JPH07506430A - 微細加工した検出構造体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微細加工した検出構造体 関連出願の引用 本願は以下の同時係属出願、米国特許出願筒０７／８７７．７０１号（１９９２ 年５月１日出願）；米国特許出願筒０７／８７７．５３６号（１９９２年５月１ 日出願）：米国特許出願筒０７／８７７．６６２号（１９９２年５月１日出願） ：および米国特許出願筒０７／８７７．６６１号（１９９２年５月１日出願）と 同時に出願されており、これらの開示を出典明示により本明細書の一部とみなす 。

発明の背景 本発明は、一般に、分析方法および分析用装置に関する。さらに詳しくは、本発 明は流体試料についての所定の検定プロトコルを受け、かつ迅速に処理する能力 を有する小型の、典型的には、−回使用のモジュールの設計および構築に関する 。

近年の数１０年間、技術は、種々の診断およびモニター観察を目的とするために 、生物学的試料を分析するための非常に多くのプロトコル、試験キット、および カートリッジを開発してきた。免疫検定、凝集検定、ポリメラーゼ連鎖反応に基 づく分析、多種のりガント−レセプター相互作用、および複合試料中の種の分別 移動は、すべて、種々の生物学的化合物または夾雑物の存在または濃度、あるい は特定の型の細胞の存在を測定するのに用いられてきた。

最近、生物学的試料を処理するための、およびある種の臨床的試験を行うための 小型の使い捨て装置が開発された。ショーン（Ｓｈｏｊｉ）らは、ノリコンウェ ーハー上に加工された小型の血液ガス分析器の使用を報告した［ショージら、セ ンサーズ・アンド・アクチュエーターズ（Ｓｅｎｓｏｒｓ　ａｎｄ　Ａｃｔｕａ ｔｏｒｓ）、１５　：　１０１−１０７　（１９８８）］。サト（Ｓａｔｏ）ら は、微細機械加エンリコン装置を用いる細胞融合法を報告した［サト（Ｓａｔｏ ）ら、センサーズ・アンド・アクチュエーターズ（ＳｅｎｓｏｒｓａｎｄＡｃｔ ｕａｔｏｒｓ）、Ａ２１−Ａ２３＋９４８　９５３（１９９０）コ。

チバ・コーニング・ダイアグノステイ・ワイス・コーポレイション（Ｃｉｂａ　 ＣｏｒｎｉｎｇＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｃａｒｐ、　）　（Ｕ　Ｓ　Ａ）は血 餅検出用のマイクロプロセツサ調整レーザー測光器を製造した。

微細機械加工技術はマイクロエレクトロニクスの産業分野に端を発する［アン的 細胞の大きさ）からナノメーター（ある生物学上の高分子の大きさ）までの範囲 の最小の構造エレメントを有するマイクロエンジニア装置の製造を可ｌｌｔとし ｔこ。

このスケールを、本明細書にて「メソスケール」という。メソスケールの構造番 ；関連する大部分の実験は微細機械加工、すなわち、機械的運動および流動特性 の研究を包含する。メソスケール構造の能力はライフサイエンスの分野（こて十 分１こは活用されていない。

プルネット（エクスペリメンタル・セル・リサーチ（Ｅｘｐｅｒ、Ｃｅ１ｌ　Ｒ ｅｓ、　）　。

１６７：２０３−２１７　（１９８６）および１旦４：１１−２６　（１９８６ ））は、シリコン、チタン被覆ポリマーなどの溝中にて繊維芽細胞および上皮細 胞の行動を研究した。マツカートニー（ＭｃＣａｒｔｎｅｙ）ら（カンサー・リ サーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、）、４１　：　３０４６−３０５１　（１９８１ ））Ｉｔ溝を付したプラスチック基材中にて腫瘍細胞の行動を試験した。ラセル （ＬａＣｅｌｌｅ）　（ブラ・ノド・セルズ（ＢｌｏｏｄＣｅｌｌｓ）　、１２ 　：１７９−１８９　（１９８６）はマイクロキャピラリー中の白血球および赤 血球の流動性を研究し、微小循環に対する眼識を得ｔこ。

ハングおよびワイスマン（Ｈｕｎｇおよびｆｅｉｓｓｍａｎ）は微細機械加工さ れたチャネル中の流体力学についての研究を報告したが、分析装置に関連するデ ータを作成しなかった［ハング（Ｈｕｎｇ）ら、メディカル・アンド・／くイオ ロジカル・エンジニアリング（Ｍｅｄ、ａｎｄ　Ｂｉｏｌ、Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉ ｎｇ）　、旦：２３７−２４５　（１９７１）；およびワイスマン（Ｙｅｉｓｓ ｍａｎ）ら、アム・インスト・ケム・エング・ジエイ（八ｍ、　Ｉｎ５ｔ、　Ｃ ｈｅＩｆｉ、　Ｅｎｇ、　Ｊ、　）　、よヱ＋　２５−３０　（１９７１）コ。

コロンブス（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ）らは、生物学的流体の毛管流動性の調整におＬ Ｘで２つの直交して配向した７字溝を付した／−トからなるサンドウ什ソチ部を 、実験的複数チャ不ル試験装置中の個々のイオン選択性電極に用いた「コロンブ ス（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ）ら、クリニカル・ケミスＩ・リー（９り町りμｍ）、子 穴　１゜５３１−１５３７　（１９８７）コ。

マスタ（Ｍａｓｕｄａ）らおよびワツズ（Ｗａｓｈｉｚｕ）らは、細胞を操作（ 例えば、細胞融合）するｊ二めの流体流動チャンバーの使用を報告している〔マ スタ（Ｍａｓｕｄａ）ら、プロン−ディンゲス−ＩＥＥＥ／ＩＡＳ−ミーティン グ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ＩＥＥＥ／ＩＡＳ　Ｍｅｅｔｉｎｇ）、１５４９ −１５５３頁（１９８７）；およびワツズ（Ｗａｓｈｉｚｕ）ら、プロノーディ ンゲス・ＩＥＥＥ／ＩＡｓ・ミーティング、１７３５−１７４０頁（１９８８） ］。該文献は生物学的流体を分析するためのおよび微生物を検出するためのメソ スケール装置の使用の可能性をそれほど探求していない。

微生物の検出用に用いる近年の分析法は、自動化されいているのが稀であり、通 常、適当な培地中にてインキュベートして微生物を増殖させ、必ず視覚的および ／または化学的方法を用いてその菌株または亜種を同定する必要がある。そのよ うな方法における固有の遅れは、感染症の性質を決定する前に、頻繁に医療介入 を必要とする。産業、一般の健康または臨床的環境下、そのような遅れは重大な 結果をもたらすかもしれない。微生物を速やかに検出するための都合のよいシス テムについての要求がある。

本発明の目的は、試料の微量を分析し、掻く低濃度にて存在する物質を検出し、 速やかに分析結果を呈示できる最適反応環境を有する分析システムを提供するこ とである。もう一つ別の目的は、生物学的および他の適用範囲にて、予め選択さ れた分子または細胞分析物を迅速にて自動的に分析可能なメソスケール機能性エ レメントを有する、量産が容易で、使い捨ての小型（例えば、容積がｌｃｃ未満 ）の装置を提供することである。本発明のさらに別の目的は、個人で、一連の迅 速な臨床試験、例えば細菌混入、ウィルス感染、精子運動性、血液パラメーター 、食品、水または体液中央雑物などについての試験を行うのに用いることができ るそのような一部の装置を提供することである。

発明の要約 本発明は流体試料中の予め選択された分析物を検出するための方法および装置を 提供する。該装置は、典型的には、２ないし３ｍｍ厚のオーダーで、適当には０ ２〜２０平方ｃｍの、試料流１人ポー叫・およびメソスケールの流動システムを 形成するように微細加工された（＋１ｃｒｏｆａｂｒｊｃａｔｅｄ）固体基材か らなる。「メンス′ｒ−ル」なる語は、本明細書中、０１μｍ〜５００μｍのオ ーダーの断面を有するチャンバへおよび流路を定義するのに用いる。メソスケー ルの流動チャネルおよび流体処理領域は、好ましい深さが０．１１１ｍ〜１００ μｍ１典型的には２〜５０μｍのオーダーである。該チャネルは、２０μｍ−５ ００μｍ、さらに好ましくは３〜１００μｍのオーダーの好ましい幅を有する。

多（の適用には、５５−５０ｕ幅のチャネルが有用である。基材中のチャンバー は、しばしば、より大きな寸法、例えば２ないし３ｍｍの寸法を有する。

該装置のメソスケールの流動／ステムは、流入ポートから伸びる試料流動チャネ ルと、流動チャネルと流体連絡している分析物検出領域とからなる。その分析物 検出領域は、分析物と特異的に結合するように、所望によりその間に固定されて いてもよい、結合部を備えている。その検出領域のメソスケールの寸法は、動力 学的に結合部と分析物の結合を容易にする。すなわち、検出領域中、複数回の分 子衝突が起こるように、反応体は限定された空間にて互いに密集した状態にある 。該装置は、細胞または高分子の分析を包含する、または反応もしくは細胞増殖 をモニター観察するための、種々の自動化された、感度良好かつ迅速な臨床試験 を行うのに用いてもよい。

一般に、本明細書にて開示されているように、固体基材は、メソスケールの流動 システムを有するチップからなる。該チップは機能的な幾何学的特徴と微量の分 析物の検出を行うのに臨床化学において周知の型を組み合わせて活用するように 設計されている。メソスケールの流動システムは、確立された微細機械加工法を 用いて／リコンおよび他の固体基材から、またはポリマー材料を成型することに より設計加工されていてもよい。装置中のメソスケールの流動システムは、流動 チャネル（複数）および検出領域（複数）を基材の表面に微細加工し、ついでそ の表面上方にカバー、例えば透明ガラスカバーを取り付けることにより組み立て られる。該チップの厚さを介するチャネルおよびチャンバーの断面は、三角形、 先端を切断した円錐形、正方形、方形、円形または池のいずれの形状であっても よい。該装置は、典型的には、微量（く５μＬ）の試料を分析するのに適する大 きさに設計されており、例えば、基材を介するかまたは透明なカバースリップを 介する流動システムとの孔連絡によって、形成された流入ポートを通って流動シ ステム中に導入される。微量の試料流体中に極低濃度（例、ナノグラム量）にて 存在する細胞または他の分析物を速やかに（例えば、＜１０分）分析できる。

