JPH07506111A - 造影用のテクネチウム−９９ｍ標識ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 造影用のテクネチウム−９９ｍ標識ペプチド本発明は、放射線診断試薬およびペ プチド、ならびに標識した放射線診断剤に関する。特に、本発明はペプチド、か かるペプチドの製法およびかかるペプチド製造用のキット、ならびにテクネチウ ム−９９ｍ　（Ｔｃ−９９ｍ）とで中性鏡体を形成する放射性同位体標識結合部 位を介してＴｃ−９９ｍで標識した哺乳動物体内の部位を撮像するためのかかる ペプチドの使用方法に関する。

２　先行技術の記載 核医学の分野において、ある種の病理学的疾患は局在しているか、あるいはその 程度は、少量の体内投与した（放射性トレーサーまたは放射性医薬と呼ばれる） 放射性同位体標識トレーサー化合物の分布を検出することによって評価される。

これらの放射性医薬の検出方法は、一般に、撮像法または放射線撮像法として知 られている。

放射線撮像法において、放射性同位体標識はガンマ線を放出する放射性核種であ り、放射性トレーサーは、ガンマ線検出カメラを用いて位置が定められる（この プロセスは、しばしば、ガンマンンチグラフィーという）。放射性トレーサーは 病理部位に局在するか（陽性コントラストという）、または、放射性トレーサー はかかる病理部位に特異的に局在しないように選択される（陰性コントラスト） ので、造影部位は検出可能である。

ヒトにおける最適放射線造影には多数の因子を考慮しなければならない。検出の 効率を最大化するためには、１００ないし２００ｋｅＶの範囲でガンマエネルギ ーを放出する放射性核種が好ましい。患者に吸収される放射線の線量を最小化す るためには、放射性核種の物理的半減期は造影手法が許す限り短いものであるべ きである。いつ何時にも調査を行うのを可能とするためには、臨床部位で常に利 用可能な放射性核種源を有するのが有利である。

”Ｇａ、””Ｔｃ　（Ｔｃ−９９ｍ）　、”’Ｉｎ、”月＼Ｉｌｌ、Ｉ＠ＩＹｂ または”’Ｒｅを含めた種々の放射性核種が放射線造影に有用であることが知ら れている。Ｔｃ−９９ｍは１４０ｋｅＶでガンマ線を放出し、６時間の物理的半 減期を有し、かつモリブデン−９９／テクネチウム−９９ｍ発生器を用いて容易 にオン−サイト利用が可能であるので、好ましい放射性核種である。

放射性同位体標識ペプチドを用いる撮像法の感度は、当該分野で公知の他の放射 性医薬よりもかなり高い。というのは、放射性ペプチドの特異的結合は、注目す る領域にわたって放射性シグナルを濃縮するからである。注目する標的に特異的 に結合する小さな合成ペプチドが放射性トレーサーのベースとして有利に使用さ れ得る。これは、１．それらは、（細菌または哺乳動物細胞のごとき生物学的系 における生産、または蛋白の断片のごとき生物学的に得られた物質からのその単 離が要求されるのとは反対に）化学的に合成できること；２　それらは小さく、 よって、非標的結合放射性トレーサーは身体から迅速に排出され、それにより、 バンクグラウンド（非標的）放射性を減少させ、標的を良好に明確化すること； および３　小さいペプチドは容易に化学的に操作して、特定の結合部位へのその 親和性を最適化できるためである。

ルーチン的に使用する放射性医薬としては、小さく容易に合成される標識化ペプ チド分子が好ましい。明らかに、患者に容易に直接注射でき、病理部位に局在す ることによって該部位を撮像できる小さい合成標識化ペプチドに対して要求が存 在する。Ｔｃ−９９ｍ標識した小さい合成ペプチドは、撮像用の放射性核種とし てのＴｃ−９９ｍの特性および放射性トレーサー分子としての特異的に結合する 小さな合成ペプチドの有用性のため、ガンマノンチグラフィー用の放射性トレー サーとして明らかな利点を供する。

放射性同位体標識ペプチドは先行技術で報告されている。

ニゲ（Ｅｇｅ）らの米国特許第４，８３２．９４０号は、局在したＴ−リンパ球 を撮像するための放射性同位体標識ペプチドを教示している。

オレキサ（Ｑｌｅｘａ）らの１９８２年の欧州特許出願第８２３０１７００９号 は、架橋フィブリンから単離した断片Ｅ１１架橋フィブリンから単離した断片Ｅ 、および断片Ｅ１およびＥ、の間のアミノ酸配列を有するペプチドから選択され た医薬上許容される放射性同位体標識ペプチドを開示している。

ランビイ（Ｒａｎｂｙ）らの１９８８年のＰＣＴ／ＵＳ８８１０２２７６は、放 射性同位体標識化合物をフィブリンに共有結合させることよりなる動物において フィブリン沈積を検出する方法を開示している。

ハトレイ（Ｈａｄｌｅｙ）らの１９８８年のＰＣＴ／ＵＳ８８１０３３１８は、 （ａ）標識した減弱化血栓溶解性蛋白を患者に投与し、ここに、該標識はフィブ リン結合ドメイン以外の血栓溶解性蛋白の部分に選択的に付着し１次いで、（ｂ ）該標識化血栓溶解性蛋白の分布パターンを患者において検出する工程よりなる フィブリン−血小板血餅をｉｎ　ｖｉｖｏで検出する方法を開示している。

レーダ（Ｌｅｅｓ）らの１９８９年のＰＣＴ／ＵＳ８９１０１８５４は、動脈撮 像用の放射性同位体標識ペプチドを教示している。

ソベル（Ｓｏｂｅｌ）らの１９８９年のＰＣＴ／ＵＳ　８９１０２６５６は放射 性同位体標識した酵素的に不活性な組織プラスミノーケンアクチベーターを用い て、動物において１またはそれを超える血栓の位置決めを行う方法を開示してい る。

スタットル（Ｓｔｕｔｔｌｅ）の１９９０年のＰＣＴ／ＧＢ９０１００９３３は 、１ｎｖｉｖｏにて、アルギニンーグリシンーアスパラギン酸（ＲＧＤ）結合部 位に結合でき、配列ＲＧＤよりなる３ないし１０個のアミノ酸を含有する放射性 同位体標識ペプチドを開示している。

マラガノル（Ｉｌａｒａｇａｎｏｒｅ）らの１９９１年のＰＣＴ／ＵＳ９０１０ ４６４２は、（ａ）阻害部位；　（ｂ）リンカ一部位、および（Ｃ）アニオン結 合部位からなる放射性同位体標識血栓阻害剤を開示している。

ｏ−）ドウエル（Ｒｏｄｗｅｌｌ）らの１９９１年のＰＣＴ／ＵＳ９１１０３１ １６は、「分子認識ユニットと「エフェクタードメイン」との複合体を開示して いる。

トウビス（Ｔｕｂｉｓ）らの１９６８年のインターナショナル・ジャーナル・オ ン・アプライド・レイディエーノヨン・アンド・アイソトープス（Ｉｎｔ、Ｊ、 　Ａｐｐｌ、　ＲａｄＩｓｏｔ、）１９：８３５　８４０は、テクネチウム−９ ９ｍでのペプチドの標識を記載している。

サンドルハーケン（Ｓｕｎｄｒｅｈａｇｅｎ）の１９８３年のインターナショナ ル・ジャーナル・オン・アプライド・レイディエーンヨン・アンド・アイソトー プス（Ｉｎｔ。

Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｒａｄ、　ｌ５ｏｔ、）３４　：１００３は、テクネチウム −９９ｍでのポリペプチドの標識を記載している。

放射性同位体標識ポリペプチドのためのキレート剤の使用、およびＴｃ−９９ｍ でのペプチドおよびポリペプチドの標識法は従来技術で公知であり、ここに引用 して明細書の一部とする同時係属する米国特許出願０７／６５３０１２および０ ７／８０７０６２に開示されている。

放射性同位体造影に最適であるにも拘わらず、Ｔｃ−９９ｍの化学は他の元素の 化学はど徹底的には研究されておらず、この理由で、テクネチウムでの放射性同 位体標識の方法は豊富ではない。Ｔｃ−９９ｍは、通常、モリブデン−９９／テ クネチウム−９９ｍ発生器から、Ｔｃ−９９ｍ過テクネチウム酸塩（Ｔ　ｃ　Ｏ ４−；テクネチウムは＋７の酸化状態）として得られる。しかしながら、過テク ネチウム酸塩は池の化合物に十分には結合しない。従って、ペプチドを放射性同 位体造影するには、Ｔｃ−９９ｍ過テクネチウム酸塩は池の形態に変換されなけ ればならない。テクネチウムは水性溶液中では安定なイオンを形成しないので、 分解を妨げるのに十分な動力学的かつ熱力学的安定性を有し、その結果、不溶性 の二酸化テクネチウムに変換されたり、あるいは過テクネチウム酸塩に戻る配位 錯体の形態でかかる溶液中に保持されなければならない。

Ｔｃ−９９ｍのかかる配位錯体（＋１ないし＋６の酸化状態）は公知である。し かしながら、これらの錯体の多くは、配位錯体の分子幾何のため、放射性同位体 標識には不適当である。放射性同位体標識の目的には、該配位錯体が、テクネチ ウムイオンを囲むすべてのドナー基が単一のキレート配位子によって供給される キレートとして形成されるのが特に有利である。これは、キレート化Ｔｃ−９９ ｍが、キレート剤とペプチドとの間の単一のリンカ−を介してペプチドに共有結 合するのを可能とする。

これらの配位子は、時々、キレート部位と結合部位を有する二官能性キレート剤 という。かかる化合物は先行技術において知られている。

ビルネ（Ｂｙｒｎｅ）らの米国特許第４４３４１５１号は造影すべき器官または 組織に位置できる末端アミン含有化合物に放射性核種をカップリングさせること ができるホモシスティンチオラクトン由来の二官能性キード剤を記載している。

フリッツベルグ（Ｆｒｉｔｚｂｅｒｇ）の米国特許第４４４４６９０号は、２． ３−ビス（メルカプトアセトアミド）プロパノエートをベースとする一連のテク ネチウムキレート剤を記載している。

ビルネ（Ｂｙｒｎｅ）らの米国特許第４５７１４３０号は、造影すべき器官また は組織に位置できる末端アミン含有化合物に放射性核種をカップリングさせるこ とができる放射性核種用の新規なホモシスティンチオラクトン三官能性キレート 剤を記載している。

ビルネ（Ｂｙｒｎｅ）らの米国特許第４５７５５５６号は、造影すべき器官また は組織に位置できる末端アミノ含有化合物に放射性核種をカップリングさせるこ とができる放射性核種キレート化用の新規なホモシスティンチオラクトン三官能 性キレート剤を記載している。

デイビソン（Ｄａｖｉｓｏｎ）らの米国特許第４６７３５６２号は、第一義的に は腎臓の機能をモニターする薬剤として使用される、ビスアミド−ビスチオ−配 位子およびその塩のテクネチウムをキレート化する錯体を記載している。

ニコロッティ（Ｎｉｃｏｌｏｔｔｉ）らの米国特許第４８６１８６９号は、抗体 のごとき生物学的分子と複合体を形成するのに有用な二官能性カップリング剤を 記載している。

フリッツベルグ（Ｆｒｉｔｚｂｅｒｇ）らの米国特許第４９６５３９２号は、蛋 白を標識するための種々のＳ−保護メルカブトアセチルグリンルグリシンをベー スとしたキレート剤を記載している。

フリッツベルグ（Ｆｒｉｔｚｂｅｒｇ）らの欧州特許出願第８６１００３６０． ６号は、テクネチウム標識造影剤を作成するのに有用なジチオール、ジアミノ、 またはジアミドカルボン酸あるいはアミン錯体を記載している。

ディー　ン（Ｄｅａｎ）らの１９８９年のＰＣＴ／ＵＳ８９１０２６３４号は蛋 白およびペプチドを放射性同位体標識するための二官能性カップリング剤を記載 している。

フラナガン（Ｆｌａｎａｇａｎ）らの欧州特許出願９０３０６４２８．５号は一 組の有機キレート分子を介する合成ペプチド断片のＴｃ−９９ｍ標識を開示して いる。

アルベート（Ａｌｂｅｒｔ）らの欧州特許出願Ｗ０９１１０１１４４号は、成長 因子、ホルモン、インターフェロンおよびサイトカインに関連し、放射性核種を キレート化する基に共有結合した特異的認識ペプチドからなる放射性同位体標識 ペプチドを用いる放射性同位体造影を開示している。

ディージ（Ｄｅａｎ）の同時係属米国特許出願０７／６５３０１２号は、ｉｎ　 ｖｉｖｏにての放射性同位体造影のための特異的結合ペプチドに共有結合したＴ ｃ−９９ｍキレート化基からなるペプチドの試薬およびその製法を教示しており 、引用して本明細書の一部とする。

（これらの手法のすべては＋５の酸化状態のテクネチウムのアニオン錯体を形成 することが予測されることに注意されたい。）パイトウーおよびレバー（Ｂａｉ ｄｏｏ　＆　Ｌｅｖｅｒ）の１９９０年のパイコンジュゲート・ケミストリー（ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｃｈｅｗ、　）工：１３２−１３７は、カチオンテ クネチウム錯体を与えるビスアミンビスチオール基を用いる生体分子の標識方法 を記載している。

ンスティンまたはメルカプト酢酸のごときチオール含有部位を添加するだけでペ プチドを放射性同位体標識することが可能である。かかる手法は先行技術で記載 されている。

ンヨンヤット（Ｓｃｈｏｃｈａｔ）らの米国特許第５０６１６４１号は、少なく とも１つの「ペンダント」スルフヒドリル基から構成される蛋白の直接的放射性 標識化を開示している。

ディージ（Ｄｅａｎ）らの同時係属米国特許出願０７／８０７０６２号は、遊離 チオールを含有する付着基を介するペプチドの放射性同位体標識を教示しており 、引用して本明細書の一部とする。

ゲーデ？ンス（Ｇｏｅｄｅｍａｎｓ）らのＰＣＴ出願ＷＯ３９１０７４５６号は 、環状チオール化合物、特に２−イミノチオランおよび誘導体を用いる蛋白の放 射性同位体標識を記載している。

ソルンバソク（Ｔｈｒｏｎｂａｃｋ）らのＥＰＣ出願９０４０２２０６．８号は 、チオール含有化合物、特に２−イミノチオランを用いる放射性同位体標識蛋白 もしくはペプチドの製法および使用を記載している。

