨ組成物は膀胱ガンに対して
高い抗腫瘍活性を示す。ＫＬＨ又はＫＬＨ組成物の調製
及び／又は貯蔵中の任意の時点でＫＬＨ又はＫＬＨ組成
物を凍結又は凍結乾燥すれば、このように高い活性は低
下する。（ａ）（アジュバントを含まない）ＫＬＨの注
射、（ｂ）ＫＬＨのアジュバントとしての使用、（ｃ）
ハプテン又は免疫原性の弱い抗原用キャリヤー免疫原と
してのＫＬＨの使用、及び（ｄ）ＫＬＨの抗腫瘍剤とし
ての使用で高い活性が見られる。本発明のＫＬＨ組成物
は、多くの腫瘍（例えば膀胱腫瘍であるが、これに限定
はされない）に対して高い抗腫瘍活性を示す。抗腫瘍に
有効な量のＫＬＨ組成物を用いて皮下免疫感作（２５）
した後に、ＫＬＨ組成物を従来技術に基づいて、好まし
くは膀胱内投与で腫瘍患者に投与する。即ち、好ましい
実施態様では、まず患者に本発明のＫＬＨ組成物を皮下
投与して免疫感作し、次いで週単位でＫＬＨ組成物を膀
胱内投与して処理する。
高い抗腫瘍活性を示す。ＫＬＨ又はＫＬＨ組成物の調製
及び／又は貯蔵中の任意の時点でＫＬＨ又はＫＬＨ組成
物を凍結又は凍結乾燥すれば、このように高い活性は低
下する。（ａ）（アジュバントを含まない）ＫＬＨの注
射、（ｂ）ＫＬＨのアジュバントとしての使用、（ｃ）
ハプテン又は免疫原性の弱い抗原用キャリヤー免疫原と
してのＫＬＨの使用、及び（ｄ）ＫＬＨの抗腫瘍剤とし
ての使用で高い活性が見られる。本発明のＫＬＨ組成物
は、多くの腫瘍（例えば膀胱腫瘍であるが、これに限定
はされない）に対して高い抗腫瘍活性を示す。抗腫瘍に
有効な量のＫＬＨ組成物を用いて皮下免疫感作（２５）
した後に、ＫＬＨ組成物を従来技術に基づいて、好まし
くは膀胱内投与で腫瘍患者に投与する。即ち、好ましい
実施態様では、まず患者に本発明のＫＬＨ組成物を皮下
投与して免疫感作し、次いで週単位でＫＬＨ組成物を膀
胱内投与して処理する。
【００１７】ＫＬＨは、従来の手順に従って新しく採取
した血リンパから精製する。ＫＬＨの精製中常に血リン
パ及び／又はＫＬＨを凍結も凍結乾燥もしないことが重
要である。精製ＫＬＨを凍結も凍結乾燥もしないことも
重要である。精製ＫＬＨを、カルシウム及びマグネシウ
ムを含む等張緩衝液中、約４℃で貯蔵して安定化させ
る。ＫＬＨの適切な精製／貯蔵方法を以下の実施例１で
説明する。しかしながら、前述の基準に適う他の方法を
使用してもよい。
した血リンパから精製する。ＫＬＨの精製中常に血リン
パ及び／又はＫＬＨを凍結も凍結乾燥もしないことが重
要である。精製ＫＬＨを凍結も凍結乾燥もしないことも
重要である。精製ＫＬＨを、カルシウム及びマグネシウ
ムを含む等張緩衝液中、約４℃で貯蔵して安定化させ
る。ＫＬＨの適切な精製／貯蔵方法を以下の実施例１で
説明する。しかしながら、前述の基準に適う他の方法を
使用してもよい。
【００１８】
【実施例】以下の実施例で本発明を説明する。実施例は
例示的であって、本発明を何等限定するものではない。
従来技術でよく知られている標準的な技術又は特に以下
で説明する技術を使用した。
例示的であって、本発明を何等限定するものではない。
従来技術でよく知られている標準的な技術又は特に以下
で説明する技術を使用した。
【００１９】実施例１ ＫＬＨの精製 新しく採取した血リンパから調製された、約３０ｍｇ／
ｍＬのＫＬＨを含む飽和硫酸アンモニウムスラリーをＰ
ａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｍａｒｉｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｖｅｎｉｃｅ， Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａから購入した。Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ等の指
針（２８）に従って血リンパを採取した。カサガイを洗
浄し、切除し、４℃で約１時間かけて採血した。更に血
リンパを回収するためにマッサージは行わなかった。６
５％飽和するまで固体硫酸アンモニウムを加えて（４３
０ｇ／Ｌ）ＫＬＨを沈殿させた。硫酸アンモニウムスラ
リーを遠心分離で採取し、約３０〜４０ｍｇ／ｍＬのタ
ンパク質を含む溶液を得た。この溶液を、マグネシウム
及びカルシウムを含むリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）溶液
［ＫＨ2ＰＯ4（１．５ｍＭ）、Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ
（８．１ｍＭ）、ＮａＣｌ（１３６．９ｍＭ）、ＫＣｌ
（２．７ｍＭ）、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（０．９ｍＭ）、
及びＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ（０．５ｍＭ）；ｐＨ＝７．３
〜７．５］で約１０〜２０ｍｇ／ｍＬに希釈した。低速
（約１，０００〜３，０００×ｇ）で２０分間遠心分離
