JPH071277B2 - 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤 - Google Patents
不安定型糖化ヘモグロビン解離剤Info
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- JPH071277B2 JPH071277B2 JP8090289A JP8090289A JPH071277B2 JP H071277 B2 JPH071277 B2 JP H071277B2 JP 8090289 A JP8090289 A JP 8090289A JP 8090289 A JP8090289 A JP 8090289A JP H071277 B2 JPH071277 B2 JP H071277B2
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は，血液中の糖化ヘモグロビン（ヘモグロビン
A1），特にヘモグロビンA1Cの測定において用いられる
不安定型糖化ヘモグロビンA1Cの解離剤に関する。
A1），特にヘモグロビンA1Cの測定において用いられる
不安定型糖化ヘモグロビンA1Cの解離剤に関する。
（従来の技術） 糖尿病の指標のひとつとして血液中の糖化ヘモグロビン
（ヘモグロビンA1），特にヘモグロビンA1Cが知られ，
その測定が行われている。ヘモグロビンA1Cは，下記式
に示されるように，ヘモグロビン（以下，ヘモグロビン
をHbで示す）のβ鎖Ｎ末端に存在するバリンのアミノ基
にグルコース１分子が非酵素的に結合した複合体であ
る。Hbの上記アミノ基にグルコースが結合すると，ま
ず，下記式に示すようなシッフ塩基である不安定型ヘモ
グロビンA1C（Ｉ）が形成される： 上記式（１）において，β‐A-NH2はHbを示し，そのな
かのNH2は，該Hbのβ鎖Ｎ末端のバリンのアミノ基を示
す。
（ヘモグロビンA1），特にヘモグロビンA1Cが知られ，
その測定が行われている。ヘモグロビンA1Cは，下記式
に示されるように，ヘモグロビン（以下，ヘモグロビン
をHbで示す）のβ鎖Ｎ末端に存在するバリンのアミノ基
にグルコース１分子が非酵素的に結合した複合体であ
る。Hbの上記アミノ基にグルコースが結合すると，ま
ず，下記式に示すようなシッフ塩基である不安定型ヘモ
グロビンA1C（Ｉ）が形成される： 上記式（１）において，β‐A-NH2はHbを示し，そのな
かのNH2は，該Hbのβ鎖Ｎ末端のバリンのアミノ基を示
す。
この不安定型HbA1C（Ｉ）の生成反応は可逆反応であ
り，グルコース濃度に応じて平衡が不安定型HbA
1C（Ｉ）の生成方向もしくは解離方向に傾く。（Ｉ）
は，さらにアマドリ転位を経て，不可逆的に安定型HbA
1C（II）に変化する。
り，グルコース濃度に応じて平衡が不安定型HbA
1C（Ｉ）の生成方向もしくは解離方向に傾く。（Ｉ）
は，さらにアマドリ転位を経て，不可逆的に安定型HbA
1C（II）に変化する。
HbA1Cは，例えば，高速液体クロマトグラフィーによりH
bを各Hb成分に分離し，そのODを測定することにより定
量され得るが，上記安定型HbA1C（S-HbA1C）および不安
定型HbA1C（L-HbA1C）を分離して測定することができな
い。そのためHbA1Cを安定した値で得られない。なぜな
ら,L-HbA1Cは，グルコース（つまり血糖）量により，そ
の量が変化し，該血糖血は，食事や運動により急激かつ
大幅に変化するためである。
bを各Hb成分に分離し，そのODを測定することにより定
量され得るが，上記安定型HbA1C（S-HbA1C）および不安
定型HbA1C（L-HbA1C）を分離して測定することができな
い。そのためHbA1Cを安定した値で得られない。なぜな
ら,L-HbA1Cは，グルコース（つまり血糖）量により，そ
の量が変化し，該血糖血は，食事や運動により急激かつ
大幅に変化するためである。
上記欠点を解消するため，血液検体からL-HbA1Cを除去
し,S-HbA1Cのみを測定する試みがなされている。例え
ば,David M.Nathanら,ClinicalChemistry,28 512〜515
（1982）には，セミカルバジドおよびアニリンをL-HbA
1Cの除去剤として用い,pH5.0,38℃にて30分間血液検体
を処理することが開示されている。セミカルバジドは，
グルコースを捕捉し，かつ求核試薬として作用し,Hbの
アミノ基と競合する。アニリンは触媒として作用する。
その結果,L-HbA1Cは実質的に除去される。しかし,L-HbA
1Cの除去反応が酸性側（pH5.0）にて，かつ比較的高温
（38℃）でなされるため,Hbの変性（例えば脱ヘム）が
