JPH07501560A - 凝固第８因子を含む組成物及びその製造方法並びに安定剤としての界面活性剤の使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 凝固節■因子を含む組成物及びその製造方法並びに安定剤としての界面活性剤の 使用方法 発明の詳細な説明 本発明は凝固節■因子と、ブロック共重合体のような非イオン系界面活性剤、例 えば、ポリオキシマ又はポリオキシエチレン（２０）ソルビタン脂肪酸エステル 、例えば、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０とから成る組成物に関す る。この組成物は塩化ナトリウム、塩化カルシウム、Ｌ−ヒスチジン及び／又は 砂糖及び／又は砂糖アルコールを含むことができる。

血友病は、数世紀前から知られた遺伝病であるが、血友病Ａ、血友病Ｂ、血友病 Ｃと区別することが可能であることが判明したのは、ここ３０年前にしか過ぎな い。

血友病Ａは、最も多く発生する種類である。これは、１ｏ、ｏｏｏ人の出生男子 当たり１又は２人の発生率で男性にしか発生しない。この病気は血漿中に通常存 在する蛋白である生態的に活性の凝固節■因子（抗血友病因子）の量が極めて低 レベルであるか、又は全く存在しないことに起因する。血友病Ａの臨床的病状は 、出血傾向が強く、第■濃縮剤による治療が導入される以前には、これらの患者 の平均寿命は、２０才以下であった。血漿から得られた第■因子の濃縮剤は、約 ３０年前から利用可能となっている。これは、血友病の治療効果を著しく向上さ せ、患者が通常の寿命まで生きることを可能にした。

現在、治療薬としての第■濃縮剤は、血漿を分画することによって製造されてい る。しかし、例えば、ジェー・ギイチェイヤー氏等著のネイチャー、第３１２巻 、第３３０頁乃至第３３７頁、１９８４年、及び欧州特許第１６０４５７号に示 されたようなりＮＡ組み換え技術を利用して、細胞組織内で第■因子を製造する 方法が利用可能になっている。

人間の血漿から得られた第■濃縮剤は、完全に活性な第■因子の形態の幾つかの 分画成分を含んでいる（アンダーソン氏等によって１９８６年５月に米国で発行 されたプレシーディング　ナショナル　アカデミツク　サイエンス、第８３巻、 第２９７９頁乃至第２９８３頁）。

その最小の活性形態は、分子量が１７０ｋＤａであり、金属イオン架橋により相 互に保持された９０ｋＤａ、８０ｋＤａの２つの鎖から成る。ここで、欧州特許 第１９７９ｏ１号を参照すると、カビ・ファーマシアは、治療薬としての第■濃 縮剤中の１７０ｋＤａ血漿第■因子に対応する組み換え第■因子製品を開発した 。この截形組み換え第■因子は、ｒ−■ＳＱと称され、有限接種により、血漿の 存在しない媒体中で細胞培養方法によって中国ネズミの卵巣（ＣＨＯ）の細胞内 で製造されている。

ｒ−■ＳＱの特別な活性は、１２．　ＯＯＯＩ　Ｕ／ｍｇ蛋白以上であり、１４ ，０ＯＯＩＵ／ｍｇ以上であることが望ましい。約１５，０００　ＩＵ／ｍｇの 活性が測定されている。以前のｒ−■ＳＱは、ｍｇ当たり約１０゜０００ＩＵ■ ：Ｃであった。

組み換え因子■ＳＱは、古典的な血友病の治療に提案されている。その投与量は 、血漿第■因子濃縮剤の投与量と同様である。現在、極めて高濃度の濃縮剤が利 用可能であるため、注射する量は、極く少量で済む。

一般に、組み換え第■因子製品の構造及び生化学は、「カーフマン・テイベテッ ク」、第９巻、１９９１年及び「血液学」、第６３巻、第１５５頁乃至第１６５ 頁、１９９１年に記載されている。ｒ−■ＳＱの構造及び生化学は、国際特許出 願公開第９１１０９１２２号公報に記載されている。

蛋白の安定性は、一般に、製薬業界における問題である。これは、蛋白冷凍乾燥 といった異なる乾燥法で乾燥させることにより、解決されることが多い。その後 、蛋白は、乾燥形態で販売され且つ貯蔵される。乾燥、又は冷凍乾燥前の溶液は 、乾燥材料及び組み換えた製品が全て安定し、乾燥工程、貯蔵又は取り扱い中に その活性が過度に失われないようにしなければならない。

血漿から分画された第■因子は、通常、水で液状に戻すことを要する凍結乾燥粉 末として販売されている。

蛋白の量の少ない調合物は、一般に、精製、滅菌製造の間、包装される間、及び 投与される間にその活性を失う。この問題点は、通常、活性蛋白の活性の低下を 著しく軽減する人間のアルブミンを添加することにより、解決される。人間のア ルブミンは、精製、滅菌製造及び冷凍乾燥中に一般な安定剤として機能する（ワ ング氏等著の「バレンテラ　サイエンス　アンド　テクニック」、第１４２巻、 １１月２５日、補足、１９８８年参照）、。