スタットル（Ｓｔｕｔｔｌｅ）のＰＣＴ出願Ｗ０９０／１５８１８号は、ＲＧＤ 含有オリゴペプチドのＴｃ−９９ｍ標識を記載している。

再度、これらのすべての場合において、予測されるＴｃ−９９ｍ標識種はアニオ ン錯体であることに注意されたい。

ある種のペプチドのその標的体への結合は、当該ペプチドの電荷修飾に感受性で ある。かくして、ある場合には、荷電Ｔｃ−９９ｍ錯体を形成するであろうキレ ート剤を介してＴｃ−９９ｍでペプチドを放射性同位体標識するのは不利である 。ある場合には、電気的に中性または非荷電のＴｃ−９９ｍ錯体を形成するキレ ート剤を使用するのは有利である。

本発明は、Ｔｃ−９９ｍ標識ペプチドを調製するのに使用できるＴｃ−９９ｍ用 のキレート剤を提供するものであり、該Ｔｃ−９９ｍは中性のキレート錯体とし て保持される。

中性Ｔｃ−９９ｍ錯体を形成すると言われるいくつかのキレート剤は先行技術に 記載されている。

バーンズ（Ｂｕｒｎｓ）らの１９８５年の欧州特許出願８５１０４９５９．３号 は、小さな中性Ｔｃ−９９ｍ脳造影剤を作成するためのビスアミンビスチオール 化合物を記載している。

クング（Ｋｕｎｇ）らの１９８６年の欧州特許出願８６１０５９２０．２号は、 小さな中性Ｔｃ−９９ｍ造影剤を作成するためのビスアミンゴスチオール化合物 を記載している。

ベルゲスティン（Ｂｅｒｇｓｔｅｉｎ）らの１９８８年の欧州特許出願８８１０ ２２５２゜９号は、小さな中性Ｔｃ−９９ｍ脳造影剤を作成するためのビスアミ ンビスチオール化合物を記載している。

グリシン（Ｂｒｙｓｏｎ）らの１９８８年のインオーガニック・ケミストリー（ Ｉｎｏｒｇ。

Ｃｈｅｍ、）２７　：　２１５４−２１６１は、過剰配位子に対して不安定なテ クネチウム−９９の中性錯体を記載している。

ミズラ（Ｍｉｓｒａ）らの１９８９年のテトラヘドロン・レターズ（Ｔｅｔ、　 Ｌｅｔ、）３　Ｑ　：１８８５−１８８８は、放射性同位体標識を目的とするビ スアミンビスチオール化合物を記載している。

グリシン（Ｂｒｙｓｏｎ）らの１９９０年のインオーガニック・ケミストリー（ Ｉｎｏｒｇ。

ＣｈｅＩｏ、　）λ９：２９４８−２９５１は中性Ｔｃ−９９錯体を形成できる ２つのアミド基、チオール基および置換ピリジンを含有するキレート剤を記載し ている。

ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）らの１９９０年のジャーナル・オン・ヌクレアー・メ デイノン（Ｊ、　Ｎｕｃｌ、Ｍｅｄ、）旦１：８８５（アブストラクト）は脳造 影用の中性Ｔｃ−９９ｍ銘体を記載している。

図面の簡単な記載 図１は、スダン■で染色した高コレステロール血症のおよび正常のウサギ・大動 脈を示す。

図２は、Ｐ２１５でｉｎ　ｖｉｖｏにて２．５時間撮像した高コレステロール血 症のおよび正常のウサギ・大動脈を示す。

図３は、Ｐ２１５でｅＸ　Ｃ０ｒｐＯｒａにて２．５時間撮像した高コレステロ ール血症のおよび正常のウサギ・大動脈を示す。

図４はＴｃ−９９ｍ標識標識５７でイヌ脚をｉｎ　ｖｉｖｏで撮像した血栓を示 す。

本発明は、放射性同位体標識ペプチドであるンンチグラフイー造影剤を提供する 。本発明の放射性同位体標識ペプチドは、標的にｉｎ　ｖｉｖｏにて特異的に結 合し、カリ放射性同位体標識結合部位に共有結合したペプチドからなり、ここに 該部位は放射性同位体に結合する。本発明においては、放射性同位体標識結合部 位と放射性同位体標識との錯体が電気的に中性であり、それにより共有結合した 放射性同位体標識錯体と特異的結合ペプチドの特異的結合特性との干渉を回避す る点が特別の利点である。

本発明の第１の態様において、哺乳動物体内の部位を造影できる放射性同位体標 識ペプチドが提供される。該ペプチドはアミノ酸配列を有する特異的結合ペプチ ドおよび該ペプチドに共有結合した放射性同位体標識結合部位からなる。さらに 、放射性同位体標識結合部位と放射性同位体標識との錯体は電気的に中性である 。好ましい具体例において、該ペプチドはアミノ酸、最も好ましくはグリシンを 介して該放射性同位体標識結合部位に共有結合している。もう１つの具体例にお いて、該放射性同位体標識はテクネチウム−９９ｍである。

第２の具体例において、本発明は、特異的結合ペプチドおよび式［本発明目的で は、この構造を有する放射性同位体標識結合部位はピコリン酸（Ｐ　ｉ　ｃ）ベ ース部位という］ または ［本発明目的では、この構造を有する放射性同位体標識結合部位はピコリルアミ ン（Ｐｉｃａ）ベース部位という」 ［式中、ＸはＨまたは保護基、（アミノ酸）はいずれかのアミノ酸、該放射性同 位体標識結合部位は当該ペプチドに共有結合しており、また該放射性結合部位と 該放射性同位体標識との錯体は電気的に中性である］で示される放射性同位体標 識結合部位からなる、哺乳動物体内の部位を造影するための放射性同位体標識ペ プチドを提供する。好ましい具体例において、該アミノ酸はグリシンであってＸ はアセトアミドメチル保護基である。さらなる好ましい具体例において、該ペプ チドはアミノ酸、最も好ましくはグリシンを介して該放射性同位体標識結合部位 に共有結合しており、また該放射性同位体標識はテクネチウム−９９ｍである。

なおさらにもう１つの本発明の具体例において、特異的結合ペプチドおよび該ペ プチドに共有結合したビスアミノヒスチオール放射性同位体標識結合部位からな る哺乳動物体内の部位を造影するための放射性同位体標識ペプチドが提供される 。本発明の−の具体例におけるビスアミノビスチオール放射性同位体標識結合部 位は、 ［式中、各Ｒは、独立して、トＬＣＨ３またはＣ２Ｈ５となり得、各（ｐｇｐ） ’は、独立して、チオール保護基またはＨであり得：ｍ、ｎおよびｐは、独立し て、２または３０．へは線状もしくは環状低級アルキル、アリール、複素環、そ れらの組合せまたは置換誘導体、およびＸはペプチドを登味するコ［式中、各Ｒ は、独立して、Ｈ，ＣＨ３またはＣ，Ｈ，；ｍ、ｎおよびｐは、独立して、２ま たは３、Ａは線状もしくは環状低級アルキル、アリール、複素環、それらの組合 せまたは置換誘導体：ＶはＩ］またはｃｏ−ペプチド；Ｒｏ　はＨまたはペプチ ド、但し、ＶがＨである場合、Ｒｏ　はペプチドであって、ＲｏがＨである場合 、■はペプチドである］　［本発明目的では、これらの構造を有する放射性同位 体標識結合部位をｒＢＡＴＪ部位という］よりなる群から選択される式を有する 。好ましい具体例において、該ペプチドはアミノ酸、最も好ましくはグリシンを 介して放射性同位体標識結合部位に共有結合しており、該放射性同位体標識はテ クネチウム−９９ｍである。

本発明の前記態様の好ましい具体例において、特異的結合化合物は３および１０ ０個の間のアミノ酸からなる。放射性同位体標識の最も好ましい具体例はテクネ チウム−９９ｍである。

本発明によって提供される特異的結合ペプチドは以下の配列ＬＲＡＬＶＤＴＬＫ ７Ｘド ＧＧＧＬＲＡＬＶＤＴＬＫ７＝　ド ＧＣＧＯＧＬＲＡＬＶＤＴＬＫｙ＝Ｆ を有するペプチドを包含するが、それらに限定されるものではない。

特異的結合化合物または放射性同位体標識結合部位が多価結合部位に共有結合し ている本発明の試薬を形成し得る。本発明の多価結合部位は、特異的結合化合物 または放射性同位体結合部位に共有結合できる少な（とも２個の同一のリンカ− 官能基からなる。好ましいリンカ−官能基は、第一級もしくは第二級アミン、ヒ ドロキシル基、カルボン酸基またはチオール−反応性基である。好ましい具体例 において、多価結合部位はビススクシンイミジルメチルエーテル（ＢＳＭＥ）、 ４−（２，２−ジメチルアセチル）安息香酸（ＤＭＡＲ）　、）リス（スクシン イミノルエチル）アミン（ＴＳＥＡ）およびＮ−［２−（Ｎ’　、Ｎｏ　−ビス （２−スフノンイミドエチル）アミノエチル］　−ＮｊＮ６−ビス（２−メチル −２−メルカプトプロピル）　−６，９−７アザノナンアミド（ＢＡＴ−ＢＳ） からなる。

また、本発明は、本発明のペプチドとＴｃ−９９ｍとの錯体、およびＴｃ−９９ ｍで本発明のペプチドを放射性同位体標識する方法からなる。本発明によって提 供される放射性同位体標識錯体は、還元剤の存在下で本発明のペプチドをＴｃ− ９９ｍと反応させることによって形成される。好ましい還元剤は亜ニチオン酸イ オン、第一スズイオン、および第一鉄イオンを包含するが、それらに限定される ものではない。また、本発明の錯体は、本明細書に記載するごと（、予め還元さ れたＴｃ−９９ｍ錯体の配位子交換によって、本発明のペプチドをＴｃ−９９ｍ で標識することによっても形成され得る。

また、本発明１ｔ、Ｔｃ−９９ｍで放射性同位体標識した本発明のペプチドを製 造用するためのキットを提供する。本発明のペプチドをＴｃ−９９ｍで放射性同 位体標識するためのキットは、所定量の本発明のペプチドおよびＴｃ−９９ｍで ペプチドを標識するのに十分な量の還元剤からなる。

本発明は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ化学合成によって本発明のペプチドを調製する方法 を提供する。好ましい具体例において、ペプチドは固相ペプチド合成法によって 合成される。

本発明は、ｉｎ　ｖｉｖｏガンマンンチグラフィー画像を得ることによって、哺 乳動物体内の部位を造影することへのＴｃ−９９ｍ標識ペプチドの使用方法を提 供する。これらの方法は、診断有効量の本発明のＴｃ−９９ｍ放射性同位体標識 ペプチドを投与し、次いで、哺乳動物体内の部位に位置するＴｃ−９９ｍによっ て放出されるガンマ線を検出することからなる。

放射性同位体とで電気的中性錯体を形成する放射性同位体標識結合部位よりなる 組成物もまた本発明によって提供される。好ましい具体例において、該放射性同 位体はＴｃ−９９ｍである。さらに、好ましい具体例は、ビスアミン、ビスチオ ール誘導体ならびにピコリン酸およびピコニルアミン誘導体を包含する。

本発明の特別の好ましい具体例は、ある好ましい具体例および請求の範囲の以下 の詳細な記載によって明らかになるであろう。

発明の詳細な記載 本発明は、放射性同位体標識結合部位に共有結合したアミノ酸配列よりなり、該 放射性同位体標識結合部位が放射性同位体と結合し、電気的に中性の錯体を形成 することを特徴とする哺乳動物体内の標的部位を造影するためのＴｃ−９９ｍ標 識ペプチドを提供する。

放射性同位体の核および放射性活性特性はそれを理想的なシンチグラフィー造影 剤とするので、Ｔｃ−９９ｍでの標識は本発明の利点である。この放射性同位体 は１４０ｋｅＶの単一のフォトンエネルギーおよび約６時間の放射能半減期を有 し、ｅ　９　Ｍｏ　−９Ｑ　″Ｔｃ発生器から容易に得られる。先行技術で知ら れている他の放射性核種は、かなり長い（例えば、６７．４時間の半減期を有す るＩｌｌ　ｌ　ｎ）有効半減期を有するか、あるいは毒性（例えば　１２８１） である。

本発明によって提供される、放射性同位体標識結合部位ならびにチオール保護基 ［（ｐｇｐ）’］に共有結合したチオールを含有するかかる部位に共有結合した ペプチドにおいて、該チオール保護基は、同一または異なり、−ＣＨ２−アリー ル（アリールはフェニルまたはアルキルもしくはアルキルオキシ置換フェニル） 。

−ＣＨ２−（アリール）２（アリールはフェニルまたはアルキルもしくはアルキ ルオキシ置換フェニル）。

−Ｃ−（アリール）３（アリールはフェニルまたはアルキルもしくはアルキルオ キシ置換フェニル）。

−ＣＨ＊　（４−メトキンフェニル）。

−ＣＨ−（４−ビリノル）（フェニル）２、−Ｃ（ＣＨｓ）　５ −９−フェニルフルオレニル。

ＣＨ！　Ｎ　ＨＣＯＲ（Ｒは非置換もしくは置換アルキルもしくはアリール）ニ ーＣＨ２−ＮＨＣＯＯＲ（Ｒは非置換もしくは置換アルキルもしくはアリール） ；−ＣＯＮＨＲ（Ｒは非置換もしくは置換アルキルもしくはアリール）。

−ＣＨ，−３−ＣＨ２−フェニル。

であるが、これらの限定されるものではない。

好ましい保護基は、Ｒが１ないし８個の炭素原子を有する低級アルキル、フェニ ルまたは低級アルキル、ヒドロキシル、低級アルコキノ、カルボキシもしくは低 級アルコキンカルボニルで置換されたフェニルである式−ＣＨ２ＮＨＣＯＲを有 する。最も好ましい保護基はアセトアミドメチル基である。

本発明の各特異的結合ペプチドを含有する具体例はアミノ酸の配列からなる。

本発明で使用するアミノ酸なる語は、天然に存在するか否かを問わず、すべての し−およびＤ−アミノ酸を包含させる意図である。

本発明のペプチドはｉｎ　ｖｉｔｒｏにて化学的に合成できる。有利には、本発 明のペプチドはアミノ酸合成器で調製できる。当業者によく知られた技術を用い 、１ｎｖｉｔｒｏ合成の間に、放射性同位体標識結合部位がペプチドに共有結合 した本発明のペプチドを合成できる。合成の間、放射性同位体は結合部位に共有 結合したかかるペプチドは、共有結合の特異的部位が決定できるゆえ有利である 。