生じる。例えば，イオン交換クロマトグラフィーによる
溶出パターンを観察すると，脱ヘムによる退色に起因す
るピーク強度の低下やHbA1aとHbA1bとに起因するピーク
の増大が観察される。
し,S-HbA1Cのみを測定する試みがなされている。例え
ば,David M.Nathanら,ClinicalChemistry,28 512〜515
（1982）には，セミカルバジドおよびアニリンをL-HbA
1Cの除去剤として用い,pH5.0,38℃にて30分間血液検体
を処理することが開示されている。セミカルバジドは，
グルコースを捕捉し，かつ求核試薬として作用し,Hbの
アミノ基と競合する。アニリンは触媒として作用する。
その結果,L-HbA1Cは実質的に除去される。しかし,L-HbA
1Cの除去反応が酸性側（pH5.0）にて，かつ比較的高温
（38℃）でなされるため,Hbの変性（例えば脱ヘム）が
生じる。例えば，イオン交換クロマトグラフィーによる
溶出パターンを観察すると，脱ヘムによる退色に起因す
るピーク強度の低下やHbA1aとHbA1bとに起因するピーク
の増大が観察される。
特開昭58-210024号公報には，ジヒドロキシポリル化合
物（ホウ酸化合物）がL-HbA1Cの除去剤として開示され
ている。このジヒドロキシポリル化合物はグルコースの
OH基をエステル化するためグルコースが系内から除去さ
れ，その結果,L-HbA1Cの解離が進行する。しかし,L-HbA
1Cを除去するためには，高濃度のジヒドロキシポリル化
合物を必要とする。例えば，溶血させた血液を含む試料
液中で約0.1〜1.0M,該ジヒドロキシポリル化合物を含む
溶離液を用いて，溶血物を溶出させる場合には，該溶離
液中に0.01〜0.15Mの割合で含有されることが必要であ
る。このように高濃度のジヒドロキシポリル化合物が含
有されると，イオン交換クロマトグラフィーにかける場
合にそのイオン強度が通常の場合とは異なり，その結
果，分離条件が変わり，測定が困難となったり測定条件
の補正が必要となる。さらに，最適pHが約4.5〜6.5,好
ましくは5.0〜6.0であるため,Hbの変性が生じるおそれ
がある。
物（ホウ酸化合物）がL-HbA1Cの除去剤として開示され
ている。このジヒドロキシポリル化合物はグルコースの
OH基をエステル化するためグルコースが系内から除去さ
れ，その結果,L-HbA1Cの解離が進行する。しかし,L-HbA
1Cを除去するためには，高濃度のジヒドロキシポリル化
合物を必要とする。例えば，溶血させた血液を含む試料
液中で約0.1〜1.0M,該ジヒドロキシポリル化合物を含む
溶離液を用いて，溶血物を溶出させる場合には，該溶離
液中に0.01〜0.15Mの割合で含有されることが必要であ
る。このように高濃度のジヒドロキシポリル化合物が含
有されると，イオン交換クロマトグラフィーにかける場
合にそのイオン強度が通常の場合とは異なり，その結
果，分離条件が変わり，測定が困難となったり測定条件
の補正が必要となる。さらに，最適pHが約4.5〜6.5,好
ましくは5.0〜6.0であるため,Hbの変性が生じるおそれ
がある。
L-HbA1Cのその他の除去方法としては，血液検体を希釈
してグルコース濃度を下げ,L-HbA1Cの解離を促進させる
方法が知られている。これを実施するには，例えば，赤
血球を大過剰の生理食塩水でインキュベートしたり，溶
血物を透析する方法が採用される。しかし，これらの方
法はいずれも長時間を必要とするため，臨床検査のため
の方法としては適切ではない。
してグルコース濃度を下げ,L-HbA1Cの解離を促進させる
方法が知られている。これを実施するには，例えば，赤
血球を大過剰の生理食塩水でインキュベートしたり，溶
血物を透析する方法が採用される。しかし，これらの方
法はいずれも長時間を必要とするため，臨床検査のため
の方法としては適切ではない。
（発明が解決しようとする問題点） 本発明は上記従来の欠点を解決するものであり，その目
的とするところは，血液検体中の安定型ヘモグロビンA
1Cのみを，精度良く簡便に，かつヘモグロビンを変性さ
せることなく測定しうる，不安定型ヘモグロビンA1Cの
除去剤もしくは解離剤，およびヘモグロビンA1Cの測定
方法を提供することにある。
的とするところは，血液検体中の安定型ヘモグロビンA
1Cのみを，精度良く簡便に，かつヘモグロビンを変性さ
せることなく測定しうる，不安定型ヘモグロビンA1Cの
除去剤もしくは解離剤，およびヘモグロビンA1Cの測定
方法を提供することにある。
（問題点を解決するための手段および作用） 本発明の不安定型糖化ヘモグロビン解離剤は，血液中の
ヘモグロビンA1の測定に用いられ，該解離剤が，フィチ