又、人間のアルブミンは、冷凍乾燥用の調合物における良好な固形分形成剤であ る。第■因子を安定させるために、アルブミンを使用することは公知であり、現 在、市販されている極めて純粋な第■因子製品に使用されている。しかし、ＤＮ Ａ組み換え技術により製造された治療用蛋白に人間のアルブミンを添加すること は望ましくない。更に、人間のアルブミンを成形結合剤として使用することは、 蛋白を特定するための多くの有効で感度に優れた多数の分析方法の使用を制限す る。

溶液中で及び水に戻した後の溶液として乾燥、又は冷凍乾燥中に安定である第■ 因子、特に、組み換え第■因子を含む、アルブミンの存在しない調合物が課題と されている。

異なる蛋白を安定される幾つかの解決方法が提案された。

カッター氏の発明に係る欧州特許第３５２０４号明細書には、ポリオールの存在 下で蛋白組成物に熱的安定性を付与する方法が開示されている。

コルインド氏の発明に係る欧州特許第３８１３４５号明細書には、カルボオキシ メチルセルロースの存在下で、混合されたペプチドの水溶性液体が開示されてい る。

ジェネンテック氏の発明に係る国際特許出願公開第８９１０９６１４号公報にお いて、グリシンと、マンニットと、緩衝剤とから成る人間成長ホルモンの安定化 された調合物が開示されており、その好適な実施例において、ポリソルベート８ ０のような非イオン系界面活性剤が添加されている。この非イオン系界面活性剤 は凝集を軽減し、変性を軽減するために添加されるものである。この調合物は、 凍結乾燥中の安定性及び水に戻したときの安定性が増す。

セタス氏の発明に係る欧州特許第２６８１１０号明細書には、溶融剤／安定剤と して非イオン系の高分子洗剤を含む不活性担体媒体中に溶解されている特定の蛋 白、即ちインターローキン−２を含む溶液が開示されている。

その好適な洗剤は、オクチフェノオキシ　ポリエキシエタノール化合物、ポリエ チレングリコールモノシレート化合物、及びポリエチレンソルビタン脂肪酸エス テルである。

ホチェスト氏の発明に係る米国特許第４，７８３，４４１号明細書には、インシ ュリンのような蛋白及び界面活性剤を含む水溶性溶液が開示されている。

コーパル氏の発明に係る米国特許第４，１６５，３７０号明細書には、ガンマ　 グロとリン溶液及びその製造方法が開示されている。この溶液は、ポリエチレン 　グリコール（ＰＥＧ）を含む。この溶液に非イオン系界面活性剤を添加するこ とができる。

グリーン　クロス氏の発明に係る欧州特許第７７．８７０号明細書には、第■因 子を含む溶液の安定性を増すために、アミノ酸、単糖類、オリゴ糖又は砂糖アル コール又は炭化水素カルボオキシ酸を添加することが開示されている。又、欧州 特許第１１７，０６４号（グリーンクロス）明細書には、熱処理中の安定性を増 すために、第■因子の水溶性溶液に砂糖アルコール、又は三糖類を添加すること が開示されている。

オクトファーマ氏の発明に係る国際特許出願公開第９１／１０４３９号明細書の 請求の範囲には、三糖類、望ましくはサッカローゼ及び１つ又は複数のアミノ酸 を含む第■因子、又は第■因子の安定的な注射可能な溶液が記載されている。

ローラ氏の発明に係る欧州特許第３１５，９６８号及び同第３１４，０９５号明 細書の請求の範囲には、イオン強度の異なる第■因子の安定的な調合物が記載さ れている。

蛋白は物理学的性質の点で異なる。物理学的に許容可能であり、長期に亘り安定 した薬剤を製造するとき、蛋白の物理的性質にのみにならず、工業的製造、患者 の取り扱いの容易性、及び患者の安全性といったその他の特性も考慮しなければ ならない。異なる調合物を試験するときには、これらの特性の結果を予測するこ とができず、従って、各蛋白毎に独自の解決手段が採用されることが多い。

血漿内で、循環する第■因子は、その担体蛋白、即ちＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子 （ｖ　Ｗ　Ｆ　）と関係付けられて安定化させる。血漿内及び従来の中程度の純 度の第■因子濃縮剤において、ｖＷＦ対第■因子の比は、重量比で少なくとも５ ０：１である。極めて高純度の第■因子濃縮剤において、特定活性がｍｇ当たり ２，０ＯＯＩＵ以上の場合、ｖＷＦ対第■因子の比は、約１　：　１　（ｗ／ｗ ）であり、略全ての第■因子がｖＷＦに結合される。この安定性にも拘わらず、 凍結乾燥及び貯蔵中の許容可能な安定性を実現するためには、アルブミンを添加 することが必要である。