本発明の放射性同位体標識結合部位はペプチドの合成の間に標的特異的ペプチド に導入できる。ピコリン酸（Ｐｉｃ−）からなる具体例については［例えば、Ｐ ｉｃ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ　（保護基）−］、放射性同位体標識結合部位は合成にお ける最後の（すなわち、アミノ末端）残基として合成できる。加えて、ピコリン 酸含有放射性同位体標識結合部位はりシンのε−アミノ基に共有結合できて、例 えば、ａＮ　（Ｆｍｏｃ）−Ｌｙｓ−εＮ　［Ｐｉ　ｃ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ　（保 護基）コを与え、これはペプチド鎖のいずれの位置に取り込むこともできる。こ の配列は標的結合ペプチドへの取込の容易な態様を提供するので特に有利である 。

同様に、ピコリルアミン（Ｐ　ｉ　ｃ　ａ）含有放射性同位体標識結合部位［− Ｃｙｓ（保護基）　−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｐ　ｉ　ｃ　ａ］は、ペプチド鎖のカルボキ シル末端に配列［−Ｃｙｓ（保護基）　−Ｇ　］　ｙ−］を包含させることによ って、ペプチド合成の間に調製できる。樹脂からのペプチドの切断の後に、ペプ チドのカルボキシル末端を活性化し、ピコリルアミンにカップリングさせる。こ の合成経路は、反応性部位−鎖官能性がマスクされた（保護された）ままであっ て、ピコリルアミンの複合体化の間に反応しないことを要する。

Ｐ　ｉ　ｃ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｃｙ　ｓ−および−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｐｉｃａキレー ト剤を含有する小さな合成ペプチドの例は、後記実施例で提供する。本発明は、 これらのキレート剤を事実いずれかのペプチドに取り込むことも提供し、その結 果、中性錯体として保持されるＴｃ−９９ｍを有する放射性同位体標識ペプチド が得られる。

また、本発明は、Ｔｃ−９９ｍで標識できるビスアミンビスチオール（ＢＡＴ） キレート剤を取り込む小さな特異的結合合成ペプチドを提供し、その結果、中性 錯体として保持されるＴｃ−９９ｍを有する放射性同位体標識ペプチドが得られ る。これらのＢＡＴキレート剤を放射性同位体標識結合部位として含有する小さ な合成ペプチドの例は後記実施例で提供する。

放射性テクネチウムと本発明のペプチドとの錯体、テクネチウム錯体を形成する において、好ましくは、Ｔｃ−９９ｍ過テクネチウム酸塩を還元剤の存在下で本 発明のペプチドと反応させる。好ましい還元剤は亜ニチオン酸、第一スズおよび 第一鉄イオンであり；最も好ましい還元剤は塩化第一スズである。さらなる好ま しい具体例において、還元剤は固相還元剤である。錯体およびかかる錯体を調製 するための手段は、便宜には、標識されるべき本発明のペプチドの所定量と該ペ プチドをＴｃ−９９ｍで標識するための還元剤の適量を含有するンールしたバイ アルからなるキットの形態で供する。別法として、錯体は、本発明のペプチドを 、テクネチウムと移行配位子として公知のもう１つの化合物の予め形成されたレ イプル錯体と反応させることによっても形成できる。このプロセスは配位子交換 として知られており、当業者によく知られている。レイプル錯体は、例えば、酒 石酸、クエン酸、グルコン酸またはマンニトールのごとき移行配位子を用いて形 成できる。本発明で有用なＴｃ−９９ｍ過テクネチウム酸塩の中には、ナトリウ ム塩のごときアルカリ金属塩、アンモニウム塩または低級アルキルアンモニウム 塩が包含される。

本発明の好ましい具体例において、テクネチウム標識ペプチドを調製するための キットが提供される。本発明のペプチドは、後記する当業者によく知られた方法 および手段を用いて化学的に合成できる。かく調製されたペプチドは３および１ ００個の間のアミノ酸残基からなり、放射性同位体標識結合部位に共有結合して おり、ここに、該放射性同位体標識結合部位は放射性同位体に結合する。適量の ペプチドを、当該ペプチドをＴｃ−９９ｍで標識するのに十分な量にて、塩化第 一スズまたは固相還元剤のごとき還元剤を含有するバイアルに導入する。前記し た（例えば、酒石酸、クエン酸、ゴルコン酸またはマンニトールのごとき）移行 配位子の適量もまた包含できる。本発明によるテクネチウム標識ペプチドは、適 量のＴｃ−９９ｍまたはＴｃ−９９ｍ錯体の適量をバイアルに添加し、後記する 実施例３に記載する条件下で反応させることによって調製できる。

適量の放射能を有する放射性同位体標識ペプチドが本発明によって提供される。

Ｔｃ−９９ｍ放射性錯体を形成するにおいて、一般に、１ｍＬ当たり約０．０１ ミリキユリー（ｍＣｉ）ないし１００ｍＣ１の濃度で放射能を含有する溶液中で 放射性錯体を形成するのが好ましい。

本発明によって提供されるテクネチウム標識ペプチドは哺乳動物体内の部位を可 視化するのに使用できる。本発明によると、テクネチウム標識ペプチドまたはそ の中性錯体は単一の単位注射用量で投与する。本発明では、滅菌生理食塩水また は血漿のごとき当業者に公知の通常のいずれの担体も、種々の器官、腫瘍等を診 断的に造影するために、注射溶液を調製するための放射性同位体標識後に使用す ることができる。一般に、投与すべき単位用量は約１０１ｍＣ１ないし約１００ ｍＣ１，好ましくは、１ｍＣ１ないし２０ｍＣ４の放射能を有する。単位用量で 注射されるべき溶液は約１０１ｍＬないし約１０ｍＬである。静脈内投与の後、 器官または腫瘍のｉｎ　ｖｉｖｏ造影は数分内に起こり得る。しかしながら、造 影は、所望ならば、放射性同位体標識したペプチドを患者に投与した後、数時間 またはそれ以上で起こり得るようにできる。はとんどの場合、シンチフオトを取 るのを可能とするためには、約０．１時間内に造影すべき領域に、十分量の投与 した用量を蓄積させる。診断目的のノンチグラフィー造影のいずれの通常の方法 も本発明で使用できる。

本発明によって提供されるテクネチウム標識ペプチドおよび錯体は、水性生理食 塩水のごときいずれの通常の媒体または血液血漿媒体中にても静脈内投与できる 。また、かかる媒体は、例えば、浸透圧を調整するための医薬上許容される塩、 緩衝液、防腐剤等のごとき通常の医薬添加剤も含有できる。好ましい媒質には通 常の生理食塩水および血漿がある。

これらの化合物を製造し標識するための方法は、以下の実施例によってさらに詳 しく説明する。これらの実施例は前記した方法のある態様および有利な結果を説 明する。これらの実施例は例示的なものであって、限定的なものではない。

実施例Ｉ ＢＡＴキレート剤の合成 Ａ、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ’　−（５−カルボキノペンチル）　−Ｎ、　Ｎ’　−ビス （２−メチル−２−トリフェニルメチルチオプロピル）エチレンジアミンの合成 ａ、２−メチル−２−（トリフェニルメチルチオ）プロパナール無水ＴＨＦ　（ ２Ｌ）に溶解したトリフェニルメチルメルカプタン（３６２，９４ｇ、１．３１ ｍｏ１．１００ｍｏ１％）を、アルゴン下にて水浴で冷却した。水素化ナトリウ ム（油中６０％、５４．３９ｇ、１．３５ｍｏ１．１０４ｍｏ１％）を少しずつ ２０分かけて添加した。ついで、２−ブロモ−２−メチルプロパナール（２０６ ，０６ｇ、１．３６ｍｏ＋、１０４ｍｏ１％、ステイーブンズ（Ｓｔｅｖｅｎｓ ）およびジルス（Ｇｉｌｌｓ）　、ジャーナル・オン・アメリカン・ケミカル・ ソサイエティ−（Ｊ、＾ｍｅｒ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ、　）　、第７９巻：３ ４４８〜３４５１頁（１９５７年）参照）をゆっくりと２０分かけて添加した。

該反応混合物を室温に暖め、１２時間撹拌した。水（ＩＬ）で反応を停止し、ジ エチルエーテル（３Ｘ　Ｉ　Ｌ）で抽出した。該エーテル抽出物を合−Ｌ、Ｎａ Ｃ］飽和溶液（５００ｍＬ）で洗浄し、Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥し、濾過し た。溶媒を減圧除去してオレンジ色の濃厚な油状物質を得た。該粗油状物質をト ルエン（２００ｍＬ）に溶解し、熱ヘキサンで２Ｌにまで希釈した。該混合物を 焼結ガラス漏斗で濾過し、−５℃で１２時間冷却した。濾別された白色結晶固体 （標記化合物）は２６６．３６ｇ（収率５９％）であった。得られた化合物の融 点は、８３〜８５℃であった。核磁気共鳴分析実験により、以下の分子の特徴が 示された：’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣＩ　ｓ）　：δ１．２４　（ｓ、 　６Ｈ，２ＣＨり　、７゜２〜７．３５　（ｍ、９Ｈ）　、７．５９〜７．６２ 　（ｍ、６Ｈ）　、８．６９　（ｓ、　Ｈ。

−ＣＯＨ） Ｉ３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣ１ｘ）：δ２２．８６．　５５．６６、　６ ７．４８゜１２６．８５，１２７．７５，１２９．７２，１４４．７９，１９７ ．３１エチレンジアミン（１，３ｍＬ、０．０１９４ｍｏ１．１００ｍｏ１％） を、アルゴン下、メタノール（４０ｍＬ）および無水ＴＨＦ　（４０ｍＬ）に溶 解した２−メチル−２−（トリフェニルメチルチオ）プロパナール（１３，８６ ｇ。

０．０４０１ｇ、２０６ｍｏ１％）に添加し、酢酸を滴下することにより、ｐＨ を６に調整した。該溶液を２０℃で２０分撹拌した。ンアノ水素化ホウ素ナトリ ウム（１，２２ｇ、０．０１９４ｍｏ１．１００ｍｏ１％）を添加し、該反応物 を３時間室温にて撹拌した。さらにシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１，０８ｇ ）を添加し、該反応物を２０℃で１７時間撹拌した。最後のシアノ水素化ホウ素 ナトリウム（１，０２ｇ）を加え、該反応物をアルゴン下で加熱して６時間還流 させた。０．５Ｍ　ＨＣＩ　（１００ｍＬ）で反応停止し、酢酸エチル（２Ｘ１ ００ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合一し、ついで、２Ｍ　ＮａＯＨ（６０ｍ Ｌ）、ＮａＣ１飽和溶液（６０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２５Ｏｎで乾燥し、濾過し た。溶媒を減圧除去して１６．３７ｇの粗生成物を得、トルエン／ヘキサンから 結晶化して１０．２０ｇ（収率７３％）の標記化合物（白色結晶）を得た。得ら れた化合物の融点は８３〜８６℃。ＦＡＢＭＳ分析：　７２１　（ＭＨ＋）。核 磁気共鳴分析実験により、以下の分子の特徴が示された：’ＨＮＭＲ（３００Ｍ Ｈｚ、ＣＤＣｌ５）：δ１．１２　（ｓ、１２Ｈ，４ＣＨｓ）。

１．６４　（ｓ、４Ｈ，Ｎ−ＣＨ２Ｃ（Ｍｅ）ｚ−３）、２．５２　（ｓ、４Ｈ 。

Ｎ−ＣＨｚ　ＣＨｚ　Ｎ）、５．３１　（Ｓ、２Ｈ，２−ＮＨ）、７．１２〜７ ．３０（ｍ、１８Ｈ，Ａｒ）、７．６２〜７．６５　（ｍ、１２Ｈ，Ａｒ）Ｋｚ ＣＯｓ（１，９２ｇ、１３．９ｍｍｏｌ、１００ｍｏ１％）を、ＣＨＩＣＮ（６ ０ｍＬ）中のＮ、　Ｎ”　−ビス（２−メチル−２−トリフェニルメチルチオプ ロピル）エチレンジアミン（１０，０３ｇ、１３．９ｍｍｏりに添加し、ツいテ 、５−ブロモ吉草酸エチル（３，３０ｍＬ、２０．８ｍｍｏ１．１５０ｍｏ１％ ）を添加した。該反応物をアルゴン下で加熱して一晩還流させた。ついで、該溶 液をペースト状まで濃縮し、０．２５Ｍ　ＫＯＨ（１００ｍＬ）および酢酸エチ ル（１００ｍＬ）の間に分配させた。水層を酢酸エチル（ＩＸ５０ｍＬ）で抽出 し、合一した酢酸エチル層を５０ｍＬのＨ，ＯおよびＮａＣ１溶液（２Ｘ５０ｍ Ｌ）で洗浄し、ＮａｚＳＯｓで乾燥し、濃縮してオレンジ色の油状物質を得た。

フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル３００ｇ、１００％ＣＨＣｌ、から ５％ＭｅＯＨ／ＣＨＣｌ５まで）により精製し、純粋な標記化合物（７，７５ｇ 、収率６６％）をｌｉた。ＦＡＢＭＳ分析１測値８４９　（ＭＨ＋）（ＣａｓＨ ｓ４ＮｚＯ！Ｓｉとして計算分子量８４９．２４）。

ＩＭ　ＫＯＨ（２５ｍＬ、２５．０ｍｍｏ１．２７４ｍｏ１％）を、ジオキサン （２００ｍＬ）中のＮ−（５−カルボエトキンペンチル）　−Ｎ、　Ｎ’　−ビ ス（２−メチル−２−トリフェニルメチルチオプロピル）エチレンジアミン（７ ，７５ｇ、９．１３ｍｍｏｌ）に添加し、ついで、水（２５０ｍＬ）を添加した 。ついで、均一な溶液が得られるまで、撹拌しなからジオキサンを滴下した。

該反応物を加熱してゆっくりと一晩還流させた。大部分のジオキサンを減圧除去 （ロータリーエバポレーション）し、ＩＭ　ＫＨ２ＰＯ４および飽和Ｎ　ａ　Ｈ ＣＯｓで溶液のｐＨを７〜８以下とした。ついで、該溶液を酢酸エチル（３ｘ７ ５ｍＬ）で抽出し、合一した有機層をＮａＣｌ溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ 、ＳＯ４で乾燥し、濃縮して泡／固体とした（６．３５　ｇ、収率８５％）。

上記反応で得た粗生成物に、（ＢＯＣ）２０　（３，３５ｇ、１５．４ｍｍｏ　 ＋。

２００ｍｏ１％）　、ＣＨｓＣＮ　（５０ｍＬ）および塩化メチレン（５０ｍＬ ）を添加し、ついで、トリエチルアミン（１，０ｍＬ、７．２ｍｍｏ１．９３ｍ ｏ１％）を添加した。該反応物を、アルゴン下、室温で一晩撹拌した。ついで、 該反応溶液を濃縮し、水（１００ｍＬ）および酢酸エチル（５０ｍＬ）間に分配 させた。

