JPH07503322A - 細管列共焦蛍光スキャナー及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細管列共焦蛍光スキャナー及び方法 発明の詳細な説明 本発明は、一般に細管列スキャナー及び方法に関し、より詳細には、細管の列で 行なう電気泳動による、クロマトグラフィーによる又は他の分離を検知するため の細管列共焦蛍光スキャナー及び方法に関する。

細管電気泳動（ＣＢ）は、分析及び生物医学の研究において広範な用途を提供し ており、ＣＥの範囲及び精巧化は、なお急速に進展している（文献工〜５）。合 成ポリヌクレオチド（文献６　）　、ＤＮＡ配列決定断片（文献７〜１１）及び ＤＮＡ制限断片（文献１２、＋３）の迅速な分離及び分析には、ゲルを充填した 細管が用いられている。開口チューブ細管電気泳動が、アミノ酸分離において次 原子（ｓｕｂａｔｔｏｍｏｌｅ）検知レベルを達成しており（文献Ｉ４）、蛋白 質、ウィルス及びバクテリアの分離に対するその有用性が証明されている（文献 １５）。ダンシルアミノ酸の光学異性体の分離も、成功裏に実証されている（文 献１６）。ミセル動電細管クロマトグラフィー（ｍｉｃｅｌｌａｒ　ｅｌｅｃｔ ｒｏｋｉｎｅｔｉｃ　ｃａｐｉ　１ｌａｒｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｔ＋ｙ ）、等電点電気泳動A 及びオンカラム・デリヴ工−ンヨン（ｏｎ−ｃｏｌｕｍｎ　ｄｅｒｉｖａｔｉｏ ｎ）は、全て細管カラムにおいて行なうことができ、分析及び微細分離用（ｍｉ ｃｒｏｐｒｅｐａｒａｌｉｖｅ）の道具としての細管の有用性を実証している（ 文献４．５）。

ＣＥの利点は、本質的に、小さい内径（２０〜２００μｍ）の細管を用いること により生しるものである。分離媒体又はカラムの温度をそれほど上昇させること なく、高い電場を小さい直径の溶融シリカ細管に沿って印加することができる。

帯電した種剤（ｃｈａｒｇｅｄ　５ｐｅｃｉｅｓ）の電気泳動速度は、電場に比 例するので、ＧＥは、迅速で高分離度（ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔ　１ｏｎ）の 分離を行なうことができる。ＣＥにおいてジュール加熱が低いのは、細管を通過 する電流が非常に低いこと、細管チャンネルの表面対体積の比が大きいこと、薄 い細管壁（〜５０〜１５０μｍ）の使用していること、壁材料の熱伝導率が高い ことの結果である（文献ｌ）。

ＣＢは、迅速な分析をもたらすが、一度に一本の細管しか分析できないため、今 のところ総スルーブツトは高くない。ＣＥのスループットを向上させるための方 法の開発は、やりがいのある重要な仕事である。一つの可能なアプローチは、よ り速い分析をもたらすより高い電場を用いることである。しかしながら、より高 い電場は、しばしばカラムの過熱及びカラム故障を招（。

スルーブツトを向上させるための別の方法は、多数の細管分離を並行して行なう ことである。このアプローチは、細管の列を用いており、そのため、細管副電気 泳動（ＣＡＥ）と呼ばれている。ＣＡＦ！は、個々の細管を入口において独立に 取り扱うことができ、それにより、多数の試料の迅速な並行投入を容易にしてい るため、潜在的に利点が有る。我々のアプローチでは、並行したオンカラム検知 を容易にするため、細管は、出口で結合されてリボンになっている。このように して、検知を行なうために１００本の細管を容易に束ねることができるので、Ｃ Ｉ！のスルーブツトの二桁増が達成される。

細管副電気泳動が直面する重要な問題は、検知である。細管には、少量の試料が 注入されるので、高感度検知システムカ坏可欠である。レーザーによって励起さ れた蛍光が、細管電気泳動及びＤＮＡ配列決定における感度の良い検知方法であ ることが証明されている（文献７〜比１４．１７〜２１）。殆どのレーザー励起 蛍光検知機構では、入射レーザー光線と放射蛍光とは、互いに垂直である。この 構成を用いて細管の列を検知するためのシステムを設計することは困難である。

我々は、近頃、スラブ・ゲルにおける蛍光標識したＤＮＡの検知が向上したレー ザー励起共角蛍光ゲル・スキャナーを紹介した（文献２２〜２６）。この検知シ ステムは、落射照明フォーマットを用いており、落射照明フォーマットにおいて は、顕微鏡対物レンズによって試料にレーザーの焦点を合わせ、放射された蛍光 を、１８０度構成（１８０’　ｇｅｏｍｅｔｒｙ）を用いた同じ対物レンズによ って集光した後、共角検知を行なう。この構成は、細管のオンカラム検知に理想 的である。共角励起及び検知を用いると、光学システムのフィールドの深度（ｄ ｅｐｔｈ）は充分に小さく、細管の内部のみが精査される。背景散乱（ｂａｃｋ ｇｒｏｕｎｄ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）　、迷蛍光及び細管壁からの反射光が、 空間及び分光フィルターによって、はね除けられる。更に、顕微鏡対物レンズの 高い開口数が、蛍光を非常に効率良く集め、高質のイメージをピンホール空間フ ィルターに提供する。ＣＥに関して、蛍光顕微鏡検知の有用性は、スタティック 光学システムを用いて単一の細管を検知する先の研究で認められている（文献２ ７．２８）。