チップは、典型的には、器具と一緒に用いられ、該器具は該チップを保持するた めの嵌め合わせ部位を有し、該チップ上の投入ポートを器具の流動ラインと接合 させる。特定の分析物、細胞性夾雑物、またはトキンンを含有すると考えられる 生物学的流体、例えば血液、血漿、血清、尿、痰、唾液または他の流体を基材の 流入ポートに加え、チップを器具に設置し、ポンプを作動させて試料を流動シス テムを介して押しやる。また、試料を器具によりチップ中に注入してもよく、ま たは試料を毛管作用により流入ポートを介してチップのメソスケールの流動シス テムに入れてもよい。

装置中、分析物の結合部への結合は、試料中の分析物の存在について陽性表示と して供する。メソスケールの検出領域は、予め選択された分析物に特異的に結合 する能力を有する結合部を備えている。結合部は、例えば、溶液にて検出領域に デリバリ−することができる。また、結合部は検出領域に固定化されていてもよ い。特異的流体試料構成物を検出または分離するために、装置のメソスケールの 検出領域の内面を固定結合部て被覆し、その表面を流体試料と相互作用させるこ とができる。抗体またはポリヌクレオヂドブローブを流動チャネルの表面に固定 し、メソスケールの流動システムを免疫検定またはポリヌクレオチド雑種形成検 定について使用することができる。結合部はまた、リガンドまたはレセプターか らなっていてもよい。細胞表面分子を介して細胞との結合能を有する結合部を用 いて、生物学的微小試料中の細胞集団を単離または検出することができる。メソ スケールの流動／ステムはまた、突出部または断面積が減少しているセクション からなっていてもよく、流動システムを流れる微小試料中の細胞の分別または溶 解を可能とする。

検出領域中の結合部に結合する分析物は、例えば、検出領域の上方にある透明カ バーまたは基材それ自体が半透明セクションであるような、透明または半透明の ウィンドーを介して、光学的に検出てきる。分析物と結合部の結合後、陽性検定 を示す色相、蛍光、発光などの変化は、視覚的にまたは機械によりいずれかで検 出できる。器具は、分析物が検出領域中の結合部に結合することによる光学特性 の変化を、検出領域の上方に配置された透明カバーを介して検出することができ る分光光度計のような検知装置を有していてもよい。

該装置は、さらには、分析物に結合し、分析物の存在を示す検出可能なシグナル を発する、標識化物質のような試薬を検出領域にデリバリ−するための手段を有 していてもよい。所望により、チップ構造体中に利用されるプロトコルに依存し て、器具はまた検定を終えるに必要な試薬を注入するように、例えば、光学的に 検出可能な基で標識化した結合蛋白質、酵素との反応用の基質溶液、または他の 試薬を注入するように設計されていてもよい。

陽性検定はまた、分析物の結合後に検出可能な凝集または流動インピーダンスに より示される。流体試料中の予め選択された分析物の存在は、流動／ステムの異 なる地点での、圧力または電気伝導度の変化のごとき、分析物誘発の試料流体の 流動特性における変化を検知することにより検出してもよい。−の具体例におい て、例えば、フラクタル（ｆｒａｃｔａｌ）領域における、分析物誘発のメソス ケール流動システム中の流動性の制限または遮断を、例えば、該装置と組み合わ せて用いる器具中の圧力検出器によって検出してもよい。もう一つ別の具体例に おいて、試料流体の導入により引き起こされる流動システムの領域における分析 物誘発の伝導度の変化は、流動システムと接触している電気伝導度検知機を介し て容易に検出することができる。例えば、分析物の存在は制限された流路の目詰 まりを引き起こし、該流路の向こうにて、流体の無いことは伝導度を測定するこ とにより検出できる。器具はさらに、嵌め合わせ領域にて、例えば、流動システ ムの一部を加熱しまたは冷汗する電気抵抗を付与するのに、チップ構造体中に一 体成型された接触部と接合する電気接触部を、または流動システムのある領域に て、分析物の存在について陽性表示としての流動制限を示すのに、検知された圧 力読み、伝導度などの電気シグナルを受ける電気接触部を有していてもよい。

メソスケールの装置は広範な生物学的試験または池の試験を行うのに用いること ができる。装置は、例えば、共通の流入ポートにより試料が送り込まれ、例えば 種々の検出領域にて種々の結合部を有する２またはそれ以上の分離された流動シ ステムからなっていてもよく、２またはそれ以上の分析物を同時に検出できる。

該装置はまた、対照用流動システムからなっていてもよく、その結果、試料領域 および対照領域からのデータを検出し、かつ比較できる。本質的に、分子または 原子スケールの分析物の存在または１度あるいは特定の型の細胞の検出を包含す るいずれの試験もこのような構造体で有利に実行することができる。このメソス ケールの装置は病原性の細菌またはウィルスの検出についての迅速な化学的試験 法を提供することができる。該装置はさらにホルモンのような血液構成物の存在 または１度についての迅速な試験を提供することができる。限定されるものでは ないが、他の適用としての血液型試験のような一部の他の生物学的検定を包含す る。

本明細書に開示されている装置はすべて、分子分析物または細胞型のような分析 成分と反応し、結合部を有するメソスケールの検出領域により特徴付けられ、分 析物の存在または濃度を検出するものである。該装置は検定前に簡単に滅菌処理 されていてもよい。検定は容易になされ、その検定の終わりに、チップは廃棄で き、それは有利には試料間の汚染を防止し、危険物質を廃棄し、処分を要するほ んの微量の流体が生じるだけの、安価な微小試料分析を提供する。該装置のいく つかの特徴および利点を表１に要約する。

五−↓ 柔軟性　チップの数、デザインまたは用途に対して制限なし。

再生可能　チップの信頼できる、標準化された量産が可能。

低コスト生産　既存のシステムと競合する価格設定が可能。−再使用を目的とす る使い捨て特性。

小型　嵩高い器具は不要。それ自体、一般的でないｌａｂ環境下にて用いるため に設計された携帯用ユニットおよびシステムに役立つ。最少の貯蔵および輸送コ スト。

マイクロスケール　必要な試料および試薬が最少。特により高価で、特異的な試 験操作の場合に、試薬コストを減少させる。簡単な操作工程が可能。

滅菌性　チップは微生物検定および清潔な環境を必要とする他の操作における使 用にて滅菌処理できる。

密封システム　生物学的危険性を最小とする。処理の信頼性を確保。

複数のサーキット　単一のチップ上で複数の処理および分析が可能。

性能 複数の検出器性能　検定および処理について、実質的にいずれのシステムまでも モニター性能が拡張する。広範な適用が可能。

再使用可能な　ある種の適用についてのユーザーの処理当たりのコストのチップ 　減少。

図面の簡単な記載 図１は、固体基材（１４）からなる装置であって、その上に機械加工処理された 流入ポート（１６）が、基材表面に取り付けた透明カバー（１２）と、メソスケ ール流動チャネル（２０）によって連結されている、本発明に係る装置の模式的 縦方向断面図である。

図２は、図１の装置の斜視図である。

図３は、装置（１０）から試薬または試料流体をデリバリ−または除去するため のポート（３２）を含む、装置（１０）を保持するための支持ブロック（３０） の断面図である。

図４は、基材上にて左右対称に配置された流動チャネル（４０）のフラクタル分 岐状のシステムて加工された基材（１４）の模式的平面図である。

図５は、器具（５０）中に嵌め合わせた分析装置（１０）の概略図であり、該器 具は装置（１０）を保持し、装置（１０）中の試料流体の圧力を調整し、検出す るのに用いられる。

図６は、流入ボー１−　（１６）および流動チャネル（２０）を有する一対のメ ソスケール流動システムを微細加工した基材（１４）からなる装置の模式的上面 図である。

図７は、流入ポート（１６）、流動チャネル（２０）および試料検出チャンバー （２２）を有するメソスケール流動システムを加工した基材（１４）からなる別 の装置の模式的上面図である。

図８は、３本の流路（２０）を微細加工した固体基材（１４）であって、その流 路の各々が一対の検出チャンバー（２２）および（２４）を形成する固体基材の 模式的上面図である。チャンバー（２２Ａ）　、（２２Ｂ）および（２２Ｃ）は 、各々、Ａ型血液抗原、Ｂ型血液抗原およびＲｈ抗原に対する抗体を含有するが 、チャンバー（２４Ａ）　、（２４Ｂ）および（２４Ｃ）は対照用チャンバーで ある。

図９は、ビーズを含有する３本の試料検出チャンバー（２２Ａ）、（２２Ｂ）お よび（２２Ｃ）を微細加工した固体基材（１４）であって、そのビーズ上に、各 々、Ａ型血液抗原、Ｂ型血液抗原およびＲｈ抗原に対する抗体を固定した固体基 材（１４）の模式的上面図である。

図１０Ａ　−Ｄは、基材（１４）中のメソスケール流動チャネル（２ｏ）の一部 の模式的断面図であって、その上に抗体（１０３）が固定化されており、分析の 間のシステムの変化状態を示す。

図１１Ａ　−Ｄは、基材（１４）中のメソスケール流動チャネル（２ｏ）の一部 の模式的断面図であり、その上にＤＮＡ結合プローブ（１１０）が固定化されて おり、分析の間のシステムの変化状態を示す。