市販されている超純度の調合剤は、アルブミン（人間の血漿アルブミン）で安定 させである。

現在、アルブミンを使用せず、添加剤の量が最小である注射可能な第■因子の開 発が課題とされている。

第■因子に対する上述の問題点を解決する新たな調合物が開発されるに至った。

非常に驚いたことに、極めて敏感な蛋白である第■因子は、非イオン系界面活性 剤を添加したとき、アルブミンを使用せずに、安定させ得ることを確認した。

このように、本発明は、凝固第■因子と、安定剤として非イオン系界面活性剤と を含む組成物に関する。この第■因子は、極めて高純度である。即ち、比活性が ５゜０ＯＯＩＵ／ｍｇ蛋白であり、組成物がアルブミンを添加せずに安定となる 。この第■因子を組み換えたとき、この因子は、未希釈の誘導体、又、ＳＱ誘導 体のような希釈誘導体とすることができる。

第■因子の量は、１０乃至１００，０ＯＯＩＵ／ｍｇ望ましくは、５０乃至１０ ，０ＯＯＩＵ／ｍｇである。

非イオン系界面活性剤は、ポロアクサマーのようなブロック共重合体又はポリソ ルベート２ｏ又はポリソルベート８０のようなポリオキシレン（２０）脂肪酸エ ステルから選択することが望ましい。ポリソルベート８０として、ツイン８０（ 登録商標）が使用されている。非イオン系界面活性剤は、臨界的ミセル濃度（Ｃ ＭＣ）以上の量で存在しなければならない（ワン　アンド　リー著の［薬物化学 ジャーナル」、第６３巻、第１３６頁、１９７４年参照）。

このように、ポリオキシレン（２０）脂肪酸エステルは、少なくとも０３０１ｍ ｇ／ｍｌの量であることが望ましい。その量は、例えば、０．０２乃至１　ｍ　 ｇ　／　ｍ　１の範囲でもよい。又、この組成物は、望ましくは０．　１Ｍ以上 の量のナトリウム又は塩化カリウムを含むこともできる。

この組成物は、望ましくは、０．５ｍＭ以上の量の塩化カルシウム又はグルコン 酸塩カルシウムのようなカルシウム塩、１ｍＭ以上のＬ−ヒスチジンのようなア ミノ酸を含むことが望ましい。この量は、例えば、０．０５乃至５００ｍＭの範 囲としてもよい。例えば、１乃至３００ｍｇ／ｍｌの量のサッカローゼ又は砂糖 アルコールのような単糖又は三糖類を添加してもよい。

この組成物は、Ｌ−ヒスチジン及びサッカローゼを含むことが望ましい。この組 成物中の塩化ナトリウムとＬ−ヒスチジンの比は、１：１以上であることが望ま しい。

この組成物は、以下のものを含むことができる。

１）１０−１００，０ＯＯＩＵ／ｍｌの組み換え第■因子。

ｉｉ）少なくともＯ，０１ｍｇ／ｍｌのポリオキシエチレン（２ｏ）脂肪酸エチ レン。

１ｉｉ）望ましくはＯ，１Ｍ以上の量の塩化ナトリウム。

ｉｖ）望ましくは０．５ｍＭ以上の量の塩化カルシウム又はグルコン酸塩カルシ ウムのようなカルシウム塩。

ｖ）Ｌ−ヒスチジンのようなアミノ酸を１ｍＭ以上の量。

この組成物には、単糖又は三糖類又は砂糖アルコール、望ましくはサッカローゼ を添加してもよい。この組成物は、乾燥形態とし、望ましくは、乾燥前又は乾燥 後に凍結乾燥させ、又は水溶液溶液であることが望ましい。乾燥製品は、注射又 は緩衝溶液とするため滅菌水で液体に戻す。

また、上記の組成物は、直ちに使用可能な安定した水溶性溶液としてもよい。

又、本発明は、ｒ−■ＳＱＯ比活性が１２，０ＯＯＩＵ　／　ｍ　ｇ蛋白以上、 望ましくは、１４，０ＯＯＩＵ／ｍｇ以上である組成物に関する。

上記の組成物は、Ｌ−ヒスチジン、ナトリウム塩、サッカローゼ及びカルシウム 塩のようなアミノ酸と共に、第■因子を゛水溶液中で非イオン系界面活性剤と混 合させ、又は望ましくは、Ｌ−ヒスチジン、ナトリウム塩、サッカローゼ及びカ ルシウム塩のようなアミノ酸と共に、非イオン系界面活性剤を含む緩衝液により 、最後の精製段階から第■因子を溶出させることによって、製造することができ る。

又、本発明は、凝固第■因子を含む組成物の安定剤として、望ましくはボロキシ マー又はポリオキシエチレン（２０）脂肪酸エステル、望ましくはポリソルベー ト２０又はポリソルベート８０のようなブロック共重合体から選択された非イオ ン系界面活性剤を使用する方法に関する。