我々は、細管列を検知するための共角蛍光検知装置の理想的な使い方は、検知装 置を通り過ぎて細管列を走査することであることを、ここに示す。このフォーマ ットは、信号対雑音比を高める幾つかの利点を有している。（１）電気泳動バン ドが、細管を下って検知領域を通過する際に、電気泳動バンドの全断面がサンプ リングされる。（２）バンド全体がサンプリングされ、光学システムがサンプリ ングされているバンドを横切って終始移動しているため、感度を限定するバンド の光漂白に起因する問題が、最小限になっている。（３）細管壁の円筒状レンズ 効果が、信号対雑音比を高める分離チャンネルの長くなった検知を可能にしてい る。

これらの利点は、共角走査が、細管カラムの列を用いた分離の高感度検知を行な うための独自の強力な方法であることを示している。

発明の目的と概要 本発明の目的は、細管分離におけるスルーブツトを向上させるための方法及び装 置を提供することである。

本発明の他の目的は、細管の列を走査して細管内の物質の分離を検知するための 方法及び装置を提供することである。

本発明の別の目的は、多数の平行な細管の内部を分析するための高感度蛍光検知 システムを提供することである。

本発明の別の目的は、並行負荷を容易にするため入口において独立に取り扱うこ とができ、共角スキャナーによって分離を検知するため結合されてリボン・アレ ーになっている細管の列における多数の分離を分析するための装置及び方法を提 供することである。

本発明の更に別の目的は、並んだ関係に配置された複数の細管を備えた細管リボ ンの各細管の内部でのゲル電気泳動の間に分析を行なうためのレーザー励起共角 蛍光検知システム及び方法を提供することである。　本発明の更に別の目的は、 ＣＥの間に細管の列を走査するためのレーザー励起蛍光細管スキャナーを提供す ることである。

本発明の別の目的は、分離バンド全体をサンプリングするため、細管チャンネル を横切って分離を検知するレーザー励起蛍光スキャナーを提供することである。

本発明の別の目的は、並行負荷を容易にするため入口において独立に取り扱うこ とができ、共角スキャナーによって分離を検知するため結合されてリボン・アレ ーになっている細管の列におけるＤＮＡ配列を分析するための装置及び方法を提 供することである。

本発明の更に別の目的は、並んだ関係に配置された複数のゲルを充填した細管を 備えた細管リボンの各細管の内部でのＤＮＡ断片のゲル電気泳動の間に分析を行 なうためのレーザー励起共角蛍光検知システム及び方法を提供することである。

本発明の別の目的は、細管内の試料の光漂白を防ぐ細管スキャナーを提供するこ とである。

本発明の更に別の目的は、細管が、細管容積の連続的サンプリングをもたらす形 態になっている細管列スキャナーを提供することである。

本発明のこれらの目的及び他の目的は、平行な同一平面に並んだ関係を有する複 数の細管と、電気泳動又は他の分離法の間に前記細管各々の選択された内部容積 からの蛍光を順に、反復的に検知するためのレーザー励起共角蛍光検知装置とを 含むレーザー励起細管列スキャナーによって達成される。本発明は、更に、並ん だ関係にある複数の毛細路を走査し、電気泳動又は任意の他の分離処理の間に各 毛細路からの蛍光を周期的、反復的に検知することにより、単一のスキャナーで 、複数の細管を分析する方法に関するものである。　本発明の上記及び他の目的 は、以下の説明を添付図面を参照して読むと、以下の説明から、より明瞭に理解 されよう。

図１は、本発明の一実施態様による共角蛍光細管列スキャナーの模式図である。

図２は、並んだ関係にある細管の領域を支持するためのホルダーの図である。

図３は、合焦ゾーンの拡大図である。

図４Ａ及び図４Ｂは、どのようにして、励起光線が円筒状細管の内部の容積に合 焦されるかを示している。

図５は、ＤＮＡ分離の間に４細管列を走査することにより得られたイメージであ る。

図６は、図５のＤＮＡ分離の電気泳動図である。

図７は、図６の電気泳動図の指示領域の拡大図である。

図８は、２４細管列を走査することにより得られたイメージである。

図９は、４色共角蛍光細管スキャナーの模式図である。

本発明に従い、並列になった多数の細管を用いることにより、細管電気泳動の処 理能力が高まる。細管電気泳動が直面する最も重要な問題は、検知である。

１９９０年６月１日に出願され、参照することにより本願明細書に組み込まれて いる同時係属出願第０７１５３１．９００号において、スラブ・ゲルにおける蛍 光標識ＤＮＡの検知が向上したレーザー励起共角蛍光ゲル・スキャナーが記載さ れている。この検知システムは、落射照明フォーマットを用いており、落射照明 フォーマットにおいては、顕微鏡対物レンズによって試料にレーザーの焦点を合 わせ、放射された蛍光を、１８０度逆戻り一光学構成（１８０°ｒｅｔｒｏ−ｏ ｐｔｉｃａｌ　ｇｅｏｍｅｔｒｙ）を用いた同し対物レンズによって集光した後 、共角検知を行なう。

小さな直径の細管において分離された蛍光標識検体を高感度で検知することは、 困難な仕事である。斯かる細管は、内径が１００μ■以下のため、小さな焦点容 積（ｌｏｃａｌ　ｖｏｌｕｍｅ）が必要である。この検知システムは、ポテンシ ャル強度の高いレイリー散乱、蛍光、及び細管壁からの反射光を、はね除けなけ ればならない。共角励起及び検知を用いると、光学システムのフィールドの深度 （ｄｅｐｔｈ）は充分に小さく、内径１００μ■の細管の内部のみが精査される 。走査ステージによって指令される横方向の解像度及びレーザー光線の直径を、 数μｍと小さくすることができる。背景散乱（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ　ｓｃａｔ ｔｅｒｉｎｇ）及び細管壁からの反射光が、空間フィルター及び分光フィルター によって光検知器の手前で、はね除けられる。

