JPH07222592A - ホスホリパーゼａ１によるリゾリン脂質の製造法 - Google Patents

ホスホリパーゼａ１によるリゾリン脂質の製造法

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JPH07222592A
JPH07222592A JP30849094A JP30849094A JPH07222592A JP H07222592 A JPH07222592 A JP H07222592A JP 30849094 A JP30849094 A JP 30849094A JP 30849094 A JP30849094 A JP 30849094A JP H07222592 A JPH07222592 A JP H07222592A
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phospholipase
enzyme
lysophospholipid
reaction
phospholipid
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JP30849094A
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Noriyoshi Uchida
典芳 内田
Atsushi Hattori
惇 服部
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Sankyo Co Ltd
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Sankyo Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 リン脂質を、酸性ホスホリパーゼＡ１で処理
することを特徴とするリゾリン脂質の製造法。 【効果】 本発明の製造法は、酵素作用時にｐＨの調整
を必要とせず、温和な加熱処理により残存酵素を失活さ
せることができ、リゾ化率が高く、品質が良いリゾリン
脂質を製造するものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の目的】
【０００２】
【産業上の利用分野】本発明は、リン脂質を、酸性ホス
ホリパーゼＡ１で処理して、リゾリン脂質を製造する方
法に関する。
【０００３】
【従来の技術】リゾリン脂質とはリン脂質のグリセリン
残基に結合した脂肪酸の一部を加水分解して得られる部
分分解リン脂質である。このようなリゾ型リン脂質は、
もとのリン脂質に比べて水溶性が増加してＯ／Ｗ型の乳
化性が強くなり、ｐＨや温度変化に対してより安定なエ
マルジョンを形成し、また、カルシウムやマグネシウム
等のイオンが高濃度に共存しても乳化力が低下しない
等、優れた特性が付与されることが報告されている。こ
のため、リゾリン脂質は食品、化粧品、医薬品等の分野
においてリン脂質に比べてその応用範囲が広い。また、
リン脂質含有物中リン脂質のリゾ化は、その現象単独で
又は他の共存物質との相乗効果等により食品物性の向上
に結びつくことがある。
【０００４】リン脂質を分解する酵素としてはホスホリ
パーゼが知られており、その作用部位によって更に細分
類されている。このうちリン脂質をリゾリン脂質と脂肪
酸に分解するものとしては、ホスホリパーゼＡ１又はホ
スホリパーゼＡ２が知られているが、いずれもリン脂質
のリゾ化を目的とした用途に使用され得る。
【０００５】現在、リン脂質からリゾリン脂質を製造す
る工業的方法には、専ら豚膵臓のホスホリパーゼＡ２が
使用されているが、以下に示す問題点がある。第一点
は、一般に、ホスホリパーゼＡ作用時には、ｐＨの調整
が必要とされる点である。ホスホリパーゼＡ作用時に
は、遊離する脂肪酸により反応系のｐＨは低下するが、
豚膵臓ホスホリパーゼＡ２の至適ｐＨは、中性乃至弱ア
ルカリ性である。そのため、酵素作用時にはｐＨの調整
が必要であり、酵素反応後にはｐＨ調整のために添加し
た物質の除去工程等が必要となる。
