JPH07252493A - 海洋性微細藻類からのドコサヘキサエン酸エステルの分離精製方法 - Google Patents
海洋性微細藻類からのドコサヘキサエン酸エステルの分離精製方法Info
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- JPH07252493A JPH07252493A JP6045426A JP4542694A JPH07252493A JP H07252493 A JPH07252493 A JP H07252493A JP 6045426 A JP6045426 A JP 6045426A JP 4542694 A JP4542694 A JP 4542694A JP H07252493 A JPH07252493 A JP H07252493A
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- dha
- acid ester
- docosahexaenoic acid
- fatty acid
- ester
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- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Fats And Perfumes (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】海洋性微細藻類に属し、ＤＨＡを産生する能力
を有する藻類の藻体から、高純度のＤＨＡエステルを高
回収率で取得する分離精製方法を提供する。 【構成】ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含有する脂質
を産生する海洋性微細藻類を培養して得られた該海洋性
微細藻類の藻体から脂質を抽出し、該脂質中の脂肪酸を
アルコール類でエステル化し脂肪酸エステルを得、次い
で、これを遠心向流分配クロマトグラフィーで処理し、
ドコサヘキサエン酸エステルを含む画分を分取するドコ
サヘキサエン酸エステルの分離精製方法。
を有する藻類の藻体から、高純度のＤＨＡエステルを高
回収率で取得する分離精製方法を提供する。 【構成】ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含有する脂質
を産生する海洋性微細藻類を培養して得られた該海洋性
微細藻類の藻体から脂質を抽出し、該脂質中の脂肪酸を
アルコール類でエステル化し脂肪酸エステルを得、次い
で、これを遠心向流分配クロマトグラフィーで処理し、
ドコサヘキサエン酸エステルを含む画分を分取するドコ
サヘキサエン酸エステルの分離精製方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医薬品としての開発が
期待されている高純度ドコサヘキサエン酸エステル（以
下ＤＨＡエステルという）の製造方法にかかわり、さら
に詳しくは微細藻を培地に培養して得られる藻体を原料
とする新規なＤＨＡエステルの製造方法に関する。ドコ
サヘキサエン酸（以下ＤＨＡということがある）は、近
年、コレステロール低下作用、抗血液凝固作用、学習機
能向上作用など多彩な生理作用が報告されている高度不
飽和脂肪酸である。
期待されている高純度ドコサヘキサエン酸エステル（以
下ＤＨＡエステルという）の製造方法にかかわり、さら
に詳しくは微細藻を培地に培養して得られる藻体を原料
とする新規なＤＨＡエステルの製造方法に関する。ドコ
サヘキサエン酸（以下ＤＨＡということがある）は、近
年、コレステロール低下作用、抗血液凝固作用、学習機
能向上作用など多彩な生理作用が報告されている高度不
飽和脂肪酸である。
【０００２】
【従来の技術】多彩な生理作用が報告されている高度不
飽和脂肪酸であるＤＨＡは、古くから魚油中に含まれる
ことが知られている。この魚油中に含まれるＤＨＡは、
尿素付加法、硝酸銀付加法、クロマト分離法、超臨界抽
出法、分子蒸留法等により分離精製されている。しか
し、原料が魚油の場合には、いずれの精製方法を採用し
ても、高純度のＤＨＡエステルを高収率で回収すること
は困難である。一方、これとは別に微生物などに選択的
にＤＨＡを産生させる検討が行なわれてきた。プラチマ
・バッパイらによる検討では、下等な菌類に属するスラ