アミノ酸は、システムの緩衝のために使用され、又該アミノ酸は、非結晶相の蛋 白を保護する。適当な緩衝剤は、Ｌ−ヒスチジン、リジン及び／又はアルギニン とすることができる。Ｌ−ヒスチンは、主として、ｐＨ７付近で良好な緩衝機能 を果たすために選択されるものである。

又、蛋白を保護するため、サッカローゼ又は砂糖アルコールを添加してもよい。

ここで、カルシウム（又は、二価金属イオン）が塩化カルシウム（Ｃａ　Ｃ１□ ）として添加されているが、グルコン酸塩カルシウム、グルビオネートカルシウ ム又はグルコン酸塩カルシウムのようなその他の塩を使用してもよ（、これらは 、第■因子の重鎮及び軽鎖が関係する状態を維持するのに必要である。

図面の簡単な説明 図１は、２５℃で５力月間、貯蔵した実施例１０ＡのＨＰＬＣのゲルろ過のグラ フ図、 図２は、３０℃で５力月間、貯蔵した実施例１０ＢのＨＰＬＣのゲルろ過のグラ フ図である。

実施例に示したデータは、ｒ−■ＳＱが５±３℃の温度で貯蔵したとき、少なく しも１２力月間、安定していることを示す。

以下の実施例は、本発明を説明し、文具なる調合物の安定性に関するデータを示 し、その保護範囲はこれら実施例にのみ限定するものではない。

実験例 材料及び方法 組み換え第■因子ＳＱ　（ｒ−■ＳＱ）の製造は、国際特許出願公開第９１１０ ９１２２号公報に記載の実施例１乃至３に述べられた方法と略同−の方法で行っ た。ＤＨＦＲ不足ＣＨ○セライン（ＤＧ４４Ｎ、Ｙ、）をｒ−■ＳＱ遺伝子を含 む発現ベクトル、及びジヒドロフォーレートレダクターゼ遺伝子を含む発現ベク トルで電気的に分極させた。選択可能な媒体を選択した後、メタトレキシエイト の量を段階的に増すことにより、生存する前体を成長させて増殖させた。その結 果、得られた前体がらの表面浮遊物質を個々に第■：Ｃ活性について測定した。

製造群体を選択し、その後、この前体を設定させた媒体中で血漿無しの懸濁成長 を行わせ、最終的に、大規模な発酵過程を生じさせた。一定時間の経過後、表面 に浮かんだ物質を集め、以下に説明するように、更に精製した。

上澄みの調整媒体のｐＨを調節し、Ｓ−セファローゼＦＦカラムに添加した。洗 浄後、５ｍＭのＣａＣ１□を含む塩緩衝液により第■因子を溶出させた。

免疫性の類似する樹脂を利用して免疫性吸着を行い、ここで、リガンドは、第■ 因子の重鎮に向けられた単固体抗体（８Ａ４）とした。カラムに装填する前に、 Ｓ−溶出物は、０．３％のＴＮＢＰ及び１％のオクトキシノール９で処理した。

カラムは、平衡状態にし、洗浄し、０．０５ＭＣａＣＩＢ及び５０％エチレング リコールを含む緩衝液で第■因子を溶出させた。

ｍＡｂ−溶出物は、免疫性近似化段階中に溶出緩衝液によって平衡状態にされた Ｑ−セファローゼＦＦカラムに装填した。洗浄後、第■因子は、０．０５ＭＬ− ヒスチジン、４ｍＭＣａＣｌ２，０．６ＭＮａＣ１、ｐＨ６゜８で溶出させた。

Ｑ−溶出液は、ゲルろ過カラム（スーパーデックス２００ｐ、ｇ、）に充填した 。塩化ナトリウム、Ｌ−ヒスチジン、塩化カルシウム及びポリソルベート８０を 含む調合物により平衡状態化及び溶出を行った。

蛋白ピークを集め、冷凍乾燥する前に、溶液を調合した。

適当な緩衝液で希釈することにより、■：Ｃの活性及び不活性成分の濃度を調節 した。次に、その溶液を滅菌ろ過し、　（０，２２μｍ）、分散させ且つ冷凍乾 燥した。

各組成物からの標本を凍結して、−７０℃で保存した。

これらの標本は、■対Ｃの分析時、溶かして基準液として使用した。

第■：Ｃの凝固機能は、色原体基質分析（コーチスト第■因子、スウェーデン、 モオーンダアール、クロモジェエックスＡＢ）活性因子Ｘ（Ｘａ）は、内在的経 路を介して発生させ、ここで、第■；Ｃ因子は、補足因子とし７て作用する。次 に、トロンビンによる基層の加水分解を防止するため、トロンビン抑制剤ｌ−２ ５８１の存在下、合成色原基質Ｓ−２２２２を使用してＸａ因子をめた。この反 応は、酸により停止させ、ｐＮＡ　（バラニトロアニリン）の放出に比例する第 ■：Ｃは、試薬ブランクに対して４５０ｎｍで測光方法によりめた。第■：Ｃの 単位は、ＷＨＯが制定した現在の国際濃縮物標準（Ｉ　Ｓ）により規定される国 際単位（ＩＵ）で表現する。