【０００６】この問題を解決するために、溶剤分別（米
国特許第3,652,397 号等）、非イオン性無極性有機溶媒
中で酵素反応させる方法（特開平3-98590 号公報）又は
遊離脂肪酸と金属セッケンを作るような化合物を反応中
に添加する方法（特開昭62-14790 号公報、特公平4-814
31 号公報）等が提案されている。しかし、これらの方
法は、操作が煩雑であり、製品の安全性が問題とされる
場合もある。
【０００７】第二点は、酵素反応後、得られた生成物中
に、加熱や有機溶媒等に対して極めて高い安定性を持つ
豚膵臓ホスホリパーゼＡ２が残存する点である。最終製
品中に加水分解を受けていないリン脂質が存在すると、
ホスホリパーゼＡ２によりリン脂質から新たに脂肪酸が
遊離し、その商品価値を著しく損ねることがある。その
ため、熱処理により残存酵素を失活させる方法が考えら
れるが、酵素反応生成物を９５℃で、３０分程度の加熱
処理をするだけでは、豚膵臓ホスホリパーゼＡ２は十分
には失活せず、また１２０℃位の加熱処理をして、失活
させると、リン脂質又は遊離脂肪酸の劣化を引き起こす
等の問題が生じる。
【０００８】また、ホスホリパーゼＡ２の残存活性を実
質的に有さないリゾリン脂質含有物を得るために、種々
の方法が試みられている。例えば、その製造工程におい
て各種の溶剤を用いた溶剤分別及びシリカゲル等を用い
たカラム処理等を組み合わせた方法、ホスホリパーゼＡ
２で処理したリン脂質を乾燥させた後、極性溶媒を用い
て分別する方法（特開昭62-262998 号公報）又は酵素処
理した後、反応生成物中のホスホリパーゼＡ２をプロテ
アーゼで処理し、ついで該プロテアーゼを加熱失活させ
る方法（特開昭63-233750 号公報）等である。しかし、
それらの操作には、時間や費用がかかり、しかも収率も
低下するなど種々の問題点がある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、長年に
亘り、ホスホリパーゼを用いて、リン脂質からリゾリン
脂質を製造する方法について、鋭意検討を行い、リン脂
質を、酸性ホスホリパーゼＡ１生産菌の酵素抽出液に水
性有機溶媒を添加することにより得られた酸性ホスホリ
パーゼＡ１で処理することにより、酵素作用時にｐＨの
調整を必要とせず、温和な加熱処理により残存酵素を失
活させることができ、リゾ化率が高く、品質が良いリゾ
リン脂質を製造する方法を見出して、本発明を完成させ
た。
【００１０】
【発明の構成】
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明の製造法は、リン
脂質を酸性ホスホリパーゼＡ１で処理することにより達
成される。
【００１２】使用される酸性ホスホリパーゼＡ１は、好
適には、ｐＨ２．５乃至６（好適には、ｐＨ３乃至５．
５）の活性領域を有するホスホリパーゼＡ１であり、更
に好適には、４５℃乃至９０℃（好適には、５０℃乃至
８０℃）の安定上限温度を有するホスホリパーゼＡ１で
あり、更により好適には、ｐＨ３．２乃至５の作用最適
ｐＨ、ｐＨ３乃至８．５のｐＨ安定性及び５５℃以下の
温度安定性を有するホスホリパーゼＡ１であり、特に好
適には、上記特性を有し、アスペルギルス(Aspergillu
s) 属の糸状菌が生産するホスホリパーゼＡ１である。
【００１３】酸性ホスホリパーゼＡ１を生産する生産菌
としては、例えば、アスペルギルス・オリゼ(Aspergill
us oryzae:例えば、SANK-11870、IFO-30102 等) 、アス
ペルギルス・ニガー（Aspergillus niger：例えば、IF
O-4407、ATCC-9642 等) 、アスペルギルス・ウサミイ
（Aspergillus usamii：例えば、IFO-6082、IAM-2414
等）、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamor
i : 例えば、IFO-4033、IAM-2112等) 、アスペルギルス
・フミガトウス（Aspergillus fumigatus : 例えば、IA
M-2034等) 、アスペルギルス・ソージャ（Aspergillus