して、粒状物及び非溶解タンパク質を除去した。溶解Ｋ
ＬＨを含む上清を４１，４００×ｇで１２〜１８時間遠
心分離にかけた。主に高分子量ＫＬＨからなるペレット
をＰＢＳに溶解して、前述したように４１，４００×ｇ
で再度遠心分離にかけた。得られたペレットを再度ＰＢ
Ｓに溶解し、最終濃度が５ｍｇ／ｍＬになるように調整
し、微孔性膜での超濾過で滅菌し、４℃で貯蔵した。こ
のＫＬＨ溶液を以後、精製ＫＬＨ（ｐ−ＫＬＨ）と称す
る。
ｍＬのＫＬＨを含む飽和硫酸アンモニウムスラリーをＰ
ａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｍａｒｉｎｅ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ， Ｉｎｃ．， Ｖｅｎｉｃｅ， Ｃａｌｉｆ
ｏｒｎｉａから購入した。Ｖａｎｄｅｎｂａｒｋ等の指
針（２８）に従って血リンパを採取した。カサガイを洗
浄し、切除し、４℃で約１時間かけて採血した。更に血
リンパを回収するためにマッサージは行わなかった。６
５％飽和するまで固体硫酸アンモニウムを加えて（４３
０ｇ／Ｌ）ＫＬＨを沈殿させた。硫酸アンモニウムスラ
リーを遠心分離で採取し、約３０〜４０ｍｇ／ｍＬのタ
ンパク質を含む溶液を得た。この溶液を、マグネシウム
及びカルシウムを含むリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）溶液
［ＫＨ2ＰＯ4（１．５ｍＭ）、Ｎａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ
（８．１ｍＭ）、ＮａＣｌ（１３６．９ｍＭ）、ＫＣｌ
（２．７ｍＭ）、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ（０．９ｍＭ）、
及びＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ（０．５ｍＭ）；ｐＨ＝７．３
〜７．５］で約１０〜２０ｍｇ／ｍＬに希釈した。低速
（約１，０００〜３，０００×ｇ）で２０分間遠心分離
して、粒状物及び非溶解タンパク質を除去した。溶解Ｋ
ＬＨを含む上清を４１，４００×ｇで１２〜１８時間遠
心分離にかけた。主に高分子量ＫＬＨからなるペレット
をＰＢＳに溶解して、前述したように４１，４００×ｇ
で再度遠心分離にかけた。得られたペレットを再度ＰＢ
Ｓに溶解し、最終濃度が５ｍｇ／ｍＬになるように調整
し、微孔性膜での超濾過で滅菌し、４℃で貯蔵した。こ
のＫＬＨ溶液を以後、精製ＫＬＨ（ｐ−ＫＬＨ）と称す
る。
【００２０】得られる溶液のイオン強度が哺乳動物の細
胞とほぼ等張状態になるように、前記ＰＢＳ溶液で規定
した緩衝液イオン及び塩酸塩の濃度を様々に組み合わせ
て調整してもよいことは当業者には自明であろう。従っ
て、前述したＰＢＳの規定内容は本発明の範囲を限定す
るものではなく、むしろＫＬＨの免疫原性及び抗腫瘍活
性を最適に保持する組成物の処方の指針として役立つも
のである。本発明の重要な特徴（例えば安定化二価カチ
オンの存在、又は完全な非分解ＫＬＨサブユニット及び
少なくとも約５０％のダイデカマー若しくはこれよりも
大きいマルチマーの存在と相容れるｐＨ範囲）を保持す
る非等張組成物が本発明の範囲に包含されることも理解
されよう。
胞とほぼ等張状態になるように、前記ＰＢＳ溶液で規定
した緩衝液イオン及び塩酸塩の濃度を様々に組み合わせ
て調整してもよいことは当業者には自明であろう。従っ
て、前述したＰＢＳの規定内容は本発明の範囲を限定す
るものではなく、むしろＫＬＨの免疫原性及び抗腫瘍活
性を最適に保持する組成物の処方の指針として役立つも
のである。本発明の重要な特徴（例えば安定化二価カチ
オンの存在、又は完全な非分解ＫＬＨサブユニット及び
少なくとも約５０％のダイデカマー若しくはこれよりも
大きいマルチマーの存在と相容れるｐＨ範囲）を保持す
る非等張組成物が本発明の範囲に包含されることも理解
されよう。
【００２１】ｐ−ＫＬＨを凍結及び凍結乾燥しないこと
が重要である。このような相変化は以下で説明するよう
にＫＬＨの構造及び活性を損なう。
が重要である。このような相変化は以下で説明するよう
にＫＬＨの構造及び活性を損なう。
【００２２】実施例２ 解離／凍結／凍結乾燥ＫＬＨの調製 ＫＬＨにトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）及びエチレンジ
アミンテトラ酢酸をそれぞれ５０ｍＭ及び１０ｍＭの最
終濃度になるまで加えて解離ＫＬＨ（ｄ−ＫＬＨ）を生
成した。ｐ−ＫＬＨを−２０℃に保持したフリーザーに
少なくとも２４時間置いて、凍結ＫＬＨ（ｆ−ＫＬＨ）
を調製した。ｐ−ＫＬＨを製造業者の指示に従ってＬａ
ｂｃｏｎｃｏ（Ｒ）Ｍｏｄｅｌ ７５０４０ Ｆｒｅｅ
ｚｅ Ｄｒｙｅｒ ８で凍結乾燥して、凍結乾燥ＫＬＨ
（ｌ−ＫＬＨ）を調製した。
アミンテトラ酢酸をそれぞれ５０ｍＭ及び１０ｍＭの最
終濃度になるまで加えて解離ＫＬＨ（ｄ−ＫＬＨ）を生
成した。ｐ−ＫＬＨを−２０℃に保持したフリーザーに