第■：Ｃの回復は、水を加えて元に戻した溶液中の第■：Ｃの値を凍結乾燥用に 凍結させ且つ溶融させた溶液中の第■：Ｃの値で割り、希釈のため適当な調節を 加えて計算する。

可溶性の集合体は、ゲルろ過によりめた。予め充填したスーパーテックス２００ ＨＲ１０／３’Ｏカラム（カビファーマシア）を蛍光検出器（励起波長２８０ｎ ｍ、放出波長３４０ｎｍ）と共に使用した。水を加えて元に戻した調整液を分析 した。クロマトグラムを肉眼で検査し、又は集合体が検出された場合、ピーク領 域を積分することにより、ゲルろ過による結果の評価を行った。

冷凍乾燥中の回復は、冷凍基準液の収率で表示されて組み換え第■因子は、実験 例で説明した方法に従って調整した。

２ｍｌの溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため５ｍｌの滅菌水で液体に戻し た。

その組成物は次の通りであった。

ＩＡ　ＩＢ　１０　１Ｄ Ｌ−ヒスチジン、ｍＭ　５０　５０　５０　５０塩化ナトリウム、Ｍ　Ｏ，６０ ，６０，６０，６塩化カルシウム、ｍＭ　４　４　４　４ポリソルベート８０、 ％　−０，０２−ＰＥＧ４，０００．％　０．１　０．１　−−　−アルブミン 　％　１　］− 第第二０の装填、ＩｔＪ／ｍｌ　２５０　２５０　２５０　２５０水に戻した後 の回復、ＩＵ／ｍｌ　８３　１９７　２３２　２２２この実施例から、非イオン 系界面活性剤、又はアルブミンを使用した場合、第■：Ｃの回復率には、何ら差 が無いことが分かる。

衷籐桝λ０強度ｑ眞欠々井〜瓜１Ｘ汰蒸匡而快剋９迎救組み換え第■因子は、実 験例で説明した方法に従って調整した。

２ｍｌの溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため２ｍｌの滅菌水で液体に戻し た。

その組成物は次の通りであった。

２Ａ　２８　２Ｃ； Ｌ−ヒスチジンルーグルタミン酸塩、等モル量、ｍｇ／ｍｌ　１０　１０　１０ 塩化ナトリウム、％　２　２　２ 塩化カルシウム、ｍｇ／ｍｌ　Ｏ，１０，１０，１ポリソルベート８０、％　− ｏ、ｏｏｉ　ｏ、ｏｉ水に戻した後の第■：ＣのＩＩＩＩＵ／ｍｌの！ＪＩＩＵ ／ｍ１　３００　３００　３００当初　６９　１３３　２２８ ３．５時間後☆　４３　１４０　２２２７時間後☆　４９　１３３　２０４ ☆周囲温度で元に戻した溶液として貯蔵した。

非イオン系界面活性剤を使用したとき、第■囚子に対する驚くほど優れた安定化 作用が明確となっている。

実施例３．各種非イオン系界面活性剤の濃度組み換え第■因子は、実験例で説明 した方法に従って調整した。

２ｍｌの溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため５ｍ１の滅菌水で液体に戻し た。

３Ａ　３８　３Ｃ：　３Ｄ　３Ｅ Ｌ−ヒスチジン、ｍＭ　５０　５０　５０　５０　５０塩化ナトリウム、Ｍ　Ｏ ，３４０，３４０，３４０゜３４　０．３４塩化カルシウム、ｍＭ　４　４　４ 　４　４ポリソルベート８０、％　０．０１　０．０２　０．０３　０．０４　 ０．０５水に戻した後の回復、％　９１　９０　９３　９９　１００この実施例 の結果から、元に戻した後の第■（■：Ｃ）の回復は、極めて良好であり、使用 した全ての濃度のポリソルベート８０に対して良好であることが分かる。

流側４．各種の塩化力士リウムの濃廉 組み換え第■因子は、実験例で説明した方法に従って調整した。

異なる温度で６力月以内、貯蔵した２ｍｌの溶液を凍結乾燥し、その後、注射の ため５ｍｌの滅菌水で元に戻し−ヒスチジン、ｍＭ　５０　５０ 塩化ナトリウム、Ｍ　Ｏ，３０，６ 塩化カルシウム、ｍＭ　４　４ ＰＥＧ−４，０００％　ｏ、ｉ　ｏ、ｉ（ポリエチレン、　グリコール） ポリソルベート８０、％　０．０２５　０，０２５８℃で貯蔵した回復、％、 当初　８５　８６ ３力月後　８８　８７ ４力月後　８７　８３ ６力月後　８７　８３ ２５℃で貯蔵、 １力月後　９２　９３ ３力月後　８７　７９ ４力月後　８４　８１ ６力月後　８５　８５ ３７°Ｃて貯蔵、 １力月後　８８　９０ ３力月後　８０　８０ ４力月後　８０　７７ ６力月後　８１　８０ ５０℃で貯蔵、 １力月後　８４　８９ ３力月後　７７　７７ ４力月後　７３　７０ ０．３又は０．６Ｍの塩化ナトリウムは、極めて優れた安定性を示した。双方の 調合物は、３７℃で６力月間、極めて安定していた。