図１２は、流動チャネルの壁から伸びる、細胞または夾雑物濾過突起部（１２２ ）を有する不活性基材（１４）上の流動チャネル（２ｏ）の断面斜視図である。

図１３は、チャネルの壁から伸びる、細胞貫通突起部（１２４）を有する不活性 基材（１４）上の流動チャネル（２０）の断面図である。

図１４は、本発明に従って構築した精子機能試験装置の模式的平面図である。

図１５は、本発明に従って構築したメソスケールのＰＣＲ分析装置の模式的平面 図である。

図１６は、細胞分別、細胞溶解およびＰＣＲ分析を包含する種々の働きをするの に適当な一連のメソスケールのチャンバーを用いて加工した分析装置の模式的上 面図である。

図１７ａは、装置中の流体の伝導度を測定するための電気接触部（１７）および （１８）を有する本発明の装置の模式的縦方向断面図である。

図１７ｂは、図１７ａに示した装置の斜視図である。

図１８は、一対のフラクタル分岐した流動チャネル（４ｏ）を微細加工した基材 の模式的平面図である。

図１９は、装置（１０）の内容物を観察するために、装置（１ｏ）と組み合わせ て用いる装置（６０）の模式的斜視図である。

図２０は、図１９の装置（６０）の模式的断面図である。

１２１１２１は、検定の間に検定成分の一定時間の添加および混合を可能とする 曲がりりくねったチャネル（２２Ａ）および（２２Ｂ）を有するメソスケール流 動システムを微細加工した装ｒｆｌ　（１０）の模式的平面図である。

詳細な記載 本発明は、流体微小試料中の特定の分析物を検出するための、小型の、量産され る、典型的には一回使用の装置を提供する。該装置は、典型的には、２ないし３ ミリメー［・ル厚のオーダーで、適当には０．２ないし２．０平方センチメート ルの、すなわち、試料流入ポートとメソスケール流動／ステムを形成するように 微細加工された固体基材からなる。該メソスケール流動システムは、該流入ポー トから伸びる少なくとも１本の試料流動チャネルと、分析物と特異的に結合する ための結合部を含有する流動チャネルと流体連絡している少なくとも１つの分析 物検出領域からなる。所望により、該結合部は検出領域内に固定化されていても よい。本明細書に開示されているように、メソスケール検出システムは、細胞ま たは高分子の分析を包含し、または反応もしくは細胞培養増殖をモニター観察す る、広範な迅速試験に用いることができる。該装置は、種々の分析物についての 結合部を含有する２またはそれ以上の異なる検出領域からなり、２またはそれ以 上の検定を同時に行うことを可能とする、２またはそれ以上のメソスケール流動 ／ステムて加工されていてもよい。検定の終わりに、該装置は典型的には廃棄さ れる。

少なくとも１のメソスケールの寸法の流動チャネルおよびチャンバーを有するメ ソスケール装置は、固体基材物質より大量に設計されかつ加工され得る。正確か つ有効な加工を可能とする技術のため、シリコンが好ましいが、ポリテトラフル オロエチレンのようなポリマーを含む他の材料を用いてもよい。試料流入ポート 、試料流動チャネル＜’ａ数）および分析物検出領域（複数）を含むメソスケー ル流動／ステム、および他の機能エレメントは、当業者に公知の種々の微細機械 加工法のうちいずれかの方法によりノリコン基材より大量にて安価に加工される 。

使用できる微細機械加工法はスピンコーティングおよび化学蒸着、レーザー加工 または写真平板技法、例えばＵＶまたはＸ−線法、または湿式化学プロセスまた はプラズマプロセスを包含するエツチング法のようなフィルム付着方法を包含す る［例、マンズ（Ｍａｎｚ）ら、ト１ノンズ・イン・アナリティカル・ケミスト リー（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　１ ０　：１４４−１４９　（１，９９１）　１３照〕。

種々の幅および厚みの流動チャネルが、メソスケールの寸法で、すなわち、０１ ないし５００μｍのオーダーの断面寸法で加工できる。

加工さｈ？二メソスケール流動チャネルを含有するノリコン基材は、アノード結 合した薄いガラスカバーで覆われ、密封されていてもよい。他の透明または不透 明カバー材料を用いてもよい。また、２つのシリコン基材が２枚のガラスカバー で挟まれていてもよく、または１のシリコン基材が挟まれていてもよい。透明カ バーの使用は、チャネル内容物の動的観察を容易にし、視覚または機械により、 いずれかの検出領域の光学プローブを可能とする観察手段をもたらす。他の加工 手段を用いてもよい。−の具体例において、循環ネットワークのような生物学的 構造の電子顕微鏡写真をマスクとして基材上のメソスケール流動システムを加工 するために用いてもよい。メソスケール流動／ステムは、一連の大きさおよび立 体配置にて加工してもよい。

図１および図２にて模式的に示したーの具体例にて、装ｆｆｉ　（１０）はメソ スケール流動チャネル（２０）を微細加工したシリコン基材（１４）を有し、こ の場合、その流動チャネルはまた検出領域として供し、予め選択された分析物と の結合能を有する結合部を設けていてもよい。流動チャネル（２０）の末端にて 加工されたポート（１６）を介する流動チャネル（２０）より、試料または試薬 流体を添加してもよ（、または回収してもよい。基材（１４）はガラスまたはプ ラスチックウィンドー　（１２）で覆われている。分析の間、装置（１０）を支 持構造体（３０）に設置する（図３）。その支持構造体は装置　（１０）の流入 ポートを介して試料流体をデリバリ−および回収するための内部流路（３２）を 備えている。／リコンメソスケール装置中の微細チャネルの寸法は幅が約２．０ μｍ〜５００μｍ、厚さが約０１μｍ〜５００μｍの範囲、細胞または高分子の 大きさに匹敵する範囲にて変化してもよい。流体と細胞培養培地のような多相物 質の流動性は組織的に研究されていない。該装置上の流入ポートはメソスケール の寸法で、または別法としてより大きな寸法で微細加工されていてもよい。

該装置の容量は非常に小さく、従って、分析に要する試料流体の量が減少する。

例えば、１．ｃｍｘｌｃｍのノリコン基材にて、その表面上に１０μｍ幅×１０ μｍｌ￥ＸＩＣｍ（１０’μｍ）長の５００個のグループの配列を有する場合、 各グローブの容量は１０″３μしてあり、５００個のグループの全容量は０５μ してある。メソスケール流動／ステムの低容量は、該装置にてなされる検定の反 応速度を向」ニさせる。例えば、質量作用の法則によって予測されるように、固 定化した結合部の表面コーティング部を有するメソスケール検出チャンバーにて 、メソスケール検出チャンバーの容量が減少すればするほど、検出領域における 結合部の容量に対する表面積の比率は増加し、その結果、分析物と結合部の間の 分子間反応の速度は増加する。本発明の装置のメソスケール流動／ステム全体は 、典型的には、１０　ｕ　Ｌよりも小さなオーダーの容量を有する。検出チャン バーは、高速動性に有利であるように、少なくとも１の寸法にて十分に小さい寸 法である。

該装置中のメソスケール流動／ステムはマイクロリッター容量で、または別にナ ノリッター容量またはそれ以下の容量で微細加工されていてもよく、それは、検 定に要する試料および／または試薬流体の量を制限し、有利である。

メソスケール流動／ステムを含有する分析装置は、該装置に流体をデリバリ−し 、および該装置から流体を受けるための器具、図５に模式的に示されている器ｎ 　（５０）と組み合わせて用いることがてき、それは、装置ｔ　（１０）を保持 するための、および装置（１０）上のポート、例えばポート（１６）を器具の流 動ライン（５６）と合致させるための嵌め合わせ部位（５８）と一体化している 。該器具は、試料が流動システムを押し進むように、図５にて図示するポンプ（ ５２）のような手段を有していてもよい。ある分析物を含有して懸濁させた生物 学的流体試料を器具の流入ポート（５１）に加えた後、ポンプ（５２）を作動さ せ、該試料を装置（１０）のポート（１６）およびメソスケール流動チャネル（ ２０）に押しやる。また、試料を器具によりチップ中に注入してもよく、または 試料を毛管作用により流入ポートを介して装置のメソスケール流動／ステムに入 れてもよい。もう一つ別の具体例において、器具を基材上に設置し、それは装置 の流入ポートと連絡する流動ラインを備えていてもよい。例えば、該装置上、カ バー不在の下で、器具を介して装置中に試料を注入することができる。別の器具 が、種々の装置による種々の検定プロトコルにて用いるために本発明に従って加 工されていてもよい。該装置の流動システムは液圧応用にて十分な容量まで満た されていてもよく、該器具を用いて、例えば装置中または器具中に配置したバル ブにより、流動システムを介して流体の流れの向きを定めるようにしてもよい。

該分析装置はまた、装置中のメソスケールチャネルの内容物を調べるための器具 と組み合わせて用いてもよい。−の具体例の器具は、装置中のメソスケールチャ ネルの内容物を調べるための顕微鏡からなっていてもよい。もう一つ別の具体例 において、図１９および図２０において模式的に示されている器具（６０）にて 説明されているように、カメラが該器具に含まれていてもよい。器具（６０）は ハウシング（６２）　、目視スクリーン（６４）およびチップを該器具に挿入す るためのスロット（６６）を備えている。図２０の断面図にて示されているよう に、器具（６０）はまたビデオカメラ（６８）　、光学システム（７０）　、お よび装０１Ｆ　（１０）を保持し、装置（１０）の配置および角度を手動で調整 できるようにするための傾斜機構（７２）からなる。光学システム（７０）はチ ャネル内容物を拡大するためのレンズシステム、ならびに光源を含む。ビデオカ メラ（６８）およびスクリーン（６４）は、試料流体の特性、例えば流れ特性ま たは色相における分析物誘発の変化を視覚的にモニター観察できるようにし、所 望により器具を用いて記録してもよい。