sojae : 例えば、IAM-2666等) 、アスペルギルス・フォ
エニシス（Aspergillus phoenisis : 例えば、IAM-2215
等) 、アスペルギルス・ウェンティ（Aspergillus went
ii :例えば、IAM-2133等) のようなアスペルギルス属に
属する糸状菌があげられ、好適には、アスペルギルス・
オリゼである。上記糸状菌は、いずれも、公知菌（例え
ば、特公昭46-32792号公報、J. Gen. Appl. Microbio
l., 17, 281(1971)、 Biochem. Z., 261 275(1933) 等）
であり、財団法人発酵研究所(Institute for Fermentat
ion Osaka:IFO)、アメリカン・タイプカルチャー・コレ
クション（American TypeCulture Collection:ATCC)、
応用微生物研究所（Institute of Applied Microbiolog
y:IAM ）等の保存機関にそれぞれの番号で保存され、自
由に分譲を受けることができる。また、SANK-11870は、
微工研菌寄第3887号(FERM BP-3887)として工業技術院微
生物工業技術研究所に寄託されている。また、これらの
菌株は、天然の元株のほか、その人工変異株をも含む。
【００１４】酸性ホスホリパーゼＡ１は、麹式培養法、
液体培養法いずれによっても生産可能であり、いずれの
場合においてもその培地組成、培養条件を適当に選択す
ることにより、リン脂質から脂肪酸を遊離せしめる活性
を有する酵素としてホスホリパーゼＡ１のみを含有し、
しかもリパーゼ活性を伴わないホスホリパーゼＡ１を選
択的に生産することができる。
【００１５】例えば、本発明のホスホリパーゼＡ１は以
下の方法で製造される。即ち、菌株の培養は、ふすま
に、水を０．５乃至２倍重量（好適には、等量）加え
て、蒸煮して得た固体培地に種菌を接種して、麹式培養
法で行う。培地原料としては、ふすまの他に、穀類（例
えば、米、麦等）、各種雑穀類（例えば、とうもろこ
し、大豆、ごま等）、綿実かす等を単独または組み合わ
せて用いることもできる。
【００１６】培養温度は、１０℃乃至４０℃（好適に
は、１５℃乃至３５℃）であり、培養時間は、培地組
成、培養温度等により異なるが、通常３日乃至２０日間
（好適には、４日乃至８日間）である。培養終了後、麹
に水又は適当な緩衝液（例えば、酢酸塩緩衝液、リン酸
塩緩衝液等）を１乃至２０倍重量加え、良く攪拌した
後、圧搾濾過して、酵素液を得ることができる。
【００１７】酵素液からの酵素の採取には常法、例え
ば、塩析法、有機溶媒沈殿法、イオン交換体等を吸着体
として用いる吸着法、限外濾過法、真空乾燥法等を単独
又は適宜組み合わせて用いることにより、目的とする品
質の酵素が調製できる。本発明においては、最も一般的
な酵素の採取法である有機溶媒沈殿法が適している。
【００１８】酵素反応における酸性ホスホリパーゼＡ１
の添加量は、反応温度、反応時間、反応時のｐＨ、基質
の性状や品質、夾雑する物質、要求される効果の程度等
により異なるが、好適には、１０００単位／g の酵素を
用いて、リン脂質（例えば、大豆リン脂質）に対して、
０．０５重量％乃至１０重量％（特に好適には、０．２
重量％乃至２重量％）である。
【００１９】使用される基質は、リン脂質自身又はリン
脂質含有物質であり、その給源、含有率、性状を問わな
い。それらは、例えば、大豆、小麦、大麦、トウモロコ
シ、ナタネ、サフラワー、ヒマワリ、落花生、綿実等の
植物性リン脂質、卵黄、動物の脳（ウシ、ヒツジ、ブ
タ、ニワトリ等）等の動物性リン脂質、クロレラ細胞、
糸状菌菌体等の微生物菌体リン脂質等であり得、好適に
は、大豆、小麦または卵黄のリン脂質である。
【００２０】本酵素とリン脂質を処理する酵素反応は、
酵素と基質を、水性媒体中又は湿潤状態で接触させるこ
とにより行われ、場合によっては非イオン性無極性有機
溶媒（例えば、ジエチルエーテル、ジオキサンのような
エーテル類、ヘキサン、ベンゼン、トルエンのような炭