実施例５．各種Ｌ−ヒスチジンの１ 組み換え第■因子は、実験例で説明した方法に従って調整した。

３力月以内異なる温度で貯蔵した２、２ｍｌの溶液を凍結乾燥し、その後、注射 のため５ｍｌの滅菌水で元に戻した。

Ｌ−ヒスチジン、ｍＭ　４６　５９ 塩化ナトリウム、Ｍ　Ｏ，３１０，３１塩化カルシウム、ｍＭ　３．７　３．７ ＰＥＧ−４，０００％　０．０９１　０．０９１（ポリエチレン、　グリコール ） ポリソルベート８０、％　０．３６４　０．３６４８℃で貯蔵した回復、％、 当初　７８　８４ ３力月後　７０　７６ ６力月後　８７　８３ ２５℃で貯蔵、 １力月後 ３力月後　６９　７４ ３７℃で貯蔵、 １力月後　７６　８２ ３力月後　６１　４８ ５０℃で貯蔵、 １力月後　６０　７３ ３力月後　４４　４８ この実験結果から、これらの異なる量のヒスチジンは、安定性に影響ないことが 分かる。

実施例６゜ 組み換え第■因子は、実験例で説明した方法に従って調整した。

６Ａ　６Ｂ Ｌ−ヒスチジン、ｍＭ　６５　６５ 塩化ナトリウム、Ｍ　Ｏ，３０，３ ＰＥＧ−４，０００％　ＯＯ，１ ツイン８００％　０．０２５　０．０２５これら溶液は、凍結／溶解を１回、５ 回及び１ｏ回行い、その回復は、次の通りであった。

ＩＵ／ｍｌ　ＩＵ／ｍｌ 冷蔵　２９８　２９１ １回目の凍結　２９３　２９３ ５回目の凍結　２９５　２８７ １ｏ回目の凍結　２９０　２８８ これらの研究から、第■：Ｃは、凍結溶解を反復した後でも安定しており、又、 極低温保護剤として機能すると考えられるＰＥＧ４，０００は、この調合物には 不要であることが判明した。

寒流４−−各律ｑλ其 組み換え第■因子は、実験例で説明した方法に従って調整した。

２．２ｍｌの溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため５ｍｌの滅菌水で液体に 戻した。

７Ａ　７８　７Ｃ７Ｄ Ｌ−ヒスチジン、ｍＭ　６５　６５　６５　６５塩化ナトリウム、Ｍ　Ｏ，３０ ，３０，３０，３塩化カルシウム、ｍＭ　４　４　４　４ポリソルベート８０、 ％　０．０２５　０．０２５　０．０２５　０．０２５ｐＨ６，０６，５７，０ ７，５ 回復、％、当初　７４　７０　７８　７９３時間後☆　７３　８０　７８　７７ ☆周囲温度で元に戻した溶液として貯蔵した。

この実験例から、６゜０乃至約７．５の範囲内では、ｐＨは、有意義な影響がな いことが分かる。

実施例８．スフローゼの添加 組み換え第■因子は、実験例で説明した方法に従って調整した。

２、’２ｍｌの溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため５ｍｌの滅菌水で液体 に戻した。

８Ａ　８Ｂ Ｌ−ヒスチジン、ｍＭ　５８　２０．５塩化ナトリウム、Ｍ　Ｏ，３０，３ 塩化カルシウム、ｍＭ　３．７　３．マスクローゼ、ｍＭ　Ｏ１３，３ ポリソルベート８０、％　０．０２５　０．０２５凍結乾燥前の最後の精製段階 の後に、スフローゼを溶液Ｂに添加した。

凍結乾燥後の回復率は、への場合７６％、Ｂの場合８７％であった。室温で元に 戻して４時間、貯蔵後の活性は、同一であることが確認された。

この研究から、スフローゼを添加することは、凍結乾燥中、第■：Ｃの回復に望 ましいことが分かった。

実施例９．各種のカルシウム塩 組み換え第■因子は、実験例で説明した方法に従って調整した。

２　ｍｌの溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため５ｍ１の滅菌水て液体に戻 した。

９Ａ　９８　９Ｃ９Ｉ） Ｌ−ヒスチジン、ｍＭ　２３　２３　２３　２３塩化ナトリウム、Ｍ　Ｏ，３１ ０，３４０，３４０，３４塩化カルシウム、ｍＭ　４　ノ１０，１５０．１５ポ リソルベー　ト８０、％　０．０２５　０．０２５　０．０２５　０．０２５ス クローゼ、ｍＭ　１０　１０ カルシウムグルコン酸塩、ｍＭ　ＯＯ６６回復、％、当初　６３　７４　７４　 ７８４時間後☆　６０　７３　７３　７’７☆周囲温度で元に戻した溶液どして 貯蔵した。