ン酸および／またはフィチン酸の塩を主成分とし，不安
定型ヘモグロビンA1Cをヘモグロビンとグルコースとに
解離する機能を有し，そのことにより上記目的が達成さ
れる。
ヘモグロビンA1の測定に用いられ，該解離剤が，フィチ
ン酸および／またはフィチン酸の塩を主成分とし，不安
定型ヘモグロビンA1Cをヘモグロビンとグルコースとに
解離する機能を有し，そのことにより上記目的が達成さ
れる。
本発明の糖化ヘモグロビンの測定法は，血液中の少なく
とも赤血球および／またはヘモグロビンを含む試料を，
フィチン酸および／またはフィチン酸の塩を含む解離用
媒質と接触させて，該赤血球および／またはヘモグロビ
ンに含まれる不安定型ヘモグロビンA1Cをヘモグロビン
とグルコースとに解離させる工程，および，該解離後の
試料中のヘモグロビンをイオン交換クロマトグラフィー
で各ヘモグロビン成分に分離し，該試料中に存在する安
定型ヘモグロビンA1Cを測定する工程を包含し，そのこ
とにより上記目的が達成される。
とも赤血球および／またはヘモグロビンを含む試料を，
フィチン酸および／またはフィチン酸の塩を含む解離用
媒質と接触させて，該赤血球および／またはヘモグロビ
ンに含まれる不安定型ヘモグロビンA1Cをヘモグロビン
とグルコースとに解離させる工程，および，該解離後の
試料中のヘモグロビンをイオン交換クロマトグラフィー
で各ヘモグロビン成分に分離し，該試料中に存在する安
定型ヘモグロビンA1Cを測定する工程を包含し，そのこ
とにより上記目的が達成される。
本発明におけるフィチン酸とは，次のような構造式で表
わされる。
わされる。
フィチン酸は、その塩であっても同等の効果が得られ
る。塩の種類は特に限定されないが，例えばアルカリ金
属やアルカリ土類金属の塩が挙げられ,Na塩,K塩などが
好適である。
る。塩の種類は特に限定されないが，例えばアルカリ金
属やアルカリ土類金属の塩が挙げられ,Na塩,K塩などが
好適である。
本発明のL-HbA1C解離剤の使用量は，用いられる化合物
の種類や測定時の条件（血液の溶血などの前処理の条
件,pHなど）によって異なるが，通常，血液（全血）1ml
あたり１〜1500mgの割合である。例えば，血液検体３μ
ｌを450μｌの溶血剤溶液にて溶血させた試料溶液中に
フィチン酸が約0.001〜1.0W/V％（W/V％は単位容量あた
りの重量を示す），好ましくは0.01〜0.2W/V％の割合で
添加される。過少であるとL-HbA1Cの解離・除去効果が
得られず，過剰であるとクロマトグラフィー分離時にお
ける分離が困難となる。
の種類や測定時の条件（血液の溶血などの前処理の条
件,pHなど）によって異なるが，通常，血液（全血）1ml
あたり１〜1500mgの割合である。例えば，血液検体３μ
ｌを450μｌの溶血剤溶液にて溶血させた試料溶液中に
フィチン酸が約0.001〜1.0W/V％（W/V％は単位容量あた
りの重量を示す），好ましくは0.01〜0.2W/V％の割合で
添加される。過少であるとL-HbA1Cの解離・除去効果が
得られず，過剰であるとクロマトグラフィー分離時にお
ける分離が困難となる。
血液中のHbを測定するときには，該Hbは赤血球中に存在
するため，通常，血液をあらかじめ溶血させておく場合
が多い。溶血剤としては，界面活性剤が好適に用いられ
る。溶血剤としては，高級脂肪族アルコール，アルキル
アリールポリエーテルアルコール，スルホネート化合物
のポリオキシエチレンエーテル，サルフェート化合物の
ポリオキシエチレンエーテル，ソルビット脂肪酸エステ
ルのポリオキシエチレン付加体などがある。溶血剤の使
用量は，その種類などによっても異なるが，通常，血液
1mlあたり10〜2000mgである。例えば，溶血剤を0.01〜
２容量％の割合で含有する溶血用処理液を血液1mlあた
り２〜400mlの割合で添加してインキュベートすること
により溶血させることができる。溶血剤が過剰であると
クロマトグラフィーによるHbの分離が困難となる。
するため，通常，血液をあらかじめ溶血させておく場合
が多い。溶血剤としては，界面活性剤が好適に用いられ
る。溶血剤としては，高級脂肪族アルコール，アルキル
アリールポリエーテルアルコール，スルホネート化合物
のポリオキシエチレンエーテル，サルフェート化合物の
ポリオキシエチレンエーテル，ソルビット脂肪酸エステ
ルのポリオキシエチレン付加体などがある。溶血剤の使
用量は，その種類などによっても異なるが，通常，血液
1mlあたり10〜2000mgである。例えば，溶血剤を0.01〜
２容量％の割合で含有する溶血用処理液を血液1mlあた
り２〜400mlの割合で添加してインキュベートすること