化水素類、酢酸エチル、酢酸ブチルのようなエステル類
等）共存下で酵素反応させることも可能である。
【００２１】水性又は湿潤媒体は、例えば、イオン交換
水、蒸留水、井水、水道水等であり得、必要に応じて、
酸（例えば、酢酸等）、アルカリ（例えば、水酸化ナト
リウム等）又は緩衝液（例えば酢酸緩衝液）を加えて、
ｐＨ2.5 乃至6.5 （好適には、3.5 乃至5.5 ）に調整す
ることもできる。また、イオン交換水、蒸留水等の軟質
の水を用いる場合には、塩化カルシウム等を添加するほ
うが好ましいことがある。
【００２２】酵素反応温度は、１０℃乃至７０℃（好適
には、２０℃乃至６５℃、特に好適には、３０℃乃至６
０℃）であり、反応に要する時間は、反応温度、ｐＨ等
により異なるが、通常１０分乃至１０日間（好適には、
１時間乃至２日間）である。また、得られるリゾリン脂
質中にホスホリパーゼＡ１活性が残存することは、通常
好ましくなく、酵素反応を行った後、必要に応じて、簡
便な操作、即ち、温和な加熱処理によって、酵素反応生
成物中の残存ホスホリパーゼＡ１活性を容易に失活させ
ることができる。この加熱処理は、４５℃乃至９０℃
（好適には、５０℃乃至８０℃）で、５分乃至５時間
（好適には、１０分乃至２時間）加熱することにより行
われる。
【００２３】また、加熱処理の他に、酵素を失活させる
ための常法、例えば、加圧処理、ｐＨ処理等を単独で又
は適宜組み合わせて用いても、残存ホスホリパーゼＡ１
活性を失活させることができる。
【００２４】本酵素反応により、反応生成物は、そのま
ま使用することが可能であるが、更に必要に応じて、薄
層濃縮等の濃縮機による濃縮、又は精製、更には、噴霧
乾燥、凍結乾燥等の乾燥手段、等の常法を施して、濃
縮、精製、又は乾燥製品とすることもできる。
【００２５】また、本酵素は、パン、麺等の小麦粉製品
の物性改良を目的として生地に直接添加するような場合
にも使用できる。この際、さらに必要に応じて、ホスホ
リパーゼＤ、乳化剤（例えば、モノグリセライド、カル
シウムステアリルラクチレート等）を添加することがで
きる。また、本酵素使用による効果は、生地物性及び製
品物性に現われ、生地は、本酵素添加により、適度の弾
力性と伸展性を有するようになり、また粘着性も抑制さ
れて、各作業工程での操作が容易となる。
【００２６】
【発明の効果】本発明の酸性ホスホリパーゼＡ１を用い
るリゾリン脂質の製造法は、酵素作用時にｐＨの調整を
必要とせず、高純度のリゾリン脂質を製造できるという
効果を有するばかりでなく、温和な加熱処理により残存
酵素を失活させることができるため、簡便な操作で、生
成したリゾリン脂質の品質劣化を防ぎ、エネルギーも節
約できる効果を有する。
【００２７】
【実施例】以下に本発明の実施例及び製造例を示すが、
本発明は、これらによってなんら限定されるものではな
い。
【００２８】［実施例１］リゾリン脂質の製造 水４５ｍｌ中に SLP- ホワイト（ツルーレシチン 社製）５ｇを
懸濁した１０％（ｗ／ｗ）懸濁液および０．２ｇ塩化カ
ルシウムを１００ｍｌ 容ビーカーに入れ、超音波ホモ
ジナイザーで十分に分散させた。３７℃で予備加温した
後、ホスホリパーゼＡ１−ａ〜−ｃを各８６５単位添加
し、撹拌子で撹拌しながら３７℃で、反応中の水分が蒸
発しないようにビーカーにはシーロンフィルム（富士フ
ィルム社製）をかぶせて、酵素反応を進行させた。反応
開始時、１時間後、２時間後及び３時間後に反応液を採
取し、サンプル中の遊離脂肪酸を遊離脂肪酸定量試薬デ
タミナーNEFAを用いて定量した。見かけのリン脂質リゾ
化率は、SLP-ホワイト中のリン脂質の平均分子量を７６
５であると仮定して、式 Ａ／Ｂ ｘ １００ Ａ：リゾリン脂質のモル数（酵素反応により遊離した脂