この実験から、Ｃａ　Ｃ１２に代えて、グルコン酸塩カルシウムを使用すること が可能であることが分かる。

害巖す」−μｍ 組み換え第■因子は、実験例で説明した方法に従って調整した。

２．２ｒｎ１の溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため５ｍｌの滅菌水で液体 に戻した。第■：Ｃの元に戻した調合剤のバイアル当たりの量は、約１，０ＯＯ Ｉｔｊであった。

］、ＯＡ　ｌ０Ｆ３ Ｌ−ヒスチジン、ｍＭ　１４．７　５８塩化ナトリウム、Ｍ　Ｏ，３１０゜３１ 塩化カルシウム、ｒｎＭ　３．７　３．マスクローゼ、ｒｎＭ　１９．９　− ポリソルベート８０、％　０．０２５　０，０２５２５回復に戻したどきのＩ　 Ｕ　／　ｍ、　１当初　２１３　１９８ ２５℃、４時間後　２１３　１９８ ２５℃、２４時間後　２０１　１８２ ８２回復 当初　９２　９１ ２５℃、５力月後　８８　− ３０℃、５力月後　７６　８５ ７℃、１２力月後　８９　９７ ■、−ヒスチジンの一部をスク゛ローゼで元に戻したとき、回復率は、良好であ った。

これらの調合物は、それぞれ２５℃、３０℃で５力月間貯蔵した後、ゲルろ過に より検査し、その結果は、図１及び図２に示しである。観察された唯一・のピー クは、第■：Ｃ因子を示す４２におけるピーク及びヒスチジンである７０におけ るピークである。集合体は、４０よすも的に観察される。図１からＩＯＡの場合 、２５℃で５力月間の貯蔵の後、何ら検出可能な集合体は観察されないことが判 明した。図２は、］、ＯＢの場合、３０℃で５力月後、２％以下の少量の集合体 が生ずることを示す。

実施例１１゜ 組み換え第■因子は、実験例で説明した方法に従って調整した。

２．２ｒｎＪの溶液を凍結乾燥させ、その後、注射のため５ｍｌの滅菌水で液体 に戻した。第■：Ｃの元に戻した調合剤のバ〜イアル当たりの量は、約５００Ｈ ＵであつＬ−ヒスチジン、ｍＭ　１４．７　５８塩化ナトリウム、Ｍ　Ｏ，３１ ０，３１塩化カルシウム、ｍＭ　３．７　３．マスクローゼ、ｍＭ　１９．９　 − ポリソルベート８０、％　０．０２５　０．０２５２５回復に戻したときのＩＵ ／ｍｌ 当初　９８　１０５ ２５°Ｃ１４時間後　９６　１０３ ２５℃、２４時間後　９３　１０１ ０１回復 当初　９１　９３ ２５℃、５力月後　８９　８７ ３０℃、５力月後　７６　７９ ７℃、１２力月後　８８　８９ 双方の調合物共に、安定性は良好である。これらの調合物は、ゲルろ過により測 定し・、その結果は、図１及び図２に示すように同様であった。

これらの調合物をそれぞれ２５℃、３０℃で５力月間、貯蔵したどぎ、集合体は 、形成されなかった。

寒流側１−？ニー 組み換え第■囚了・は、実験例で説明した方法に従って調整した。

２　ｎｉ　１の溶液を凍結乾燥し、５力月以内、異なる温度で貯蔵し、その後、 注射のため４ｍｌの滅菌水で元に戻した。元に戻した調合剤のバイアル当たりの 第■：Ｃは、約５００　ＩＵであった。

１．２Ａ　１２Ｂ マンニット、ｍ　ｇ　／　ｒｎ　１　２０　２０Ｌ−ヒスチジン、ｍＭ　２，６ ７　２．６７塩化ナトリウム、Ｍ　１８　１８ 塩化カルシウム、ｍＭ　３゜７　３．７ポリソルベート８０、％　０．２３　０ ．２３回復、％ 当初　９１　９３ ７℃で５力月貯蔵した後　９０　８５ ７℃で５力月貯蔵した後、安定性は許容し得るものであった。

Ｆｉｃｒｕｒｅ　１ フロントページの続き （３１）優先権主張番号　９３０２００６−３（３２）優先臼　１９９３年６月 １１日（３３）優先権主張国　スウェーデン（ＳＥ）（８１）指定国　ＥＰ（Ａ Ｔ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＰ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＮＥ 、ＳＮ。

ＴＤ、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＢＹ。

ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ， ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＬＶ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＮＺ、ＰＬ、ＰＴ、 ＲＯ。

ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＵＳ、ＵＺ、ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）凝固第ＶＩＩＩ因子と、安定剤として非イオン糸界面活性剤とから成ること を特徴とする組成物。 ２）第ＶＩＩＩ因子が極めて高純度であり、アルブミンを添加せずに安定してい ることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の組成物。 ３）第ＶＩＩＩ因子が組み換え第ＶＩＩＩ因子の完全な誘導体又は希釈された誘 導体であることを特徴とする請求の範囲第１項及び第２項に記載の組成物。 ４）第ＶＩＩＩ因子の量が１０乃至１００，０００ＩＵ／ｍＩ、望ましくは５０ 乃至１０，０００ＩＵ／ｍＩであることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第３ 項のいずれか１項に記載の組成物。 ５）非イオン糸界面活性剤が臨界的なミセル濃度以上の濃度で存在することを特 徴とする請求の範囲第１項乃至第４項のいずれか１項に記載の組成物。 ６）非イオン糸界面活性剤が、ブロック共重合体、望ましくは、ポリオキシマ、 又はポリオキシエチレン（２０）脂肪酸エステル、望ましくは、ポリソルベート ２０又はポリソルベート８０から選択されることを特徴とする請求の範囲第１項 乃至第５項のいずれか１項に記載の組成物。 ７）ポリオキシエチレン（２０）脂肪酸エステルの量が少なくしも０．０１ｍｇ ／ｍＩであることを特徴とする請求の範囲第６項に記載の組成物。 ８）望ましくは０．１Ｍ以上の量のナトリウム又は塩化カリウムを含むことを特 徴とする請求の範囲第１項乃至第７項のいずれか１項に記載の組成物。 ９）望ましくは０．５ｍＭ以上の量の塩化カルシウム、又はグルコン酸塩カルシ ウムのようなカルシウム塩を含むことを特徴とする請求の範囲第１項乃至第８項 のいずれか１項に記載の組成物。 １０）１ｍＭ以上の量のＬ−ヒスチジンのようなアミノ酸を含むことを特徴とす る請求の範囲第１項乃至第９項のいずれか１項に記載の組成物。 １１）望ましくはスクローゼ、又は砂糖アルコールのような単糖又は二糖類を含 むことを特徴とする請求の範囲第１項乃至第１０項のいずれか１項に記載の組成 物。 １２）Ｌ−ヒスチジン及びスクローゼを含むことを特徴とする請求の範囲第１０ 項又は第１１項に記載の組成物。 １３）塩化ナトリウム対Ｌ−ヒスチジンの比が１対１以上であることを特徴とす る請求の範囲第８項又は第１０項に記載の組成物。 １４）ｉ）１０乃至１００，０００ＩＵ／ｍＩの組み換え第ＶＩＩＩ因子と、 ｉｉ）少なくとも０．０１ｍｇ／ｍＩのポリオキシエチレン（２０）脂肪酸エス テルと、 ｉｉｉ）望ましくは０．１Ｍ以上の塩化ナトリウムと、ｉＶ）望ましくは０．５ ｍＭ以上の塩化カルシウム又はグルコン酸塩カルシウムのようなカルシウム塩と 、Ｖ）１ｍＭ以上のＬ−ヒスチジンのようなアミノ酸とを含むことを特徴とする 請求の範囲第１項乃至第１３項のいずれか１項に記載の組成物。 １５）組成物が乾燥されることを特徴とする請求の範囲第１項乃至第１４項のい ずれか１項に記載の組成物。 １６）組成物が凍結乾燥されることを特徴とする請求の範囲第１５項に記載の組 成物。 １７）組成物が直ちに使用可能な安定的な水溶性溶液であることを特徴とする請 求の範囲第１項乃至第１４項のいずれか１項に記載の組成物。 １８）ｒ−第ＶＩＩＩＳＱの比特性が１２，０００ＩＵ／ｍｇ蛋白、望ましくは 、１４，０００ＩＵ／ｍｇ以上であることを特徴とする請求の範囲第３項乃至第 １７項のいずれか１項に記載の組成物。 １９）Ｌ−ヒスチジンのようなアミノ酸、ナトリウム塩、スクローゼ及びカルシ ウム塩のようなアミノ酸と共に、第ＶＩＩＩ因子を水溶性溶液内で非イオン系界 面活性剤と混合させることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の組成物を製造 する方法。 ２０）Ｌ−ヒスチジン、ナトリウム塩、スクローゼ及びカルシウム塩のようなア ミノ酸と共に、非イオン糸界面活性剤を含む緩衝液により水溶性溶液内で最後の 精製段階から第ＶＩＩＩ因子を溶出させることを特徴とする請求の範囲第１項に 記載の組成物を製造する方法。 ２１）凝固第ＶＩＩＩ因子を含む組成物の安定剤として、望ましくは、ブロック 共重合体、望ましくは、ポリオキシマ又はポリオキシエチレン（２０）脂肪酸エ ステル、望ましくは、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０から選択され た非イオン系界面活性剤を使用することを特徴とする使用方法。