少なくとも２４時間置いて、凍結ＫＬＨ（ｆ−ＫＬＨ）
を調製した。ｐ−ＫＬＨを製造業者の指示に従ってＬａ
ｂｃｏｎｃｏ（Ｒ）Ｍｏｄｅｌ ７５０４０ Ｆｒｅｅ
ｚｅ Ｄｒｙｅｒ ８で凍結乾燥して、凍結乾燥ＫＬＨ
（ｌ−ＫＬＨ）を調製した。
【００２３】実施例３ 非天然変性サブユニット構造のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる
特性分析 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して、ＫＬＨサブユニ
ットの寸法及び純度を評価した。結果（図１）は約４０
０，０００Ｄａで主タンパク質バンドを示し、微小タン
パク質は全体の２％未満を構成し、より小さい分子量で
移動した。４種全てのＫＬＨ調製物は同様のバンドプロ
フィールを示したので、ＫＬＨの解離、凍結又は凍結乾
燥のプロセスはサブユニットの構造に影響しないことが
分かる。注：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＫＬＨサブユニッ
トの分子量推定値は信頼性が高いことが知られている
が、他の技術（例えば沈降平衡超遠心）による推定値と
比較すると異常に低い。
特性分析 ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して、ＫＬＨサブユニ
ットの寸法及び純度を評価した。結果（図１）は約４０
０，０００Ｄａで主タンパク質バンドを示し、微小タン
パク質は全体の２％未満を構成し、より小さい分子量で
移動した。４種全てのＫＬＨ調製物は同様のバンドプロ
フィールを示したので、ＫＬＨの解離、凍結又は凍結乾
燥のプロセスはサブユニットの構造に影響しないことが
分かる。注：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＫＬＨサブユニッ
トの分子量推定値は信頼性が高いことが知られている
が、他の技術（例えば沈降平衡超遠心）による推定値と
比較すると異常に低い。
【００２４】実施例４ ＥＭによるサブユニット構造の特性分析 電子鏡検法（ＥＭ）を使用して、ＫＬＨ構造に対する解
離、凍結及び凍結乾燥の作用を分析した。図２Ａで明白
なように、本発明の方法に基づいて精製したＫＬＨは主
に、ダイデカマー又はこれよりも大きいマルチマーから
なる。解離ＫＬＨ（図２Ｂ）は完全にモノマー又はダイ
マーサブユニットからなる。凍結／凍結乾燥ＫＬＨ（図
２Ｃ及び図２Ｄ）は著しく異なる外観を示し、ダイデカ
マーが実質的に少なくなり、デカマーの比率が増して、
より小さい構造になっている。即ち、ｆ−ＫＬＨ又はｌ
−ＫＬＨ調製物はダイデカマー又はこれよりも大きいマ
ルチマーの含有率が実質的に５０％未満である。
離、凍結及び凍結乾燥の作用を分析した。図２Ａで明白
なように、本発明の方法に基づいて精製したＫＬＨは主
に、ダイデカマー又はこれよりも大きいマルチマーから
なる。解離ＫＬＨ（図２Ｂ）は完全にモノマー又はダイ
マーサブユニットからなる。凍結／凍結乾燥ＫＬＨ（図
２Ｃ及び図２Ｄ）は著しく異なる外観を示し、ダイデカ
マーが実質的に少なくなり、デカマーの比率が増して、
より小さい構造になっている。即ち、ｆ−ＫＬＨ又はｌ
−ＫＬＨ調製物はダイデカマー又はこれよりも大きいマ
ルチマーの含有率が実質的に５０％未満である。
【００２５】実施例５ 速度超遠心による天然溶液構造の特性分析 沈降速度超遠心分析で、溶液構造に対する解離、凍結又
は凍結乾燥ＫＬＨの主な作用を示した（図３）。ｐ−Ｋ
ＬＨは約７３％がダイデカマーマルチマーからなること
が判明したが、ｄ−ＫＬＨ、ｆ−ＫＬＨ及びｌ−ＫＬＨ
ではこの形態のマルチマーの含有率はそれぞれ０％、１
３％及び２３％であった。ｆ−ＫＬＨ及びｌ−ＫＬＨが
ｄ−ＫＬＨの成分の実質的な増加を伴うダイデカマー形
態からデカマー形態への顕著な移行を示したことも図３
のデータから明白であろう。凍結又は凍結乾燥するだけ
で四成分構造がこのように劇的に変化するとは予期しな
かったことであり、この変化はタンパク質の免疫原性に
影響を及ぼし得る（以下参照）。
は凍結乾燥ＫＬＨの主な作用を示した（図３）。ｐ−Ｋ
ＬＨは約７３％がダイデカマーマルチマーからなること
が判明したが、ｄ−ＫＬＨ、ｆ−ＫＬＨ及びｌ−ＫＬＨ
ではこの形態のマルチマーの含有率はそれぞれ０％、１
３％及び２３％であった。ｆ−ＫＬＨ及びｌ−ＫＬＨが
ｄ−ＫＬＨの成分の実質的な増加を伴うダイデカマー形
態からデカマー形態への顕著な移行を示したことも図３
のデータから明白であろう。凍結又は凍結乾燥するだけ
で四成分構造がこのように劇的に変化するとは予期しな
かったことであり、この変化はタンパク質の免疫原性に
影響を及ぼし得る（以下参照）。
【００２６】実施例６ 膀胱内マウス膀胱腫瘍モデルでのｐ−ＫＬＨの用量−応
答関係 Ｓｈａｐｉｒｏ等の膀胱内マウス膀胱腫瘍モデル（２
９）で、ＫＬＨ投与量とＫＬＨの抗腫瘍作用との間の用
量−応答関係をｐ−ＫＬＨについて分析した。腫瘍を移
植する３週間前にマウスの皮下（肉趾）に２００μｇの