ウストキトリウム・オーレウム(Thraustochytrium aure
um) にＤＨＡを産生させることが報告されている（App
l.Microbiol.Biotechnol., 35, 706(1991) 参照）が、
これは培養に光を必要とし、さらに物性の似通ったアラ
キドン酸、エイコサペンタエン酸といった他の高度不飽
和脂肪酸を同時に１０〜２０％産生するなどの点で、特
殊な大掛かりな培養装置や高度な分離精製設備を必要と
するなどの問題点があった。また、Ｒ．Ｊ．ヘンダーソ
ンらによる検討では、海洋性微細藻類のクリプテコディ
ニウム・コーニーが高度不飽和脂肪酸としてほぼＤＨＡ
のみを全脂肪酸に対して９％程度産生させることが報告
されている（Phytochemistry, 27 (6), 1697(1988)参
照）が、培養方法が大量培養に向かない静置培養である
点とＤＨＡの含量が低いなどの問題点があった。一方、
本発明者らは、海洋性微細藻類を液体振盪培養や液体深
部培養といった方法で培養することにより、藻体生産性
を高めたばかりでなく、高度不飽和脂肪酸としてはほぼ
ＤＨＡのみを選択的に産生させ、かつ脂質中のＤＨＡの
含量を飛躍的に増大させることを見いだし、これを提案
している（特願平４−３４４２７９号）。しかしなが
ら、ＤＨＡを含有した微生物や藻類を原料とした場合で
も、これから高純度のＤＨＡエステルを高収率で回収し
たという報告例は見当たらない。
飽和脂肪酸であるＤＨＡは、古くから魚油中に含まれる
ことが知られている。この魚油中に含まれるＤＨＡは、
尿素付加法、硝酸銀付加法、クロマト分離法、超臨界抽
出法、分子蒸留法等により分離精製されている。しか
し、原料が魚油の場合には、いずれの精製方法を採用し
ても、高純度のＤＨＡエステルを高収率で回収すること
は困難である。一方、これとは別に微生物などに選択的
にＤＨＡを産生させる検討が行なわれてきた。プラチマ
・バッパイらによる検討では、下等な菌類に属するスラ
ウストキトリウム・オーレウム(Thraustochytrium aure
um) にＤＨＡを産生させることが報告されている（App
l.Microbiol.Biotechnol., 35, 706(1991) 参照）が、
これは培養に光を必要とし、さらに物性の似通ったアラ
キドン酸、エイコサペンタエン酸といった他の高度不飽
和脂肪酸を同時に１０〜２０％産生するなどの点で、特
殊な大掛かりな培養装置や高度な分離精製設備を必要と
するなどの問題点があった。また、Ｒ．Ｊ．ヘンダーソ
ンらによる検討では、海洋性微細藻類のクリプテコディ
ニウム・コーニーが高度不飽和脂肪酸としてほぼＤＨＡ
のみを全脂肪酸に対して９％程度産生させることが報告
されている（Phytochemistry, 27 (6), 1697(1988)参
照）が、培養方法が大量培養に向かない静置培養である
点とＤＨＡの含量が低いなどの問題点があった。一方、
本発明者らは、海洋性微細藻類を液体振盪培養や液体深
部培養といった方法で培養することにより、藻体生産性
を高めたばかりでなく、高度不飽和脂肪酸としてはほぼ
ＤＨＡのみを選択的に産生させ、かつ脂質中のＤＨＡの
含量を飛躍的に増大させることを見いだし、これを提案
している（特願平４−３４４２７９号）。しかしなが
ら、ＤＨＡを含有した微生物や藻類を原料とした場合で
も、これから高純度のＤＨＡエステルを高収率で回収し
たという報告例は見当たらない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、海洋
性微細藻類に属し、ＤＨＡを産生する能力を有する藻類
を、好ましくは、振盪培養または深部通気撹拌培養して
増殖させて得られた海洋性微細藻類の藻体から、高純度
のＤＨＡエステルを高回収率で取得する分離精製方法を
提供することにある。
性微細藻類に属し、ＤＨＡを産生する能力を有する藻類
を、好ましくは、振盪培養または深部通気撹拌培養して
増殖させて得られた海洋性微細藻類の藻体から、高純度
のＤＨＡエステルを高回収率で取得する分離精製方法を
提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、さきにＤ
ＨＡを産生する能力を有する海洋性微細藻類を、振盪培
養または深部通気撹拌培養することにより、脂質中のＤ
ＨＡの含量が飛躍的に上昇することを見いだし、また、
その脂肪酸組成が非常に特徴的で、高度不飽和脂肪酸と