肪酸のモル数） Ｂ：基質リン脂質のモル数 を用いて、求めた。その結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】 ──────────────────────────────────── 実験 添加酵素 見かけのリン脂質リゾ化率（％） 番号 （ｐＨ値） 反応時間 0時間 1時間 2時間 3 時間 ──────────────────────────────────── 1．ホスホリパーゼＡ１−ａ 0 70 84 89 (6.4) (4.7) (4.6) (4.6) 比較例 2．ホスホリパーゼＡ１−ｂ 0 65 83 90 (6.4) (4.7) (4.6) (4.7) 3 ホスホリパーゼＡ１−ｃ 0 68 86 90 (6.4) (4.7) (4.6) (4.6) ──────────────────────────────────── 本発明のホスホリパーゼＡ１−ａは、比較例として示し
た、ホスホリパーゼＡ１−ｂ（ホスホリパーゼＡ１−ａ
を更に精製したもの）及びホスホリパーゼＡ１−ｃ（As
pergillus niger 由来）と殆ど同様の優れたリン脂質リ
ゾ化率を示した。
【００３０】［実施例２］熱処理による残存する酵素の失活 基質［１０(w/w) ％ SLP-ホワイト（ツルーレシチン 社製）］
５０ｍl および０．２ｇ塩化カルシウムを１００ｍl 容
ビーカーに入れ、超音波ホモジナイザーで十分に分散さ
せた。３７℃で予備加温した後、ホスホリパーゼＡ１−
ａ〜−ｃを各２１６０単位添加し、撹拌子で撹拌しなが
ら、３７℃で５時間酵素反応を進行させた。なお、緩衝
液として、５mM酢酸緩衝液(pH ４．５) を用いた。ま
た、５時間後の見かけのリン脂質リゾ化率は９０％以上
であった。酵素反応後、各々の反応液約７ｇずつを数本
のソモギー（Somogyi ）試験管に分注し、水分が蒸発し
ないようにシーロンフィルムをかぶせて、５０〜８０℃
で３０分間放置した。各反応液中に残存するホスホリパ
ーゼＡ１活性は、後述する方法で測定し、熱処理しない
反応液中のホスホリパーゼＡ１活性に対する百分率で表
した。その結果を表２に示す。
【００３１】
【表２】 ──────────────────────────────────── 実験 添加酵素 残存する酵素活性（％） 番号 処理温度 未処理 50℃ 60℃ 70℃ 80℃ ──────────────────────────────────── 1 ホスホリパーゼＡ１−ａ 100 77 68 0 0 比較例 2 ホスホリパーゼＡ１−ｂ 100 80 70 0 0 3 ホスホリパーゼＡ１−ｃ 100 78 73 19 0 ──────────────────────────────────── 本発明のホスホリパーゼＡ１−ａは、比較例として示し
たホスホリパーゼＡ１−ｂ（ホスホリパーゼＡ１−ａを
更に精製したもの）及びホスホリパーゼＡ１−ｃ（Aspe
rgillus niger 由来）と同様に、温和な加熱処理により
完全に失活させることができた。
【００３２】［製造例］ ホスホリパーゼＡ１−ａ アスペルギルス・ オリゼ（Aspergillus oryzae）SANK11
870 株を、ふすまと水の等量混合物からなる培地１２ｇ
で、３０℃にて６日間培養た。次いで、ふすまと水の混
合物６００ｇを金属皿（４２×２４×７( 深さ) ｃｍ）
に入れ１２０℃にて３０分間加圧蒸煮した培地に先の培
養物を植菌し、３０℃にて１５時間、更に１９℃にて５
日間培養した。こうして形成されたふすまこうじに、水
３ｌを加え、よく混合し、３７℃にて２時間放置した
後、濾過して、ホスホリパーゼＡ１力価５．９単位／ｍ
ｌの酵素抽出液２．８７ｌを得た。この酵素抽出液に酢
酸を加え、ｐＨを４．０に調整し、冷却したアセトンを
３倍量加え、冷所に一夜放置した。その後上澄を捨て、
沈殿部をアセトンでよく洗い、真空乾燥して、ホスホリ
パーゼＡ１−ａを１１．１ｇを得た。
【００３３】本サンプル１ｇ当りの主な酵素活性を表３
に示す。なお、各酵素活性は、後述する方法により測定
した。
【００３４】
【表３】
単位 ──────────────────────────────────── ホスホリパーゼＡ１ １, １７０単位 リパーゼ 測定下限( １０単位）以下 アミラーゼ ８, ７４０単位 酸性プロテアーゼ ３８, ８００単位 中性・アルカリ性プロテアーゼ ２３０, ０００単位 ──────────────────────────────────── ［比較例１］ ホスホリパーゼＡ１−ｂ 製造例で得られたホスホリパーゼＡ１−ａ １０ｇを水