水層を酢酸エチル（ＩＸ５０ｍＬ）で抽出し、合一した酢酸エチル層を５％クエ ン酸およびＮａＣ１（各５０ｍＬ）で洗浄し、ついで、Ｎａ、ＳＯ４で乾燥し、 濃縮してオレンジ色の油状物質を得た。フラッシュクロマトグラフィー（シリカ ゲル２００ｇ、１００％ＣＤＣ］３からメタノール／クロロホルムまで）により 純粋な標記化合物（２，５８ｇ、収率３６％）を得た。Ｆ　Ａ　Ｂ　Ｍ　Ｓ分析 ：実測値９２１（ＭＨ＋）（Ｃ□Ｈｅ５ＮｔＯ４Ｓｚとして計算値９２１．３１ ）。

Ｂ、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ’　−（５−カルボキシペンチル）　−Ｎ、　Ｎ’−ビス− ［２−（４−メトキシベンジルチオ）−２−メチルプロピル］エチレンジアミン の合成メタノール（５００ｍＬ）中のＮ、　Ｎ’　−ビス（２−メルカプト−２ −メチルプロピル）エチレンジアミン（１１，２３ｇ、４７．５ｍｍｏｌ　；デ ィジオ（ＤｉＺｉｏ）ら、バイオコンジュゲート・ケム（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａ ｔｅ　Ｃｈｅｗ、　）　、第２巻＝３５３頁（１９９１年）およびコービン（Ｃ ｏｒｂｉｎ）ら、ジャーナル・オン・オーガニック・ケミストリー（Ｊ、　Ｏｒ ｇ、　ＣｈｅＩｌｌ、　）　、第４１巻：４８９頁（１９７６年）参照）の溶液 を、氷水浴中で冷却し、ついで、アンモニアガスで４５分間飽和させた。これに 塩化４−メトキンベンジル（１７，０ｍＬ、１２５ｍｍｏ＋、２６４ｍｏ１％） を添加した。該反応物をアルゴン下で撹拌しながら室温で一晩暖めた。該溶液を 濃縮してペースト状物質を得、ついで、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）および ０．５Ｍ　ＫＯＨ（２００ｍＬ）間に分配させた。さらに水層をジエチルエーテ ル（２Ｘ５０ｍＬ）で抽出した。合一した有機層をＮａＣｌ溶液で洗浄し、濃縮 して無色透明油状物質とした。該油状物質をジエチルエーテル（２００ｍＬ）に 溶解し、ついで、さらなる沈澱が見られなくなるまでジオキサン中の４．０ＭＨ Ｃｌで酸性にした。該白色沈澱を濾過により集め、ジエチルエーテルで洗浄した 。該白色固体をｐＨ２以下の熱水から再結晶した。生成物を濾過により集めて２ ９．９４ｇの−および二塩酸塩を得た。該塩酸塩を、ＬＭ　ＫＯＨ（１００ｍＬ ）および酢酸エチル（１００ｍＬ）間に分配させた。水層を酢酸エチル（２Ｘ３ ０ｍＬ）で抽出し、合一した有機層をＮａＣｌ溶液で洗浄し、Ｍｇ５Ｏ，で乾燥 し、濃縮して純粋な生成物（うす黄色油状物質）を遊離塩基として得た（１８． ５３ｇ、収率８２％）。核磁気共鳴分析実験により以下の分子の特徴が示された ：’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣＩＭ）：δ７．２５　（ｄ、４Ｈ，Ｊ＝９ ）　、６゜８３　（ｄ、４Ｈ，Ｊ＝９）、３．７８　（ｓ、６Ｈ）、３．６７　 （ｓ、４Ｈ）、２゜６３　（ｓ、４Ｈ）、２．５６　（ｓ、４Ｈ）、１．３４　 （ｓ、１２Ｈ）ＣＨｓ　ＣＮ　（５０ｍ　Ｌ　）中のＮ、　Ｎ’−ビス−［２− （４−メトキシベンジルチオ）−２−メチルプロピル］−エチレンジアミン（４ ，１３ｇ、ｓ、　６６ｍｍｏ　１）に、ＫｚＣＯｓ（１，２１ｇ、８．７５ｍｍ ｏ１．１０１ｍｏ１％）、ついで５−ブロモ吉草酸エチル（２，８０ｍＬ、１７ ．７ｍｍｏ＋、２０４ｍｏ１％）を添加した。該反応物を還流下で一晩撹拌し、 ついで、減圧濃縮してペースト状にした。

残渣を酢酸エチル（１００ｍＬ）および０．５Ｍ　ＫＯＨ（１００ｍＬ）間に分 配させた。酢酸エチル（Ｉ　Ｘ　５０ｍＬ）で水層を抽出し、合一した有機層を ＮａＣ１溶液（５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２５Ｏ＜で乾燥し、濃縮して黄色油状 物質（６ｇ以下）を得た。調製用順相ＨＰＬＣ（１００％ＣＨＣ］３から２５分 かけて５％メタノール／クロロホルムまで）により純粋な標記化合物（１，７５ ９ｇ。

収率３４％）を得た。ＦＡＢＭＳ　：実測値６０５　（ＭＨ＋）（Ｃｘｘｌｈｚ Ｎ２０４Ｓｚとして計算値６０４．９０）。核磁気共鳴分析実験により以下の分 子の特徴が示された：　’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣＩ３）：６７．２５ 　（ｄ、４Ｈ，Ｊ＝８．５）　、６．８３　（ｄ、４Ｈ，Ｊ＝８．５）　、４． １３　（ｑ、２Ｈ，Ｊ＝７）　、３゜７９３　（ｓ、３Ｈ）、３．７８９　（ｓ 、３Ｈ）、３．７４　（ｓ、２Ｈ）、３．６７（ｓ、２Ｈ）、２．６　（ｍ、ｌ ０Ｈ）、２．３１　（ｔ、、　２Ｈ，Ｊ＝７）、１．６（ｍ、２Ｈ）、１．５　 （ｍ、２Ｈ）　、１．３４　（ｓ、１２Ｈ）、１．２８（ｔ、３Ｈ。

Ｊ＝７） ｃ、Ｎ−Ｂｏｃ−Ｎ’　−（５−カルボキシペンチル）　−Ｎ、　Ｎ’−ビス− ［２−（４−メトキシベンジルチオ）−２−メチルプロピル］エチレンジアミン ＴＨＦ　（４０ｍＬ）中のＮ−（５−カルボエトキンペンチル）　−Ｎ、　Ｎ’ 　−ビス−［２−（４−メトキシベンジルチオ）−２−メチルプロピル］エチレ ンジアミン（５８６ｍｇ、０．９６９ｍｍｏｌ）に、水（３０ｍＬ）およびＩＭ 　ＫＯＨ（２，５ｍＬ、２．５ｍｍｏｌ、２６０ｍｏ１％）を添加した。得られ た均一な溶液を加熱してゆっくりと一晩還流させた。ついで、該溶液を室温まで 冷却し、ＴＨＦを減圧除去（ロータリーエバポレーション）した。残渣を水で５ ０ｍＬにまで希釈し、ＩＭＨＣＩでｐＨを２〜３以下にした。該溶液を酢酸エチ ル（３Ｘ３０ｍＬ）で抽出し、合一した有機層をＮａＣｌ溶液（５０ｍＬ）で洗 浄し、Ｎａ２５Ｏａで乾燥し、濃縮して粗酸（４２２ｍｇ、収率７５％）を得た 。

上記反応で得た該粗生成物に、ＣＨｓＣＮ　（４０ｍＬ）および（ＢＯＣ）！０ （２４０ｍｇ、１．１０ｍｍｏ１．１５０ｍｏ１％）を添加し、ツイテトリエチ ルアミン（０，２００ｍＬ、１．４３ｍｍｏ１．１９６ｍｏ１％）を添加した。

該均一溶液をアルゴン下、室温で一晩撹拌した。ついで、該溶液をペースト状に 濃縮し、酢酸エチル（２５ｍＬ）およびＩＭ　ＫＨｚＰＯｎ　（２５ｍＬ）間に 分配させた。有機層を５％クエン酸（２Ｘ２５ｍＬ）およびＮａＣｌ溶液（２５ ｍＬ）で洗浄し、Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏ４で乾燥し、濃縮して黄色油状物質を得た 。フラッシュクロマトグラフィー（フラッシュ・シリカゲル５０ｍＬ、１００％ クロロホルムから１５％メタノール／クロロホルムまで）により純粋な標記化合 物（３４４ｍｇ、収率７０％）を得た。ＦＡＢＭＳ分析、実測値６７７　（ＭＨ ＋）（Ｃｓ＠ＨｓｓＮｔＯｓＳｚとして計算値６７６．９７）。核磁気共鳴分析 実験により以下の分子の特徴が示された：　’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣ ｌｓ）：δ７．２０　（ｄ、４Ｈ。

Ｊ＝７）、６．７９　（ｄ、４Ｈ，Ｊ＝７）、３．７５　（ｓ、３Ｈ）、３．７ ４　（ｓ。

３Ｈ）、３．６８　（ｍ、４Ｈ）、３．３５　（ｍ、４Ｈ）、２．６５　（ｍ、 ２Ｈ）。

２．５３　（ｍ、４Ｈ）、２．３１　（ｍ、２Ｈ）、１．５９　（ｍ、２Ｈ）、 １．４３（ｓ、ＩＩＨ）、１．３０　（ｓ、６Ｈ）、１．２６　（ｓ、６Ｈ）Ｃ ，ＢＡＴ−ＢＭ　（Ｎ−［２−（Ｎ’　、Ｎ”　−ビス（２−マレイミドエチル ）アミノエチル）］−Ｎ’、Ｎ’−ビス（２−メチル−２−トリフェニルメチル チオプロピル）−６，９−ジアザノナンアミド）の合成りＡＴ−ＢＭを以下のよ うにして調製した。ＢＡＴ酸（Ｎ’−（ｔ−ブトキンカルボニル）−Ｎ”、Ｎ” −ビス（２−メチル−２−トリフェニルメチルチオプロピル）−６，９−ジアザ ノナン酸）（１０，０３ｇ、１０．８９ｍｍｏｌ）および７５ｍＬの転環化メチ レン（ＣＨ２ＣＨ２）を、磁気撹拌棒およびアルゴン・バルーンを備えた２５０ ｍＬ容丸底フラスコに入れた。この溶液に、ジイソプロピルカルボジイミド（３ ，４０ｍＬ、２１．７ｍｍｏ１．１９９ｍｏｌｅ％）、ライでＮ−ヒドロキシー サクシンイミド（３，１２ｇ、２７．１ｍｍｏｌ、２４９ｍｏｌｅ％）を添加し た。この溶液が１時間以内に濁るのを確認し、さらに合計４時間撹拌しながら室 温でインキュベーションした。ついで、３０ｍＬの塩化メチレン中のトリス（２ −アミノエチル）アミン（３０ｍＬ、２００ｍｍｏｌ、１８４０ｍｏｌｅ％）溶 液を添加し、−晩撹拌を続けた。ついで、該反応混合物を減圧濃縮し、残渣を酢 酸エチル（１５０ｍＬ）および０．５Ｍ　炭酸カリウム（Ｋ、ＣＯ８；１５０ｍ Ｌ）間に分配させた。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、濃縮して粗生成物（ Ｎ−［２−（Ｎ’、　Ｎ’−ビス（２−アミノエチル）アミノエチル）］−Ｎ’ −（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ’、Ｎ’−ビス（２−メチル−２−トリフェ ニルメチルチオプロピル）−６，９−ジアザノナンアミド）を泡／油として得た 。

この粗生成物を、磁気撹拌棒を備えた１０１００Ｏ容丸底フラスコ（３００ｍＬ のＴＨＦが入っている）に入れ、ついで３０ｍＬの重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣ Ｏｓ）、１００ｍＬの水およびＮ−メトキシカルボニルマレイミド（６，１３ｇ 、３９．５ｍｍｏ１．３６３ｍｏｌｅ％）を添加した。コノ異種の物質の混合物 を室温で一晩撹拌した。該混合物からＴＨＦを減圧除去（ロータリーエバポレー ション）し、水性残渣を酢酸エチルで２回（２Ｘ７５ｍＬ）抽出した。

合一したこれらの有機層をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、中くら いの目のガラスフィルターで濾過し、濃縮して約１２ｇの粗生成物を得た。液体 クロマトグラフィー（シリカゲル２５０ｇ／クロロホルム→クロロホルム中２％ メタノールのグラジェント）により、５ｇの粗生成物（再精製により純粋な生成 物となる）を伴って、５．３ｇの純粋な生成物（Ｎ−［２−（Ｎ’、　Ｎ’−ビ ス（２−マレイミドエチル）アミノエチル）］　−Ｎ’−（ｔ−ブトキシカルボ ニル）−Ｎｓ、Ｎ＠−ビス（２−メチル−２−トリフェニルメチルチオプロピル ）−６゜９−ジアザノナンアミド）（収率４０％に相当）を得た。該精製した生 成物の化学分析によりＢＡＴ−ＢＭとしての同一性を確認した（以下のごと（） ：’ＨＮＭＲ（２００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ５）：δ０．９１　（１２Ｈ，ｓ）、１ ．３８（９Ｈ，ｓ）、１．２〜１．６　（４Ｈ，ｍ）　、　２．０６　（２Ｈ， ｓ）、２．１８（２Ｈ，Ｊ＝７）、２．３１　（４Ｈ，ｍ）、２．５５　（２Ｈ ，ｔ、Ｊ＝５）、２゜６１　（４Ｈ，ｔ、Ｊ＝６）　、２．９９　（２Ｈ，ｓ） 　、３．０〜３．３　（４Ｈ，ｍ）　。

３．４６　（４Ｈ，ｔ、Ｊ＝６）、６．４９　（−ＮＨ，ｔ、Ｊ＝４）、６．６ ４（４Ｈ。

ｓ）、７．１〜７．３　（１８Ｈ，ｍ）、７．６　（１２Ｈ，ｔ、Ｊ＝１７）Ｄ 、［ＢＡＴ］−結合（εＮ）Ｌｙｓ　ＣａＮ−Ｆｍｏｃ）（［Ｎ−ｔ−（Ｎ・− ｔ−ブトキシカルボニル）　Ｈａ、Ｎ９ビス［２−メチル−２−（トリフェニル メチルチオ）プロピル］−６．９−ジアザノナノイル−Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−リジ ン）の合成 撹拌棒およびアルゴン・バルーンを備えた１００ｍＬ容一つ首丸底フラスコに、 室温の塩化メチレン５０ｍＬ中のＮ’−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ’、Ｎ ・−ビス［２−メチル−２（トリフェニルメチルチオ）プロピル］−６．９−ジ アザノナン酸（ＢＡＴ酸；３．２９ｇ、３．５７ｍｍｏ＋）を入れた。これに、 ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ；５８０μＬ、３．７０ｍｍｏｌ、１０ ４ｍｏｌｅ％）、ついで直ちにＮ−ヒドロキシサクシンイミド（ＨＯＳｕ；４３ ２ｍｇ。