して、他の不飽和脂肪酸の含有量が少なくほとんどＤＨ
Ａのみである培養法を開発した。本発明者らは、この開
発した培養法の特徴を生かしたＤＨＡの分離精製方法を
検討し、本発明をなすに至った。
ＨＡを産生する能力を有する海洋性微細藻類を、振盪培
養または深部通気撹拌培養することにより、脂質中のＤ
ＨＡの含量が飛躍的に上昇することを見いだし、また、
その脂肪酸組成が非常に特徴的で、高度不飽和脂肪酸と
して、他の不飽和脂肪酸の含有量が少なくほとんどＤＨ
Ａのみである培養法を開発した。本発明者らは、この開
発した培養法の特徴を生かしたＤＨＡの分離精製方法を
検討し、本発明をなすに至った。
【０００５】すなわち、本発明は、ドコサヘキサエン酸
（ＤＨＡ）を含有する脂質を産生する海洋性微細藻類を
培養して得られた該海洋性微細藻類の藻体から脂質を抽
出し、該脂質中の脂肪酸をアルコール類でエステル化し
脂肪酸エステルを得、次いで、これを遠心向流分配クロ
マトグラフィーで処理し、ＤＨＡエステルを含む画分を
分取することを特徴とするＤＨＡエステルの分離精製方
法を提供する。
（ＤＨＡ）を含有する脂質を産生する海洋性微細藻類を
培養して得られた該海洋性微細藻類の藻体から脂質を抽
出し、該脂質中の脂肪酸をアルコール類でエステル化し
脂肪酸エステルを得、次いで、これを遠心向流分配クロ
マトグラフィーで処理し、ＤＨＡエステルを含む画分を
分取することを特徴とするＤＨＡエステルの分離精製方
法を提供する。
【０００６】さらに、上記海洋性微細藻類が、クリプテ
コディニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii）に
属する藻類であるのが好ましい。
コディニウム・コーニー（Crypthecodinium cohnii）に
属する藻類であるのが好ましい。
【０００７】また、遠心向流分配クロマトグラフィーで
使用する２相分離液が、ヘキサン／アセトニトリルおよ
び／またはヘキサン／メタノール水溶液であるのが好ま
しい。
使用する２相分離液が、ヘキサン／アセトニトリルおよ
び／またはヘキサン／メタノール水溶液であるのが好ま
しい。
【０００８】本発明のＤＨＡエステルの製造に用いる好
ましい微生物は、海洋性微細藻類で、ＤＨＡを生成する
能力のある菌株である。具体例としては、クリプテコデ
ィニウム・コーニーに属する藻類、特に、クリプテコデ
ィニウム・コーニーＡＴＣＣ３００２１、３０５４３、
３０５５６、３０５７１、３０５７２、３０７７５、５
００５１、５００５３、５００５５、５００５６、５０
０５８、５００６０等が挙げられる。しかし、本発明で
精製するＤＨＡエステルは、上記のものによって製造さ
れるものに限定されるものでなく、ＤＨＡが脂質中の脂
肪酸として含まれるものであればいかなるものでもよ
い。
ましい微生物は、海洋性微細藻類で、ＤＨＡを生成する
能力のある菌株である。具体例としては、クリプテコデ
ィニウム・コーニーに属する藻類、特に、クリプテコデ
ィニウム・コーニーＡＴＣＣ３００２１、３０５４３、
３０５５６、３０５７１、３０５７２、３０７７５、５
００５１、５００５３、５００５５、５００５６、５０
０５８、５００６０等が挙げられる。しかし、本発明で
精製するＤＨＡエステルは、上記のものによって製造さ
れるものに限定されるものでなく、ＤＨＡが脂質中の脂
肪酸として含まれるものであればいかなるものでもよ
い。
【０００９】上述の海洋性微細藻類の菌体を液体振盪培
養または液体深部培養して、藻体を得る。このような藻
体は、高度不飽和脂肪酸としてＤＨＡを極めて特異的に
産出させるばかりでなく、意外にも脂質中のＤＨＡの割
合が４０％程度にまで上昇するので好ましい。
養または液体深部培養して、藻体を得る。このような藻
体は、高度不飽和脂肪酸としてＤＨＡを極めて特異的に
産出させるばかりでなく、意外にも脂質中のＤＨＡの割
合が４０％程度にまで上昇するので好ましい。
【００１０】本発明の分離精製方法では、上述の藻体、
あるいは藻体を乾燥させた乾燥藻体からＤＨＡエステル
を分離精製するものである。まず、エタノール、ヘキサ
ンおよびその混合物を用いて、上述の藻体から脂質を抽
出する。得られた脂質と低級アルコールとを反応させて
ＤＨＡエステルを得る。低級アルコールとしてはメタノ
ール、エタノール、プロピルアルコール、ブチルアルコ
ールなどを用いることができる。反応にあたっては、エ