により溶血させることができる。溶血剤が過剰であると
クロマトグラフィーによるHbの分離が困難となる。
本発明により糖化Hbの測定を行うには，まず，血液検体
を必要に応じて溶血剤で前処理して溶血させ，少なくと
も赤血球および／またはHbを含む試料を調製する。この
試料を，本発明の上記解離剤を含む解離用媒質と接触さ
せる。この解離剤は，試料が後述のクロマトグラフィー
のカラム中でイオン交換により分離されて溶出される以
前に赤血球および／またはHbと接触すればよい。従っ
て，解離剤は，血液検体を適当な濃度に希釈するための
希釈液，溶血剤を含む溶血剤溶液，クロマトグラフィー
に用いられる溶離液などに含まれていてもよく，このよ
うな溶液や溶離液もまた，上記解離用媒質と考えられ
る。その他，解離剤は，例えば試料の赤血球分散液，そ
の溶血物,Hb溶液に固体のまま添加されてもよい。この
解離剤は速やかに溶解し，試料中のHbは解離用媒質と接
触すると解離される。
を必要に応じて溶血剤で前処理して溶血させ，少なくと
も赤血球および／またはHbを含む試料を調製する。この
試料を，本発明の上記解離剤を含む解離用媒質と接触さ
せる。この解離剤は，試料が後述のクロマトグラフィー
のカラム中でイオン交換により分離されて溶出される以
前に赤血球および／またはHbと接触すればよい。従っ
て，解離剤は，血液検体を適当な濃度に希釈するための
希釈液，溶血剤を含む溶血剤溶液，クロマトグラフィー
に用いられる溶離液などに含まれていてもよく，このよ
うな溶液や溶離液もまた，上記解離用媒質と考えられ
る。その他，解離剤は，例えば試料の赤血球分散液，そ
の溶血物,Hb溶液に固体のまま添加されてもよい。この
解離剤は速やかに溶解し，試料中のHbは解離用媒質と接
触すると解離される。
本発明の解離剤を用いた糖化Hbの測定方法のうち，試料
を該解離剤で解離させた後，クロマトグラフィーにかけ
て分離・測定する方法について，次に説明する。試料と
解離剤（解離用媒質）との接触時のpHは酸性側であるほ
ど,L-HbA1Cの解離速度は上昇するが,pHが低すぎるとHb
の変性が生じる。さらに，極端に高いか低いpH条件下で
はクロマトグラフィーによるHbの分離が困難になる。従
って，通常，試料および解離剤を含む混合液のpHが4.6
〜7.0,好ましくは5.3〜6.5となるように調整される。試
料と解離剤との接触時間は解離剤の種類や濃度,pH条件
などにより異なるが，通常，室温においては10分以上，
好ましくは10〜30分である。温度を上げることによる接
触時間の短縮も可能であり，例えば37℃にて約３〜７
分,50℃にて約１〜３分間インキュベートすることもで
きる。このように処理された試料は，イオン交換クロマ
トグラフィー（例えば高速液体クロマトグラフィー）に
かけられ,Hbの各成分が分離されて溶出され，測定され
る。
を該解離剤で解離させた後，クロマトグラフィーにかけ
て分離・測定する方法について，次に説明する。試料と
解離剤（解離用媒質）との接触時のpHは酸性側であるほ
ど,L-HbA1Cの解離速度は上昇するが,pHが低すぎるとHb
の変性が生じる。さらに，極端に高いか低いpH条件下で
はクロマトグラフィーによるHbの分離が困難になる。従
って，通常，試料および解離剤を含む混合液のpHが4.6
〜7.0,好ましくは5.3〜6.5となるように調整される。試
料と解離剤との接触時間は解離剤の種類や濃度,pH条件
などにより異なるが，通常，室温においては10分以上，
好ましくは10〜30分である。温度を上げることによる接
触時間の短縮も可能であり，例えば37℃にて約３〜７
分,50℃にて約１〜３分間インキュベートすることもで
きる。このように処理された試料は，イオン交換クロマ
トグラフィー（例えば高速液体クロマトグラフィー）に
かけられ,Hbの各成分が分離されて溶出され，測定され
る。
試料溶液を直接イオン交換クロマトグラフィーにかけ上
記解離剤が含有される溶離液を用いて溶出させる場合に
は，該溶離液のpHは,Hbを変性させず，かつクロマトグ
ラフィーにより容易にHbA1Cが分離されて測定され得る
ような範囲であればよい。通常,pH5.0〜6.5の範囲が選
択される。試料がクロマトグラフィーのカラムを通過す
る間に含有されるL-HbA1Cが解離され，次いで各Hb成分
に分離されて溶出され，測定される。解離剤は，上記試
料の希釈液や溶血用前処理液などとクロマトグラフィー
用溶離液との両者に含有させることも可能で，この場合
は特に効果的にL-HbA1Cの解離がなされる。
記解離剤が含有される溶離液を用いて溶出させる場合に
は，該溶離液のpHは,Hbを変性させず，かつクロマトグ
ラフィーにより容易にHbA1Cが分離されて測定され得る