細管列とともに用いる共角蛍光検知システムが、図１に示されている。アルゴン ・イオン・レーザー（カリフォルニア州、マウンテン・ビューのスペクトラ−フ ィジックス（Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）社製、２０２０型１（図示せず ）が、励起光源として用いられている。レーザー光線は、直径５ａ＋ｎ＋に広げ られ、平行化された後、３２ｘ。

開口数０．４の無限共役対物レンズ１１　（西ドイツ、カール・ツァイス社製、 レーザー・ダイオード・ブラン−アク０７−ト４４０８５０型化Ｄ　Ｐｌａｎ− Ａｃｈｒｏｍａｔ　４４０８５０゜Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ、　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒ ｍａｎｙ）　ｌ　を通り長光路二色ビーム・スプリッター１２ｔバーモント州、 ブラトルバロのオメガ・オプティカル社製、４８０ＤＭ型（４８０ＤＭ、　Ｏｍ ｅｇａＯｐｔｉｃａｌ、　Ｂｒａｔｆｌｅｂｏｒｏ、　ｖＴ）によって送られる 。二色ビーム・スプリッター１２は、励起レーザー光線を対物レンズＩＩ内へ反 射するが、より長い波長へとンフトされたストークス線である対物レンズによっ て集光された蛍光を透過させる。

対物レンズは、励起レーザーを試料に合焦させ、蛍光を非常に高い集光効率で集 める。無限共役対物レンズの使用は、ベース１４に固定された取り付は台１３を 用いて対物レンズを移動させることにより、はとんど光学的整合の摂動（ｐｅｒ ｔｕｒｂａｔ　１ｏｎ）なしに、プローブ容積の横方向の調節を可能にしている 。合焦されたｌ　ＩＩＩＷ、波長４８８ｎｍの光線は、１０μｍの光線直径で２ ５μｍの共角光線パラメーターに合焦される。放射蛍光は、レーザー干渉を減少 させ、励起路と検知路とを分離するため、逆戻りにベース１４に取り付けられた 長光路二色ビーム・スプリッター１２を通過させる。次いで、蛍光は、ベース１ ４に取り付けられた焦点距離が７５ｎｗｎのレンズ１６によって、共角空間フィ ルターとしての役割をする４００μｍのピンホールに合焦される。ピンホールを 通過する光は、４８８ｎｍ排除帯フィルター（バーモント州、ブラトルバロのオ メガ・オプティカル社製、４８８排除帯フイルター（４８８ＲＢ　ｆｉｌｔｅｒ 、　（ｈｎｅｇａ　０ｐｔｉｃａｌ、　Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ、　ＶＴ）　ｌ 　、長光路カットオフ・フィルター（ニューシャーシー州、オークリッジのエス コ社製、ショットＧＧ−４９５型（Ｓｃｈｏｔｔ　ＧＧ−４９５，Ｅｓｃｏ、　 Ｏａｋｒｉｄｇｅ、　ＮＪ）　、及びバンドパス蛍光フィルター（バーモント州 、ブラトルバロのオメガ・オプティカル社製、５３０　ＤＦ６０型（５３０ＤＦ ６０．０ｍｅｇａ　０ｐｔｉｃａｌ、　ＢｒａＬｔｌｅｂｏｒｏ、　ＶＴ）ｌ　 ［これらのフィルターは、全てハウジング１７内に配置されている］によってフ ィルター選別された後、冷却された光電子増倍管１１ペンシルバニア州、ランカ スターのバール・インダストリーズ製、ＲＣＡ　３１０３４Ａ型（ＲＣＡ　３１ ０３４Ａ、　Ｂｕｒｌｅ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　Ｌａｎｃａｓｔｅｒ、　Ｐ Ａ）　Ｉによっ■ 検知される。空間フィルター、光フィルター及び光電子増倍管は、ベースＩ４に 取り付けられている。光電管のアウトプットは、低ノイズ増幅器（カリフォルニ ア州、サニーヴ工−ルのスタッフォード・リサーチ・システムズ製、５Ｒ５６０ 型（ＳＲ５６０，５ｔａｎｆｏｒｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｓｙｓｔｅｗ＋ｓ、　 ５ｕｎｎｙｖａｌｅ、　ＣＡ）　ｌによって増幅され、フィルター選別され、１ ２ビツトのアナログ−デジタル変換ボード（マサチューセッツ州、ターントンの メトラーバイト社製、ＤＡＳＨ−１６Ｆ型（ＤＡＳＨ−１６Ｆ、　Ｍｅｔｒａ− Ｂｙｔｅ。

Ｔａｕｎｔｏｎ、　ＭＡ）ｌによってデジタル化され、ＩＢＭのＰＳ／２型マイ クロコンピュータに記憶される。光電管のアウトプットに関して用いる電子フィ ルターは、ロールオフがＩ２デシベル（ｄＢ）／オクターブの一次アクティヴ低 域通過フィルター（直流〜４００Ｈｚ）であった。

細管列は、壁２４．２６内へと延びる端部２２．２３を有する複数の細管を備え ており、これらの壁の間には、電気泳動のための高電圧が印加される。端部２２ は、個々に操作及び負荷を行うよう、分離されていてもよい。細管の一部分２７ は、ホルダー２８によって同一平面に平行に並置された関係に維持されている（ 図２参照）。ホルダー２８は、窓を備えており、この窓を通して光線を細管の内 部容積（ｉｎｔｅｒｉｏｒ　ｖｏｌｕｍｅ）に合焦させることができる。図３は 、細管２１ａの内部容積に焦点を合わせた光線２９を示している。