３．７５ｍｍｏ１．１０５ｍｏｌｅ％）を添加した。該反応物を一晩室温で撹拌 し、その間、白色結晶が生成した。該混合物を濾過し、濾液を濃縮して固体泡状 物を得た。１００ｍＬ丸底フラスコ中で該粗泡状物を７５ｍＬのジメトキシエタ ンおよび水の混合物（２：　１）に溶解した。この均一溶液に、Ｎ−α−Ｆｍｏ 　ｃ−リジン塩酸塩（１，５２ｇ、３．７５ｍｍｏｌ、１０５ｍｏｌｅ％）、ツ イテＫｚＣＯｓ（５１７ｍｇ、３．７４ｍｍｏ１．１０５ｍｏｌｅ％）を添加し 、黄色溶液を一晩室温で撹拌した。ついで、該溶液を２５０ｍＬのエルレンマイ ヤーフラスコ（酢酸エチル１００ｍＬおよび水１００ｍＬが入っている）に注い だ。有機層を分離し、水層をさらに５０ｍＬの酢酸エチルで抽出した。合一した 有機層をブライン（１００ｍＬ）で１回洗浄し、Ｎ　ａ　２　Ｓ　Ｏｓで乾燥し 、濃縮して黄色固体を得た。この粗生成物を低圧液体クロマトグラフィー（シリ カゲル１５０ｇ。

ＣＨＣ］、→ＣＨＣｌ、中１０％メ中ソ０％メタノールより精製した。このよう にして、３１２ｇの標記化合物を調製した（収率６９％）。該精製した生成物を 化学分析により以下のように同定した：’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ５ ）６０．８８（１２Ｈ，ｓ、ブロード）　、１．０５〜１．４５（１９Ｈ，ｍ） 、１．８〜２．１　（４Ｈ，ｍ）、１　８−２．４７　（４Ｈ，ｍ）、２．７５ 〜３．２（６Ｈ，ｍ）。

３．９〜４．３　（４Ｈ，ｍ）　、７．２　（２２Ｈ，ｍ）　、７．６　（１６ Ｈ，ｓ、結合）。

ＦＡＢＭＳ　（ＭＨ”）　・計算値１２７０．６、実測値１２７２゜Ｅ、ＢＡＭ 　（Ｎ’−（ｔ−ブトキンカルボニル’）−Ｎ’、〜４−ビス［２−メチル−２ −（）リフェニルメチルチオ）プロピル］−１，４，１０−トリアザデカン）の 合成 撹拌棒および還流用濃縮器を備えた２５０ｍＬ容一つ首丸底フラスコに、５０ｍ ＬのＣＨ３ＣＮおよび３０ｍＬのジオキサン中のＮｌ　、〜４−ビス［２−メチ ル−２−（トリフェニルメチルチオ）プロピル］−エチレンジアミン（ＢＡＴ− Ｉ　；１０．０ｇ、１４．０１ｍｍｏｌ）を入れた。これに、Ｎ−（５−ブロモ フェニル）−フタルイミド（８，０４ｇ、２７．１ｍｍｏ１．１９４ｍｏｌｅ％ ）、ツいでに２　ＣＯ３（２，９５ｇ、２１．３ｍｍｏ１．１５２ｍｏｌｅ％） を添加した。

該混合物をアルゴン下で２日間還流させた。ついで、該反応混合物を濃縮し、残 渣を１５０ｍＬの水および１５０ｍＬの酢酸エチルの間に分配させた。有機層を 分離し、水層（ｐＨ約１０）をさらに５０ｍＬの酢酸エチルで抽出した。合一し た有機層をブライン（７５ｍＬ）で１回洗浄し、Ｎａ２ＣＯｓで乾燥し、濃縮し て油状物質を得た。低圧液体クロマトグラフィー（シリカゲル３００ｇ、ＣＨＣ ｌ５→ＣＨＣｌ５中２％メタノール）により９２０ｇの９−フタルイミド−ＮＩ 。

〜４−ビス［２−メチル−２−（トリフェニルメチルチオ）プロピル］−１，４ −ジアザノナンを黄色泡状物として得た（収率７０％）。該精製した生成物の化 学分析により以下の同定結果を得た： ’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣＩｇ　）：δ１．０１　（６Ｈ，ｓ）、１． ０３（６Ｈ，ｓ）、１．１５〜１．４　（２Ｈ，ｔ）、１．９８　（２Ｈ，ｓ） 、２．１０（２Ｈ，ｓ）、２．２８　（２Ｈ，ｍ）、２．４５　（３Ｈ，ｍ）、 ３．６８　（２Ｈ。

Ｄ、７．１５〜７．３５　（１８Ｈ，ｍ）、７．６２　（１２Ｈ，ｔ）、７．７ ２（２Ｈ，ｍ）　、７．８５　（２Ｈ，ｍ）　。ＦＡＢＭＳ　（ＭＨ’）：計算 値９３５．４、実測値９３６゜ 撹拌棒を惰えた５００ｍＬ容一つ首丸底フラスコに、７５ｍＬのｃＨｓ　ＣＮお よび２０ｍＬのＣＨ２ＣＨ２中の９−フタルイミド−Ｎｌ　、〜４−ビス［２− メチル−２−（トリフェニルメチルチオ）プロピル］−１，４−ジアザノナン（ ８，８３ｇ、９．４３ｍｍｏｌ）を入れた。これに、Ｋ２ＣＯｓ　（１，３０ｇ 。

９．４１ｍｍｏ１．１００ｍｏｌｅ％）、ついで重炭酸ジーｔｅｒｔ−ブチル（ ２，１５ｇ、９．８５ｍｍｏ１．１０４ｍｏｌｅ％）を添加し、反応物を室温で 一晩撹拌した。ついで、該反応混合物を濃縮し、１００ｍＬの水および１００ｍ Ｌの酢酸エチル間に分配させた。有機層を分離し、水層をさらに５０ｍＬの酢酸 エチルで抽出した。合一した有機層をブライン（７５ｍＬ）で１回洗浄し、Ｎａ ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮して９．６９ｇの粗９−フタルイミド−Ｎ’−（ｔ−ブ トキンカルボニル）　ｉｑｌ、〜４−ビス［２−メチル−２−（トリフェニルメ チルチオ）プロピル］−１，４−ジアザノナンを黄色泡状物として得た（収率９ ９％）。この粗生成物をさらに精製せずに用いた。

撹拌棒および還流用濃縮器を備えた２５０ｍＬ容一つ首丸底フラスコに、２５ｍ ＬのＴＨＦ中の９−フタルイミド−Ｎ’−（ｔ−ブトキシカルボニル）　Ｎｌ。

〜４−ビス［２−メチル−２−（トリフェニルメチルチオ）プロピル］−１，４ −ジアザノナン（５，５０ｇ、５．３１ｍｍｏｌ）を入れた。これに、１００ｍ Ｌのエタノールおよび５ｍＬの水を添加した。水の添加により、出発物質が沈澱 した。ヒドラジ水和物（１，２ｍＬ、２４．７ｍｍｏ１．４６５ｍｏｌｅ％）を 添加し、該反応物を加熱して２日間還流させた。反応混合物を濃縮し、１００ｍ Ｌの水および１００ｍＬの０．２５Ｍ　Ｋ２ＣＯ３間に分配させた。有機層を分 離し、ブライン（７５ｍＬ）で１回洗浄し、Ｎａ、ＳＯ，で乾燥し、濃縮して固 体泡状物を得た。該粗生成物を低圧液体クロマトグラフィー（シリカゲル１００ ｇ。

ＣＨＣｌ５−ＣＨＣ］　３中５％メタノール、カラムを２００ｍＬのＣＨＣ１９ ２％トリエチルアミンで前処理しておいた）により精製して、３．２７ｇの純粋 なＮ’−（ｔ−ブトキンカルボニル）−Ｎ’、ＮＩ−ビス［２−メチル−２−（ トリフェニルメチルチオ）プロピル］−１，４，１０−トリアザデカンを黄色泡 状物として得た（収率６８％）。該精製した生成物の化学分析により以下のよう に同定された。

’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣ１３）：δ０．９　（１２Ｈ，ｓ）　、１． ２　（６Ｈ。

ｓ）、１．３６　（９Ｈ，ｓ）、２．０５　（４Ｈ，ｍ）、２．２４　（２Ｈ， ｔ）、２゜３１　（２Ｈ１ｔ）、２．６２　（３Ｈ，ｔ）、３．０　（２Ｈ，ｓ 、ブロード）、３゜１　（２Ｈ，ｓ、ブロード）、７．２　（１８Ｈ，ｍ）、７ ．６　（１２Ｈ，ｔ）、ＦＡＢＭＳ　（ＭＨ’）　計算値９０５５、実測値９０ ６５実施例２ 固相ペプチド合成 アプライド・パイオンステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製 の４３１Ａ型ペプチド合成装置を用い、９−フルオレニルメチルオキシカルボニ ル（Ｆｍｏｃ）アミノ末端保護基を用い、ジノクロへキンルカルボジイミド／ヒ ドロキシベンゾトリアゾールまたはヘキサフルオロリン酸２−　（ＩＨ−ペンシ ートリアシー１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウコニウム／ヒドロキ シベンゾトリアゾール（ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴ）とカップリングさせて、ｐ−ヒド ロキシメチルフェノキン−メチルポリスチレン（ＨＭＰ）樹脂をカルボキシル末 端の駿馬に、あるいはリンク（Ｒｉｎｋ）アミド樹脂をカルボキシル末端アミド 用に用いて、固相ペプチド合成（Ｓ　Ｐ　Ｐ　Ｓ）を行った。トリフルオロ酢酸 、水、チオアニソール、エタンジオールおよびトリエチルンランからなる溶液（ １００：５：５：２．５＋２の割合で調製）を用いて、樹脂結合生成物を手順通 り室温で１．５〜３時間開裂させた。

適当には、開裂され脱保護されたペプチドを過剰の無水酢酸（９８％ギ酸中）で 処理し、１８時間撹拌してからＨＰＬＣ精製することによりα−Ｎ−ホルミル基 を導入した。適当には、ＭＮＰ　（Ｎ−メチルピロリジノン）でＮ−末端が遊離 状態の樹脂結合ペプチドを３０分間処理することによりＮ−末端アセチル基を導 入した。適当には、５ｐｐｓｉ程において２−ハロ酢酸をカップリングすべき最 後の残基として用いることにより、あるいはＮＭＰ中の２−ハロ酸／ジイソプロ ピルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドまたはＮＭＰ中の無水２− ハロー酢酸／ジイソプロピルエチルアミンでＮ−末端が遊離状態の樹脂結合ペプ チドを処理することにより、２−クロロアセチルおよび２−ブロモアセチル基を 導入した。適当には、１−Ｉ　Ｐ　Ｌ　Ｃ精製した２−ハロアセチル化ペプチド を、重炭酸またはアンモニア緩衝液（ｐＨ８）中０．１〜１．０ｍｇ／ｍＬ溶液 として、０．５〜１．０ｍＭ、ＥＤＴＡ添加または無添加にて、１〜４８時間撹 拌することにより環化させた。適当には、緩衝液（ｐＨ７）中の０．１ｍｇ／ｍ Ｌの前駆体ンステインー遊離チオールペプチドを、０．　ＯＯ６Ｍ　Ｋ３Ｆ　ｅ 　（ＣＮ）　ａで溶液の黄色が消えなくなるまで処理することにより、Ｃｙｓ− Ｃｙｓジスルフィド結合の環化を行った。過剰の酸化体を過剰のンステインで還 元し、該混合物を凍結乾燥し、ついでＨＰＬＣで精製した。

適当には、ジイソプロピルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシサクシンイミド を用いて、ピコリルアミンを前駆体ペプチドと結合させることにより、「ｐｉｃ ａＪ基を導入した。適当には、５ｐｐｓ過程において、適当なりＡＴ酸をカップ リングすべき最後の残基として用いるか、あるいはＮ−末端が遊離の状態の樹脂 結合ペプチドをＮＭＰ中のＢＡ、Ｔ酸／ジイソプロピルカルボジイミドで処理す るかのいずれかにより、ＢＡＴリガンドを導入した。適当には、ＤＭＦ。

ＭＮＰまたはＣＨ，ＣＨ，中のジイソプロピルカルボジイミド／Ｎ−ヒドロキシ サクンンイミドまたはＨＢＴＵ／ＨＯＢｔの混合物で最初にカルボキシル化ペプ チドを活性化し、ついでジイソプロピルエチルアミンの存在下でカッツブリング させることにより、［ＲＡＭ、ｌをペプチドに結合させた。カップリング後、該 結合体を上記のごと（脱保護した。

適当には、単一チオール基を含有するペプチド（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝 液（ｐＨ８）中５ないし５０ｍｇ／ｍＬ）を、０５モル当量のＢＭＭＥ　Ｃビス −マレイミドメチルエーテル）（前以てアセトニトリル中に溶解しておく）と室 温で１〜１８時間反応させることにより、ＢＳＭＥ付加物を調製した。該溶液を 濃縮し、生成物をＨＰＬＣにより精製した。

適当には、単一チオール基を含有するペプチド（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝 液（ｐＨ８）中１０ないし１００ｍｇ／ｍＬ）を、０．３３モル当量のＴ　Ｍ　 Ｅ　Ａ（トリス（２−マレイミドエチル）アミン、実施例２）（前以てアセトニ トリルまたはＤＭＦに溶解しておく）と、１モル当量のトリエタノールアミン存 在下あるいは不存在下で、室温で１〜１８時間反応させることにより、ＴＳＥＡ 付加物を調製した。付加物を含有するかかる反応混合物を濃縮し、ついで、該付 加物をＨＰＬＣを用いて精製した。

適当には、単一チオール基を含有するペプチド（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝 液（ｐＨ８）／アセトニトリル中２ないし５０ｍｇ／ｍＬ）を、０．５モル当量 のＢＡＴ−ＢＭ　（Ｎ−［２−（Ｎ’　、Ｎ’　−ビス（２−マレイミドエチル ）アミノエチル］　−Ｎ’−（ｔ−ブトキンカルボニル）−Ｎ’、Ｎｅ−ビス（ ２−メチル−２−トリフェニルメチルチオプロピル）−６，９−ジアザノナンア ミド；実施例１）（前以てアセトニトリルまたはＴＨＦに溶解しである）と室温 で適当に（１〜１８時間）反応させることにより、ＢＡＴ−ＢＳ付加物を調製し た。つぃで、該溶液を減圧乾固し、［ＢＡＴ−ＢＳＩ−ペプチド結合体を、１０ ｍＬのＴＦＡおよび０．２ｍＬのトリエチルンランで１時間処理することにより 脱保護した。該溶液を濃縮し、生成物（付加物）をエーテルで沈澱させ、ついで ＨＰＬＣにより精製した。