ような範囲であればよい。通常,pH5.0〜6.5の範囲が選
択される。試料がクロマトグラフィーのカラムを通過す
る間に含有されるL-HbA1Cが解離され，次いで各Hb成分
に分離されて溶出され，測定される。解離剤は，上記試
料の希釈液や溶血用前処理液などとクロマトグラフィー
用溶離液との両者に含有させることも可能で，この場合
は特に効果的にL-HbA1Cの解離がなされる。
このような本発明解離剤によるL-HbA1Cの解離・除去作
用は,Hb上の2,3−DPGポケットの性質に起因すると考え
られる。2,3−DPGポケットに関しては,Beneschら，（Bi
ochem.Biophys.Res.Commun.,26,162,1967）;Chanutin
ら，（Arch.Biochem.Biophys.,121:96,1967）などによ
り詳しく報告されている。この2,3−DPGポケットはHbの
β鎖のヒスチジン，リジンなどの塩基性アミノ酸残基，
およびHbA1CのHbβ鎖のＮ末端バリンによって形成され
ており，カチオン性を帯びていることが知られている。
本発明解離剤の主成分であるフィチン酸およびその塩は
アニオン性を有しかつその分子形状も適切であるため上
記2,3−DPGポケットに対して強力な親和性を有する。そ
のため，グルコースと競合してHbのβ鎖Ｎ末端に結合す
る。その結果,L-HbA1Cの解離が促進される。
用は,Hb上の2,3−DPGポケットの性質に起因すると考え
られる。2,3−DPGポケットに関しては,Beneschら，（Bi
ochem.Biophys.Res.Commun.,26,162,1967）;Chanutin
ら，（Arch.Biochem.Biophys.,121:96,1967）などによ
り詳しく報告されている。この2,3−DPGポケットはHbの
β鎖のヒスチジン，リジンなどの塩基性アミノ酸残基，
およびHbA1CのHbβ鎖のＮ末端バリンによって形成され
ており，カチオン性を帯びていることが知られている。
本発明解離剤の主成分であるフィチン酸およびその塩は
アニオン性を有しかつその分子形状も適切であるため上
記2,3−DPGポケットに対して強力な親和性を有する。そ
のため，グルコースと競合してHbのβ鎖Ｎ末端に結合す
る。その結果,L-HbA1Cの解離が促進される。
このようにしてフィチン酸および／またはフィチン酸の
塩のL-HbA1Cの解離作用によりL-HbA1Cが試料中から除去
され,S-HbA1Cのみが試料中に残留する。この解離剤は,H
bのイオン交換クロマトグラフィーによる溶出パターン
に影響を与えない。そのため上記S-HbA1Cは，従来と同
様の方法でイオン交換クロマトグラフィーにより分離さ
れ，精度よく測定される。
塩のL-HbA1Cの解離作用によりL-HbA1Cが試料中から除去
され,S-HbA1Cのみが試料中に残留する。この解離剤は,H
bのイオン交換クロマトグラフィーによる溶出パターン
に影響を与えない。そのため上記S-HbA1Cは，従来と同
様の方法でイオン交換クロマトグラフィーにより分離さ
れ，精度よく測定される。
（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。
測定方法 以下の実施例においてHbA1Cの測定は，（株）京都第一
科学製のHi-AutoA1CHA-8120を用い適切条件を選択して
測定した。このHA-8120はHPLCによるHbA1C測定専用装置
であり，陽イオン交換により各Hb成分を４分間で分離し
て溶出する。溶出用緩衝液は専用の溶離液（リン酸緩衝
液）が用いられる。この装置を用いたHbの溶出パターン
は一般に第１図に示される。第１図において，P1および
P2はHbA1a+b成分に起因するピークであり，P3およびP4
はL-HbA1CおよびS-HbA1C成分に起因するピークである。
P5は他のヘモグロビンに起因するピークである。ここ
で，HbA1C（Ｓ型とＬ型との合計）は次式で算出され
る。
科学製のHi-AutoA1CHA-8120を用い適切条件を選択して
測定した。このHA-8120はHPLCによるHbA1C測定専用装置
であり，陽イオン交換により各Hb成分を４分間で分離し
て溶出する。溶出用緩衝液は専用の溶離液（リン酸緩衝
液）が用いられる。この装置を用いたHbの溶出パターン
は一般に第１図に示される。第１図において，P1および
P2はHbA1a+b成分に起因するピークであり，P3およびP4
はL-HbA1CおよびS-HbA1C成分に起因するピークである。
P5は他のヘモグロビンに起因するピークである。ここ
で，HbA1C（Ｓ型とＬ型との合計）は次式で算出され
る。
本実施例においては同一人（健常人）の血液を使用し，