幾つかの理由により、細管の中心において精査するだけよりも、光線と検知シス テムとを細管を横切って走査させるほうが良い。第一に、プローブのレーザーが 細管の中心に固定されている場合には、試料流は、レーザーによって急速に光漂 白される（ｐｈｏｔｏ−ｂｌｅａｃｈｅｄ）。細管内部を横方向に横切って光を 走査させるのは、帯域全体が（横方向に）精査され、光漂白が減少するため、一 箇所にじっとしているよりもはるかに良い。更に、軸外れの精査が有利なのは、 図４Ａ及び図４Ｂに示すように、円筒状レンズの効果が、光線のくびれ部を現実 に細管のゲル中に戻すため、検知システムは、走査の間、表示の細管の直径及び 走査速度から予測されるよりも長い時間ゲルを精査するからである。

ホルダー２８は、移動ステージ３１マサチユーセツツ州、フランクリンのデザイ ン・コンポーネンツ社製、４０００型（Ｍｏｄｅｌ　４０００．　Ｄｅｓｉｇｎ 　Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ。

Ｆｒａｎｋｌｉｎ、　ＭＡ）　ｌ　に取り付けられている。このステージは、細 管列を、電気泳動と垂直の方向に２０＋ｍ＋／ｓｅｃで連続的に往復走査させる ようプログラムされている。

このようにして得られた像は、二つの次元を有している。一方は、細管の物理的 像を表わす空間的次元である。もう一方は、経過時間に比例する時間的次元であ る。特定の掃査の間、光検知器からの蛍光データが、２０００ヘルツで試料採取 されるため、公称解像度は、ＩＯμｍ／画素であり、よって、１０個の画素が、 所定の細管の内部の１００μｍの巾を示す。電子低域通過フィルターのカットオ フは、細管の１００μｍの内径を構成するのに要する空間周波数を通過させなが らも高周波ノイズの排除を行なうよう、３００ヘルツに設定された。細管の照明 された領域の周期的な二重の一掃査（ｏｎｅ−ｓｅｃｏｎｄ　ｓｗｅｅｐｓ）を 累積することにより、泳動する帯域の像が、時間の関数として出来上がる。プロ ーブ領域を通り過ぎて泳動するＤＮＡの移行時間は、ここで用いた条件下では、 低分子量断片（４０〜５０量体（ｌＩｅｒｓ）ｌの約１０秒〜より高分子量の断 片（３８０〜３９０量体）の約１４秒の範囲である。１秒の反復サイクルで、各 帯域につき１０〜１４の試料が得られる。コンピュータは、このデータを処理し 、得られた像をリアルタイムで表示する。イメージを得るため、米国国立衛生研 究所（ＮＩＨ）のプログラムであるＩｍｇｅ　１．２９、及び市販のイメージ処 理パッケージであるＣａｎｖａｓ（商標）を用いてイメージ処理を行うことがで る（図５参照）。

イメージ・データは、Ｉｍａｇｅ　１．２９を用いて各レーンの巾を横切る画素 数を平均することにより一次元の線プロット又は電気泳動図にすることができ（ 図６参照）、図７に示すように部分を拡大することができる。

−例において、コーエン等によって説明された手法（文献６．７参照）の変法を 用いて無架橋のポリアクリルアミド・ゲルを充填した細管を用意した。３■巾の 検知窓が、ポリアミド被膜を熱線（ホット・ワイヤ）で焼き取ることにより、内 径１００μｍ、外径２００μｍの各溶融シリカ細管（アリシナ州、フェニックス のポリミクロ・チクノロシーズ製（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ ｅｓ、　Ｐｈｏｅｎｉｘ、　ＡＺ）　Ｉ　に形成された。窓は、長さ４０ｃ＋ｏ の細管の入口側から２５ｃ＋ｎの箇所に焼き取りされた。次いで、細管の内壁を 、三官能試薬であるγ−メタクリルオキシプロピルトリメトキシ−シランで一晩 処理し、アクリルアミド付着用の壁を形成した（文献６参照）。新たに調製した ７モルの尿素を含んだＩ　Ｘ　ＴＢＢ緩衝液（トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ）に溶 解したアクリルアミド・ゲル溶液（９％Ｔ、　０ＸＣ）を、０．２μ■のシリン ジ・フィルターでろ過し、減圧下で約１時間脱気した。ＩＯＸＴＥＭＥＤ　（テ トラエチルメチレンジアミン）及びｌＯ％ＡＰＳ（過硫酸アンモニウム）溶液を 、ゲル溶液に加えて最終濃度を約０．０３％とした。この溶液を、直ちにサイフ オンで減圧下に細管内に移した後、冷却室で一晩重合させた。使用に先立って、 カラムの両端を約１ｃ＋＋ｒｔＵり落としてそろえた後、７ｋＶで３０〜６０分 間、予備電気泳動を行なった。

細管列は、移動ステージ３０に取り付けられた細管ホルダー２８に挟み込まれた 。細管ホルダー２８（図２）は、（１）列の各細管を、移動ステージ３ｏ上面の 上方の同じ高さに均一に拘束する、及び（２）小窓（これを通して共角帯域が細 管内部を精査する）を晒すという二重の目的を果たすものである。細管をほぼ同 一の平面に拘束することは、顕微鏡の対物レンズの焦点深度がわずか２５〜５０ μｍであるため、各細管からの均一な検知感度を得るのに必要である。