ｐ−ＫＬＨで免疫感作した。０日目、マウスに麻酔をか
け（Ｎａペントバルビタール、０．０５ｍｇ／ｇ）、カ
テーテルを挿入し、膀胱を焼灼し、（Ｇ． Ｃｈｏｄａ
ｋ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏ，
Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ；３０から入手し
た）２×１０4個のＭＢ−４９膀胱腫瘍細胞を含むＰＢ
Ｓ０．１ｍＬを膀胱内に点滴注入した。１日目、マウス
を無作為に、１グループ１０匹からなる処理グループに
分けた。１日目、７日目及び１４日目にマウスに麻酔を
かけて、カテーテルを挿入し、規定用量のｐ−ＫＬＨを
与えた。対照グループは、２１日前には皮下（肉趾）
で、１日目、７日目、及び１４日目には膀胱内で同量の
ビヒクルを処理した。この腫瘍モデルで変動し得る応答
は腫瘍発生であり、これは触診で検出され、また選択し
た動物の検死によって確認される。
答関係 Ｓｈａｐｉｒｏ等の膀胱内マウス膀胱腫瘍モデル（２
９）で、ＫＬＨ投与量とＫＬＨの抗腫瘍作用との間の用
量−応答関係をｐ−ＫＬＨについて分析した。腫瘍を移
植する３週間前にマウスの皮下（肉趾）に２００μｇの
ｐ−ＫＬＨで免疫感作した。０日目、マウスに麻酔をか
け（Ｎａペントバルビタール、０．０５ｍｇ／ｇ）、カ
テーテルを挿入し、膀胱を焼灼し、（Ｇ． Ｃｈｏｄａ
ｋ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｃａｇｏ，
Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ；３０から入手し
た）２×１０4個のＭＢ−４９膀胱腫瘍細胞を含むＰＢ
Ｓ０．１ｍＬを膀胱内に点滴注入した。１日目、マウス
を無作為に、１グループ１０匹からなる処理グループに
分けた。１日目、７日目及び１４日目にマウスに麻酔を
かけて、カテーテルを挿入し、規定用量のｐ−ＫＬＨを
与えた。対照グループは、２１日前には皮下（肉趾）
で、１日目、７日目、及び１４日目には膀胱内で同量の
ビヒクルを処理した。この腫瘍モデルで変動し得る応答
は腫瘍発生であり、これは触診で検出され、また選択し
た動物の検死によって確認される。
【００２７】週１度で少なくとも４週間、マウスの腫瘍
発生を監視した。テスト期間が終了すると、マウスを殺
して、膀胱腫瘍が存在するかどうかを必要に応じて肉眼
検査又は組織検査で確認した。
発生を監視した。テスト期間が終了すると、マウスを殺
して、膀胱腫瘍が存在するかどうかを必要に応じて肉眼
検査又は組織検査で確認した。
【００２８】図４に示すように、被処理グループでは腫
瘍発生の用量依存的遅延及び腫瘍発生率の低下が認めら
れ、１００〜１０００μｇのｐ−ＫＬＨ（高い免疫原性
を有する本発明のＫＬＨ組成物）を投与したグループで
最大の抗腫瘍活性を示した。４週間目の時点で、対照と
被実験動物との間でかなりの差（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓＥｘ
ａｃｔ）が観察された。従って、ＫＬＨ組成物１０μｇ
は次善の用量であり、ｐ−ＫＬＨ組成物の用量が１００
μｇ以上になれば、この動物モデルで効果的である。
瘍発生の用量依存的遅延及び腫瘍発生率の低下が認めら
れ、１００〜１０００μｇのｐ−ＫＬＨ（高い免疫原性
を有する本発明のＫＬＨ組成物）を投与したグループで
最大の抗腫瘍活性を示した。４週間目の時点で、対照と
被実験動物との間でかなりの差（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓＥｘ
ａｃｔ）が観察された。従って、ＫＬＨ組成物１０μｇ
は次善の用量であり、ｐ−ＫＬＨ組成物の用量が１００
μｇ以上になれば、この動物モデルで効果的である。
【００２９】実施例７ 膀胱内マウス膀胱腫瘍モデルでのｐ−ＫＬＨ、ｄ−ＫＬ
Ｈ、ｆ−ＫＬＨ及びｌ−ＫＬＨの抗腫瘍活性の比較 Ｓｈａｐｉｒｏ等の膀胱内マウス膀胱腫瘍モデル（２
９）を再度使用して、抗腫瘍活性を調べた。腫瘍移植の
２週間又は３週間前に、メスマウス（６〜１０週齢；２
０〜３０ｇ）の皮下（肉趾）にｐ−ＫＬＨで免疫感作し
た。０日目にマウスに麻酔をかけ（Ｎａ−ペントバルビ
タール、０．０５ｍｇ／ｇ）、カテーテルを挿入し、膀
胱を焼灼し、２×１０4個のＭＢ−４９膀胱腫瘍細胞
（３０）を含むリン酸緩衝塩水溶液（ＰＢＳ）０．１ｍ
Ｌを点滴注入した。１日目、マウスを無作為にそれぞれ
が１０匹のグループに分けた。対照動物はビヒクルで免
疫感作及び処理を行う（ビヒクル対照）か又はビヒクル
で免疫感作して、ｐ−ＫＬＨで処理した（ＫＬＨ対
照）。全ての被実験グループはＫＬＨで免疫感作して、
１０μｇ又は１００μｇの点滴注入で処理した。前述の
実施例のように、この腫瘍モデルで変動し得る応答は腫
瘍発生であり、これは触診で検出され、また選択した動
物の検死によって確認される。
Ｈ、ｆ−ＫＬＨ及びｌ−ＫＬＨの抗腫瘍活性の比較 Ｓｈａｐｉｒｏ等の膀胱内マウス膀胱腫瘍モデル（２