約１００ｍl に溶かし、１Ｎ酢酸を加えて、ｐＨ4.0 に
調整し、水を加えて２００ｍl とした後、２００ｍl の
冷アセトンを加えて混合し、１時間放置した。その後、
混合液を遠心分離して、第１沈殿を得た。上澄に６００
ｍl の冷アセトンを加えて混合し、１時間放置した。そ
の後、混合液を遠心分離して、第２沈殿を５ｇ得た。こ
の５ｇの沈殿を、５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）５
００ｍl に溶かし、硫酸アンモニウム３００ｇを加えて
塩析した。遠心分離して得た沈殿を１Ｍ硫酸アンモニウ
ムを、含む５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶か
し、不純物を濾別した後、カラムクロマトグラフィー
［カラム: ブチルトヨパールパック６５０Ｓ(Butyl Toy
opearl pak 650S)、東ソー社製、流出溶剤：硫酸アンモ
ニウム含有５０ｍＭ酢酸緩衝液( ｐＨ５．５) 、硫酸ア
ンモニウム濃度、１〜０Ｍグラジェント溶出］を実施し
た。溶出したホスホリパーゼＡ１活性画分に、硫酸アン
モニウムを添加して塩析し、１夜放置の後、遠心分離し
て得た沈殿を、カラムクロマトグラフィー［カラム：ス
ーパーロース１２（Superose 12）ファルマシア社製、
溶出溶剤：脱イオン水］により脱塩した。溶出したホス
ホリパーゼＡ１活性画分を凍結乾燥してホスホリパーゼ
Ａ１−ｂを０．０３４ｇ得た。なお、本サンプルに含ま
れる２種類のホスホリパーゼＡ１の分子量は、ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定し、それぞ
れ３７，０００又は３５，０００であり、等電点はそれ
ぞれ３．９又は４．３であった。
【００３５】本サンプル１ｇ当りの主な酵素活性を表４
に示す。なお、各酵素活性は、後述する方法により測定
した。
【００３６】
【表４】 ─────────────────────────────────── ホスホリパーゼＡ ７２, １００単位 リパーゼ １００単位以下 アミラーゼ ３，９９０単位 酸性プロテアーゼ ５０, ５００単位 中性・アルカリ性プロテアーゼ ４９, ０００単位 ─────────────────────────────────── ［比較例２］ ホスホリパーゼＡ１−ｃ アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger ）ATCC96
42株を、ふすまと水の等量混合物からなる培地１２ｇ
で、３０℃にて６日間培養し、次いで、前培養した全菌
株を、ふすまと水の混合物６００ｇを金属皿（４２×２
４×７（深さ）ｃｍ）に入れ、１２０℃にて３０分間蒸
煮した培地に植菌し、３０℃にて１５時間、更に１９℃
にて５日間培養した。こうして調製したふすまに、水３
ｌを加え、よく混合し、３７℃にて２時間放置した後、
濾過して酵素抽出液を得た。この酵素抽出液に酢酸を加
え、ｐＨを４．０に調整し、冷却したアセトンを３倍量
加え、冷所に一夜放置した。その後上澄を捨て、沈殿部
をアセトンでよく洗い、真空乾燥して、リン脂質から脂
肪酸遊離せしめる活性１１９単位／ｇの酵素サンプルを
19.2ｇを得た。この酵素サンプル１０ｇを水約１００ｍ
ｌに溶かし、１Ｎ酢酸を加えて、ｐＨ４．０に調整し、
水を加えて２００ｍｌとした後、２００ｍｌの冷アセト
ンを加えて混合し、１時間放置した。その後、混合液を
遠心分離して、第１沈殿を得た。上澄に６００ｍｌの冷
アセトンを加えて混合し、１時間放置した。その後、混
合液を遠心分離して、第２沈殿を得た。この沈殿を、５
０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ5.5 ）５００ｍｌに溶かし、硫
酸アンモニウム３００ｇを加えて塩析した。遠心分離し
て得た沈殿を１Ｍ硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ酢酸