結合部は検出領域と流体連絡している流入ポートを介して溶液中のメソスケール 検出領域に導入されてもよい。また、結合部を、例えば流動システムの表面に、 または検出領域に配置したポリマーヒーズのような固相反応体に物理的吸着また は化学的結合させることにより、製造後に分析装置のメソスケール検出領域に固 定化されていてもよい。

シリコン基材中のメソスケール検出チャネルの表面を、化学的に活性化し、蛋白 質、脂質、多糖類または池の高分子と反応させ、メソスケール流動チャネルにて 被覆表面を形成させてもよい。シリカ質表面を化学的に活性化する方法は当該分 野において利用可能である。（例えば、ハラ−（Ｈａｌｌｅｒ）　ソリッド・フ エーコラテン（ｆ、Ｌｓｃｏｕｔｅｎ）　、ンヨン・ウィリー編（Ｅｄ、、Ｊｏ ｈｎ　ｆｉｌｅｙ）　、　二、−ヨーク、５３５−５９７頁（１９８３）＋マン デニウス（Ｍａｎｄｅｎｉｕｓ）ら、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａ ｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　、よ旦ユニ１０６−１１４（１９８４）およ びエヱ旦：６８−７２　（１９８８）およびマンデニウスら、メッソド・イン・ エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、よ旦ユニ ３８８−３９４参照）。当該分野において生体分子をシリコンに結合させるため の多数の方法がある。例えば、酵素を光架橋可能なポリビニルアルコール中の捕 獲を介してシリコン装置上に固定化してもよく　（ホエ（Ｉｌｏｗｅ）ら、Ｉ　 ＥＥＥ・トランザクションズ−エレクトロン・デバイセス（ＩＥＥＥ　Ｔｒａｎ ｓａｃｔｉｏｎｓ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎ肋μμミ）、ＥＤ３３：４９９−５０６　 （１９８６））、または予備成形膜を用いて間接的に結合させてもよい（ハナザ ト（Ｈａｎａｚａｔｏ）ら、ＩＥＥＥ・トランザクションズ・エレクトロン・デ バイセス、ＥＤ３３・４７−５１　（１９８６））。

疎水性二層グリセロールモノオレエートコーティングをシリコン基村上に加工し てもよい。フロムヘルツ（Ｆｒｏｍｈｅｒｚ）ら、バイオチム・バイオフィシ・ アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）　、１０６２　：１０３ −１０７　（１９９１）。

当該分野において公知の蛋白質結合および固定化方法が活性化シリカ質表面を用 いるのに適している。ケネディ−（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、クリン・ケム・アクタ （Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｅｍ、Ａｃｔａ）　、ヱ０　：１−３１　（１９７６）；サン コルリ（Ｓａｎｋｏｌｌｉ）ら、ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソソズ （Ｊ、Ｉｍｍ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　、１０４１９１−１９４　（１９８７）； クリツカ（Ｋｒｊｃｋａ）ら、クリニカル・ケミストリー　（Ｃ１ｉｎ、Ｃｈｅ ｍ、）　、２６　：　７４１−７４４　（１９８０）　：およびデル力（Ｄｅｌ ｕｃａ）ら、アーカイブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・ハイオフィジ ソクス（＾ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　）　、λλ５：２ ８５−２９１　（１９８３）、当該分野における公知化学技法は生体分子を被覆 または非被Ｉシリコンチャネル表面に結合させるのに適している。抗原結合蛋白 質、ポリヌクレオチド、プローブ、またはりガント／レセプター対の一方のよう な結合部をノリコンチャネル表面に付着させてもよい。表面被覆されたメソスケ ール流動／ステムは、免疫検定、酵素検定、リガンド／バインダー検定、ポリヌ クレオチド雑種形成検定、および細胞表面結合検定のような、当該分野において 公知の利用できる広範な結合検定にて用いることができる。細胞または高分子分 析物の検出は、検出領域の表面に被覆された適当な結合部を選択することにより 行うことができる。

加えて、磁性ビーズを装置中に用いてもよ（、それは、例えば、該装置と組み合 わせて用いられる器具中に位置する磁性源から、外部より加えられる磁場を用い てメソスケール流動システムを介して移動させることができる。検定に要する結 合部または他の試薬を磁性ビーズ上に固定化し、例えば、該結合部を検出領域に デリバリ−し、分析物に結合させることもできる。分析物を磁性ビーズに取り付 けた結合部に結合させた後、例えば、該分析物をさらに精製してもよく、または 外部磁場を介して別の分析物についての流動システム中の別の検出領域に移動さ せてもよい。

分析物の検出領域における結合部への結合は、本明細書中に開示されているよう に、装置中の試料流体の圧力または電気伝導度をモニターすることを包含する種 々の方法のいずれかにて、または視覚的もしくは機械により透明カバーを介する 光学検定により検出できる。バルブ、メソスケール圧力センサー、および他の機 械センサーのような装置はシリコン基村上に直接加工でき、かつ十分に確立され た技法に従って量産できる。アンゲル（＾ｎｇｅｌｌ）ら、サイエンティフィッ ク・アメリカン（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ）　２４８　：　４ ４−５５　（１９８３）。

分析物の検出領域中の結合部への結合は光学的に検出できる。最も簡単な具体例 は、陽性結果が粒子の凝塊形成または凝集作用により、または色相の発色もしく は変化により示されるものであり、それは最適には顕微鏡の助成を得て、視覚的 に観察できる。分析物のメソスケール検出チャンバー中の結合部への結合を検出 する光学検定は、蛍光または発光分子のような検出可能な標識またはポリマー支 持体、例えばビーズを、自体公知の検定プロトコルを用いて分析物または結合部 のいずれかに付着させることにより実行できる。検出領域中の発光または蛍光標 識は基材上に配置された透明ウィンドーを介して光学顕微鏡により検出できる。

分析物の結合後に結合部により発せられる発光または蛍光シグナルにより分析物 を検出できる。別法として、蛍光標識化抗体のような別の標識化物質を流動シス テムを介してデリバリ−し、検出領域中の結合した分析物／結合部の複合体に結 合させ、その存在が分析物の存在を示す、光学的に検出できる部分を含む「サン ドウィッチ」を生成できる。例えば、先行文献に報告されている免疫金または免 疫蛍光標識を用いてもよい。［例えば、ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ） ら、クリ（１９８５）；およびゴイン（Ｇｏｉｎ）ら、クリニカル・ケミストリ ー３２゜１６５５−１６５９　（１９８６）参照コ。

液体生物学的流体試料中の分析物が検出領域中の結合部に結合することはまた、 装置内のある領域での電気伝導度を検知することにより検出してもよい。検出領 域中の結合部に結合している分析物についての電気特性の変化を検出するために 、メソスケール流路中の液体の伝導度を測定することができる。例えば、図１７ ａおよび図１７ｂにて模式的に示されている装置（１０）にて伝導度を測定して もよい。

装置（１０）はシリコン基材（１４）からなり、その上に流入ポート（１６）お よび流動チャネル（２０）が微細加工されている。該基材は透明ウィンドー（１ ２）によりカバーされている。電気伝導度測定は、メソスケール試料流動チャネ ル（２０）と接触して、基材の頂面上に加工されており、基材の底面に伸びる接 触部（１７）に連結している電気接触部（１８）を用いてなされる。接触部（１ ７）は公知の熱勾配帯溶融法により加工できる［ゼメル（Ｚｅｍｅｌ）ら、ファ ンダメンタルズ・アンド・八Ｃ８・ノンポノウム・フリーズ・３０９、ワンント ン、ＤＣ，１９８６，ｐ２参照］。装置（１０）は、接触部（１７）を介して伝 導度変化を検出する能力を有する、図５に示される器具（５０）のような器具に 嵌め合わせられる。伝導度変化は、検出領域中に結合している分析物により誘発 される、流体圧のような流体特性の変化と相関させることができる。

分析物の検出領域中の結合部への結合はまた、メソスケール流路のある特別に設 計された領域中の試料流体の圧力をモニターすることにより検出できる。例えば 、試料流体の流入するまたは存在するメソスケール流動システムに連結した圧力 検出器は、分析物が結合し、その結果得られる目詰まりまたは流動制限により引 き起こされる圧力低下の検出を可能とする。図５は、例示的に、器具（５０）内 に嵌め合わせられる装置ｔ　（１０）を模式的に示しており、それはボート（１ ６）を介して装置（１０）に入るおよび存在する流体の流圧を検出するための２ つの圧力検出器（５４）からなる。検定の間に、粒子が凝塊形成し、または分子 が化学的に相互作用してネットワークを形成し、流路を塞ぐかまたは流体粘度を 増加させると、その変化は陽性結果として圧力変化として検出できる。メソスケ ール圧力検出器はまた、シリコン基村上に直接加工してもよい。アンゲル（＾ｎ ｇｅｌｌ）ら、サイエ検出領域中の結合部に結合している分析物のこの形態の検 出は、流動システム中の流動制限に敏感な幾何学的構造により強化することがで きる。−の具体例において、装置中のメソスケール流動チャネルは「フラクタル 」パターン、すなわち、連続的に分岐した流動チャネルのパターンで構築されて いてもよい。図１８は、２つのフラクタル流動システム（４０）を微細加工した 構造体（１４）からなる装置（１０）の−具体例を模式的に説明するものである 。フラクタル状に分岐するチャネルは、図４にて模式的に説明されているように 、逐次狭くした流動チャネルを提供し、各分岐で寸法を減少させながらシリコン 基村上に加工してもよい。図４は、ポート（１６）に連結した流動チャネル（４ ０）のフラクタル状に分岐したシステムで加工された基材（１４）の模式的平面 図である。この具体例におけるチャネルは対称的に配置されており、基材の中心 に向かって逐次径が狭（なる。これらのフラクタル状に構築された流動システム における流体流動性は、流体粘度および、例えば、細胞の増殖または細胞、粒子 もしくは試料中に存在するかもしれない高分子複合体の凝集により引き起こされ る流動制限の発生に対して非常に敏感である。流動制限に基づく分析物の存在の 検出は米国特許出願［＾ｔｔｏｒｎｅｙＤｏｃｋｅｔ　Ｎｏ、　ＵＰ＾００２　 （８２６１／３）　］に記載されている。その開示を出典明示により本明細書の 一部とみなす。

フラクタル状に設計した微細チャネルは、例えば、基材」二の透明カバー４・介 して光学的に検出することができる流体粘度の変化により、流動インピーダンス を基礎として、例えば、培ｌＩ基中の微生物の増殖を容易にモニター観察するこ とを可能とする。試料中の微生物の存在および増殖はフラクタル内の流動特性に 影響を与えるであろう。１またはてれ以」−の圧力センサーを用いて、フラクタ ル流路中まｔ−はその向こうに存在する分析物によって引き起こされる流体特性 の変化により圧力変化を検出してもよい。分析物の結合後の伝導度の変化は、流 動領域と接触している電気伝導度検知機を介して容易に検出できる。例えば、図 ４において、’Ａｒｊｉ　（１０）のフラクタル領域（４０）の目詰まりは、投 入ポート（１６Ａ）から排出ポート（１６Ｂ）への分析物の流れを遮断し、通常 の伝導度プローブ（１７）により検出され、その出力は流出チャネル中の水性流 体の存在または不在を表す。

結合部は、フラクタル領域に、例えばフラクタル流路の表面に、またはビーズの ような固相反応体上に固定化して設けられ、分析物に結合し、フラクタル流路中 の流動制限を強化してもよい。

当該分野において公知の多数の結合検定方法が本発明のメソスケール検出システ ムにて活かすことができる。

分析物と結合部の検出領域における反応は凝集により検出できる。検出領域中、 分析物または分析物／結合部複合体との結合能を有する蛍光または発光標識化分 子またはビーズを用い、検出領域上の透明カバーを介し、光学顕微鏡により結合 部と分析物の凝集を検出することができる。例えば、メンスケール検出チャンバ ー中の血液細胞の凝集は、試料の血液型についての陽性試験として供することが できる。化学的にまたは吸着により、抗体を検出領域の表面に被覆し、血液型に ついて陽性試験を示す凝集を誘発してもよい。血液試料を蛍光染料と混合し、血 液細胞を標識化し、凝集反応の光学検定を行うことができる。蛍光ビーズに結合 させた抗体もまた用いることができる。種々の抗体を有する複数の検出領域をメ ソスケール流路にて加工し、−の装置にて、例えばＡ型、Ｂ型およびＲｈ型の血 液を同時に検定できる。

抗体サンドインチ検定および酵素免疫法のような当該分野において公知の免疫化 ７．検定技法を該装置のメソスケール検出領域にて活用し、予め選択さねた分析 物を検出１７．でもよい。［イムノアッセイについでの論文として、ボＪｌト／ （Ｂｏｌ　ｔｏｎ）ら、ハンドブック・オブ・エクスベリメン・タル・・イムノ ロン−（Ｉ（ａｎｄｂｏｏｋ　ｎｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏ ｌｏｇｙ）　、　Ｗｅｉｒ、　ｒｌ、　Ｍ、　ｔＱ、ブツツクｅノSール・す ・１′エンテイフイ・ツク・パブリケーンヨンズ（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５ｃｉ ｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）。

オソクスフゴード、１９８６．第１巻、第２６章参照］。−の具体例において、 分析物が抗原であり、結合部は標識化された抗原結合蛋白質、例えば蛍光標識化 抗体である。また、サンドイッチ免疫検定を行うことができ、この場合、蛍光標 識化抗体のような標識化した結合分子を用い、検出領域にて形成された分析物／ 結合部複合体に検出可能なように結合する。サンドイッチ免疫検定の一例が図１ ０Ａ−Ｄにて模式的に説明されており、この場合、基材（１４）におけるメソス ケール流動チャネル（２０）の表面は分析物（１０４）との結合能を有する抗体 （１０３）で被覆されている。図１０ＢおよびＩＯＣは、流動チャネルにおける 分析物（１０４）の抗体（１０３）への結合を示している。ついで、図１０Ｄに 図示するように、その後、結合分析物と複合体を形成する蛍光標識化抗体（１０ ５）の添加により、結合分析物を検出する。蛍光標識化複合体は蛍光計を用いて 検定領域上の透明ウィンドーを介して検出できる。

例えば、フルオレセイン標識化結合部より放出される発光が、装置のメソスケー ル流動システムにて容易に検出される。−の具体例において、発光放出は、例え ば、光電子増倍管、またはカメラルミノメータ−を包含する、マイクロプレート ・リーダーを用いてメソスケール流動／ステムにて容易に検出てきる。−の具体 例において、分析物との結合能を有する２種の抗体からなる結合部を用いること により分析物を検出してもよい。この場合、−の抗体は光を放出するフルオレセ インで標識化されており、他方は光を吸収するローダミンで標識化されている。

ローダミンおよびフルオレセイン標識化抗体が夫々分析物に結合すると、分析物 の存在を示す、フルオレセインのクエンチが観察できる。ナカムラ（Ｎａｋａｍ ｕｒａ）ら、　ｅｄｓ、、イムノケミカル・アソセイズ・アンド・バイオセンサ ー・テクノロンＢｉｏｓｅｎｓｏｒ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　 １９９０ｓ）　、　アメリカン・ソづイエティー・オブ・ミクロバイオロジー（ ＾ｍｅｒｉｃａｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）　、ワ ンントン、ＤＣ。

ｐｐ、２０５−２１５゜−の具体例において、フルオレセイン標識化抗体を検出 領域に固定化する。ついで、分析物およびローダミン標識化抗体を検出領域にデ リバリ−し、分析物の存在を示すフルオレセインのクエンチが観察される。モラ 一つ別の具体例において、細菌性磁性粒子に連結し、被覆するフルオレセイン標 識化抗体を免疫検定にて用いてもよい。この場合、該抗体は分析物との結合能を 層化抗体に連結した細菌性磁性粒子の凝集は、分析物についての陽性検定を示す 、蛍光性のクエンチを引き起こす。凝集およびその結果生じるクエンチは、例え ば、器具と組み合わせて用いられる、器具に配置した磁性源を介して、磁場をメ ソスケール検出領域に加えることにより強化される。

別の具体例において、当該分野において公知のポリヌクレオチド雑種形成検定を 行ってもよい［マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、モレキュラー・クローニ ングア・ラボラトリ−φマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　： 　Ａ　Ｌ　ｂｏｒ　ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ　１）　。

第２版、コールド・スプリング−バーバー−プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ）。

１９８９］。図１１にて模式的に説明されているように、基材（１４）の流動チ ャネル（２０）の表面はポリヌクレオチドプローブ（１１０）で被覆されていて もよい。

相補的分析物のポリヌクレオチド（１０４）を固定されたポリヌクレオチドプロ ーブ（１１０）に結合させた後、別の検出可能な、例えば、蛍光標識化高分子プ ローブ（１０５）を加えて試料のポリヌクレオチドに結合させることができる。

蛍光発光の検出は陽性検定を示す。

別の具体例において、メソスケール流動／ステムは、細胞上または細胞内の高分 子あるいは細胞外流体中の成分を下流分析するための、調製物中、生体流体試料 からの選択された細胞集団を分離するためのチャンバーを有していてもよい。

メソスケール分離領域は蛋白質のような特徴的な細胞表面分子を介して標的細胞 と可逆的に結合する能力を有する固定化された結合部を有する。メソスケールの 分離領域は、動力学的に細胞と結合部の結合を強化する。−の具体例において、 細胞は固定化されたままであるが、細胞外流体は下流に流れて分析される。他方 、例えば、バッファー流で細胞を洗浄するために、流動を続けてもよい。高速流 および高速圧て、洗浄された細胞が分離領域より放出され、分析のために下流に 移動させる。

本発明の装置はまた、メソスケール流動チャネルと流体連絡し、ｍＲＮＡのよう な細胞内分子について分析する前に、細胞を溶解させる細胞溶解手段からなって いてもよい。図１３に示されているように、細胞溶解手段は、流動チャネル（２ ０）の表面から伸びる、細胞膜を貫通する突起部（１２４）からなっていてもよ い。流体流は該貫通突起部（１２４）を押しとおるため、細胞が破壊される。細 胞残骸を濾去し、細胞内分析物を分析する。ノリコンのような物質の鋭角片を用 い、メソスケール流動システムでトラップし、十分な流動圧を加えて細胞を溶解 させる。

もう一つ別の具体例において、流動チャネルは、簡単には、十分な流動圧を加え た場合に細胞溶解を実行する制限された断面の領域からなる。これらの装置は、 典型的には、細胞含有試料を細胞溶解手段に押し進め、十分な流動圧を加えた場 合に細胞溶解を生じさせるための手段、例えばポンプ手段を有する器具と連結し て用いられる。加えて、該細胞溶解手段は、細胞溶解剤からなっていてもよい。

当該分野において知られている細胞溶解剤を用いてもよい。

図１２に示されているように、流動チャネル（２０）の表面はまた、大きさによ り細胞を分離するためのモレキュラーンーブを構成要素とする突起部（１２２） を有していてもよい。典型的には、細胞試料が、低圧下で流動チャネルを介して 流れると、突起部（１２２）の間を通過できる細胞だけが流動チャネルを通り抜 けて流れることができる。