採血後直ちにヘパリンを添加したものを新鮮血液として
用いた。
採血後直ちにヘパリンを添加したものを新鮮血液として
用いた。
リファレンス値の測定 pH6.3の0.005Mリン酸緩衝液100ml中に溶血剤としてTrit
on X-100（和光純薬製）0.1mlを加えて溶血用試薬を調
製した。この溶血用試薬450μｌに新鮮血液３μｌを加
えて溶血させた後に，上記方法によりHbA1C（Ｌ型およ
びＳ型を含む）を測定したところ，全Hb中HbA1Cは5.0％
の割合で存在することがわかった。この値をブランク値
とした。
on X-100（和光純薬製）0.1mlを加えて溶血用試薬を調
製した。この溶血用試薬450μｌに新鮮血液３μｌを加
えて溶血させた後に，上記方法によりHbA1C（Ｌ型およ
びＳ型を含む）を測定したところ，全Hb中HbA1Cは5.0％
の割合で存在することがわかった。この値をブランク値
とした。
次に，新鮮血10mlを遠心分離して得た血球約5mlを8/32i
nchセロファンチューブ（和光純薬製）に入れ，生理食
塩水１を用いて各２回，計５時間37℃にてインキュベ
ートした。このようにしてL-HbA1Cを解離させた後，こ
れを約1.5μｌ採取し，上記溶血試薬450μｌを用いて溶
血させた。このサンプルについてHbA1Cを同様の方法で
測定したところ4.3％であった。この値は，血液中のS-H
bA1Cに相当すると考えられる。
nchセロファンチューブ（和光純薬製）に入れ，生理食
塩水１を用いて各２回，計５時間37℃にてインキュベ
ートした。このようにしてL-HbA1Cを解離させた後，こ
れを約1.5μｌ採取し，上記溶血試薬450μｌを用いて溶
血させた。このサンプルについてHbA1Cを同様の方法で
測定したところ4.3％であった。この値は，血液中のS-H
bA1Cに相当すると考えられる。
実施例１ 0.005Mリン酸緩衝液100ml中に溶血剤としてTritonX-100
（和光純薬製）0.1mlおよび解離剤としてフィチン酸40
％水溶液（Aldrich製）約0.1gを溶解させ，塩基を加え
てpHを6.3に調整し，溶血剤を含む解離用媒質を得た。
この溶血剤含有解離用媒質450μｌに新鮮血液３μｌを
添加し，室温で約10分間放置して溶血ならびにL-HbA1C
の解離を行った。このサンプルのHbA1Cを測定したとこ
ろ4.4％であった。別に，フィチン酸（解離剤）を加え
ない溶血剤溶液を調製し，同様の方法でHbA1Cの測定を
行った。
（和光純薬製）0.1mlおよび解離剤としてフィチン酸40
％水溶液（Aldrich製）約0.1gを溶解させ，塩基を加え
てpHを6.3に調整し，溶血剤を含む解離用媒質を得た。
この溶血剤含有解離用媒質450μｌに新鮮血液３μｌを
添加し，室温で約10分間放置して溶血ならびにL-HbA1C
の解離を行った。このサンプルのHbA1Cを測定したとこ
ろ4.4％であった。別に，フィチン酸（解離剤）を加え
ない溶血剤溶液を調製し，同様の方法でHbA1Cの測定を
行った。
次に，上記溶血剤含有解離用媒質および溶血剤溶液（解
離剤を含まない）のそれぞれについてpHを5.8,5.3,5.0
および4.6に設定し，同様にHbA1Cの測定を行った。溶血
剤を含む解離用媒質を用いた場合，および，溶血剤溶液
（解離剤を含まない）を用いた場合の総Hb中のHbA1C含
有量，および総Hb量を表１に示す。総Hb量は，もとの血
液中の総Hb量を100％として換算した。
離剤を含まない）のそれぞれについてpHを5.8,5.3,5.0
および4.6に設定し，同様にHbA1Cの測定を行った。溶血
剤を含む解離用媒質を用いた場合，および，溶血剤溶液
（解離剤を含まない）を用いた場合の総Hb中のHbA1C含
有量，および総Hb量を表１に示す。総Hb量は，もとの血
液中の総Hb量を100％として換算した。
表１から,pH条件が低くなるにつれてHbA1C値が低くな
り,L-HbA1Cが解離・除去されていることが明らかであ
る。しかし,pHが5.3を下まわると脱ヘムによる退色が認
められ，総Hb量が低下するのがわかる。上記系において
は,pH4.6における総Hb量はpH6.3の場合の約75％であ
る。本発明解離剤を用いて測定する場合には,pH6.3〜5.
3の領域において,Hbが変化することなくL-HbA1Cが解離
・除去されることが明らかである。
り,L-HbA1Cが解離・除去されていることが明らかであ
る。しかし,pHが5.3を下まわると脱ヘムによる退色が認
められ，総Hb量が低下するのがわかる。上記系において
は,pH4.6における総Hb量はpH6.3の場合の約75％であ
る。本発明解離剤を用いて測定する場合には,pH6.3〜5.