ウォーターズ（ｊａｔｅｒｓ）社製デルタ・バック（Ｄｅｌｔａ　Ｐａｋ）　Ｃ １８カラムおよび水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）中のアセトニトリル 濃度を変化させるグラジェント溶出を用いて、粗ペプチドを精製した。溶出フラ クションからアセトニトリルを減圧除去し、ついで凍結乾燥した。個々の生成物 の同一性を、高速原子衝撃質量スペクトル分析（ＦＡＢＭＳ）により確認した。

実施例３ Ｔｃ−９９ｍでの放射性標識の一般的方法実施例２で調製したペプチド０．１ｍ ｇを、０．１ｍＬの水または５０ｍＭリン酸カルシウム緩衝液（ｐＨ＝５．６ま たは７．４）に溶解した。グルセブト酸Ｔｃ−９９ｍを、グルコサン・バイアル （Ｇｌｕｃｏｓａｎ　ｖｉａｌ）　（イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・ インコーポレイテッド（Ｅ、　１．　ＤｕＰｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ、　 Ｉｎｃ、　）社製）を２００ｍＣ１までを含有する１ｍＬの過テクネチウム酸Ｔ ｃ−９９ｍナトリウムで再構成し、１５分室温に放置した。ついで、２５μＬの グルセプト酸Ｔｃ−９９ｍをペプチドに添加し、室温または１００℃で１５〜３ ０分反応を進行させ、ついで０．２μｍのフィルターで濾過した。

Ｔｃ−９９ｍ標識ペプチドの純度を以下の条件のＨＰＬＣにより検定した。ウォ ーターズ社製デルタピュア（ＤｅｌｔａＰｕｒｅ）　ＲＰ−１８，５ｕ、１５０ ｍｍＸ３．９ｍｍ分析用カラムに個々の放射性標識ペプチドを負荷し、溶媒を１ ｍＬ／分の流速で流してペプチドを溶出した。１０％溶媒Ａ（０，１％ＣＦ　３ 　ＣＯＯＨ／　Ｈ２０）から４０％溶媒Ｂ、。（０，１％ＣＦ、Ｃ０ＯＨ／９０ ％ＣＨｓ　ＣＮ　／　Ｈ２０）まで、２０分かけてグラジェント溶出を行った。

積分記録計に接続されたイン−ライン放射線検出器により、放射性成分を検出し た。これらの条件において、グルセプト酸Ｔｃ−９９ｍおよび過テクネチウム酸 Ｔｃ−９９ｍナトリウムは、１および４分に溶出したが、一方、Ｔｃ−９９ｍ標 識ペプチドは、溶出にずっと時間がかかった。

以下の表は、本明細書記載の方法を用いて実施例２に従って調製したペプチドの 好成績なＴｃ−９９ｍ標識例を示す。

ＦＡＢＭＳ　放射化学的　ＨＰＬＣ ペプチド　ＭＨ”　収率（％）Ｘ　保持時間（分）寡Ｘホルミル−ＭＬＦＣＡ、 、Ｇ、Ｐｉｃａ　７６０　１．００　１０．９，１１．５，１２．２Ｐｉｃ、Ｇ ＣＡ−ｎ（ＶＧＶＡＰＧ）３アミド　１７９５　１００　１２．４ＰＩＣ，ＧＣ ＡＣＩＩ（ＶＰＧＶＧ）４アミド　１９９２　１００　１２．０Ｐｉｃ、ＧＣＡ ｃ、ＲＡＬｖＤＴＬＫＦＶＴＱＡＥＧＡＫアミド　２１８３　９５　１７．２Ｐ ｉｅ、ＧＣＡｃｆｆｉＲＡＬＶＤＴＥＦＫＶＫＱＥＡＧＡＫ了ミド　２２２６　 ９６　１５．５Ｐｊ、ｃ、ＧＣＡｅｆｆｉＰＬＡＲＩＴＬＰＤＦＲＬＰＥＩＡＩ Ｐアミド　２３６　９２　１９．２Ｐｉｃ、ＧＣＡｃｆｆｉＧＱＱＨ）ＩＬＧＧ ＡＫＡＧＤ■　１ｇ３８　４８　１２．８〜１６．６Ｐｉｃ、ＧＣＡｃ、ＰＬＹ ＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ　１９１０　８１　１０．７〜１４．５Ｐｉｃ、ＧＣＡｅ ｆｆｉＬＲＡＬＶＤＴＬＫアミド　１３６３　９２　１３．０〜１４．５Ｐｉｃ 、ＧＣＡｃ、ＧＧＧＬＲＡＬＶＤＴＬＫ了ミド　１５３５　１００　１５．６Ｐ ｉｃ、ＧＣＡｃ＝ＧＧＧＬＲＡＬＶＤＴＬＫＦＶＴＱＡＥＧＡＫアミド　２３５ ４　９２　１５．ＩＰｉｃ、ＧＣＡｃ、ＧＧＧＲＡＬＶＤＴＬＫＡＬＶＤＴＬア ミド　２０３５　８６　１４．５Ｐｉｅ、ＧＣＡｃ、ＧＨＲＰＬＤＫＫＲＥＥＡ ＰＳＬＲＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＲ３３７７９４１１，３Ｐｉｃ、ＧＣＡｅＭＰ ＳＰＳＰＩＨＰＡｆ（ＨＫＲＤＲＲＱアミド　２３５１　９４　１１．２．１４ ．４Ｐｉｃ、ＧＣＡｃｌ＝ＧＧＧＦＤ、Ｃｐａ、ＹＷＤＫＴＦＴアミド　１６８ １　９８　１３．８〜１６．８Ｐｉｃ、ＧＣＡ、、ＧＧＣＮＰ、Ａｐｃ、ＧＤＣ １２１７６９６，ｆｒ１３．７（Ｐｉｃ、５ＣＡｃ１．５ＹＮＲＧＤＳＴＣ）３ −ＴＳＥＡ　４４８８　９９　１０．４，１１．２Ｐｉｃ、ＧＣＭ　６ｂＧＧＧ ＬＲＡＬＶＤＴＬＫ了ミド　１４７１　１００　１１．９Ｐｉｃ、ＧＣＧＧＧＬ ＲＡＬＶＤＴＬＫアミド　１３５０　１００　１１．２．１１．６ＦＡＢＭＳ　 放射化学的　ＨＰＬＣ ペプチド　ＭＨ＋　収率（％）ｘ　保持時間（分）寒ＩＰｉｃ、ＧＣＹＲＡＬＶ ＤＴＬＫＦＶＴＱＡＥＧＡＫ７ミド　２２７５　９５　１８．６．１９．ＩＰｉ ｃ、ＧＣ（ＶＧＶＡＰＧ）ｓ７ミＦ　１７２４　９５　１７．３［ＢＡＴ］ＧＧ ＰＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ　２００６　９４　９．５［ＢＡＴ］、Ｈｌｙ、Ｇ ＤＰ、Ｈｌｙ、ＧＤＦ、アミド　１２０９　９９　１０．８［ＢＡＴコＧＨＲＰ ＬＤＫＫＲＥＥＡＰＳＬＲＰＡＰＰＰＩＳＧＧＧＹＲ，アミド　３３５７　９３ 　１０．４，１１．６［ＢＡＴ］ＰＫＬＥＥＬＫＥＫＬＫＥＬＬＥＫＬＫＥＫＬ Ａ　２９６９　９０　１２．３［ＢＡＴ］Ｇ、Ａｐｃ、ＧＤＶ、Ａｐｃ、ＧＤＦ Ｋ、アミド　１４３２　９７　１７．５［ＢＡＴ］ＰＬＡＲＩＴＬＰＤＦＲＬＰ ＥＩＡＩＰ、アミド　２３５０　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

［ＢＡＴ］ＲＡＬＶＤＴＥＦＫＶＫＱＥＡＧＡＫ、７ミＦ　２２０８　９６　１ ２．１［ＢＡＴコＹＲＡＬＶＤＴＬＫＦＶＴＱＡＥＧＡＫ了ミＦ　２３２９　９ ６　１３．３［ＢＡＴコＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧ、７ミド　 １９７４　９６　１１．９，１２．８［ＢＡＴコＲＡＬＶＤＴＬＫＦＶＴＱＡＥ ＧＡＫｙミＦ　２１６５　９８　１９．０ホルミル−ＭＬＦＫ［ＢＡＴコ、アミ ド　８８４　９９　１２．６ホルミル、　Ｔｈｐ、ＬＦ［ＢＡＭコ　７７５　９ ９　１３．３，１３．６（ＣＨ３−Ｎ）−ＦＹＷ、ＫＶＥ［ＢＡＭ］　１１７１ 　９８　１２．３，１３．６本ルミルーＭＬＦＫ［ＢＡＴコ　８８４　９６　１ １．９，１２．８ホルミル−ＭＬＦＫ［ＢＡＴ］ＫＫＫＫＫ、アミド　１５２４ 　９６　１１．７，１２．２ネルミル−ＭＬＦＫ［ＢＡＴ］Ｇ５Ｇ５Ｇ５．アミ Ｆ　１３１５　９７　１１．９，１２．８本ルミルーＭＬＦＫ［ＢＡＴ］ＥＧＥ 　１０１３　９９　１２．３ＦＡＢＭＳ　放射化学的　ＨＰＬＣ 本１ミル−Ｍ、Ｄｐｇ、Ｆ［ＢＡＭ］　７７０　９８　１３．７＊ルミル−ＭＬ ＦＫ［ＢＡＴ］Ｅ　１２００　９８　１３．７（ネルミル−ＭＬＦＫ［ＢＡＴコ ＧＧＣＡ　ｃｆｆｉＧＣＡ　ｃ、ＧＧＣ，アミド）２−ＢＳＭＥ　３４７７　９ ９　１１．９，１２．４［ＢＡＴ］ＲＡＬＶＤＴＬＫＫＬＫＫＫＬ、７ミＦ　２ １３５　９７　１１．９（ＣＨ３ＣＯ−Ｙｏ、ＡＩ）Ｃ，ＧＤＣＧＧＣＡ−−Ｇ ＣＡ−−ＧＧＣ，７ミ））２［ＢＡＴ］（ＶＧＶＡＰＧ）ｓ、７ミＦ　１７７８ 　９８　１０．３ＹＲＡＬＶＤＴＬＫＦＶＴＱＡＥＧＡＫ［ＢＡＴ］、７　ミド 　２３２９　９８　１１．４Ｋ［ＢＡＴ］Ｄ、Ｎａ１．ＣＭｅＹＷＤＫＶＣＭ、 Ｔ、７ミＦ　１５７３　９７　１２．０，１２．５［ＤＴＰＡコ（ｎ−Ｎａ１． ５Ｙ１１ｏＫＶＴＫ［ＢＡＴ］）２．７ミＦ　３２１０　９７　１２．１，１２ ．５［ＤＴＰＡ］　（ｏ−Ｎａ１．５ＹｆＤＫＶＴＫ［ＢＡＴコ）、アミド　１ ８０１　９６　１１．８，１２．０［ＤＴＰＡコＫ［ＢＡＴコｏ−Ｎａ１．ＣＭ 、ＹＷＤＫＶＣＭ、Ｔ、７ミＦ　１９４９　９６　１１．８，１２．０［ＢＡＴ −ＢＳ］（ｍａ）ＧＧＧＲＡＬｖＤＴＬＫＦＶＴＱＡＥＧＡＫ、７ミｔ’　４８ ０８　９６　１２．０［ＢＡＴコＫＫＬＬＫＫＬＹＫＫＩＩＫＫＬＬＥＳ　２５ ３３　９９　樹脂に結合ｐＧ１ｕ、ＧＶＮＤＮＥＥＧＦＦＳＡＲＫ［ＢＡＴ］、 アミド　１９９７　Ｎ、Ｄ、　Ｎ、Ｄ。

Ｉ適当なペプチドに関して以下の標識条件を用いた。

１ペプチドを５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解し、室温で標 識する。

２ペプチドを５ＱｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解し、１００℃ で標識する。

３ペプチドを水に溶解し、室温で標識する。

４ペプチドを水に溶解し、１００℃で標識する。

５ペプチドを５ＱｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６，０）に溶解し、１００℃ で標識する。

６ペプチドを５０ｍＭリン酸力ＩＪ’）ム緩衝液（ｐＨ５，０）に溶解し、室温 で標識する。

”ＨＰＬＣ法。

一般法　溶媒Ａ＝０．１％ＣＦ　３ＣＯＯＨ／　Ｈ２０溶媒Ｂ７゜＝０．１％Ｃ Ｆ、Ｃ０ＯＨ／７０％ＣＨｓ　ＣＮ　／　Ｈ２０溶媒Ｂ、。＝０１％ＣＦ３ＣＯ ＯＨ／９０％ＣＨ３ＣＮ／Ｈ，０溶媒流速＝１ｍＬ／分 ビダソク（Ｖｙｄａｋ）社のカラム＝Ｖｙｄａｋ２１８ＴＰ５４　ＲＰ−１８， ５μｍｘ　２２０ｍｍ　ｘ　４．６ｍｍの分析用カラム（ガードカラム付き）ブ ラウンリー（Ｂｒｏｖｎｌｅｅ）社のカラム＝Ｂｒｏｗｎｌｅｅ　５ｐｈｅｒｉ −５ＲＰ−１８，５μｍ　Ｘ　２２０ｍｍ　ｘ　４．５ｍｍのカラムウォーター ズ（Ｗａｔｅｒｓ）社のカラム＝Ｗａｔｅｒｓ　Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ　Ｃ１８゜ ５μｍ、３９　Ｘ　１５０ｍｍ 方法１：ブラウンリー社のカラム　１０分で１００％Ａから１００％Ｂ７゜へ方 法２　ビダック社のカラム　１０分で１００％Ａから１００％Ｂ、。へ方法３　 ビダック社のカラム　１０分で１００％八から１００％Ｂｔ。へ方法４：ブラウ ンリー社のカラム　１０分で１００％Ａから１００％Ｂｅｏへ方法５：ウォータ ーズ社のカラム　１０分で１００％Ａから１００％１３ｅｏヘアミノ酸の１文字 表記法は、ザベイ（Ｚｕｂａｙ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ ｒｙ）（第２版）、（１９８８年）（マクミレン・パブリッシング（ＭａｃＭｉ ｌｌｅｎ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）：ニューヨーク）の３３頁に記載されている ：Ａｃ＝アセチル；Ｐｉｃ＝ピコリノイル（ピリジン−２−カルボニル）；　＝ ６−アミノカプロン酸：Ｈ］ｙ＝ホモリジン；Ａｃｍ＝アセトアミドメチル；　 ｐＧ］　ｕ＝ピログルタミン酸：Ｍｏｂ＝４−メトキシベンジル；Ｐｉｃａ＝ピ コリルアミン（２−（アミノメチル）ピリジン）＋Ａｐｃ＝Ｌ−［Ｓ−（３−ア ミノプロピル）システィン：Ｆ　ｏ　”　Ｄ−フェニルアラニン：ＷＤ＝Ｄ　） ’リブトファン：Ｙｏ＝Ｄ−チロシン。