メソスケール装置はまた、酵素反応を行うのに用いてもよい。基材中に加工され たメソスケール酵素反応チャンバーは、酵素反応についての最適温度を得るよう に温度調整されていてもよい。酵素反応チャンバーと流体連絡している、流入ポ ートが設けられていてもよ（、試薬および酵素検定に必要な他の成分を添加また は取り出すことができる。そのようなチャンバーを組み入れている検定Ｗｉｔは 、図５に模式的に示されている、酵素反応チャンバーの温度を調整し、器具（５ ｏ）の流動チャネル（５６）および装置（１０）のポート（１６）を通って検定 成分をデリバリ−または回収するための手段を有する、器具（５０）のような器 具に収められている。該器具を用いて、試料または試薬流体を装置に添加する時 間を設定してもよい。反応チャンバーの温度を調節するために、該装置を該装置 と組み合わせて用いる器具中の嵌め合わせ部位にて用いてもよい。該装置の反応 チャンバーを加熱または冷却するために、電気加熱または冷却エレメントを嵌め 合わせ部位に設けてもよい。別法として、電気接触部を基材中に設け、器具中の 電気接触部と接合させ、反応チャンバーを加熱または冷却する電気抵抗を付与し てもよい。

−の具体例において、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）をメソスケール反応チャ ンバーにて行い、試料中のポリヌクレオチドを検出することができる。反応チャ ンバーと流体連絡している流入ポートより、核酸、プライマーおよびＴａｑポリ メラーゼのような必要な試薬の添加が可能である。連鎖反応は、当該分野におい て確豆されている方法［マニアティス（Ｍａｎｏａｔｉｓ）ら、モレキュラー・ クローニング　ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ ｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）。

コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−・プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉ ｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）　、１９８９コに従っ て行ってもよい。図１５にて図示されている−の具体例は、シリコン基材（１４ ）中に微細加工された一対のメソスケールＰ　ＣＲ反応チ＋　ンｔ＜　−（１６ ４）　オヨＵ　（１６６）　’ｅ有するＰＣＲチップ（１０）　テある。

増幅させるべきポリヌクレオチド含有溶液を、流入部（１６Ａ）から、流路（２ ｏ）を介して反応チャンバー（１６４）および（１６６）にデリバリ−する。そ れらチャンバーは、各々、例えば、電気的に９４℃および６５°Ｃに加軌されて いる。ポンプをポート（１６Ｂ）を介して取り付け、流体をチャンバー（１６４ ）　（ポリヌクレオチド脱雑種形成が生じる）とチャンバー（１６６）　（重合 が起こる）の間で循環運動させる。ポート（１６Ｃ）は該システムを排出するの に用いることができ、所望によりまた、Ｔａｑポリメラーゼ、ヌクレオシド三リ ン酸、プライマー、およびポリメラーゼ反応に必要な他の試薬をデリバリ−する のに用いてもよい。検出チャンバー（２２）を、ビーズ上に固定化された標識化 ポリヌクレオチドプローブのような標識化結合部を含有する、メソスケール流動 システムに設け、増幅されたポリヌクレオチド産生物の存在を検出する。

操作では、ＰＣＲチップ（１０）を、図５に図示する器具（５ｏ）のような、チ ップを保持するための嵌め合わせ部位を含有する、器具と組み合わせて用いる。

器具（５０）はポート（１６Ａ−Ｄ）に接合した流路（５６）を備えている。該 器具はまた、ポート（１６Ａ−Ｄ）を機械的に開閉させるようにバルブを有する 。器具（５ｏ）を用いて生物学的試料の流体を流入ポート（１６Ａ）からフィル ター（１６８）を介して反応チャンバー（１６４）および（１６６）にデリバリ −する。流入ボート（１６Ａ）を介してデリバリ−する前に、プライマー、ヌク レオシド三リン酸、およびＴａｑポリメラーゼのような試薬をポリヌクレオチド 試料に加えてもよく、または所望により、器具により、ポート（１６Ｃ）を介し て試料チャンバー（１６４）および（１６６）中の試料にデリバリ−してもよい 。試料をＰＣＲ反応チャンバー（１６４）および（１６６）にデリバリ−した後 、該器具を用いてポート（１６Ａ）および（１６Ｄ）を閉鎖する。ポート（１６ Ｃ）は排出口として開いたままである。ついで、器具（５０）に配置されたポン プを用いて、ポリヌクレオチド脱雑種形成のために９４℃に加熱したチャンバー （１６４）と、重合反応のために６５℃に加熱したチャンｔ＜−（１６６）の間 で流体を循環させる。

チャンバー（１６４）と（１６６）の温度は、例えば、反応チャンバーの下方に て基材中に一体成型された電気接触部により調整され、その電気接触部は器具中 の電気接触部と接合することができる。また、光学レーザーを用い、例えば基材 上に配置されたガラスカバーを介して、または基材それ自体の透明領域を介して 該反応チャンバーを加熱してもよい。ポリメラーゼ循環反応が完了したら、ポー ト（１６Ａ）および（１６Ｃ）を閉じ、ポー１−　（１６Ｄ）を開いて反応生成 物を、標識化されたポリヌクレオチドプローブ、例えば蛍光ビーズ上に固定化さ れたプローブを含有する、検出チャンバー（２２）にデリバリ−する。重合生成 物は、例えば、検出領域上に配置した透明カバーを介して、視覚的に、標識化プ ローブと重合したポリヌクレオチド生成物の凝集を観察することにより検出され る。メソスケールＰＣＲ分析に関する方法および装置は米国特許出願［＾ｔｔｏ ｒｎｅｙ　Ｄｏｃｋｅｔ　Ｎｏ、　ＵＰ＾００４　（８２６１１５）］に記載さ れており、その開示を出典明示により本明細書の一部とみなす。

もう一つ別の具体例にて、該装置を用いて酵素反応を行ってもよく、図２１に模 式的に示されている装置（１０）で説明されているように、それでは試料と試薬 成分の混合および添加の時間が設定される。装置（１０）の基材（１４）は、流 入ポー）　（１６）　、流動チャネル（２０）　、反応チャンバー（２２Ａ）お よび（２２Ｂ）ならびに検出チャンバー（２２Ｃ）で微細加工されている。反応 チャンバー（２２Ａ）および（２２Ｂ）は、各々、曲がりくねったメソスケール 流動チャネルからなる。該曲がりくねったチャネルの通路長は、試料および試薬 成分の混合および添加時間を設定するように設計できる。該装置は器具と組み合 わせてポートを該装置のポートに接合させて用いてもよく、それて該装置の流動 システムを介して流体をデリバリ−および受容することができ、所望により検出 チャンバーにて陽性結果の光学的に検出することができる。−の具体例として、 試料のコレステロール含有量を検定することができる。コレステロールエステラ ーゼを流入ポート（１６Ａ）を介して加え、バッファーおよび試料を流入ポート （１６Ｂ）および（１６Ｃ）を介して加える。ついで、該混合物をチャネル（２ ０Ｄ）を介して曲がりくねった混合／反応チャネル（２２Ａ）に流す。混合およ び反応の時間は適当な長さの曲がり（ねったチャネルを微細加工することにより 予め決定することができる。コレステロールオキシダーゼをポー１−　（１６Ｄ ）を介して加え、チャネル（２０Ｇ）を介して曲が７　つくねったチャネル（２ ２Ｂ）に流し、それで一定時間のオキシダーゼとチャネル（２２Ａ）からの流体 の混合および反応が生じる。基材上に配置された光学ウィンドーを介して検出チ ャンバー（２２Ｃ）を観察することにより陽性結果が視覚的に検出できる。検出 チャンバー（２２Ｃ）は酵素反応の生成物と検出できるように反応する能力を有 する結合部を備えていてもよい。該装置は一連の臨床酵素反応および他の反応に 用いてもよい。

所望により、チップの構造体にて活用されているプロトコルに依存して、さらに 検定を完了するのに必要な試薬を注入するように、例えば光学的に検出可能な基 で標識化した結合蛋白質、基質溶液または他の試薬を注入するように器具を設計 してもよい。装ｆｆｉ　（１０）中のメソスケール流動チャネル（２０）におけ る流体流の圧力は、器具中に設けた圧力検出器（５４）により検出できる。−の 検定または一連の検定についてのデータ収集を助成するように、マイクロプロセ ッサが器具中に設けられていてもよい。検定の精度を増すために、流動システム 中に対照領域、例えば、結合部を有しない領域を含めるように基材を加工しても よく、それで、試料は検出領域および対照領域の両方に向けられる。対照領域を 介して流れる試料流体由来のデータを取り出し、試料検出領域より得られるデー タと比較して、該検定の精度を向上させることができる。

上述した記載は例示であり、本発明は本明細書に記載の構造体および方法の範囲 内に含まれる別の形態とすることができる。当業者であれば変形および修飾を行 うであろうし、そのような変形および修飾は請求の範囲にて定義したのと同様に 本発明の一部であると考えられる。

次に例示である実施例を用いて本発明をさらに詳しく説明する。

実施例１ 幅が変化する流動チャネル（２０）を用いて加工した一連のシリコン基材（１４ ）　（第６図に概略示した）において、赤血球および固定された抗−Ａ抗血清の 毛管凝集を試験した。／リコン基材１〜５は、深さ１０μｍおよび幅２０〜３０ ０μｍを有する流動チャネル（２０＾）および（２０Ｂ）を含む（第２表）。ま ず、該チャネルに抗体を充填しく毛管作用）、次いで、それを乾燥させることに よって、該チャネルの内側の表面に抗−Ａ（１：１０希釈）を塗布した。次いで 、毛管作用によって流入ポート（１６）からチャネル（２０）中にＡ型血液（１ ：５に希釈した）を導入し、該チャネルを顕微鏡を使用して視覚的に観察した（ ライフ・アリストメット（Ｌｅｉｔｚ　ＡｒｉｓｔＡｒ１５ｔｏ。結果を第２表 に示す。