緩衝液（ｐＨ5.5 ）に溶かし、不溶物を濾別した後、ブ
チルトヨパールパック６５０Ｓ（Butyl Toyopearl pak
650S、東ソー社製）、Ｑ−セファロース（Q-Sepharose
、ファルマシア社製）、及びスーパーロース１２（Sup
erose 12 、ファルマシア社製）をー 用いたカラムクロ
マトグラフィーにより精製し、ホスホリパーゼＡ１力価
２，１００単位／ｇのホスホリパーゼＡ１−ｃ ０．０
１５ｇを得た。なお、本サンプルに含まれるホスホリパ
ーゼＡ１の分子量は、スーパーロース１２を用いたゲル
濾過法による推定により３２，０００と推定され、等電
点は、３．０であった。
【００３７】本サンプル１ｇ当りの主な酵素活性を表５
に示す。なお、各酵素活性は、後述する方法により測定
した。
【００３８】
【表５】 ─────────────────────────────────── ホスホリパーゼＡ ２, １００単位 リパーゼ 測定下限( １０単位) 以下 アミラーゼ １７単位 酸性プロテアーゼ ２８０単位 中性・アルカリ性プロテアーゼ ７００単位 ─────────────────────────────────── 次に、製造例及び比較例１〜２でえられたホスホリパー
ゼＡ１−ａ〜−ｃをそれぞれ２位のパルミトイル基が14
Ｃ標識されたＬ- α- ジパルミトイルホスファチジルコ
リン（Ｌ- α-di-palmitoyl-phosphatidylcholine 、NE
N 社 NEC764 ）及び１と２位のパルミトイル基が14Ｃ標
識されたＬ- α- ジパルミトイルホスファチジルコリン
（NEN 社 NEC 682）に作用させた。その結果、１と２位
のパルミトイル基が14Ｃ標識されたホスファチジルコリ
ンからのみ14Ｃ標識されたパルミチン酸が遊離した。こ
の結果から、ホスホリパーゼＡ１−ａ〜−ｃに含まれる
リン脂質からの脂肪酸遊離活性は１- アシル基からの脂
肪酸の遊離に由来するものであることを確認した。ま
た、ホスホリパーゼＡ１−ａ〜−ｃは、いずれもリパー
ゼ活性をほとんど伴わないこと（ホスホリパーゼＡ１活
性の約０．１％以下）を確認した。
【００３９】以下に本発明のホスホリパーゼＡ１−ａの
特性を比較例１及び２に示したホスホリパーゼＡ１−ｂ
及び−ｃと比較して示す。 （１）作用最適ｐＨ 作用最適ｐＨは、図１に示すようにｐＨ３．２乃至５で
ある。なお、ホスホリパーゼＡ１活性は、後述する方法
で測定し、ｐＨ４における活性を１００％とした。
【００４０】（２）作用最適温度 作用最適温度は、図２に示すように５０℃乃至６０℃で
あった。なお、ホスホリパーゼＡ１活性は、後述する方
法で測定し、３７℃における活性を１００％とした。 （３）ｐＨ安定性 ｐＨ安定性は、図３に示すようにｐＨ３乃至８．５であ
る。なお、ホスホリパーゼＡ１活性は、０．２Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ３．２〜６．５）及び０．０１Ｍトリス- 塩
酸緩衝液（ｐＨ３．２〜９．０）を用いて、ホスホリパ
ーゼＡ１約１０単位／ｍｌの酵素液を調製し、３７℃
で、６０分間加温処理した後、後述する方法で測定し、
３７℃で、６０分間の加温処理した場合の残存活性の最
大値を１００％とした。
【００４１】（４）温度安定性 ｐＨ４における温度安定性は、図４に示すように３０℃
乃至５５℃である。なお、ホスホリパーゼＡ１活性は、
酵素液を、３０〜７０℃で３０分間で、加温処理した
後、後述する方法で測定し、加温処理しない場合の活性
を１００％とした。
【００４２】なお、各酵素活性は、以下の方法により測
定した。
【００４３】(i) ホスホリパーゼＡ１活性及びリン脂質
からの脂肪酸遊離活性試験 ２．０（w ／v ）％ SLP- ホワイト（ツルーレシチン工
業社製）及び４(v／v）％トライトン(Triton)Ｘ-1００
水溶液０．５ｍl に0.1 Ｍ 塩化カルシウム０．０５ｍ
l ０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）０．２５ｍl を
加えた。ついで、酵素液０．１ｍｌを加えて、撹拌して