データを図５〜図７に示したＤＮＡ試料は、以下のように調製した。配列決定キ ット（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｋｉｔ）である５ｅｑｕｅｎａｓｅ　２．０　１ オハイオ州、クリーブランドのニー・ニス・バイオケミカル社（Ｌｌ、Ｓ、Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　０Ｈ）ｌ　、及び フルオレセインで標識したプライマーであるｒＦＡＭＪ　［カリフォルニア州、 フォスター・シティのアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ ｓｙｓＬｅｍｓ、　ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ、　ＣＡ）　ｌを用いて、連鎖終結さ れた（ｃｈａｉｎ−１ｅｒｍｉｎａｔｅｄ）Ｍ１３ｍｐ１８　ＤＮＡ断片を生じ させた。手順の詳細は、他の文献に発表されている（文献２５参照）。簡単に言 えば、約１ピコ・モル（ｐｍｏｌ）のプライマー及び一本鎖ＭＩ３ｍｐ１８ＤＮ Ａを６５℃に３分間加熱した後、放冷する（アニーリング反応）。一方、配列決 定延長混合物（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｍ１ｘｔｕｒｅ） を、遠心管に投入した後、ジデオキシ終結混合物を加えた。アニーリング反応混 合物の温度が、３０℃より低くなった時に、標識混合物及び希釈酵素（Ｓｅｑｕ ｅｎａｓｅ　２．　Ｏ：商標）の組合せを加え、この混合物を室温で５分間保温 した。次いで、この混合物を、終結混合物の入った管に移し、更に３７℃で５分 間装置した。停止溶液を加える代りに、じかにエタノール析出を行なって反応を 終結させ、ＤＮＡ配列決定試料を回収した。終結過程の後にＤＮＡ配列決定試料 中に存在する高濃度の導電イオンは、動電注入法（ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉ ｃ　１ｎｊｅｃｔｉｏｎ）により各細管に充填することのできるＤＮＡの量を減 少させる。この影響に対抗するため、全てのＤＮＡ試料に対してエタノール析出 を行なった後、６μｌの８０％（Ｖ／Ｖ）ポルムアミド中に再艷濁させてスラブ ・ゲルに用いる濃度よりも約１０倍の濃度にした。試料を９０℃で３分間加熱し て確実に変性させた後、試料の注入まで氷上に置いた。

細管カラムの可撓性が、列の個々の細管を個々の試料溜めに接続することを可能 ならしめている。先の例では、唯だ一種類のＤＮＡ配列決定試料を試験したので 、細管に動電注入するのに、試料を単一の５００Ｉｌｌ遠心管に入れた。分離の 間に用いたと同じ電場強度（２００ポルト／ｃｍ）が、試料注入の間にも印加さ れた。典型的な注入時間は、１０秒であった。注入後、細管の入口を、遠心管か ら取り外し、清浄な流れる緩衝液で満たされた緩衝液貯蔵容器又は緩衝液溜め２ ４内に配置した。

９％Ｔゲルは、各細管につき４〜５回の配列決定試験を行なえるほど充分安定し ている。

図５は、ＤＮＡ配列決定断片の混合物の電気泳動の間の４本の細管列のオンライ ン共焦点走査により得られたイメージを示している。水平方向は、列の幾何学的 な配列を表わす物理次元であり、一方、垂直方向は、蛍光ＤＮＡ断片が検知窓を 通過したことを示す時間次元である。レーン対レーンの比較のため、［Ｇｊベー スのＤＮＡ断片の同じ試料を、各細管に同時に動電注入した。経過したデータ取 得時間全体は、プライマーの通過の後約８０分間である。イメージの拡大領域が 、図５に含まれている。４本のレーンの全てにおけるバンドは、良く解像され、 この解像度は、充分な信号対雑音比で配列決定試験を通じて持続して、プライマ ーのほかに５００を越える塩基のバンドを検知する。図５から、円筒状の細管は 、イメージをあまり歪ませないことが明らかに分る。

図６及び図７は、各細管の巾を横切って集積したＤＮＡ信号の線プロットを示し ている。この実験条件で、約２０の信号対雑音比が、３８５番目の塩基（６５分 後）に対して観察され、バンドが、５００番目の塩基に対して検知される。理論 段数は、２４Ｃｍの有効カラム長を通じて（塩基３８５での）１．９ｘｌＯ６よ り大きい。

この検知モードで得られた信号対雑音比と、システムが単一の定置細管の中心に 合焦された場合との間で、比較がなされた。後者のアプローチは、伝統的な単一 の細管からのオン−カラム（ｏｎ−ｃｏｌｕ＋ｎｒ＋）検知と類似している。こ の走査モードに関して補作した感度限界は、空いている細管にｌｘｌｏ−１１Ｍ のフルオレセインを流通させることにより、〜２ｘｌＯ−１２Ｍ（信号対雑音比 ：Ｓ／Ｎ＝３）であることが分った。定置モードの感度限界は、〜１ｘｌＯ−１ ２Ｍであることが分った。これらの感度限界は、従来の９０度の検知形態（文献 ＩＯ参照）を用いた単一の細管から報告された感度限界と、少なくとも同じ程度 には良好である。ゲルを充填した細管によるバックグラウンドは、ＴＨＥ緩衝液 のみを充填した細管によるものよりも〜２．６倍（ｎ＝４）高かった。したがっ て、ゲルの存在が、パックグラウンド・ノイズを〜１．６のファクターだけ増加 させたのである。

この仕事は、細管列電気泳動（ＣＡＢ）のスルーブツト性能全体を非常に高くで きることを示している。この研究において、４本の細管の各々に関し、５００の 塩基に対して満足すべき配列決定情報が得られる。システムの全スループットは 、走査することのできる細管の総数Ｎによる。式、Ｎ−ｖＴ／２Ｄは、Ｎが、走 査速度（Ｖ）、走査反復周期（Ｔ）、及び細管の外径（Ｄ）にどのように依存し ているかを規定している。