ステル化触媒の存在下に行なうのが望ましく、例えば三
フッ化ホウ素、塩酸、硫酸、ナトリウムメトキシド、ナ
トリウムエトキシドなど公知のエステル化触媒を用いる
ことができる。
あるいは藻体を乾燥させた乾燥藻体からＤＨＡエステル
を分離精製するものである。まず、エタノール、ヘキサ
ンおよびその混合物を用いて、上述の藻体から脂質を抽
出する。得られた脂質と低級アルコールとを反応させて
ＤＨＡエステルを得る。低級アルコールとしてはメタノ
ール、エタノール、プロピルアルコール、ブチルアルコ
ールなどを用いることができる。反応にあたっては、エ
ステル化触媒の存在下に行なうのが望ましく、例えば三
フッ化ホウ素、塩酸、硫酸、ナトリウムメトキシド、ナ
トリウムエトキシドなど公知のエステル化触媒を用いる
ことができる。
【００１１】エステル化反応させた後、脂肪酸エステル
を溶剤抽出などにより回収し、抽出溶剤を留去すること
で、脂肪酸エステルを回収する。次にこの脂肪酸エステ
ルを遠心向流分配クロマトグラフィーにより精製する。
を溶剤抽出などにより回収し、抽出溶剤を留去すること
で、脂肪酸エステルを回収する。次にこの脂肪酸エステ
ルを遠心向流分配クロマトグラフィーにより精製する。
【００１２】遠心向流分配クロマトグラフィーは特開昭
５９−６２３１２号公報に開示されているもので、相互
に自由には混和せず、２相に分離する２種類またはそれ
以上の溶媒の混合液のうち、一方を固定相として遠心力
により保持しつつ、他方を移動相として連続的に固定相
内を通過させて、移動相内に注入された試料を２層間の
物質の分配係数の差を利用して連続的に分画する向流分
配クロマトグラフィーである。遠心向流分配クロマトグ
ラフィーに用いる２相分離液は、ＤＨＡエステルと他の
不純物との分配係数の値を参考にして決めることができ
る。本発明においては、特に、ヘキサン／アセトニトリ
ル、ヘキサン／メタノール水溶液を用いるのが適してい
る。
５９−６２３１２号公報に開示されているもので、相互
に自由には混和せず、２相に分離する２種類またはそれ
以上の溶媒の混合液のうち、一方を固定相として遠心力
により保持しつつ、他方を移動相として連続的に固定相
内を通過させて、移動相内に注入された試料を２層間の
物質の分配係数の差を利用して連続的に分画する向流分
配クロマトグラフィーである。遠心向流分配クロマトグ
ラフィーに用いる２相分離液は、ＤＨＡエステルと他の
不純物との分配係数の値を参考にして決めることができ
る。本発明においては、特に、ヘキサン／アセトニトリ
ル、ヘキサン／メタノール水溶液を用いるのが適してい
る。
【００１３】本発明では比重および極性が異なり、２相
に分離する２種の溶媒の一方を固定相、他方を移動相と
し、遠心力の作用により固定相中を移動相を移動させ、
移動相中に含まれる試料中の各成分を分配係数の差を利
用して多段分配平衡によりクロマトグラフィー的に分画
する。この方法では、試料中の極性の高い成分が順次極
性の高い溶媒に分配され、また極性の低い成分が順次極
性の低い溶媒に分配される。
に分離する２種の溶媒の一方を固定相、他方を移動相と
し、遠心力の作用により固定相中を移動相を移動させ、
移動相中に含まれる試料中の各成分を分配係数の差を利
用して多段分配平衡によりクロマトグラフィー的に分画
する。この方法では、試料中の極性の高い成分が順次極
性の高い溶媒に分配され、また極性の低い成分が順次極
性の低い溶媒に分配される。
【００１４】図１は本発明で用いられる遠心向流分配ク
ロマトグラフィーの系統図であり、その原理は以下の通
りである。遠心機ローターＲ上に多数の分配管Ｃが遠心
加速度ｇの方向と平行に配列され、相互に直列に導管Ｔ
で接続されている。導管Ｔの両端は遠心機回転軸の両端
に設置された回転送液ジョイントＪ1 、Ｊ2 に接続され
ている。回転送液ジョイントＪ1 、Ｊ2 は４方バルブＶ
3 、６方バルブ（試料インジェクター）Ｖ2 、定流量ポ
ンプＰおよび４方ロータリーバルブＶ1 を介して固定相
ＳＰ、移動相ＭＰ、洗浄液ＷＳの容器に接続され、また
４方バルブＶ3 、フローセルモニターＭおよび３方ロー
タリーバルブＶ4 を介してフラクションコレクターＦお
よび廃液ＷＴの容器に接続している。またＳＬは６方バ
ルブＶ2 を介して試料を移動相ＭＰ中に導入するための
サンプリング回路である。ＲＣは移動相中の試料成分を
検出するフローセルモニターＭで検出されたデーターを
記録するレコーダーである。