９）を再度使用して、抗腫瘍活性を調べた。腫瘍移植の
２週間又は３週間前に、メスマウス（６〜１０週齢；２
０〜３０ｇ）の皮下（肉趾）にｐ−ＫＬＨで免疫感作し
た。０日目にマウスに麻酔をかけ（Ｎａ−ペントバルビ
タール、０．０５ｍｇ／ｇ）、カテーテルを挿入し、膀
胱を焼灼し、２×１０4個のＭＢ−４９膀胱腫瘍細胞
（３０）を含むリン酸緩衝塩水溶液（ＰＢＳ）０．１ｍ
Ｌを点滴注入した。１日目、マウスを無作為にそれぞれ
が１０匹のグループに分けた。対照動物はビヒクルで免
疫感作及び処理を行う（ビヒクル対照）か又はビヒクル
で免疫感作して、ｐ−ＫＬＨで処理した（ＫＬＨ対
照）。全ての被実験グループはＫＬＨで免疫感作して、
１０μｇ又は１００μｇの点滴注入で処理した。前述の
実施例のように、この腫瘍モデルで変動し得る応答は腫
瘍発生であり、これは触診で検出され、また選択した動
物の検死によって確認される。
【００３０】４種の異なるＫＬＨ調製物を次善用量（１
０μｇ）及び最適用量（１００μｇ）で用いて、２種の
投与レベルでの異なる形態のＫＬＨの作用を分析した。
腫瘍移植の２週間前に、メスマウス（６〜１０週齢；２
０〜３０ｇ）（の肉趾）に２００μｇのｐ−ＫＬＨで皮
下免疫感作した。０日目、マウスの膀胱内に前述したよ
うな２×１０4個のＭＢ−４９膀胱腫瘍細胞を接種し
た。１日目、マウスを無作為にそれぞれが１０匹のグル
ープに分けた。対照動物はビヒクルでみかけ処理する
か、又はビヒクルでみかけ免疫感作してＫＬＨで処理し
た。被実験マウスは４種の各ＫＬＨ調製物を１０μｇ又
は１００μｇ点滴注入して処理した。
０μｇ）及び最適用量（１００μｇ）で用いて、２種の
投与レベルでの異なる形態のＫＬＨの作用を分析した。
腫瘍移植の２週間前に、メスマウス（６〜１０週齢；２
０〜３０ｇ）（の肉趾）に２００μｇのｐ−ＫＬＨで皮
下免疫感作した。０日目、マウスの膀胱内に前述したよ
うな２×１０4個のＭＢ−４９膀胱腫瘍細胞を接種し
た。１日目、マウスを無作為にそれぞれが１０匹のグル
ープに分けた。対照動物はビヒクルでみかけ処理する
か、又はビヒクルでみかけ免疫感作してＫＬＨで処理し
た。被実験マウスは４種の各ＫＬＨ調製物を１０μｇ又
は１００μｇ点滴注入して処理した。
【００３１】１０μｇの用量をマウスに投与した結果を
図５に示す。ビヒクル対照グループ又はＫＬＨ対照グル
ープでは、接種後４週間まで７０％のマウスに触知可能
な腫瘍が存在していた。１０μｇのｐ−ＫＬＨ又はｄ−
ＫＬＨで処理した被免疫感作マウスは、いずれの対照グ
ループよりも腫瘍がかなり少なかった（ｐ＜０．０９；
Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ）。ｆ−ＫＬＨ又はｌ−
ＫＬＨを投与して免疫感作したマウスでは腫瘍発生率は
それほど低下しなかった（ｐ＞０．０１；Ｆｉｓｈｅ
ｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ）。特に２〜４週間目の時点で、次
善用量のｐ−ＫＬＨ組成物で最大の抗腫瘍活性が認めら
れた。
図５に示す。ビヒクル対照グループ又はＫＬＨ対照グル
ープでは、接種後４週間まで７０％のマウスに触知可能
な腫瘍が存在していた。１０μｇのｐ−ＫＬＨ又はｄ−
ＫＬＨで処理した被免疫感作マウスは、いずれの対照グ
ループよりも腫瘍がかなり少なかった（ｐ＜０．０９；
Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ）。ｆ−ＫＬＨ又はｌ−
ＫＬＨを投与して免疫感作したマウスでは腫瘍発生率は
それほど低下しなかった（ｐ＞０．０１；Ｆｉｓｈｅ
ｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ）。特に２〜４週間目の時点で、次
善用量のｐ−ＫＬＨ組成物で最大の抗腫瘍活性が認めら
れた。
【００３２】１００μｇの用量をマウスに投与した結果
を図６に示す。ビヒクル対照グループ又はＫＬＨ対照グ
ループでは、接種後４週間まで７０％のマウスに触知可
能な腫瘍が存在していた。１００μｇのｐ−ＫＬＨで処
理した被実験グループは、いずれの対照グループよりも
腫瘍がかなり少なかった（ｐ＜０．０１；Ｆｉｓｈｅ
ｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ）。解離ＫＬＨ又は凍結ＫＬＨで処
理した被免疫感作マウスもこの用量では腫瘍発生率がか
なり低下した（ｐ＜０．０９；Ｆｉｓｈｅｒ’ｓＥｘａ
ｃｔ）。凍結乾燥ＫＬＨで処理したマウスでは、腫瘍発
生率はそれほど低下しなかった（ｐ＞０．０１；Ｆｉｓ
ｈｅｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ）。特に２〜４週間目の時点
で、有効用量のｐ−ＫＬＨ組成物で最大の抗腫瘍活性が
認められた。
を図６に示す。ビヒクル対照グループ又はＫＬＨ対照グ
ループでは、接種後４週間まで７０％のマウスに触知可
能な腫瘍が存在していた。１００μｇのｐ−ＫＬＨで処
理した被実験グループは、いずれの対照グループよりも