Ｃｐａ−Ｌ−（４−クロロフェニル）アラニン；Ｔｈｐ＝４−アミノ−テトラヒ ドロチオピラン−４−カルボン酸；ｍａ＝メルカプト酢酸；Ｄ−Ｎａ　Ｉ＝Ｄ− ２−ナフチルアラニン：Ｄｐｇ＝９ｇニジプロピルグリシンｅ＝ノルロイシン； ＢＡＴ＝Ｎ’、Ｎ’−ビス（２−メルカプト−２−メチルプロピル）−６，９− ジアザノナン酸；　ＢＡＴ酸（保護化）＝Ｎ’−（ｔ−ブトキノカルボニル）　 −Ｎａ。

ＮＯ−ビス（２−メチル−２−トリフェニルメチルチオプロピル）−６，９−ジ アザノナン酸；ＢＡＭ＝Ｎ’、Ｎｌ−ビス（２−メルカプト−２−メチルプロピ ル）−１，４，１０−トリアザデカン、ＢＡＭ（、保護化）＝Ｎ’−（ｔ−ブト キシカルボニル）−Ｎｌ、Ｎｌ−ビス（２−メチル−２−トリフェニルメチルチ オプロピル）−１，４，１０−）リアザブカン；　［ＢＡＴ−ＢＭＩ　＝Ｎ−［ ２−（Ｎ’　。

Ｎ゛−ビス（２−マレイミドエチル）アミノエチル］−Ｎ’−（ｔ−ブトキシカ ルボニル）−ＮＩ、Ｎ’−ビス（２−メチル−２−トリフェニルメチルチオプロ ピル）−６，９−ジアザノナンアミド：　［ＢＡＴ−ＢＳＳコニ−［２−（Ｎ’ 、Ｎ’−ビス（２−サクシンイミドエチル）アミノエチル］　−ＮＳ、ＮＩ−ビ ス（２−メルカプト−２−メチルプロピル）−６，９−ジアザノナンアミド、［ ＢＭＭＥ］　＝ビスーマレイミドメチルエーテル：　［ＢＳＭＥ］　＝ビスーサ クシンイミドメチルエーテル＋　［ＤＴＰＡ］　＝ジエチレントリアミンペンタ 酢酸実施例４ 高コレステロール血症ウサギモデルにおけるＴｃ−９９ｍ標識化合物Ｐ２１５を 用いるアテローム性動脈硬化症プラークの位置決定およびインビボ映像化体重が ２〜３ｋｇである２２匹の雌雄のニューシーラント・ホワイト（ＮＺＷ）ウサギ を２群に分けた。対照群は、市販のウサギの餌（ブリナ（Ｐｕｒｉｎａ）　）で 飼育された６匹のウサギよりなるものであった。１６匹のウサギ（ＨＣ群）には 、７通船から２８週船主で、標準化されたコレステロール高含有食（コレステロ ール濃度１％ｖ／ｖまで混合されたウサギ餌）を与えた。全動物に任意量の水を 与えた。

Ｔｃ−９９ｍ１ｌｌ識Ｐ２１５　（［ＢＡＴ］ＲＡＬＶＤＴＬＫＦＶＴＱＡＥＧ ＡＫアミド）を上記のとおり製造した。約２５０〜４００μｇのペプチドを、１ ４０〜１６０ｍＣ１のＴｃ−９９ｍで標識し、０２ｍｌ容量の用量中７〜８ｍＣ １（１２５〜２００μｇ／ウサギ；６〜７μｇ／ｋｇ）の単位用量で調製した。

成体ウサギにＴｃ−９９ｍ標識ペプチドを、外側耳静脈からゆっくりとしたポー ラス注入（約０．１ｍｌ／分）により静脈内投与した。針穴コリメーター（５ｍ ｍ口径）およびエネルギー窓の付いたガンマカメラをＴｃ−９９ｍに合わせ、５ ００．０００カウントを積算するかまたは所望の時間をスキャンするようにプロ グラムした。映像化の直前に、ケタミンおよびキンラジンの混合物（５，１，１ ｍｌ／ｋｇ筋肉内）で動物を麻酔した。

大動脈弓を描かせ下行大動脈を投影させるために、ガンマカメラ映像を４５°〜 ４５６で心臓の真上で（左前斜位［ＬＡＯ］投影）収集した。注射後１時間およ び２時間、時には３時間および５時間後に映像を得た。各映像収集の前に必要に 応じて追加の麻酔を注射した。

２．５時間経過時（２時間スキャン後）に、ベントパルビタールナトリウムの静 脈内投与で動物を犠牲にした。検死に際して、大動脈を取り出し、大動脈弁から 中腹部位までから分枝血管を切り離した。平行穴（ｐａｒａｌｌｅｌ　ｈｏｌｅ ）コリメーターを用いて、該大動脈をエクスコルボラ（ｅｘ　ｃｏｒｐｏｒａ） で映像化した。次に、該大動脈を縦長さ方向に開き、スダンＩＶで染色した。こ れにより、アテローム性動脈硬化症プラークを深赤レンガ色に変色させた。無脂 肪で無傷の動脈内皮は、これらの条件下、正常の輝く白ピンクの外観を保持した 。

これらの実験の結果を図１〜３に示す。両群のウサギが、Ｔｃ−９９ｍＰ２１５ の迅速な全身性クリアランスを示した。該シンチグラフィー映像は、肝胆管系が 主要なりリアランス経路を与えることを示している。対照（無プラーク）動脈は 、注射後短時間、循環する血液生成の放射活性のために見得るに過ぎなかった。

ＨＣ飼育ＮＺＷウサギの大動脈のそれぞれは、エクスコルボラ（ｅｘ　ｃｏｒｐ ｏｒａ）で映像化した場合、特有のプラーク分布のパターンおよび強度を示した 。ＨＣ大動脈はすべて、可変量の放射活性集積を有していたが、大動脈目領域の 最大沈渣の表示において、大動脈の遠位および近位の分節におけるより低度の集 積と合致した。

ＨＣ処理ウサギの大動脈におけるインビボおよびエクスコルボラ（ｅｘ　ｃｏｒ ｐｏｒａ）Ｔｃ−９９ｍ　Ｐ２１５映像およびスダンＩｖの沈渣パターンの間に 正の相関が認められた。これに反して、対照大動脈は、標識ペプチドの局所取り 込みを全く示さなかった。図１は、ＨＣ処理および４対照ウサギ大動脈のスダン ＩＶの沈渣パターンを示す。濃厚部分は、アテローム性動脈硬化症プラークの位 置を示す。図２および３は、それぞれ、対応するインビボおよびエクスコルボラ （ｅｘ　ｃｏｒｐｏｒａ）映像を示す。

これらの結果の示すところによれば、Ｔｃ−９９ｍ標識標識１５は、動物におい て、アテローム性動脈硬化症プラークを映像化する能力を有し、高い取り込みお よび迅速なりリアランスを有し、早期観察を促進する。また、正常な大動脈組織 は、標識Ｐ２１５の最小の取り込みを示し、これにより、人工的な正のシンチグ ラフィー映像の可能性を減少させる。

実施例５ イヌモデルにおける深静脈血栓のＴｃ−９９ｍ標識化合物Ｐ３５７を用いるイン ビボ映像化 雑種イヌ（２５〜３５１ｂ、−夜絶食）を、ケタミンおよびアセブロザミンの組 み合わせにより筋肉的に鎮静させ、ついでベントパルビタールナトリウムで静脈 内的に麻酔した。各々の動物に１８ゲージの血管カテーテルを右大腿静脈の半遠 位から挿入し、中大腿付近の大腿静脈に８ｍｍダクロン（Ｄａｃｒｏｎ（登録商 標））−巻きつきステンレス鋼塞栓フィル（タック・コーポレーション（Ｃｏｏ ｋ　Ｃｏ、）、ブルーミントン（Ｂ　ｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ）　、インジアナ） を入れた。該カテーテルを除去し、傷を縫合し、コイルの配置をＸ線により立証 した。

コイルを入れた１日後、各々の動物を再び麻酔し、前脚から食塩水を点滴静注し 、膀胱カテーテルを挿入して尿を集めた。低エネルギーの万能コリメーターの付 いたＴｃ−９９ｍについて光ピークにされたガンマカメラの下に動物を仰向けに した。ニュークリアー・マック・コンピューター・システム（ＮｕｃＬｅａｒ　 Ｍａｃｃｏｍｐｕｔｅｒ　ｓｙｓｔｅｍ）上で映像を得た。

Ｔｃ−９９ｍ標識標識０７［（ＣＨ３ＣＯ−Ｙｏ、　Ａｐｃ、　Ｇ　Ｄ　ＣＧ　 Ｇ　Ｃ−−−Ｇ　ＣＡ、。

ＧＧＣ，７ミド）２　［ＢＡＴ−ＢＳココ［１８５−３７０ｍＢｑ　（５〜１０ ｍｃ　ｉ）Ｔｃ−９９ｍおよび０．２〜０．４ｍｇ　Ｐ２Ｓ５コを、−の前足静 脈線に、挿入位置から注射した。第二の線は、血液の収集のために維持した。５ ００，０００カウントになるまでまたは２０分間（これはより短い）、注射後約 １０〜２０分および約１．２．３および４時間後に足の前方映像を得た。最終映 像の収集後、各動物をフェノバルビタールで深く麻酔した。心臓穿刺上、ヘパリ ン化シリンジを用いて２個の血液サンプルを集め、ついで心臓間またはポーラス 静脈内注射により安楽死量の飽和塩化カリウム溶液を投与した。ついで血栓を含 有する大腿静脈および大腿部筋肉のサンプルを注意深（解剖した。ついで該血栓 を血管から切り離し、秤量した試験管に入れた。ついで該血栓サンプルを秤量し 、Ｔｃ−９９ｍチャンネルのガンマウェルカウンター中で計数した。注射用量の 既知画分についても計数した。

新鮮な血栓の重量、血栓および安楽死の直前に得られた血液中のパーセント注射 用量（％ＩＤ）／ｇおよび血栓／血液および血栓／筋肉比を決定した。コンピュ ーター貯蔵映像から該血栓および隣接筋肉上に引かれた関心領域（ＲＯＩ）で測 定した計数／ビクセルを分析することにより、血栓／バックグランド比を決定し た。

深静脈血栓の映像化を合計８匹のイヌで検討した。これらの実験から得られた組 織データを以下の表に示す。２３．７１．１３９．２０８および２２２分に１匹 のイヌの後足の前方投影で得られた映像の代表例を図４に示す。これらの映像は 、注射後２３分における標識ペプチドの取り込みの指標を示す。これは、映像時 間終了まで続いた７１分までのはっきりとした位置を示す。

これらの結果は、深静脈血栓がインビボで速やかにまた効率的に位置決定され得 ることを示す。位置決定は注射後１時間以内に完全に達成され、コントラストお よび病巣解像を増しながら注射後約４時間にわたり継続した。

血栓／　％ＩＤ／ｇ ＩＣ□　バックグランド　血栓　血栓／血液　血栓／筋肉０．０８１°　２．３ ″　０゜０１６±０．００５　５．６±１４　１７±４，７示した値は平均±平 均からの標準偏差である。

［’＝ｎ＝１１ 表中に示したＩＣ，。値を以下のとおり決定した。実質的にズッカー（Ｚ　ｕｃ ｋｅｒ）の記載（１９８９、メソッズ・インーエンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏＬ、）１６９・１１７−１３３）のとおりにして血小板 凝集を調べた。簡単に言えば、血小板凝集抑制性と推定される化合物を用いある いは用いないで、１マイクロリツトルあたり３００．０００の血小板を含む新鮮 なヒト血小板高含有血漿を使用することにより血小板凝集を検定した。最終濃度 １０〜１５マイクロモルになるまでアデノシンニリン酸の溶液を加えることによ り血小板凝集を誘導し、バイオ／データ（Ｂ　ｉｏ／　Ｄａｔａ）凝集検出計（ バイオ／データ・コーポレーション（Ｂ　ｉｏ／Ｄａｔａ　Ｃｏｒｐ、）　、ホ ージャム（Ｈｏｒｓｈａｓ）　、ペンンルベニア）を使用して血小板凝集を監視 した。使用する血小板凝集抑制化合物の濃度は、０．１〜５００μｇ／ｍ１の範 囲であった。血小板凝集度を５０％減少させる抑制剤の濃度（ＩＣ５゜とじて定 義される）は、抑制剤１度対血小板凝集度のプロットから決定した。陽性対照と して試験した血小板の各バッチについて、ペプチドＲＧＤＳについての抑制曲線 を決定した。

以上の開示は、本発明のある特定の具体例を強調するものであり、これらと等価 なあらゆる修飾または代替は、添付の請求の範囲に記載のとおり、本発明の精神 および範囲に含まれるものと理解されるべきである。

ｂ狽」 ＮＲＩＣ６ＩＣ５ＩＣ３ＨＣＩ ｂ狽ニ 旦＆」 番 圭 １＋＋＋＋ｌＡ、＋＋＋Ｎ−ＰＣＴ／ＵＳ　９３１０３６８７１＋＋＋＋＋＋＋ −＋　ＰＣＴ／ＵＳ　９３１０３６８７フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＣＯ７Ｋ　７７０８ １４１００　ＺＮＡ　８３１８−４Ｈ （７２）発明者　マクブライド、ウィリアムアメリカ合衆国０３１０２ニユーハ ンプシヤー州、マンチェスター、ゴルフビュー・ドライブ１１０番 Ｉ （７２）発明者　リスター−ジェイムズ、ジョンアメリカ合衆国０３１１０ニュ ーハンプシャー州、ベッドフォード、オールド・ストーン・ウェイ２罎 （７２）発明者　シビテッ口、エドガー・アールアメリカ合衆国０３０５４ニユ ーハンプシヤー州、メリマック、キンバリー・ドライブ１７−３２番

Claims (52)