第２表 ２　１０　Ａ：５Ｑ　＋ Ｂ　８０　＋ ３　１０　Ａ：１００　＋ Ｂ：１２０　＋ ４　１０　Ａ：１５０　＋ Ｂ：２００　＋ ５　１０　Ａ：２５０　＋ Ｂ：３００　＋ 実施例２ チャネルの両側の流入ポート（１６）および中央検出チャンバー（２２）を有す る流動チャネル（２０）を用いて微細加工したノリコン基材（１４）　（第７図 に概略示した）上にプラスチック（３Ｍ透過性ノート）カバーを装着することに よって、プラスチノクーソリコンハイブリソドを加工した。抗−Ａ（０，０５Ｌ ｉ炭酸水素ナトリウム（ｐｉ（９、６）中）の希釈液および食塩水中Ａ型血液の １．１０希釈液を、ホルダーを使用して注射器を介してチャネル（２０）の両端 の流入ポーｈ　（１６）中に導入した。

中央チャンバー（２２）中で該溶液を一緒に混合させ、プラスチックカバーを通 して、光学顕微鏡によって凝集を観察した。結果を第３表に示す。

第３表 （Ｇａｍｍａ　Ｋｉｔ） ガンマ・不ズミ・モノ　１２０　＋ （Ｇａｍｍａ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｍｏｎｏ）ガンマ・ヒト希釈　１５　＋ （Ｇａｍｍａ　Ｈｕｍａｎ　Ｄｉｌｕｔｉｏｎ）イムコア・アフィニティ・ピュ ア　１・１００　＋（Ｉｍｍｕｃｏｒ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｅ）チャネル の両端に微細加工した流入ポート（１６）およびメソスケール中央混合チャンバ ー（２２）を有するメソスケール流動チャネル（２０）でエツチングされたノリ コン基材（１４）　（第７図に概略示した）の上に一片のプラスチック（３Ｍ透 過性ソート）を装着させることによって、プラスチック＝７リコンハイブリソド を加工した。マウスＩｇＧの溶液（０，０５Ｍ炭酸水素ナトウリム（ｐＨ９，６ ）中５０μｇ／ｍＬ）（ＳＩＧＭＡＣａｔ、ｎｏ、１　５３８１）およびヤギ抗 −マウスＩｇＧ　（Ｈ＆Ｌ）−蛍光カルホキル−トビーズ（ポリサイエンシズ、 インコーポレイテッド （Ｐｏ１ｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、　ｌ　ｎｃ、　））のＰＢＳバッファー中１．２ ０希釈液を、ホルダーを使用して注射器を介して、チャネルの両端の流入ポート 中に導入した。中央チャンバー（２２）中で該溶液を一緒に混合させ、透明プラ スチックカバーを通して、光学顕微鏡によって凝集を観察した。

実施例４ 血液試料の血液型の判定のために、流入ポート（１６）から広がる３組のメソス ケール対照チャンバー（２４八〜Ｃ）に連結した３組のメソスケール分析チャン バー（２２＾〜Ｃ）を有する分析素子（１４）を使用する（第８図に概略示した ）。チャンバー（２２＾）の表面は、血液型Ａ抗原に対する抗体で感作されてお り、チャンバー（２２Ｂ）は、血液型Ｂ抗原に対する抗体で感作されており、チ ャンバー（２２Ｃ）は、アカゲザル抗際に対する抗体で感作されている。チャン バー（２４Ａ）、（２４Ｂ）および（２４Ｃ）の表面は、未処理であり、陰性の 対照として使用される。指を刺して採取した血液試料を、注射器を使用してポー ト（１６）を通して装置中に引き込む。

３つのチャンバー（２２＾〜Ｃ）の表面への赤血球の結合を観察する。個々のチ ャンバー（２２＾、２２Ｂおよび／′または２２Ｃ）の表面上の赤血球の存在は 、血液型抗原に対する陽性の結果を示す。次に、試料を含む分析装置を廃棄する 。

実施例５ 血液試料の血液型の判定のために、流入ポー１−（１６）から広がるチャネル（ ２０）によって連結した３つのチャンバー（２２＾、２２Ｂおよび２２Ｃを有す る分析素子（１４）（第９図に概略示す）を使用する。チャンバー（２２＾）は 、血液型Ａ抗原に対する抗体で感作されたビーズを含有しており、チャンバー（ ２２Ｂ）は、血液型Ｂ抗原に対する抗体で感作されたビーズを含有しており、チ ャンバー（２２Ｃ）は、アカゲザル抗原に対する抗体で感作されたビーズを含有 している。指刺血液試料を、注射器を使用して装置中に引き込む。赤血球のビー ズへの結合および結果としてのチャンバー中での凝集を観察する。個々のチャン バー中の凝集した赤血球の存在は、血液型抗原に対する陽性の結果を示す。次に 、試料を含む分析装置を廃棄する。

実施例６ 血液試料の血液型の判定のために、流入ポート（１６）から広がるチャネル（２ ０）によって連結した３組のチャンバー（２２＾、２２Ｂおよび２２Ｃ）を有す る分析素子（１４）（第８図に概略示した）を使用する。該素子は、対照チャン バー（２４Ａ、　２４Ｂおよび２４Ｃ）をも含む。チャンバー（２２Ａ）の表面 は、血液型Ａ抗原に対する抗体で感作されており、チャ〉バー（２２Ｂ）は、血 液型Ｂ抗原に対する抗体で感作されており、チャンバー（２２Ｃ）は、アカゲサ ル抗原に対する抗体て感作されている。

チャンバー（２４＾〜Ｃ）の表面は、未処理であり、陰性の対照として作用する 。指刺血液試料を蛍光色素と混合し、次いで、注射器を使用して流入ポー１−（ １６）中に引き込む。３つのチャンバー（２２Ａ、２２Ｂおよび／または２２Ｃ ）における蛍光赤血球の表面への結合は、微量蛍光計を使用して迅速に観察され 、血液型抗原に対する陽性の結果を示す。次に、試料を含有する分析装置を廃棄 する。

実施例７ 第４図に概略示される装置において、微生物の増殖をモニターする。基材（１４ ）におけるフラクタルメソスケール流路（４０）に、流入ポート（１６＾）を介 して、試験標本の試料を接種した増殖培地の混合物２μＬを充填する。該装置を 密封し、３７°Ｃで６０分間インキュベートする。顕微鏡を使用して視覚的に検 査することによって、または、チャネルンステムの流れ特性を、例えば、導電率 プローブ（１７）を介して測定することによって、増殖を検出する。流れがない ことは、増殖を示し、結果として、チヤ不ルシステムの封鎖を示す。

実施例８ 第１４図に示す微細加工固体基材（１４）で精子機能を試験する。精子試料を流 入ポート（１６）に添加し、次いで、メソスケール流動チャネル（２０）を通し て、各々試薬添加部（１４０）を有する検出チャンバー（２２＾〜Ｄ）まで流す 。検出チャンバー　（２２Ａ）は、白血球に関する試験を提供し、一般的な白血 球抗原に対する固定された抗体を含有するビーズを含む。検出チャンバー（２２ Ｂ）は、精子抗体に関する試験を提供し、ヒトＩｇＧに対する抗体を固定したビ ーズ（例えば、バイオ−ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、イムノビーズ（ｉｍｍｕｎ ｏｂｅａｄ）　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　１７０＝５１．００）を含有する。チャンバ ー（２２Ｃ）は、アクロソーム反応に関する試験を提供し、フルオレセイン標識 レクチンを含有する。チャンバー（２２Ｄ）は、精子−子宮頚部相互作用に関す る試験を提供し、ヒアルロン酸またはウソ子宮頚部粘液を含有する。チャンバー における凝集は、視覚的に手動で、または機械によって、検出される。フラクタ ル流動チャネル（４０）を使用して、試料の流れ特性を試験する。精子試料がフ ラクタル流路に沿って移動する距離は、精子運動性の指示因子として供される。

別法としては、枝分かれしない流動チャネルなどの別の形態で加工されたメソス ケール流動／ステムを利用することもできる。

実施例９ 第１５図に概略示す装置において、ポリメラーゼ連鎖反応を行って、流体試料中 のポリヌクレオチドの存在を検出する。第１５図に示す装置（１０）は、メソス ケール流動チャネル（２０）に接続した流入ポート（１６＾〜Ｄ）を用いて微細 加工した固体基材（１４）を含む。メソスケール流動チャネル（２０）は、ＰＣ Ｒ反応チャンバー（１６４および１６６）、フィルター（１６８）および検出チ ャンバー（２２）も装備している。装置（１０）は、例えば第５図における器具 （５０）のように、器具と共同で使用され、すなわち、流路、流動ポンプならび に反応チャンバー（１６４および１６６）の温度を制御するための温度制御素子 を装備している。器具は、また、ポート（１６＾、１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄ ）と流動的に連絡している、アッセイの間にポートを可逆的に開閉させるバルブ を有する流体流路も含む。

ＰＣＲ分析を行って細胞中のポリヌクレオチドを検出するために、Ｔａｑポリメ ラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、ポリヌクレオチドプライマーおよびＰＣＲアッ セイに必要な他の試薬の緩衝化溶液に試料細胞溶解物を添加する。

該試料細胞溶解物は、器具を介し、流入ポート（１６人）を通してＰＣＲ反応チ ャンバー（１６４および１６６）に運搬される。ポート（１６＾および１６Ｄ） は、器具中に含まれるバルブによって閉じられ、一方、ポート（１６Ｂおよび１ ６Ｃ）は、開いている。

反応チャンバー（１６４および１６６）の温度を調節するために、器具中に電気 的手段などの手段が含まれている。ポート（１６Ｂ）を通して接続される器具中 のポンプを使用して、ポリヌクレオチドデハイブリダイゼーションのための９４ ℃に設定した反応チャンバー（１６４）と、ポリメラーゼ反応のための６５℃に 設定した反応チャンバー（１６６）との間で試料流体を循環させる。ポート（１ ６ｃ）は、ベントとして供される。ポリメラーゼ連鎖反応が終了した後、ポート （１６Ｃ）は、閉じられ、（１６Ｄ）は、開けられ、ポート（１６Ｂ）に接続し ている器具中のポンプを使用して、ＰＣＲ反応チャンバー（１６４および１６６ ）から検出チャンバー（２２）に試料を運搬する。検出チャンバー（２２）は、 増幅したポリヌクレオチドを結合する能力を有するポリヌクレオチドプローブを 固定している蛍光標識ビーズを装備している。増幅したポリヌクレオチドの標識 ポリヌクレオチドプローブとの凝集は、検出領域（２２）−面に配置された窓を 通して検出可能であり、増幅したポリヌクレオチド生成物の存在に関する試験を 提供する。