腫瘍がかなり少なかった（ｐ＜０．０１；Ｆｉｓｈｅ
ｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ）。解離ＫＬＨ又は凍結ＫＬＨで処
理した被免疫感作マウスもこの用量では腫瘍発生率がか
なり低下した（ｐ＜０．０９；Ｆｉｓｈｅｒ’ｓＥｘａ
ｃｔ）。凍結乾燥ＫＬＨで処理したマウスでは、腫瘍発
生率はそれほど低下しなかった（ｐ＞０．０１；Ｆｉｓ
ｈｅｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ）。特に２〜４週間目の時点
で、有効用量のｐ−ＫＬＨ組成物で最大の抗腫瘍活性が
認められた。
【００３３】これらの結果は、解離、凍結又は凍結乾燥
したＫＬＨ調製物が（ある程度抗腫瘍活性を保持してい
るが）、このような相変化がおきなかったＫＬＨ溶液ほ
ど有効でないことを示している。従って、本発明のＫＬ
Ｈ組成物は高い免疫原性、特に高い抗腫瘍活性を示す。
したＫＬＨ調製物が（ある程度抗腫瘍活性を保持してい
るが）、このような相変化がおきなかったＫＬＨ溶液ほ
ど有効でないことを示している。従って、本発明のＫＬ
Ｈ組成物は高い免疫原性、特に高い抗腫瘍活性を示す。
【００３４】本発明の方法及び組成物は種々の形態の実
施態様で組み込むことができ、本明細書に開示されてい
るものはごく一部にすぎない。他の実施態様が存在し、
本発明の範囲を逸脱するものでないことは当業者には明
白であろう。従って、前述の実施態様は例示的であっ
て、限定的なものではない。
施態様で組み込むことができ、本明細書に開示されてい
るものはごく一部にすぎない。他の実施態様が存在し、
本発明の範囲を逸脱するものでないことは当業者には明
白であろう。従って、前述の実施態様は例示的であっ
て、限定的なものではない。
【００３５】参考文献リスト
【００３６】
【表１】
【００３７】
【表２】
【００３８】
【表３】
【図１】ＫＬＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す［Ｌａｅ
ｍｍｌｉ等の方法（２６）、還元条件下；５％〜１５％
ポリアクリルアミド勾配；クーマシーブルーＲ−２５０
染色］。レーン１、ｐ−ＫＬＨ；レーン２、ｄ−ＫＬ
Ｈ；レーン３、ｆ−ＫＬＨ；レーン４、ｌ−ＫＬＨ。分
子量マーカー（ｋＤａ）は左に示す。
ｍｍｌｉ等の方法（２６）、還元条件下；５％〜１５％
ポリアクリルアミド勾配；クーマシーブルーＲ−２５０
染色］。レーン１、ｐ−ＫＬＨ；レーン２、ｄ−ＫＬ
Ｈ；レーン３、ｆ−ＫＬＨ；レーン４、ｌ−ＫＬＨ。分
子量マーカー（ｋＤａ）は左に示す。
【図２】ＫＬＨの電子顕微鏡写真を示す。パネルＡ、ｐ
−ＫＬＨ；パネルＢ、ｄ−ＫＬＨ；パネルＣ、ｆ−ＫＬ
Ｈ；パネルＤ、ｌ−ＫＬＨ。
−ＫＬＨ；パネルＢ、ｄ−ＫＬＨ；パネルＣ、ｆ−ＫＬ
Ｈ；パネルＤ、ｌ−ＫＬＨ。
【図３】沈降速度超遠心によるＫＬＨの寸法分布を示
す。サンプルはＰＢＳで１：１０に希釈し、光電スキャ
ナーを備えたＢｅｃｋｍａｎ Ｍｏｄｅｌ Ｅ分析超遠
心分離器によって、５７，０００×ｇにて室温で遠心分
離にかけた。Ｖａｎ Ｈｏｌｄｅ等の方法（２７）によ
ってＳ値を測定した。
す。サンプルはＰＢＳで１：１０に希釈し、光電スキャ
ナーを備えたＢｅｃｋｍａｎ Ｍｏｄｅｌ Ｅ分析超遠
心分離器によって、５７，０００×ｇにて室温で遠心分
離にかけた。Ｖａｎ Ｈｏｌｄｅ等の方法（２７）によ
ってＳ値を測定した。
【図４】用量−応答実験でのｐ−ＫＬＨに対する腫瘍発
生率を示す。０日目にＭＢ−４９膀胱腫瘍細胞を接種し
たマウスの膀胱内にｐ−ＫＬＨを投与した。○ビヒクル
対照；ｐ−ＫＬＨ用量：△１０μｇ；□５０μｇ；●１
００μｇ；▲５００μｇ；■１０００μｇ。＊対照とは
有意差あり（ｐ＜０．０１；Ｆｉｓｈｅｒ’ｓＥｘａｃ
ｔ）；＊＊対照とは有意差あり（ｐ＜０．００１；Ｆｉ
ｓｈｅｒ’ｓＥｘａｃｔ）。
生率を示す。０日目にＭＢ−４９膀胱腫瘍細胞を接種し
たマウスの膀胱内にｐ−ＫＬＨを投与した。○ビヒクル
対照；ｐ−ＫＬＨ用量：△１０μｇ；□５０μｇ；●１
００μｇ；▲５００μｇ；■１０００μｇ。＊対照とは
有意差あり（ｐ＜０．０１；Ｆｉｓｈｅｒ’ｓＥｘａｃ
ｔ）；＊＊対照とは有意差あり（ｐ＜０．００１；Ｆｉ
ｓｈｅｒ’ｓＥｘａｃｔ）。
【図５】用量１０μｇでの腫瘍発生率を示す。０日目に
ＭＢ−４９膀胱腫瘍細胞を接種したマウスの膀胱内に規
定した型のＫＬＨを投与した。○ビヒクル対照；△ＫＬ
Ｈ対照（ビヒクルで免疫感作／ｐ−ＫＬＨで処理）；●
ｐ−ＫＬＨ；▲ｄ−ＫＬＨ；■ｆ−ＫＬＨ；◆ｌ−ＫＬ
Ｈ。＊対照とは有意差あり（ｐ＜０．０９；Ｆｉｓｈｅ
ｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ）。
ＭＢ−４９膀胱腫瘍細胞を接種したマウスの膀胱内に規
定した型のＫＬＨを投与した。○ビヒクル対照；△ＫＬ
Ｈ対照（ビヒクルで免疫感作／ｐ−ＫＬＨで処理）；●
ｐ−ＫＬＨ；▲ｄ−ＫＬＨ；■ｆ−ＫＬＨ；◆ｌ−ＫＬ
Ｈ。＊対照とは有意差あり（ｐ＜０．０９；Ｆｉｓｈｅ
ｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ）。
【図６】用量１００μｇでの腫瘍発生率を示す。０日目
にＭＢ−４９膀胱腫瘍細胞を接種したマウスの膀胱内に
規定した型のＫＬＨを投与した。○ビヒクル対照；△Ｋ
ＬＨ対照（ビヒクルで免疫感作／ｐ−ＫＬＨで処理）；
●ｐ−ＫＬＨ；▲ｄ−ＫＬＨ；■ｆ−ＫＬＨ；◆ｌ−Ｋ
ＬＨ。＊対照とは有意差あり（ｐ＜０．０９；Ｆｉｓｈ
ｅｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ）。＊＊対照とは有意差あり（ｐ
＜０．０１；Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ）。
にＭＢ−４９膀胱腫瘍細胞を接種したマウスの膀胱内に
規定した型のＫＬＨを投与した。○ビヒクル対照；△Ｋ
ＬＨ対照（ビヒクルで免疫感作／ｐ−ＫＬＨで処理）；
●ｐ−ＫＬＨ；▲ｄ−ＫＬＨ；■ｆ−ＫＬＨ；◆ｌ−Ｋ
ＬＨ。＊対照とは有意差あり（ｐ＜０．０９；Ｆｉｓｈ
ｅｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ）。＊＊対照とは有意差あり（ｐ
＜０．０１；Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ Ｅｘａｃｔ）。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年１２月１４日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ＫＬＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を示す写真
である［Ｌａｅｍｍｌｉ等の方法（２６）、還元条件
下；５％〜１５％ポリアクリルアミド勾配；クーマシー
ブルーＲ−２５０染色］。レーン１、ｐ−ＫＬＨ；レー
ン２、ｄ−ＫＬＨ；レーン３、ｆ−ＫＬＨ；レーン４、
ｌ−ＫＬＨ。分子量マーカー（ｋＤａ）は左に示す。
である［Ｌａｅｍｍｌｉ等の方法（２６）、還元条件
下；５％〜１５％ポリアクリルアミド勾配；クーマシー
ブルーＲ−２５０染色］。レーン１、ｐ−ＫＬＨ；レー
ン２、ｄ−ＫＬＨ；レーン３、ｆ−ＫＬＨ；レーン４、
ｌ−ＫＬＨ。分子量マーカー（ｋＤａ）は左に示す。
【図２】ＫＬＨの電子顕微鏡による粒子構造を示す写真
である。パネルＡ、ｐ−ＫＬＨ；パネルＢ、ｄ−ＫＬ
Ｈ；パネルＣ、ｆ−ＫＬＨ；パネルＤ、ｌ−ＫＬＨ。
である。パネルＡ、ｐ−ＫＬＨ；パネルＢ、ｄ−ＫＬ
Ｈ；パネルＣ、ｆ−ＫＬＨ；パネルＤ、ｌ−ＫＬＨ。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
Claims (9)
- 【請求項１】 治療に使用するための、高い免疫原性を
有するカサガイヘモシアニン（ＫＬＨ）組成物であっ
て、該組成物がＫＬＨと生理学的に許容できる等張緩衝
液とを含み、前記ＫＬＨが（ｉ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ
る分子量が約４００，０００の完全な非分解サブユニッ
トと、（ｉｉ）分析超遠心によれば少なくとも約５０％
の、前記サブユニットのダイデカマー又はこれよりも大
きいマルチマーを含んでいることを特徴とする組成物。 - 【請求項２】 前記緩衝液がカルシウム及びマグネシウ
ムを含んでいることを特徴とする請求項１に記載のＫＬ
Ｈ組成物。 - 【請求項３】 組成物の温度が２℃〜１０℃であること
を特徴とする請求項１又は２に記載のＫＬＨ組成物。 - 【請求項４】 温度が４℃であることを特徴とする請求
項３に記載のＫＬＨ組成物。 - 【請求項５】 ＫＬＨ濃度が約０．１〜約２０ｍｇ／ｍ
ｌであることを特徴とする請求項１から４のいずれか一
項に記載のＫＬＨ組成物。 - 【請求項６】 ＫＬＨ濃度が約２〜約１０ｍｇ／ｍｌで
あることを特徴とする請求項５に記載のＫＬＨ組成物。 - 【請求項７】 ＫＬＨ濃度が５ｍｇ／ｍｌであることを
特徴とする請求項６に記載のＫＬＨ組成物。 - 【請求項８】 ＫＬＨを、凍結も凍結乾燥もしないで単
離、精製し、精製ＫＬＨを前記等張緩衝液に溶解するこ
とを特徴とする請求項１から７のいずれか一項に記載の
ＫＬＨ組成物の調製方法。 - 【請求項９】 請求項１から７のいずれか一項に記載の
ＫＬＨ組成物を使用することを特徴とする膀胱ガン治療
薬の製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/050,697 US5407912A (en) | 1993-04-19 | 1993-04-19 | Method of treating bladder cancer with a keyhole limpet hemocyanin composition with enhanced anti-tumor activity |