【特許請求の範囲】
1. １．３〜１００個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列を有する特異的結合ペプチド およびそれに共有結合した放射性同位体標識結合部位からなり、該放射性同位体 標識結合部位が放射性同位体とで錯体を形成でき、該放射性同位体結合部位と該 放射性同位体との該錯体が電気的に中性である哺乳動物体内の部位を造影するた めのシンチグラフィー造影剤の製造用試薬。
2. ２．該特異的結合ペプチドおよび該放射性同位体標識結合部位が約１〜約２０個 のアミノ酸を介して共有結合している請求項１記載の試薬。
3. ３．該放射性同位体がテクネチウムー９９ｍである請求項１記載の試薬。
4. ４．該特異的結合ペプチドかアミノ酸配列：【配列があります】 を有するペプチドからなる群より選択される請求項１記載の試薬。
5. ５．該試薬が、さらに、多数の多価シンチグラフィー造影剤を調製するための試 薬を構成するための、多数の特異的結合化合物に共有結合し、かつ多数の放射性 同位体標識結合部位に共有結合した多価結合部位よりなり、ここに、該多数の多 価シンチグラフィー造影剤の分子量が約２００００ダルトン未満である請求項１ 記載の試薬。
6. ６．該多価結合部位がビス−スクシンイミジルメチルエーテル、４−（２，２− ジメチルアセチル）安息香酸、Ｎ−［２−Ｎ１，Ｎ１−ビス（２−スクシンイミ ドーエチル）アミノエチル］−Ｎ８，Ｎ９−ピス（２−メチル−２−メルカプト プロピル）−６，９−ジアザノナンアミド、トリス（スクシンイミジルエチル） アミンまたはそれらの誘導体である請求項５記載の試薬。
7. ７．請求項１記載の試薬よりなり、該放射性同位体標識結合部位が放射性同位体 標識に結合したシンチグラフィー造影剤。
8. ８．該放射性同位体標識がテクネチウムー９９ｍである請求項６記載の試薬。
9. ９．還元剤の存在下で請求項１記載の試薬をテクネチウー９９ｍと反応させるこ とにより形成された錯体。
10. １０．該還元剤が亜二チオン酸イオン、第一スズイオンまたは第一鉄イオンの群 から選択される請求項９記載の錯体。
11. １１．予め還元したテクネチウムー９９ｍ錯体の配位子交換によって、請求項１ 記載の試薬を、テクネチウムー９９ｍで標識することによって形成された錯体。
12. １２．放射性医薬製剤を調製するためのキットであって、所定量の請求項１記載 の試薬および該試薬をテクネチウムー９９ｍで標識するのに十分な量の還元剤を 含有するシールしたバイアルからなる該キット。
13. １３．テクネチウムー９９ｍで標識した請求項１記載の試薬の診断有効量を投与 し、次いで、哺乳動物体内の部位に位置するＴｃ−９９ｍを検出することを特徴 とする哺乳動物体内の部位を造影する方法。
14. １４．請求項１記載の試薬の製法であって、ペプチドをｉｎｖｉｔｒｏにて化学 的に合成する該製法。
15. １５．請求項１４記載のペプチドの製法であって、該ペプチドを固相ペプチド合 成法によって合成する該製法。
16. １６．３〜１００個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列を有する特異的結合ペプチ ドおよび式： ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＸはＨまたは保護基； （アミノ酸）はいずれかのアミノ酸］ の放射性同位体標識結合部位よりなり、該放射性同位体標識結合部位は該ペプチ ドに共有結合しており、該放射性同位体標識結合部位は放射性同位体とで錯体を 形成し、該放射性同位体標識結合部位と該放射性同位体との該錯体は電気的に中 性である哺乳動物体内の部位を造影するためのシンチグラフィー造影剤の製造用 試薬。
17. １７．該アミノ酸がグリシンであって、Ｘがアセトアミドメチル保護基である請 求項１６記載の試薬。
18. １８．該特異的結合ペプチドおよび該放射性同位体標識結合部位が約１〜約２０ 個のアミノ酸を介して共有結合している請求項１６記載の試薬。
19. １９．該放射性同位体かテクネチウムー９９ｍである請求項１６記載の試薬。
20. ２０．該特異的結合ペプチドが、アミノ酸配列：【配列があります】 を有するペプチドからなる群より選択される請求項１６記載の試薬。
21. ２１．該試薬が、さらに、多数の多価シンチグラフィー造影剤を調製するための 試薬を構成するための、多数の特異的結合化合物に共有結合し、かつ多数の放射 性同位体標識結合部位に共有結合した多価結合部位よりなり、ここに、該多数の 多価シンチグラフィー造影剤の分子量が約２００００ダルトン未満である請求項 １６記載の試薬。
22. ２２．該多価結合部位がビス−スクシンイミジルメチルエーテル、４−（２，２ −ジメチルアセチル）安息香酸、Ｎ−［２−Ｎ１、Ｎ１−ピス（２−スクシンイ ミド−エチル）アミノエチル］−Ｎ６，Ｎ９−ビス（２−メチル−２−メルカプ トプロピル）−６，９−ジアザノナンアミド、トリス（スクシンイミジルエチル ）アミンまたはそれらの誘導体である請求項２１記載の試薬。
23. ２３．請求項１６記載の試薬よりなり、該放射性同位体標識結合部位が放射性同 位体標識に結合したシンチグラフィー造影剤。
24. ２４．該放射性同位体標識がテクネチウムー９９ｍである請求項２３記載の試薬 。
25. ２５．還元剤の存在下で請求項１６記載の試薬をテクネチウムー９９ｍと反応さ せることによって形成された錯体。
26. ２６．該還元剤が亜二チオン酸イオン、第一スズイオン、または第一鉄イオンの 群から選択される請求項２５記載の錯体。
27. ２７．予め還元されたテクネチウムー９９ｍ錯体の配位子交換によって、請求項 １６記載の試薬をテクネチウムー９９ｍで標識することによって形成された錯体 。
28. ２８．放射性医薬製剤を製造するためのキットであって、請求項１６記載の試薬 の所定量と、テクネチウムー９９ｍで試薬を標識するのに十分な量の還元剤を含 有するシールしたバイアルからなる該キット。
29. ２９．テクネチウムー９９ｍで標識した請求項１６記載の試薬の診断有効量を投 与し、次いで、哺乳動物体内の部位に位置するＴｃ−９９ｍを検出することを特 徴とする哺乳動物体内の部位を造影する方法。
30. ３０．請求項１６記載の試薬の製法であって、該ペプチドをｉｎｖｉｔｒｏにて 化学的に合成する該製法。
31. ３１．請求項３０記載のペプチドの製法であって、該ペプチドを固相ペプチド合 成法によって合成する該製法。
32. ３２．３〜１００個のアミノ酸よりなるアミノ酸配列を有する特異的結合ペプチ ド、およびそれに共有結合したビスアミノビスチオール放射性同位体標識結合部 位からなり、該放射性同位体標識結合部位が放射性同位体とで錯体を形成し、該 放射性同位体標識結合部位と該放射性同位体との該錯体が電気的に中性であり、 および該ビスアミノビスチオール放射性同位体標識結合部位が：▲数式、化学式 、表等があります▼ ［式中、各Ｒは、独立して、Ｈ、ＣＨ３またはＣ２Ｈ５；各（ｐｇｐ）■は、独 立して、チオール保護基またはＨ；ｍ、ｎおよびｐは、独立して、２または３； Ａは線状または環状低級アルキル、アリール、複素環、それらの組合せまたは置 換誘導体を意味する］ および ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、各Ｒは、独立して、Ｈ、ＣＨ３またはＣ２Ｈ５；ｍ、ｎおよびｐは、独 立して、２または３；Ａは線状または環状低級アルキル、アリール、複素環、そ れらの組合せまたは置換誘導体； ＶはＨまたは−ＣＯ−ペプチド； Ｒ′はＨまたはペプチド； ここに、ＶがＨである場合、Ｒ′はペプチドであって、Ｒ′がＨである場合、Ｖ は−ＣＯ−ペプチドである］ よりなる群から選択される式を有する、哺乳動物体内の部位を造影するためのシ ンチクグラフィー造影剤製造用の試薬。
33. ３３．該特異的結合ペプチドおよび放射性同位体標識結合部位が約１ないし約２ ０個のアミノ酸を介して共有結合している請求項３２記載のペプチド。
34. ３４．該放射性同位体がテクネチウムー９９ｍである請求項３２記載のペプチド 。
35. ３５．該特異的結合ペプチドがアミノ酸配列：【配列があります】 を有するペプチドよりなる群から選択される請求項３２記載のペプチド。
36. ３６．該試薬が、さらに、多数の多価シンチグラフィー造影剤を調製するための 試薬を構成するための、多数の特異的結合化合物に共有結合し、かつ多数の放射 性同位体標識結合部位に共有結合した多価結合部位よりなり、ここに、該多数の 多価シンチグラフィー造影剤の分子量が約２００００ダルトン未満である請求項 ３２記載の試薬。
37. ３７．該多価結合部位かピスースクシンイミジルメチルエーテル、４−（２，２ −ジメチルアセチル）安息香酸、Ｎ−［２−Ｎ１、Ｎ１−ビス（２−スクシンイ ミド−エチル）アミノエチル］−Ｎ６，Ｎ９−ビス（２−メチル−２−メルカプ トプロピル）−６，９−ジアザノナンアミド、トリス（スクシンイミジルエチル ）アミンまたはそれらの誘導体である請求項３６記載の試薬。
38. ３８．請求項３２記載の試薬よりなり、該放射性同位体標識結合部位が放射性同 位体標識に結合したシンチグラフィー造影剤。
39. ３９．該放射性同位体標識がテクネチウムー９９ｍである請求項３８記載の試薬 。
40. ４０．還元剤の存在下で請求項３２記載の試薬をテクネチウムー９９ｍと反応さ せることによって形成された錯体。
41. ４１．該還元が亜ニチオン酸イオン、第一スズイオン、または第一鉄イオンの群 から選択される請求項４０記載の錯体。
42. ４２．予め還元されたテクネチウムー９９ｍ錯体の配位子交換によって、請求項 ３２記載の試薬をテクネチウムー９９ｍで標識することによって形成された錯体 。
43. ４３．放射性医薬型剤を製造するためのキットであって、請求項３２記載の試薬 の所定量と、テクネチウムー９９ｍで試薬を標識するのに十分な量の還元剤を含 有するシールしたバイアルからなる該キット。
44. ４４．テクネチウムー９９ｍで標識した請求項３２記載の試薬の診断有効量を投 与し、次いで、哺乳動物体内の部位に位置するＴｃ−９９ｍを検出することを特 徴とする哺乳動物体内の部位を造影する方法。
45. ４５．請求項３２記載の試薬の製法であって、該ペプチドをｉｎｖｉｔｒｏにて 化学的に合成する該製法。
46. ４６．請求項４５記載のペプチドの製法であって、該ペプチドを固相ペプチド合 成法によって合成する該製法。
47. ４７．放射性同位体標識結合部位からなり、ここに該放射性同位体標識結合部位 が放射性同位体とで錯体を形成し、該放射性同位体標識結合部位と該放射性同位 体との該錯体が電気的に中性である組成物。
48. ４８．式： ▲数式、化学式、表等があります▼または▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｘは水素または保護基： （アミノ酸）はいずれかのアミノ酸を意味する］の放射性同位体標識結合部位よ りなり、該放射性同位体標識結合部位が放射性同位体とで錯体を形成し、および 該放射性同位体標識結合部位と該放射性同位体との該錯体が電気的に中性である 組成物。
49. ４９．該アミノ酸がグリシンであってＸがアセトアミドメチル保護基である請求 項１２記載の試薬。
50. ５０． ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、各Ｒは、独立して、Ｈ、ＣＨ３またはＣ２Ｈ５であり、ＸがＨであれば １つのＲはＹ； （ｐｇｐ）Ｎはアミノ保護基またはＨ；各（ｐｇｐ）■は、独立して、チオール 保護基またはＨ；ｍ、ｎおよびｐは、独立して、２または３；ＸはＨまたは−Ａ −ＣＯＯＨであり、ＸがＨである場合、１つのＲはＹであって（ｐｇｐ）ＮはＨ でない； Ｙは−Ａ−ＣＯＯＨ； Ａは線状または環状低級アルキル、アリール、複素環、それらの組合せまたは置 換誘導体を意味する］ ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、各Ｒは、独立して、Ｈ、ＣＨ３またはＣ２Ｈ５であり、ＺがＨである場 合、１つのＲはＹ； 各（ｐｇｐ）Ｎはアミノ保護基またはＨ；各（ｐｇｐ）■は、柱立して、チオー ル保護基またはＨ；ｍ、ｎおよびｐは、独立して、２または３；ＺはＨまたは− Ａ−ＣＨ（Ｖ）ＮＨ（ｐｇｐ）２Ｎであり、ＺがＨである場合、１つのＲはＹ； Ｙは−Ａ−ＣＨ（Ｖ）ＮＨ（ｐｇｐ）２Ｎ；Ａは線状または環状低級アルキル、 アリール、複素環、それらの組合せまたは置換誘導体； ＶはＨまたはＣＯＯＨ； （ｐｇｐ）ＮおよびＶがＨである場合、（ｐｇｐ）５はＨでなく、（ｐｇｐ）■ およびＶがＨである場合、（ｐｇｐ）ＮはＨでなく、ＶがＨである場合、（Ｐｇ Ｐ）１ＮはＨでない］ および ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、各Ｒは、独立して、Ｈ、ＣＨ３またはＣ２Ｈ５であって１つのＲはＹ； 各（ｐｇｐ）Ｎはアミノ保護基またはＨ；各（ｐｇｐ）■は、独立して、チオー ル保護基またはＨ；ｍ、ｎおよびｐは、独立して、２または３；Ｙは−Ａ−ＣＨ （Ｖ）ＮＨ（ｐｇｐ）２Ｎ；Ｙは線状または環状低級アルキル、アリール、複素 環、それらの組合せまたは置換誘導体； ＶはＨまたはＣＯＯＨ； （ｐｇｐ）２ＮおよびＶがＨである場合、（ｐｇｐ）■はＨでなく、（ｐｇｐ） ■およびＶがＨである場合、（ｐｇｐ）２ＮはＨでなく、および少なくとも１つ の（ｐｇｐ）１Ｎ部位はＨでない］ よりなる群から選択される式を有するビスアミノビスチオール放射性同位体標識 結合部位からなり、該放射性同位体標識結合部位が放射性同位体とで錯体を形成 し、該放射性同位体標識結合部位と該放射性同位体との該錯体が電気的に中性で ある組成物。
51. ５１．Ｎ−α−保護リシンのε−アミノ基に結合した請求項５０の化合物からな る組成物。
52. ５２．該化合物が［Ｎ−ε−（Ｎ′−ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｎ６，Ｎ９− ビス［２−メチル−２−（トリフェニルメチルチオ）プロピル］−６，９−ジア ザノナノイル）−Ｎ−α−Ｆｍｏｃ−リシンである請求項５０記載の組成物。