均一にして、３７℃で静置し、１０分間酵素反応を行っ
た。その後、１Ｎ塩酸０．１ｍｌを加えて、酵素反応を
停止させた。反応液０．０２ｍｌを採り、遊離脂肪酸定
量試薬デタミナーNEFA（協和メデックス社製）を用い
て、遊離脂肪酸を定量した。酵素反応１分当たり脂肪酸
１μモルを生成させる酵素活性を１単位と定義した。
【００４４】(ii)リパーゼ活性試験 ２．０（w ／v ）％オリーブ油（和光純薬工業社製）エ
マルジョン［オリーブ油０．２ｇに０．５（w ／w ）％
アラビアゴム水溶液１０ｍl を加え、超音波ホモジナイ
ザーで５分間分散させたもの］０．５ｍｌに０．１Ｍ塩
化カルシウム０．０５ｍｌと０．０２Ｍ酢酸緩衝液（ｐ
Ｈ６）を加えた。ついで、酵素液０．１ｍｌを加えて、
撹拌して均一にして、３７℃で静置し、１０分間酵素反
応を行った。その後、１Ｎ塩酸0.1ml を加えて、酵素反
応を停止させた。反応液 0.02 ｍl を採り、遊離脂肪酸
定量試薬デタミナーNEFAを用いて、遊離脂肪酸を定量し
た。酵素反応１分当たり脂肪酸１μモルを生成させる酵
素活性を１単位と定義した。
【００４５】(iii) アミラーゼ（糖化型）活性試験 試験管に、基質［可溶性デンプン２ｇに水２０ｍl(適当
量) を加えて加熱溶解し、冷却した後、０．２Ｍ酢酸緩
衝液 (ｐＨ４．５) を２０ｍl 加え、さらに水を加えて
５０ｍl に調製したもの］０．５ｍｌを入れ、３７℃恒
温水槽にて予備加温した後、酵素液０．２５ｍｌを添加
した。３０分間の酵素反応の後、０．５Ｎ水酸化ナトリ
ウム０．２５ｍｌを加えて反応停止させた。これを酵素
反応液とし、ソモギーネルソン（Somogyi −Nelson）還
元糖測定法（J. Biol. Chem., 160, 61-68(1945)、J. B
iol. Chem., 153, 375-380(1944)）を用いて、酵素反応
によって生じた還元糖を定量した。酵素反応１分当たり
グルコース１μモル相当量の還元糖を生成させる酵素活
性を１単位と定義した。
【００４６】(iv)プロテアーゼ活性試験 萩原の方法（酵素研究法２ 朝倉書店，237-246(1956)
）により測定した。なお、基質のｐＨは３．０（酸性
プロテアーゼ) 又は７．０( 中性・ アルカリ性プロテア
ーゼ) とした。酵素活性の単位は、ノースロプ（Nothro
p ）やアンソン（Anson ）に準じて基準条件下で１分間
にチロシン（tyrosine）１μｇ相当量の２７５ｎｍにお
ける吸収を示す非蛋白性物質を生成する酵素活性を１単
位と定義した。
【図面の簡単な説明】
【図１】製造例のホスホリパーゼＡ１−ａ及び比較例
１、２のホスホリパーゼＡ１−ｂ〜−ｃの作用最適ｐＨ
【図２】製造例のホスホリパーゼＡ１−ａ及び比較例
１、２のホスホリパーゼＡ１−ｂ〜−ｃの作用最適温度
【図３】製造例のホスホリパーゼＡ１−ａ及び比較例
１、２のホスホリパーゼＡ１−ｂ〜−ｃのｐＨ安定性
【図４】製造例のホスホリパーゼＡ１−ａ及び比較例
１、２のホスホリパーゼＡ１−ｂ〜−ｃの温度安定性

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 リン脂質を、酸性ホスホリパーゼＡ１で
    処理することを特徴とするリゾリン脂質の製造法。
  2. 【請求項２】 酸性ホスホリパーゼＡ１が、酸性ホスホ
    リパーゼＡ１生産菌の酵素抽出液に水性有機溶媒を添加
    することにより得られたホスホリパーゼＡ１である請求
    項１のリゾリン脂質の製造法。
  3. 【請求項３】 酸性ホスホリパーゼＡ１が、アスペルギ
    ルス(Aspergillus)属の糸状菌が生産するホスホリパー
    ゼＡ１である請求項１又は請求項２のリゾリン脂質の製
    造法。
  4. 【請求項４】 酸性ホスホリパーゼＡ１が、アスペルギ
    ルス・オリゼ(Aspergillus oryzae)が生産するホスホリ
    パーゼＡ１である請求項１、請求項２又は請求項３のリ
    ゾリン脂質の製造法。
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