| US050697 | 1993-04-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07101875A true JPH07101875A (ja) | 1995-04-18 |
Family
ID=21966839
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6104838A Pending JPH07101875A (ja) | 1993-04-19 | 1994-04-19 | 膀胱ガンに対して高い抗腫瘍活性を有するカサガイヘモシアニン |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US5407912A (ja) |
| EP (1) | EP0621039A1 (ja) |
| JP (1) | JPH07101875A (ja) |
| AU (1) | AU681872B2 (ja) |
| CA (1) | CA2121296A1 (ja) |
| FI (1) | FI941725A7 (ja) |
Families Citing this family (11)
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|---|---|---|---|---|
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| DE19939578A1 (de) * | 1999-08-20 | 2001-02-22 | Biosyn Arzneimittel Gmbh | Nukleinsäuremolekül, umfassend eine für ein Hämocyanin kodierende Nukleinsäuresequenz |
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| CA2454853A1 (en) * | 2001-08-14 | 2003-02-27 | Biomira, Inc. | Imunogenic conjugate of carbohydrate haptens and aggregated protein carrier |
| US6916908B2 (en) * | 2003-07-21 | 2005-07-12 | Alfredo Emilio De Ioannes | Product and composition containing a Concholepas concholepas hemocyanin (CCH) subunit, and a method of use thereof |
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| EP3620793A1 (en) | 2013-12-03 | 2020-03-11 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and reagents for the assessment of gestational diabetes |
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-
1993
- 1993-04-19 US US08/050,697 patent/US5407912A/en not_active Expired - Lifetime
-
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- 1994-04-14 FI FI941725A patent/FI941725A7/fi unknown
- 1994-04-14 CA CA002121296A patent/CA2121296A1/en not_active Abandoned
- 1994-04-18 AU AU60519/94A patent/AU681872B2/en not_active Ceased
- 1994-04-19 JP JP6104838A patent/JPH07101875A/ja active Pending
-
1997
- 1997-03-26 US US08/837,498 patent/US5855919A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-01-20 US US09/009,121 patent/US5981476A/en not_active Expired - Lifetime
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| AU681872B2 (en) | 1997-09-11 |
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| US5981476A (en) | 1999-11-09 |
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