例えば、４ｃｍ＋／秒の走査速度及び１秒の走査反復周期を用いると、２００μ ｌ巾の細管が１００本であることが容易に分る。列のサイズを大きくすることは 、（１）走査速度を高めること；（２）より小さい外径の細管の使用；及び（３ ）電気泳動分離の時間的解像度を低下させる走査反復周期を増加させることを要 する。信頼性のあるシステムが最高１０ｃＩＩ／秒までの速度を有しており、１ ５０μｍの外径を有する細管が市販されているので、１秒走査反復周期を仮定し て、細管的３３０本／列の限界を算出することができる。

このシステムを多数の細管に拡張する我々の能力を実証するため、図８に、異な るＤＮＡ配列決定試料を分離するのに用いた２４本の細管の列を示す。

最後に、レーン間で、所定のＤＮＡバンドの泳動時間にかなりの差異があること に留意すべきである。これは、ゲル・マトリックスの不均質又は電場強度の局部 的に不均一な偏差（ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）の存在によって生じ得る。異なるゲ ル・カラムに関して、同じ試料間で泳動時間に５％の偏差があることが、先に概 算されている（文献４参照）。

レーン間のＤＮＡバンドの速度のずれは、里−の蛍光体及び４本（各塩基に対し て１本）の異なる細管を用いた細管副電気泳動によるＤＮＡの配列決定を妨げる ことがある。ＤＮＡの配列決定をするには、四つの塩基全てを単一の細管で配列 決定するよう、本装置を、マルチ・カラー検知システムに発展させなければなら ない。

斯かる４色検知構成は、単一の細管に関して（文献８）、及びスラブ・ゲルに関 して（文献１９）開発されている。基本的者えは、Ｇ、　Ａ、　Ｔ又はＣで終る ４組のＤＮＡ断片を分離することである。各組を、幾つかの手法のうちの任意の 手法により異なる蛍光標識で標識した後、断片の組を、プールして同じ細管で分 離する。蛍光標識が、充分に識別のできる波長領域で発光する場合には、４組の 断片を、４色検知システムを用いて独自に検知することができる。

４色共焦蛍光細管列スキャナーの模式図が、図９に示されている。このスキャナ ーは、アルゴン・レーザー等のレーザー源を含んでおり、レーザー源は、光線３ ０を二色ビーム・スプリッター３１に投光し、ビーム・スプリッターは、光線を 対物レンズ３２に送る。対物レンズは、焦点容積（ｆｏｃａｌ　ｖｏｌｕｌｌｅ ）からの蛍光エネルギーを集め、このエネルギーをビーム・スプリッターを通し て送る。このビーム・スプリッターのアウトプットは、第一のビーム・スプリッ ター３３に送り、第一のビーム・スプリッターは、一つの波長、例えば５４０μ ｍのエネルギーを反射し、より長い他の波長を通過させる。次の二色ビーム・ス プリッター３４は、第二の波長、例えば５６０μｍエネルギーを反射し、より長 い他の波長を通過させる。

第三のビーム・スプリッター３６は、他の波長、例えば５８０μｍエネルギーを 反射し、６１０μ］のエネルギーを通過させる。ビーム・スプリッター３３．３ ４及び３６各々からのエネルギー並びに透過したエネルギーは、空間及び分光フ ィルター３７．３８．３９及び光電子増倍管４１，４２．４３及び４４にかけら れ、光電子増倍管は、処理されてコンピュータ４７に送られる出力信号を発信し 、コンピュータは、各々の細管についての各々の波長に関してイメージを形成す る。次いで、各カラー・イメージは、特定の標識されたＤＮＡ配列決定断片の組 が検知帯域を通過したことを記録する−ある色がＡ断片、第二の色がＣ断片、第 三の色力ｑ断片及び第四の色がＣ断片である。

上記の説明及び図面を通じて、細管列に言及してきた。複数の毛細チューブを備 えた細管列を示し、記述したが、フォトエツチング、細密機械加工、キャスティ ング及び半導体産業で用いられる他の技術によって、材料のブロックに平行な毛 細路を形成することが可能であることが認識さるべきである。よって、本明細書 で用いる細管列は、列になって配置された凡ゆる種類の毛細路を包含することを 意図するものである。

先の説明は、細管列を横切る連続走査に基づいている。ある用途においては、各 細管の中心に順に焦点を合わせ、細管の間をステップするのが望ましいことがあ る。最後に、バンドを走査するため、各細管を横切って走査するが、次の細管に 迅速にステップ又は移動することが可能である。

要するに、共角蛍光スキャナーを用いて細管列の高感度蛍光検知を行なうことが できることが示されたのである。この構成は、（１）多くの検体を並行して試験 することができる：（２）複数の試料の充填（ｌｏａｄｉｎｇ）を容易に行なう ことができる：（３）迅速な分離が達成される；及び（４）検知感度が優れてい るという利点を有している。細管列の使用は、例えばＤＮＡ配列決定における細 管電気泳動（ＣＥ）の有用性を制限している基本的なスルーブツトの問題（文献 ２９）を解決するものである。

加えて、細管副電気泳動は、分析のための分離の規模の大きな最適化の好機をも たらすものである。最良の分離条件を決定するため、各々異なる緩衝液ｐＨ１緩 衝液組成、又は負荷を有する多数の細管を並行して試験することができる。大規 模な試料の並行導入のための多数試料溜め装置に接続する商業的に製造された細 管列を組み立てることもできる。細管副電気泳動は、迅速な並行分離分析のため の価値ある新技術のはずである。装置は、細管副電気泳動に関して説明されきた 。