ロマトグラフィーの系統図であり、その原理は以下の通
りである。遠心機ローターＲ上に多数の分配管Ｃが遠心
加速度ｇの方向と平行に配列され、相互に直列に導管Ｔ
で接続されている。導管Ｔの両端は遠心機回転軸の両端
に設置された回転送液ジョイントＪ1 、Ｊ2 に接続され
ている。回転送液ジョイントＪ1 、Ｊ2 は４方バルブＶ
3 、６方バルブ（試料インジェクター）Ｖ2 、定流量ポ
ンプＰおよび４方ロータリーバルブＶ1 を介して固定相
ＳＰ、移動相ＭＰ、洗浄液ＷＳの容器に接続され、また
４方バルブＶ3 、フローセルモニターＭおよび３方ロー
タリーバルブＶ4 を介してフラクションコレクターＦお
よび廃液ＷＴの容器に接続している。またＳＬは６方バ
ルブＶ2 を介して試料を移動相ＭＰ中に導入するための
サンプリング回路である。ＲＣは移動相中の試料成分を
検出するフローセルモニターＭで検出されたデーターを
記録するレコーダーである。
【００１５】この装置を用いた遠心向流分配クロマトグ
ラフィーは次のような手順で行なわれる。比重および極
性が異なり、２相に分離する任意の溶媒を混合、静置
後、重液相、軽液相にそれぞれ分離し容器に貯える。い
ずれか一方の液相（図面では重液相）を固定相ＳＰとし
て分配管Ｃに充填した後、ローターＲを回転させ、一定
の遠心加速度ｇを与えつつ、他方の液相（図面では軽液
相）を移動相ＭＰとして回転軸の一端にある回転送液ジ
ョイントＪ1 を通して連続的に送液する。移動相ＭＰは
遠心加速度ｇの作用により、固定相ＳＰ中を微細な液滴
となって分配管Ｃ中を順次通過し、回転軸の他端に位置
する回転送液ジョイントＪ2 より連続的に流出する。遠
心機外部に設置されたサンプリング回路ＳＬにより、送
液初期の一定量の移動相ＭＰ中に導入された試料成分
は、上記過程中に遠心向流分配クロマトグラフィーによ
りそれぞれ目的成分に分離され、その後必要に応じてフ
ラクションコレクターＦで分画される。このようにし
て、遠心向流分配クロマトグラフィーにより回収される
ＤＨＡエステルは極めて高純度であり、健康食品用、試
薬用、医薬用に十分利用できる。遠心向流分配クロマト
グラフィーは、必要により複数回行ってもよい。
ラフィーは次のような手順で行なわれる。比重および極
性が異なり、２相に分離する任意の溶媒を混合、静置
後、重液相、軽液相にそれぞれ分離し容器に貯える。い
ずれか一方の液相（図面では重液相）を固定相ＳＰとし
て分配管Ｃに充填した後、ローターＲを回転させ、一定
の遠心加速度ｇを与えつつ、他方の液相（図面では軽液
相）を移動相ＭＰとして回転軸の一端にある回転送液ジ
ョイントＪ1 を通して連続的に送液する。移動相ＭＰは
遠心加速度ｇの作用により、固定相ＳＰ中を微細な液滴
となって分配管Ｃ中を順次通過し、回転軸の他端に位置
する回転送液ジョイントＪ2 より連続的に流出する。遠
心機外部に設置されたサンプリング回路ＳＬにより、送
液初期の一定量の移動相ＭＰ中に導入された試料成分
は、上記過程中に遠心向流分配クロマトグラフィーによ
りそれぞれ目的成分に分離され、その後必要に応じてフ
ラクションコレクターＦで分画される。このようにし
て、遠心向流分配クロマトグラフィーにより回収される
ＤＨＡエステルは極めて高純度であり、健康食品用、試
薬用、医薬用に十分利用できる。遠心向流分配クロマト
グラフィーは、必要により複数回行ってもよい。
【００１６】
【実施例】以下に本発明を実施例によりさらに詳しく説
明するが、これらの実施例が本発明の範囲を限定するも
のではないことはいうまでもない。以下の実施例におい
て、脂肪酸エステル成分はガスクロマトグラフィーで定
量することにより測定した。また、％は重量％である。
また、精製収率は下記の値を示す。* 精製収率＝〔得られた脂肪酸エチルエステルの重量×
ＤＨＡエチルエステルの純度％／粗製脂肪酸エチルエス
テルの重量×ＤＨＡの組成％〕×１００（％）
明するが、これらの実施例が本発明の範囲を限定するも
のではないことはいうまでもない。以下の実施例におい
て、脂肪酸エステル成分はガスクロマトグラフィーで定
量することにより測定した。また、％は重量％である。
また、精製収率は下記の値を示す。* 精製収率＝〔得られた脂肪酸エチルエステルの重量×
ＤＨＡエチルエステルの純度％／粗製脂肪酸エチルエス
テルの重量×ＤＨＡの組成％〕×１００（％）
【００１７】（実施例１）乾燥藻体（水分５％）１００
ｇにヘキサン４４０ｍＬを加え、室温で２時間攪拌し、
藻体に含有されるＤＨＡ含有脂質をヘキサン中に抽出し
た。攪拌終了後、吸引濾過により廃藻体を濾別し、ＤＨ
Ａ含有脂質が溶解したヘキサン溶液を回収した。回収し
たヘキサン溶液から、減圧下、エバポレーターにてヘキ
サンを留去し、橙色のＤＨＡ含有脂質２０ｇを得た。次
にこのＤＨＡ含有脂質２０ｇにエタノール２５．６ｍＬ
およびナトリウムエトキシド０．４ｇを加え、窒素雰囲
気下、温度６０℃で２時間攪拌し、エステル化反応を行
なった。反応終了後、反応液を室温まで冷却した。この
反応液にヘキサン４０ｍＬおよび水８ｍＬを加え、５分
間攪拌し、ヘキサン層に脂肪酸エチルエステルを抽出し
た。攪拌終了後、静置分離でヘキサン層を回収した。次
に、このヘキサン層を水２ｍＬで、２回水洗した。水洗
したヘキサン層より、ヘキサンを減圧下、エバポレータ
ーにて留去したところ、橙色の粗製脂肪酸エチルエステ
ル１８ｇが得られた。得られた粗製脂肪酸エチルエステ
ルの組成を表１に示す。
ｇにヘキサン４４０ｍＬを加え、室温で２時間攪拌し、
藻体に含有されるＤＨＡ含有脂質をヘキサン中に抽出し
た。攪拌終了後、吸引濾過により廃藻体を濾別し、ＤＨ
Ａ含有脂質が溶解したヘキサン溶液を回収した。回収し
たヘキサン溶液から、減圧下、エバポレーターにてヘキ
サンを留去し、橙色のＤＨＡ含有脂質２０ｇを得た。次
にこのＤＨＡ含有脂質２０ｇにエタノール２５．６ｍＬ
およびナトリウムエトキシド０．４ｇを加え、窒素雰囲
気下、温度６０℃で２時間攪拌し、エステル化反応を行
なった。反応終了後、反応液を室温まで冷却した。この
反応液にヘキサン４０ｍＬおよび水８ｍＬを加え、５分
間攪拌し、ヘキサン層に脂肪酸エチルエステルを抽出し
た。攪拌終了後、静置分離でヘキサン層を回収した。次
に、このヘキサン層を水２ｍＬで、２回水洗した。水洗
したヘキサン層より、ヘキサンを減圧下、エバポレータ
ーにて留去したところ、橙色の粗製脂肪酸エチルエステ
ル１８ｇが得られた。得られた粗製脂肪酸エチルエステ
ルの組成を表１に示す。
【００１８】
【００１９】次にこの粗製脂肪酸エチルエステルを遠心
向流分配クロマトグラフィーにより精製した。用いた装
置は、三鬼エンジニアリング（株）製ＣＰＣ−ＬＬＮで
ある。分配液としては、ヘキサンおよびアセトニトリル
を混合後静置して分離した軽液を固定相として２５０ｍ
Ｌ充填し、重液を移動相とした。次に表１の組成のサン
プル１．０ｇを５ｍＬとなるように移動相に溶解した溶
液を注入し、その後、移動相を流量３．５ｍＬ／分で
５．５時間流通させた。その時のローターの回転数は７
００ｒｐｍ、操作温度は２０℃であった。上記により、
溶出した移動相（重液）から、減圧下、エバポレーター
にて溶剤を留去したところ、わずかに黄色味を帯びた脂
肪酸エチルエステル０．３２５ｇが回収された。回収さ
れた脂肪酸エチルエステル中のＤＨＡエチルエステルの
純度は、９６．７％であり、ＤＨＡエチルエステルの精
製収率* は９１．５％であった。
向流分配クロマトグラフィーにより精製した。用いた装
置は、三鬼エンジニアリング（株）製ＣＰＣ−ＬＬＮで
ある。分配液としては、ヘキサンおよびアセトニトリル
を混合後静置して分離した軽液を固定相として２５０ｍ
Ｌ充填し、重液を移動相とした。次に表１の組成のサン
プル１．０ｇを５ｍＬとなるように移動相に溶解した溶
液を注入し、その後、移動相を流量３．５ｍＬ／分で
５．５時間流通させた。その時のローターの回転数は７
００ｒｐｍ、操作温度は２０℃であった。上記により、
溶出した移動相（重液）から、減圧下、エバポレーター
にて溶剤を留去したところ、わずかに黄色味を帯びた脂
肪酸エチルエステル０．３２５ｇが回収された。回収さ
れた脂肪酸エチルエステル中のＤＨＡエチルエステルの
純度は、９６．７％であり、ＤＨＡエチルエステルの精
製収率* は９１．５％であった。
【００２０】（実施例２）実施例１で精製したＤＨＡエ
チルエステルを、再度、遠心向流分配クロマトグラフィ
ーで精製した。用いた装置は実施例１と同じである。分
配液としては、ヘキサンおよび９０％メタノール水溶液
を混合後静置して分離した軽液を固定相として２５０ｍ
Ｌ充填し、重液を移動相とした。次に実施例１で回収し
た脂肪酸エチルエステル（ＤＨＡエチルエステル純度：
９６．７％）１．０ｇを５ｍＬとなるように移動相に溶
解した溶液を注入し、その後、移動相（重液）を流量