3の領域において,Hbが変化することなくL-HbA1Cが解離
・除去されることが明らかである。
実施例２ 0.005Mリン酸緩衝液100ml中に溶血剤としてTritonX-100
（和光純薬製）0.1mlおよび解離剤としてフィチン酸ナ
トリウム（Aldrich製）約0.1gを溶解させ，塩基を加え
てpHを6.3に調整し，溶血剤を含む解離用媒質を得た。
この溶血剤含有解離用媒質450μｌに新鮮血液３μｌを
添加し，室温で約10分間放置して溶血ならびにL-HbA1C
の解離を行った。このサンプルのHbA1Cを測定したとこ
ろ4.3％であった。
（和光純薬製）0.1mlおよび解離剤としてフィチン酸ナ
トリウム（Aldrich製）約0.1gを溶解させ，塩基を加え
てpHを6.3に調整し，溶血剤を含む解離用媒質を得た。
この溶血剤含有解離用媒質450μｌに新鮮血液３μｌを
添加し，室温で約10分間放置して溶血ならびにL-HbA1C
の解離を行った。このサンプルのHbA1Cを測定したとこ
ろ4.3％であった。
実施例３ 実施例２に準じ，フィチン酸ナトリウムの量をそれぞれ
1.0g,0.2g,0.05g,0.005gおよび0.001g含有する溶血剤含
有解離用媒質（いずれもpH約6.0）を調製した。これを
用いて実施例１と同様の方法でHbA1Cの含有量を測定し
た。その結果を表２に示す。
1.0g,0.2g,0.05g,0.005gおよび0.001g含有する溶血剤含
有解離用媒質（いずれもpH約6.0）を調製した。これを
用いて実施例１と同様の方法でHbA1Cの含有量を測定し
た。その結果を表２に示す。
表２から，フィチン酸ナトリウムが0.005g（0.005W/V％
程度）の低濃度であってもL-HbA1Cの除去効果が得られ
ることがわかる。フィチン酸ナトリウムが1.0/g（1.0W/
V％程度）の場合は，クロマトグラムのパターンがブロ
ードに変化するため，濃度をやや低くすることが望まし
い。
程度）の低濃度であってもL-HbA1Cの除去効果が得られ
ることがわかる。フィチン酸ナトリウムが1.0/g（1.0W/
V％程度）の場合は，クロマトグラムのパターンがブロ
ードに変化するため，濃度をやや低くすることが望まし
い。
実施例４ 実施例２に準じ,pHを6.0に調整した溶血剤含有解離用媒
質を調製した。これを用い，温度条件を37℃,50℃およ
び60℃に設定して，それぞれ所定時間インキュベートし
た後にHbA1Cの測定を行った。その結果を表３に示す。
質を調製した。これを用い，温度条件を37℃,50℃およ
び60℃に設定して，それぞれ所定時間インキュベートし
た後にHbA1Cの測定を行った。その結果を表３に示す。
表３から反応温度を上げるにつれてより迅速にL-HbA1C
が除去されることがわかる。しかし,60℃で3.5分間イン
キュベートするとHbの変性が認められ，総Hb量が約90％
に低下した。そのため，高温で長時間インキュベートす
ることは好ましくないと考えられる。
が除去されることがわかる。しかし,60℃で3.5分間イン
キュベートするとHbの変性が認められ，総Hb量が約90％
に低下した。そのため，高温で長時間インキュベートす
ることは好ましくないと考えられる。
実施例５ リン酸緩衝液からなるHbA1C測定用専用溶離液Ａ液（積
水化学工業（株）製）にフィチン酸ナトリウムを0.005
％になるように添加し，解離剤含有溶離液を得た（pH6.
0）。別に，実施例１と同様の溶血剤溶液（解離剤を含
有しない）を調製し，これを用いて，新鮮血液を実施例
１と同様に溶血させた。この試料をすみやかに上記溶離
液を用いてクロマトグラフィーにかけて，分離・測定し
たところ，溶出パターンは，実施例１の解離用媒質を用
いた場合と，ほぼ同様であり，HbA1C含量は4.4％であっ
た。本発明の解離剤を含有する溶離液を用いると充分に
L-HbA1Cが除去されることがわかる。
水化学工業（株）製）にフィチン酸ナトリウムを0.005
％になるように添加し，解離剤含有溶離液を得た（pH6.