しかしながら、この装置は、細管クロマトグラフィー、等電点電気泳動、及びカ ラム・デリヴ工−ション（ｃｏｌｕｍ口ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎｓ）等の他の種類 の細管分離に使用できることが理解さるべきである。

本発明の具体的な実施態様の上記の記載は、例示及び説明の目的で掲げられたも のである。それらの記載は、余すところのないものであること又は本発明を開示 されたものと寸分違わぬ態様に限定することを意図するものではなく、上記の教 示に照して、多くの改変及び変更が可能である。実施態様は、本発明の原理及び 本発明の実用的用途を最も良く説明するために選択され、説明されたものであり 、それにより、他の当業者が、本発明及び意図する特定の用途に適するよう種々 の変更が施された種々の実施態様を用いることができるようにするものである。

本発明の範囲は、本明細書に添付の請求の範囲及びその均等態様により規定され ることを意図するものである。

’　Ｋｕｈｒ、　Ｗ、Ｇ、；　Ａｎａｌ、Ｃｈｅｍ、　１９９０．６２．４０５ Ｒ−４１４Ｒ”　Ｃｈａｎｇ、　Ｙ、Ｆ、；　Ｄｏｖｉｃｈｉ、　Ｎ、：ｆ、； 　Ｅ；ｃｉｅｎｃｅ＊　１９Ｔ３Ｂ、　２４２５６２−５６４”　Ｓｍ１ｔｈ、 Ｌ、Ｍ、；　Ｎａｔｕｒｅ　１９９１．　３４９．　８１２−８１３ＦＩＧ、− ４Ａ ＦＩＧ、−４Ｂ ＦＩＧ、−５ ＦＩＧ、−８ 手続補正書 平成　年　月　日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．複数の隣接する毛細路から輻射線の励起及び検知を行なうためのスキャナー であって、 平面に配置された複数の並んだ毛細路と、第一の波長の輻射エネルギー源と、 前記輻射エネルギーを受け、前記毛細路の平面の励起容積に焦点を合わせるため の対物レンズと、 前記励起容積が、順に反復的に前記毛細路のうちの一つの内にあって、前記毛細 路内の材料を励起し、材料に異なる波長のエネルギーを放射させるよう、前記毛 細路を移動させるための手段と、前記放射された輻射線を受け、信号を発生させ るための検知システムと、各々の前記毛細路内の励起容積にある材料を表わす出 力をもたらすため、前記信号を受信し、処理をするコンピュータ手段とを、備え 、 前記対物レンズは、前記輻射エネルギーを集め、この輻射エネルギーを、前記異 なる波長の放射された輻射エネルギーを透過させ、他の波長の輻射線を透過させ ないための共焦空間及び分光フィルター手段を含む光学システムに送る役割をす る、 ことを特徴とするスキャナー。 ２．前記毛細路を移動させるための前記手段は、前記コンピュータによって制御 され、それにより、出力を毛細路と相関させることができることを特徴とする請 求項１記載のスキャナー。 ３．毛細路を移動させるための手段は、連続的に移動し、それにより、各前記毛 細管におけるバンドを走査することを特徴とする請求項１記載のスキャナー。 ４．前記毛細路を移動させるための前記手段は、毛細路を前記励起容積にステッ プさせることを特徴とする請求項１記載のスキャナー。 ５．毛管路は、細長い円筒状の細管の部分であることを特徴とする請求項２記載 のスキャナー。 ６．合焦した輻射エネルギーに晒すため、前記細管の領域を同一平面に並んだ関 係に保持するための手段を含んでいることを特徴とする請求項５記載のスキャナ ー。 ７．前記細管の端は、個々に取り扱い及び負荷できるよう分離可能であることを 特徴とする請求項６記載のスキャナー。 ８．前記励起輻射エネルギーは、複数の波長で輻射エネルギーを放射する材料を 励起し、前記光学システムは、異なる波長の放射された輻射エネルギーを異なる 位置に選択的に送るための複数の共焦空間及び分光フィルター手段と、各々選択 された波長の放射されたエネルギーを受け、対応する出力信号を提供する複数の 検知手段とを含んでいることを特徴とする請求項１記載のスキャナー。 ９．毛細路内の試料から輻射線の励起及び検知を行なうための装置であって、同 一平面に並んだ関係にある複数の毛細路を提供する手段と、第一の波長の輻射線 で前記毛細路内の試料を励起するための輻射手段と、各毛細路内の試料を前記輻 射線で順に、反復的に励起するため、前記同一平面に並んだ複数の毛細路を移動 させるための手段と、前記試料から放射された輻射線を集めるための手段と、前 記励起輻射線に応じて前記毛細路内の試料によって放射された輻射線を検知する ための手段と、 検知された放射された輻射線を処理するため、及び前記移動手段の運動を制御し て前記毛細路内の試料を表わす二次元の出力を時間と位置の関数として提供する ためのコンピュータ手段とを、 備えていることを特徴とする装置。 １０．前記毛管路は、細長い円筒状の細管の部分であることを特徴とする請求項 ９記載のスキャナー。 Ｈ．合焦した輻射エネルギーに晒すため、前記細管の領域を同一平面に並んだ関 係に保持するための手段を含んでいることを特徴とする請求項１０記載のスキャ ナー。 １２．前記細管の端は、独立に取り扱い可能であることを特徴とする請求項９記 載のスキャナー。 １３．小さな直径の細管内で分離することのできる蛍光標識した検体を検知する ためのスキャナーであって、 各々蛍光標識した検体を分離するための複数の細管と、前記標識した検体から蛍 光を励起する波長を有する輻射エネルギーのエネルギー源と、 前記輻射エネルギーを小さな容積に合焦するため、及び前記容積から放射された エネルギーを集めるためのレンズ手段と、前記複数の細管の領域を順に、反復的 に前記容積の輻射エネルギーに晒し、それにより、前記容積において蛍光標識さ れた検体の蛍光を生じさせるための手段と、 集められた蛍光輻射線を受け、前記容積にある検体を表わす出力をもたらすため の手段とを、備えていることを特徴とするスキャナー。 １４．前記レンズ手段は、空間フィルターを含む共焦光学検知アセンブリの一部 をなす対物レンズを備えていることを特徴とする請求項１３記載のスキャナー。 １５．前記光学検知システムは、前記励起波長のエネルギーを排除するための空 間フィルターを含んでいることを特徴とする請求項１４記載のスキャナー。 １６．複数の細管内で電気泳動により分離されたＤＮＡ配置決定断片からの蛍光 を検知する方法であって、前記複数の細管の領域を、同一平面で並んだ関係に配 置することと、 前記細管における所定の容積を順に、反復的に、対物レンズによって所定の容積 に合焦された所定波長の光エネルギーで励起し、断片を異なる波長で蛍光発光さ せることと、 前記細管各々における前記所定の容積から蛍光放射された光を、前記対物レンズ で集めることと、 前記所定波長の光を排除し、前記放射光を通過させるため、異なる波長の前記蛍 光放射された光エネルギーを分光的及び空間的にろ過することと、前記細管各々 内の前記断片からの蛍光を表わす出力信号を発生させるため、ろ過した放射光を 検知装置に供すること、を含むことを特徴とする方法。 １７．細管の一端が、配列決定断片を細管の端内に速やかに並行して負荷するこ とができるよう、分れていることを特徴とする請求項１６記載の方法。 １８．複数の隣接する毛細路から輻射線の励起及び検知を行なうためのスキャナ ーであって、平面に配置された複数の並んだ毛細路と、第一の波長の輻射エネル ギー源と、 前記輻射エネルギーを受け、前記毛細路の平面の励起容積に焦点を合わせるため の対物レンズと、 前記波長のエネルギーで前記励起容積を励起するため、前記輻射エネルギーを対 物レンズに送るためのビーム・スプリッターと、前記励起容積が、順に反復的に 前記毛細路のうちの一つの内にあって、前記毛細路内の材料を励起し、材料に異 なる波長のエネルギーを放射させるよう、前記毛細路を移動させるための手段と 、前記放射された輻射線を受け、信号を発生させるための検知システムと、 各々の前記毛細路内の励起容積にある材料を表わす出力をもたらすため、前記信 号を受信し、処理をするコンピュータ手段とを、備え、 前記対物レンズは、前記輻射エネルギーを集め、この輻射エネルギーを、前記異 なる波長の輻射エネルギーを通過させるビーム・スプリッターを通じて、前記異 なる波長の放射された輻射エネルギーを透過させ、他の波長の輻射線を透過させ ないための共焦空間及び分光フィルターを含む光学システムに送る役割をする、 ことを特徴とするスキャナー。 １９．前記毛細路を移動させるための前記手段は、前記コンピュータによって制 御され、それにより、出力を毛細路と相関させることができることを特徴とする 請求項１８記載のスキャナー。 ２０．毛細路を移動させるための前記手段は、連続的に移動し、それにより、各 前記毛細管におけるバンドを走査することを特徴とする請求項１９記載のスキャ ナー。 ２１．前記毛細路を移動させるための前記手段は、毛細路を前記励起容積にステ ップさせることを特徴とする請求項１８記載のスキャナー。 ２２．毛管路は、細長い円周状の細管の部分であることを特徴とする請求項１９ 記載のスキャナー。 ２３．合焦した輻射エネルギーに晒すため、前記細管の領域を同一平面に並んだ 関係に保持するための手段を含んでいることを特徴とする請求項２２記載のスキ ャナー。 ２４．前記細管の端は、個々に取り扱い及び負荷できるよう分離可能であること を特徴とする請求項２３記載のスキャナー。 ２５．前記励起輻射エネルギーは、複数の波長で輻射エネルギーを放射する材料 を励起し、前記光学システムは、複数の追加のビーム・スプリッター、異なる波 長の放射された輻射エネルギーを異なる位置に選択的に送るための共焦空間及び 分光フィルター手段、及び各々選択された波長の放射されたエネルギーを受け、 対応する出力信号を提供する複数の検知手段を含んでいることを特徴とする請求 項１８記載のスキャナー。 ２６．複数の細管内で電気泳動により分離されたＤＮＡ配置決定断片からの蛍光 を検知する方法であって、前記複数の細管の領域を、同一平面で並んだ関係に配 置することと、 前記細管における所定の容積を順に、反復的に、対物レンズによって所定の容積 に合焦された所定波長の光エネルギーで励起し、断片を異なる波長で蛍光発光さ せることと、 前記細管各々における前記所定の容積から蛍光放射された光を、前記対物レンズ で集めることと、 前記所定波長の光及び散乱光を排除し、前記放射光を通過させるため、異なる波 長の前記蛍光放射された光エネルギーを分光的及び共焦的空間的にろ過すること と、 前記細管各々内の前記断片からの蛍光を表わす出力信号を発生させるため、ろ過 した放射光を検知装置に供すること、を含むことを特徴とする方法。 ２７．細管の一端が、配列決定断片を細管の端内に速やかに並行して負荷するこ とができるよう、分れていることを特徴とする請求項２６記載の方法。 ２８．前記断片は、複数の波長で蛍光を発し、前記複数の波長の各々で前記蛍光 放射された光エネルギーを分光的及び共焦的空間的にろ過し、これを対応する検 知要素に供することを特徴とする請求項２６記載の方法。