３．３ｍＬ／分で１７．５時間流通させた。次に、送液
方向を反転して、軽液を流量３．３ｍＬ／分で２時間流
通させた。この時のローターの回転数は６００ｒｐｍ、
操作温度は２０℃であった。溶出した固定相（軽液）か
ら、減圧下、エバポレーターにて溶剤を留去したとこ
ろ、無色透明な脂肪酸エチルエステル０．９２０ｇが回
収された。回収された脂肪酸エチルエステル中のＤＨＡ
エチルエステルの純度は、９９．９％であり、ＤＨＡエ
チルエステルの精製収率* は９５．０％であった。
チルエステルを、再度、遠心向流分配クロマトグラフィ
ーで精製した。用いた装置は実施例１と同じである。分
配液としては、ヘキサンおよび９０％メタノール水溶液
を混合後静置して分離した軽液を固定相として２５０ｍ
Ｌ充填し、重液を移動相とした。次に実施例１で回収し
た脂肪酸エチルエステル（ＤＨＡエチルエステル純度：
９６．７％）１．０ｇを５ｍＬとなるように移動相に溶
解した溶液を注入し、その後、移動相（重液）を流量
３．３ｍＬ／分で１７．５時間流通させた。次に、送液
方向を反転して、軽液を流量３．３ｍＬ／分で２時間流
通させた。この時のローターの回転数は６００ｒｐｍ、
操作温度は２０℃であった。溶出した固定相（軽液）か
ら、減圧下、エバポレーターにて溶剤を留去したとこ
ろ、無色透明な脂肪酸エチルエステル０．９２０ｇが回
収された。回収された脂肪酸エチルエステル中のＤＨＡ
エチルエステルの純度は、９９．９％であり、ＤＨＡエ
チルエステルの精製収率* は９５．０％であった。
【００２１】（実施例３）実施例１の表１に示した組成
の粗製脂肪酸エチルエステル１．０ｇを、実施例２と同
じ条件の下で遠心向流配分クロマトグラフィーにより精
製した。無色透明な脂肪酸エチルエステル０．４１２ｇ
が回収された。回収された脂肪酸エチルエステル中のＤ
ＨＡエチルエステルの純度は、７５．０％であり、ＤＨ
Ａエチルエステルの精製収率* は９０．０％であった。
の粗製脂肪酸エチルエステル１．０ｇを、実施例２と同
じ条件の下で遠心向流配分クロマトグラフィーにより精
製した。無色透明な脂肪酸エチルエステル０．４１２ｇ
が回収された。回収された脂肪酸エチルエステル中のＤ
ＨＡエチルエステルの純度は、７５．０％であり、ＤＨ
Ａエチルエステルの精製収率* は９０．０％であった。
【００２２】（実施例４）実施例３で精製したＤＨＡエ
チルエステル１．０ｇを、実施例１と同じ条件の下で遠
心向流分配クロマトグラフィーにより精製した。無色透
明な脂肪酸エチルエステル０．７１３ｇが回収された。
回収された脂肪酸エチルエステル中のＤＨＡエチルエス
テルの純度は、９９．９％であり、ＤＨＡエチルエステ
ルの精製収率* は９５．０％であった。
チルエステル１．０ｇを、実施例１と同じ条件の下で遠
心向流分配クロマトグラフィーにより精製した。無色透
明な脂肪酸エチルエステル０．７１３ｇが回収された。
回収された脂肪酸エチルエステル中のＤＨＡエチルエス
テルの純度は、９９．９％であり、ＤＨＡエチルエステ
ルの精製収率* は９５．０％であった。
【００２３】
【発明の効果】本発明はＤＨＡを産生する能力を有する
海洋性微細藻類を、振盪培養または深部通気攪拌培養す
ることにより、他の高度不飽和脂肪酸をほとんど含ま
ず、ＤＨＡの含量のみを上昇させることを見いだしたこ
とを基に、従来は原料の供給が不安定で品質が一定せ
ず、独特の臭気をもつ魚油からの抽出と高度な分離精製
技術により得ていた高純度ＤＨＡエステルを簡便な精製
で製造できる点、およびＤＨＡエステルの回収率が極め
て高い点で、その経済的効果は非常に大である。
海洋性微細藻類を、振盪培養または深部通気攪拌培養す
ることにより、他の高度不飽和脂肪酸をほとんど含ま
ず、ＤＨＡの含量のみを上昇させることを見いだしたこ
とを基に、従来は原料の供給が不安定で品質が一定せ
ず、独特の臭気をもつ魚油からの抽出と高度な分離精製
技術により得ていた高純度ＤＨＡエステルを簡便な精製
で製造できる点、およびＤＨＡエステルの回収率が極め
て高い点で、その経済的効果は非常に大である。
【図１】 遠心向流分配クロマトグラフィーの系統図で
ある。
ある。
ＳＰ 固定相 ＭＰ 移動相 ＷＳ 洗浄液 ＷＴ 廃液 Ｖ1 ４方ロータリーバルブ Ｖ2 ６方バルブ Ｖ3 ４方バルブ Ｖ4 ３方ロータリーバルブ ＳＬ サンプリング回路 Ｐ 定量ポンプ Ｊ1 ，Ｊ2 回転送液ジョイント Ｒ ローター Ｃ 分配管 Ｔ 導管 Ｍ フローセルモニター ＲＣ レコーダー Ｆ フラクションコレクター