0）。別に，実施例１と同様の溶血剤溶液（解離剤を含
有しない）を調製し，これを用いて，新鮮血液を実施例
１と同様に溶血させた。この試料をすみやかに上記溶離
液を用いてクロマトグラフィーにかけて，分離・測定し
たところ，溶出パターンは，実施例１の解離用媒質を用
いた場合と，ほぼ同様であり，HbA1C含量は4.4％であっ
た。本発明の解離剤を含有する溶離液を用いると充分に
L-HbA1Cが除去されることがわかる。
比較例１ 実施例１と同様の溶血剤（実施例１と同濃度），セミカ
ルバジド塩酸塩（和光純薬製）0.01M,アニリン（和光純
薬製）0.004Mを含むpH5.3の0.005Mリン酸緩衝液からな
る溶血剤含有L-HbA1C除去剤溶液を調製した。これを用
いて新鮮血を実施例１と同様に溶血させ，溶血物を60℃
にて２分間インキュベートした。これを測定したとこ
ろ，HbA1C含量は4.7％であった。しかし，分画パターン
はかなりブロードになり,Hbピーク総面積は当初の約70
％であった。
ルバジド塩酸塩（和光純薬製）0.01M,アニリン（和光純
薬製）0.004Mを含むpH5.3の0.005Mリン酸緩衝液からな
る溶血剤含有L-HbA1C除去剤溶液を調製した。これを用
いて新鮮血を実施例１と同様に溶血させ，溶血物を60℃
にて２分間インキュベートした。これを測定したとこ
ろ，HbA1C含量は4.7％であった。しかし，分画パターン
はかなりブロードになり,Hbピーク総面積は当初の約70
％であった。
比較例２ 実施例１と同様の溶血剤（実施例１と同濃度）およびホ
ウ酸1.0％を含有するpH5.3の0.005Mリン酸緩衝液からな
る溶血剤含有L-HbA1C除去剤溶液を調製した。これを用
いて新鮮血を実施例１と同様に溶血させ溶血物を60℃に
て２分インキュベートした。これを測定したところ，Hb
A1C含量は4.4％であった。しかし，ホウ酸濃度を0.1％
としpHを6.0に調製して同様の測定を行ったところ，HbA
1C含量は4.8％となった。このように，ホウ酸が低濃度
である場合には，充分にL-HbA1Cを除去することができ
ない。
ウ酸1.0％を含有するpH5.3の0.005Mリン酸緩衝液からな
る溶血剤含有L-HbA1C除去剤溶液を調製した。これを用
いて新鮮血を実施例１と同様に溶血させ溶血物を60℃に
て２分インキュベートした。これを測定したところ，Hb
A1C含量は4.4％であった。しかし，ホウ酸濃度を0.1％
としpHを6.0に調製して同様の測定を行ったところ，HbA
1C含量は4.8％となった。このように，ホウ酸が低濃度
である場合には，充分にL-HbA1Cを除去することができ
ない。
（発明の効果） 本発明によれば，このように，血液中のHbA1CのうちL-H
bA1Cが除去され,S-HbA1Cのみが精度良く簡便にかつヘモ
グロビンを変性させることなく短時間のうちに測定され
る。
bA1Cが除去され,S-HbA1Cのみが精度良く簡便にかつヘモ
グロビンを変性させることなく短時間のうちに測定され
る。
S-HbA1Cは，一時的な血糖の上昇もしくは降下に左右さ
れずに比較的安定して血液中に存在するため，この測定
値はより信頼度の高い糖尿病の指標とされ得る。測定系
を自動化することにより，さらに効果的な臨床検査が可
能となる。
れずに比較的安定して血液中に存在するため，この測定
値はより信頼度の高い糖尿病の指標とされ得る。測定系
を自動化することにより，さらに効果的な臨床検査が可
能となる。
第１図は血液中のHbをイオン交換クロマトグラフィーに
より分離して測定したときの溶出パターンを示すチャー
トである。
より分離して測定したときの溶出パターンを示すチャー
トである。
Claims (2)
- 【請求項１】血液中の糖化ヘモグロビンの測定に用いら
れる不安定型糖化ヘモグロビンの解離剤であって， 該解離剤が，フィチン酸および／またはフィチン酸の塩
を主成分とし，不安定型ヘモグロビンA1Cをヘモグロビ
ンとグルコースとに解離しうる， 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤。 - 【請求項２】血液中の少なくとも赤血球および／または
ヘモグロビンを含む試料を，フィチン酸および／または
フィチン酸の塩を含む解離用媒質と接触させて，該赤血
球および／またはヘモグロビンに含まれる不安定型ヘモ
グロビンA1Cをヘモグロビンとグルコースとに解離させ
る工程，および 該解離後の試料中のヘモグロビンをイオン交換クロマト
グラフィーで各ヘモグロビン成分に分離し，該試料中に
存在する安定型ヘモグロビンA1Cを測定する工程， を包含する糖化ヘモグロビンの測定法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8090289A JPH071277B2 (ja) | 1989-03-30 | 1989-03-30 | 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8090289A JPH071277B2 (ja) | 1989-03-30 | 1989-03-30 | 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02259467A JPH02259467A (ja) | 1990-10-22 |
| JPH071277B2 true JPH071277B2 (ja) | 1995-01-11 |
Family
ID=13731302
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8090289A Expired - Fee Related JPH071277B2 (ja) | 1989-03-30 | 1989-03-30 | 不安定型糖化ヘモグロビン解離剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH071277B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2782470B2 (ja) * | 1990-07-20 | 1998-07-30 | 株式会社日立製作所 | グリコヘモグロビンの分離方法および分離装置並びに分離カラム |
| JPH0912598A (ja) * | 1995-06-29 | 1997-01-14 | Sekisui Chem Co Ltd | ヘモグロビンの分離精製方法 |
| JP6786917B2 (ja) * | 2016-07-08 | 2020-11-18 | 東ソー株式会社 | ヘモグロビン調製液及びヘモグロビン類測定液体クロマトグラフィー法 |
-
1989
- 1989-03-30 JP JP8090289A patent/JPH071277B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02259467A (ja) | 1990-10-22 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |