JPH0731486A - 光学活性ジカルボン酸の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 シトラコン酸またはハロマレイン酸にアルス
ロバクター属に属する微生物またはその菌体処理物を作
用させて、光学活性ジカルボン酸を製造する方法。 【効果】 本発明の方法によれば、医農薬等の合成原料
として有用な光学活性ジカルボン酸を、従来の方法に比
べて高い立体選択性でかつ効率よく生産することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はアルスロバクター属に属
する微生物またはその菌体処理物を作用させることによ
る不飽和ジカルボン酸から光学活性ジカルボン酸を製造
する方法に関する。光学活性なジカルボン酸は、医薬、
農薬等の生理活性物質を合成する際の原料もしくは中間
体として有用である。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】リン
ゴ酸誘導体やシトラマル酸等の光学活性なジカルボン酸
は、通常不斉炭素原子を１以上含むことが多いため、化
学的に合成しようとすると収率が低い、反応工程数が多
い、最終製品の光学純度が低い等の問題があった。一
方、微生物や酵素の作用を利用した生物学的反応は、反
応特異性が高い、常温・常圧で反応が進行する等の長所
を有しており、アミノ酸の醗酵や抗生物質の生産等で従
来から広く検討が行われてきた。光学活性なジカルボン
酸においても、生物学的反応を利用した製造方法が報告
されている。

【０００３】例えばＲ−（−）−シトラマル酸の製造に
関しては、Ｓ．Ｓ．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ等がシュー
ドモナス属に属する微生物からシトラコン酸をＲ−
（−）−シトラマル酸に変換する酵素活性を得ている
（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３，２３６７（１９
６８））。また香月らは、バチルス属に属する微生物が
シトラコン酸をＲ−（−）−シトラマル酸に変換するこ
とを報告しており（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７０，４４
１（１９７１））、長谷川らはキャンディダ属、ピキヤ
属、ロードトルラ属、アシネトバクター属、ブレビバク
テリウム属、クロモバクテリウム属、エンテロバクター
属、ミクロコッカス属、ノカルディア属およびオエルス
コビア属に属する微生物のシトラコヒネートヒドラター
ゼを用いてシトラコン酸からＲ−（−）−シトラマル酸
を生成させている（特開昭６０−１９６１９２号公
報）。リンゴ酸誘導体の製造に関してはシトラコン酸に
微生物を作用させて２Ｓ，３Ｒ−メチルリンゴ酸を生産
する方法が報告されている（特開昭６１−１９４９５号
公報）。しかしながら、これらの微生物学的方法による
光学活性なジカルボン酸の製造方法は生産効率が必ずし
も十分とは言えないものであり、さらに優れた方法の開
発が望まれている。またリンゴ酸の誘導体については有
用性が高いにもかかわらず、微生物学的方法による生産
検討が十分に行われていないのが現状である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、微生物学
的方法により光学活性なジカルボン酸を効率よく生産す
る方法につき検討を行った結果、アルスロバクター属
（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）に属する微生物またはそ
の菌体処理物を不飽和ジカルボン酸に作用させることに
より光学活性なジカルボン酸を効率よく生産することを
見出し、本発明を完成するに至った。

【０００５】即ち本発明の要旨は、下記一般式（Ｉ）

【０００６】

【化３】

【０００７】（上記式中、Ｒ¹ はメチル基またはハロゲ
ン原子を表す）で表される不飽和ジカルボン酸にアルス
ロバクター属に属する微生物またはその菌体処理物を作
用させることを特徴とする、下記一般式（II）

【０００８】

【化４】

【０００９】（上記式中、Ｒ¹ は前記一般式（Ｉ）で定
義したとおりであり、Ｒ² およびＲ³はそれぞれ独立し
て水素原子またはヒドロキシル基を表すが、同時に同じ
置換基を表さない。但し、Ｒ¹ がメチル基を表すとき、
Ｒ² はヒドロキシル基を表す。）で表される光学活性ジ
カルボン酸の製造方法に存する。

【００１０】以下、本発明につき詳細に説明する。前記
一般式（Ｉ）で表される不飽和ジカルボン酸は、本発明
の微生物学的方法において基質となる物質である。前記
一般式（Ｉ）中、Ｒ¹ がメチル基の場合はシトラコン酸
を示し、Ｒ¹ がハロゲン原子の場合はハロマレイン酸を
示す。Ｒ¹で定義されるハロゲン原子としては、フッ素
原子、塩素原子、臭素原子等が挙げられる。従って本発
明においては、シトラコン酸からはＲ−（−）−シトラ
マル酸が、ハロマレイン酸からは２Ｓ，３Ｓ−ハロリン
ゴ酸が生産される。

【００１１】反応を触媒する微生物としては、アルスロ
バクター属に属する微生物で、前記一般式（Ｉ）で表さ
れる不飽和ジカルボン酸から前記一般式（II）で表され
る光学活性ジカルボン酸を生成する能力を有するもので
あれば特に制限はされない。本発明においては、アルス
ロバクター属に属する微生物がマレートヒドラターゼを
有していることが好ましい。具体的には、本発明者らが
天然土壌より分離したアルスロバクター エスピー（Ａ
ｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＭＣＩ２６１２（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１２５６２）が挙げられる。同微生物の菌
学的性質については、特開平５−１０３６８０号公報に
詳述されている。

【００１２】本発明においては、前記の菌を通常に微生
物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養することに
より容易に増殖させることができる。栄養源としては、
グルコース、水飴、デキストリン、シュクロース、デン
プン、糖アルコール、糖蜜、有機酸、動・植物油等を使
用できる。また窒素源としては、大豆粉、小麦胚芽、コ
ーンスティープリカー、綿実油、肉エキス、ペプトン、
酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、硝酸アン
モニウム、尿素等を使用できる。その他必要に応じて、
ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コ
バルト、マンガン、塩素、リン酸、硫酸およびその他の
イオンを生成することができる無機塩類を添加すること
は有効である。また、ビタミン等の通常の培養に用いら
れる栄養源を培地に適宜混合することもできる。

【００１３】培養方法としては、栄養培地のｐＨを４．
０〜９．５とし、好気的に２０〜４０℃で１０〜９６時
間程度培養する。本発明において使用する微生物とは、
微生物の菌体または菌体処理物を意味する。本発明にお
ける「微生物菌体処理物」とは、微生物菌体の抽出物、
磨砕物および超音波破砕物等のマレートヒドラターゼ含
有物を意味し、本発明においては微生物菌体自身（生菌
体または乾燥菌体）を用いてもよいし、あるいは微生物
菌体処理物を用いてもよい。

【００１４】また上記の培養で得られた微生物菌体また
は菌体処理物を、ポリアクリルアミドゲル、光架橋性樹
脂、寒天、カラギーナン等の固定化担体に吸着、結合、
包括して適当な緩衝液に懸濁したものや、かかる固定化
物をカラムに充填したものに、基質を加えて反応させる
こともできる。微生物菌体自身を作用させる場合は、上
記栄養培地中に基質となる不飽和ジカルボン酸を添加し
て培養と反応を同時に行う方法、あるいは培養終了後に
基質を添加して反応を行わせる方法等を用いることがで
きる。反応時の温度は２０〜５０℃の範囲が好ましく、
ｐＨは５．０〜１０．０の範囲が好ましい。添加する基
質の濃度は、０．１〜１０％の範囲が好ましい。また反
応時にトルエン等の有機溶媒の添加により反応速度を早
めることが可能である。

【００１５】菌体の処理物を作用させる場合は、菌体の
抽出物、磨砕物、超音波破砕物等のマレートヒドラター
ゼ含有物を用いて、適当な緩衝液中で微生物自身を作用
させる場合と同様の条件にて反応を行うことができる。
具体的には、培養終了後、培養液から菌体を遠心分離等
によって分離し、得られた菌体を超音波破砕機等により
破壊し、遠心分離等によって得られた上清から例えば硫
安（３０〜６０％）処理により沈澱物を取得し、少量の
水に懸濁させた後透析を行って粗酵素液を得る。この粗
酵素液を、例えばｐＨ７．５に調整した０．０１〜０．
１Ｍトリス緩衝液中で基質と反応させる。かかる粗酵素
は、さらにＤＥＡＥ−ｔｏｙｏｐｅａｒｌ、Ｏｃｔｙｌ
−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷ等のイオン
交換クロマトグラフィーを用いて精製することにより、
精製酵素標品を得ることができるので、かかる精製酵素
標品を反応に供してもよい。なお精製酵素標品の至適ｐ
Ｈは８．０であり、４５℃で最大活性を示す。またｐＨ
７．０〜９．０の範囲で安定であり、３０分間の熱処理
では４０℃まで安定である。２つのサブユニットより構
成され、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳
動によれば、その分子量はそれぞれ２８，０００と５
８，０００である。

【００１６】かくして得られる本発明の光学活性ジカル
ボン酸は、常法により抽出・精製することができる。例
えば、得られた光学活性ジカルボン酸含有液のｐＨを硫
酸等を用いて１．０付近にまで下げ、さらに飽和に達す
るまで硫酸アンモニウムを加える。しかる後、等量の酢
酸エチル等で数回抽出を行う。これを減圧下で溶剤を除
去すると、光学活性ジカルボン酸含有物が得られる。さ
らにこのものを少量のヘキサン等に溶解し、ヘキサン−
酢酸エチル等の混合溶剤で溶出するシリカゲルクロマト
グラフィーを行うことにより、容易に他の不純物と分離
することができる。

【００１７】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明の方法をさらに
具体的に説明するが、本発明はその要旨を越えない限り
以下の実施例に限定されるものではない。 実施例１ ソルビトール１０ｇ、ＮＨ₄ ＮＯ₃ ６ｇ、ＫＨ₂ ＰＯ
₄ ３ｇ、Ｋ₂ ＨＰＯ ₄ １０．５ｇ、ＭｇＳＯ₄ ・７
Ｈ₂ Ｏ ２５０ｍｇ、イーストエキス５．５ｇ、Ｌ−プ
ロリン２ｇ、マレイン酸２ｇ、水１リットル、ｐＨ６．
０の組成からなる液体培地に、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ ｓｐ． ＭＣＩ２６１２を接種し、２８℃で２０時
間培養した。得られた培養液を遠心分離して菌体を集
め、２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した。
これにシトラコン酸４０ｇおよびトルエン１０ｍｌを含
む２５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を加えて全量を
１リットルとし、２７℃で反応させた。反応の経過時間
と生成したＲ−（−）−シトラマル酸との関係を、下記
表１に示す。いずれの場合も反応は速やかに進行し、反
応開始４５時間後には、光学純度１００％のＲ−（−）
−シトラマル酸が４３．５％の収率で得られた。なお生
成物の確認は、元素分析、ＮＭＲ、液体クロマトグラフ
ィーを用いて行った。

【００１８】

【表１】 表１ ────────────────────────────────── 反応時間 生成したシトラマル酸 Ｒ−（−）−シトラマル モル収率 （ｈｒ） （ｇ／ｌ） 酸の光学純度 （％） （％） ────────────────────────────────── ３ ２．５ １００ ５．５ ８ ６．５ １００ １４．３ １１ ８．６ １００ １８．９ ２５ １５．０ １００ ３２．９ ４５ １９．８ １００ ４３．５ ──────────────────────────────────

【００１９】実施例２ 実施例１の菌体培養液から菌体を分離し、精製マレート
ヒドラターゼ（８０ユニット）を得た。これにクロロマ
レイン酸１０ｇを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
７．５）を加えて全量を１００ｍｌとし、２８℃で反応
させた。１０時間後、光学純度１００％の２Ｓ，３Ｓ−
クロロリンゴ酸が６ｇ得られた。

【００２０】実施例３ 実施例２で得られた精製マレートヒドラターゼに、ブロ
モマレイン酸１０ｇを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ７．５）を加えて全量を１００ｍｌとし、２８℃
で反応させた。１０時間後、光学純度１００％の２Ｓ，
３Ｓ−ブロモリンゴ酸が６ｇ得られた。

【００２１】

【発明の効果】本発明の方法によれば、医農薬等の合成
原料として有用な光学活性ジカルボン酸を、従来の方法
に比べて高い立体選択性でかつ効率よく生産することが
できる。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記一般式（Ｉ） 【化１】 （上記式中、Ｒ¹ はメチル基またはハロゲン原子を表
   す）で表される不飽和ジカルボン酸にアルスロバクター
   属に属する微生物またはその菌体処理物を作用させるこ
   とを特徴とする、下記一般式（II） 【化２】 （上記式中、Ｒ¹ は前記一般式（Ｉ）で定義したとおり
   であり、Ｒ² およびＲ³はそれぞれ独立して水素原子ま
   たはヒドロキシル基を表すが、同時に同じ置換基を表さ
   ない。但し、Ｒ¹ がメチル基を表すとき、Ｒ² はヒドロ
   キシル基を表す。）で表される光学活性ジカルボン酸の
   製造方法。
2. 【請求項２】 アルスロバクター属に属する微生物また
   はその菌体処理物がマレートヒドラターゼを有すること
   を特徴とする請求項１記載の方法。