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｐ 7/64 Ｃ１２Ｒ 1:89）
Claims (3)
- 【請求項１】ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含有する
脂質を産生する海洋性微細藻類を培養して得られた該海
洋性微細藻類の藻体から脂質を抽出し、該脂質中の脂肪
酸をアルコール類でエステル化し脂肪酸エステルを得、
次いで、これを遠心向流分配クロマトグラフィーで処理
し、ドコサヘキサエン酸エステルを含む画分を分取する
ことを特徴とするドコサヘキサエン酸エステルの分離精
製方法。 - 【請求項２】前記海洋性微細藻類が、クリプテコディニ
ウム・コーニー（Crypthecodiniumcohnii）に属する藻
類である請求項１に記載のドコサヘキサエン酸エステル
の分離精製方法。 - 【請求項３】前記遠心向流分配クロマトグラフィーで使
用する２相分離液が、ヘキサン／アセトニトリルおよび
／またはヘキサン／メタノール水溶液である請求項１ま
たは２に記載のドコサヘキサエン酸エステルの分離精製
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6045426A JPH07252493A (ja) | 1994-03-16 | 1994-03-16 | 海洋性微細藻類からのドコサヘキサエン酸エステルの分離精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6045426A JPH07252493A (ja) | 1994-03-16 | 1994-03-16 | 海洋性微細藻類からのドコサヘキサエン酸エステルの分離精製方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07252493A true JPH07252493A (ja) | 1995-10-03 |
Family
ID=12718964
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6045426A Pending JPH07252493A (ja) | 1994-03-16 | 1994-03-16 | 海洋性微細藻類からのドコサヘキサエン酸エステルの分離精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07252493A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103086873A (zh) * | 2013-01-11 | 2013-05-08 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 高速逆流色谱分离制备高纯度dha方法 |
| JP2014514924A (ja) * | 2011-04-06 | 2014-06-26 | ヘリアエ デベロップメント、 エルエルシー | 二溶媒方法による中性脂質の抽出 |
| CN104017734A (zh) * | 1996-03-28 | 2014-09-03 | Dsmip资产有限公司 | 粒状微生物生物质的制备及其有价值的化合物的分离方法 |
-
1994
- 1994-03-16 JP JP6045426A patent/JPH07252493A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104017734A (zh) * | 1996-03-28 | 2014-09-03 | Dsmip资产有限公司 | 粒状微生物生物质的制备及其有价值的化合物的分离方法 |
| JP2014514924A (ja) * | 2011-04-06 | 2014-06-26 | ヘリアエ デベロップメント、 エルエルシー | 二溶媒方法による中性脂質の抽出 |
| CN103086873A (zh) * | 2013-01-11 | 2013-05-08 | 国家海洋局第三海洋研究所 | 高速逆流色谱分离制备高纯度dha方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20031007 |