実施例１０ 第１６図に概略示されている基材（１４）を含むマルチ試験装ｆｆ１（１０）を 使用して、生物細胞含有流体試料中の細胞内ポリヌクレオチドの存在を検出する 。該装置は、第５図に示される器具（５０）のように、器具と共同で使用される 。器具は、可逆的に開閉されるバルブを含む、装置（１０）におけるポートと合 致するポートを有する流路を含んでおり、アッセイの間に該装置におけるポート を機械的に開閉させる。該器具は、反応チャンバー（１６４および１６６）の温 度を調節するために、基材（１４）に埋め込まれた接触部と合致する電気的接触 部などの手段も含む。

器具は、さらに、装置（１０）を通して流体の流れを制御するためのポンプを含 む。

まず、器具中のバルブを使用して、ポート（１６Ｃおよび１６Ｄ）を閉じ、一方 、ポート（１６＾および１６Ｂ）は、開いたままである。器具中のポンプによっ て試料を試料流入ポート（１６＾）に向かわせ、メソスケール流路（２０＾）を 通して、所望の細胞個体群上の表面分子に選択的に結合させるためのチャンバー の壁に固定された結合部分を含有するチャンバー（２２Ａ）に流す。チャンバー （２２Ａ）における所望の細胞個体群の結合後、バッファーを有する流れは、ポ ート（１６Ｂ）を通して排出されつつ、細胞個体群を精製および単離し続ける。

次いで、ポート（１６Ｂ）は、閉じられ、ポート（１６Ｃ）は、開けられる。次 に、流れを充分に増大させて、単離した細胞をチャンバー（２２＾）の表面から チャンバー（２２Ｂ）に移転させる。ここで、チャンバー（２２Ｂ）における膜 貫通用突出部（１２４）が細胞を破り、細胞内物質を放出させる。

通ってメソスケールＰＣＲチャンバー（１６４および１６６）まで続く。器具中 のバルブを使用して、ポート（１６Ｂ）を開け、ポート（１６＾）を閉じる。Ｔ ａｑポリメラーゼ、プライマーおよびＰＣＲアッセイに必要な他の試薬を、器具 中の合致するポートおよび流路からポート（１６Ｃ）を通してチャンバー（１６ ４および１６６）に添加する。ポート （１６Ｂ）を介して接続された器具中のポンプを使用して、各々、９４℃および ６５℃に設定されたチャンバー（１６４および１６８）間でＰＣＲ試料および試 薬を循環させて、ポリヌクレオチドデハイプリダイゼーションおよび重合サイク ルを行い、ポリヌクレオチド生成物の生成および単離を行う。器具中のバルブを 使用して、ポート（＋６Ｃ）を閉じ、ポート（１６Ｄ）を開ける。ポート（１６ Ｂ）に接続された器具中のポンプを使用して、細胞個体群から単離された重合ポ リヌクレオチドを、相補ポリヌクレオチドプローブなどの固定用結合部分を含有 するフラクタル検出領域（４０）に向かわせる。フラクタル領域（４０）におけ る流れ制限は、細胞内ポリヌクレオチドについての陽性のアッセイを示す。

実施例１１ メソスケール流動チャネルにおいて、化学発光ベルオキジオキシレート有機相反 応を行った。ンアルム（ＣｙａｌｕｍｅＴＭ）ライトスティック（ライスコンシ ン州ミルウォーキーのアルドリッチ（Ａ　１ｄｒｉｃｈ））を開け、ベルオキシ オキル−トおよびフルオロフォアの混合物（成分Ａ）を試験管中にしたたり落と した。

オキシダントを含有するガラスバイアルを取り出し、アルコールで洗浄した。

該バイアルの内容物（成分Ｂ）を試験管に移した。成分Ａの１００μＬ試料およ び成分Ｂ５０μＬを一緒に混合して、化学発光反応を開始させた。

蛍光溶液の試料を、幅８１２μｍ１深さ４００μｍおよび長さ５．２ｍｍの大き さのチャンバーを装備したチップ＃６の中央流入ポート中に導入した。いずれの 過剰の試料もチップの表面から取り去り、該チップを、変形したマイクロウェル ストリップホルダー中に置いた。アマ−ライト（ＡＩ５ｅｒｌｉｔｅ）マイクロ プレートリーダー（イギリス、アマーノヤムのアマーノヤム・ダイアグノステイ クス°リミテッド（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　Ｌｔｄ、）） を使用して、メソスケール流動チャネルからの発光を測定した。チップ＃５にお いて幅３００μｍ、深さ２０μｍのメソスケール流動チャネル（容量７０．２ｐ Ｌ）を使用して、同様の実験を行った。発光（ペルオキシオキル−トケミルミネ センス）を検出し、ルミネセンス・マイクロプレート・リーダーを使用して、種 々のチップにおけるメンスケール流動チャネルからＲＬＵ　（比光単位）の単位 で測定した（第４表）。

第４表 チップ　チャネル容量　発光（ＲＬ　Ｕ）＃６　１７０２ｐＬ　７１８．２６ ＄５　７０．２ｐＬ　３５．６３ 実施例１２ 水性相反応において、イソルミノールの、化学発光ホースラディッンユペルオキ シダーゼ触媒化酸化を試験した。以下のとおり、ルミノール−過酸化水素試薬を 調製した。ナトリウムルミノール（１２，５ｍｇ）をトリスバッファー（０，１ ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８，６）５０ｍＬに溶解させた。過酸化水素（３０％Ｗ／ｖ） １５．５μＬをトリスバッファー　（０，１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ８，６）０．５ｍ Ｌと混合これらの２つの溶液を合わせ、光から保護した。ルミノール過酸化水素 試１１（（１００μＬ）、４−ヨードフェノール（（アルドリッチ）、トリスバ ッファー０．１１Ｉｌｏｌ／Ｌ中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ８，６）、およびホースラ ディツシュペルオキシダーゼ（ＶＩＡ型、１ｍｇ／ｍＬ）のトリスバッフｙ　（ ０，１ｍｏｌ／　Ｉ、ｐＨ８，６）中の希釈液１０μｇを一緒に混合した。この 溶液の試料をチップ＃６における中央チャンバーまたはチップ＃５の３００μｍ チャネル中に導入した。次いで、アマ−ライト・マイクロプレート・リーダーを 使用して、発光を測定した。

ルミネセンス・マイクロプレート・リーダーを使用して、種々のメソスケールチ ャネルにおけるルミノールのホースラデイッ／ユペルオキシダーゼ触媒化酸化に よる発光を検出した。ペルオキシダーゼ母液の希釈を使用したベルオキ／ダーゼ アッセイによって、投与量に依存する関係が判明した（第５表）。

＃６　１７０２ｐＬ　非希釈　０．１８工１：１０　４．６８ １：１００　２．２３ １：１０００　１．８２ ｓ５　７０．２ｐＬ　非希釈　２．０９Ｘ基材の消耗のための低い光度 実施例１３ メ゛ノスケール流動ヂャ不ルにおける化学発光反応を写真によって検出した。

実施例１１および１２の記載に従って、チップ＃６のメソスケールチャネルにペ ルオキシオキル−トまたはホースラデイッノユペルオキシダーゼ（１０μｇ／ｍ Ｌ）−ルミノール−過酸化物反応混合物を充填した。該チ・ツブを、カメラ！レ ミノＪ−夕−（イギリス、ハーミン・カムのウルフソン・アプライド・テクノｏ 　）−（Ｗｏｌｆｓｏｎ　、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））中でイ ンスタント写真用フィルム（ポラロイド（Ｐｏ１ａｒｏｉｄ）、タイプ６１２） と接触させることによって、発光を検出した。高速インスタント写真用フィルム を使用して、メソスケール流動チャネルにおける種々の化学発光反応による発光 を検出した（第６表）。

ベル４−キノダーゼ反応からの低い光度は、より長い露出時間を必要とした。

第６表 ベルオキソオキ／レート反応　１秒　Ｄ５分ｘ　Ｄ ホースラディソノユベルオキシダーゼ反応　１０分　ＤＸ室温で２日間インギュ ベーソヨン後。

実施例１４ メソスケール流動システムを使用して、種々の殺精子薬を試験する実験を行った 。ノンオキシツール（ｎｏｎｏｘｙｎｏｌ）　−９およびＣ１３−Ｇ（ベンンル ベニア州のハイオンン、インコーポレイテッド（Ｂ　１ｏｓｙ口、Ｉｎｃ、）） の殺精子活性の同時試験のために、各末端でチャネル（長さ３．２５ｍｍ、幅１ ００μｍ１深さ２０μｍ）によって流入口に各々連結している２つのチャンバー （長さ５．２ｍｍ、幅７５０μｍ、深さ１．５ｍｍ）からなるチップを使用した 。４つのチャネルに、各々、ＨＴＦ−ＢＳＡ溶液（チャネル＃１、対照）、０． ００５％（チャネル＃２）、０．０１２５％（チャネル＃３）および０，０５％ （チャネル＃４）ノンオキシツール−９（またはＣ１３−Ｇ）を充填した。精液 試料を各チャンバー中にＷき、顕微鏡を使用して、精子の接続したチャネル中へ の進行をモニターした。チャネル中で観察された精子の数は、精子数の減少する 順番で以下のとおりであった６チヤネル＃１＞＃２＞＃３＞＃４゜対照チャネル 中には、はとんどの精子がμられ、殺精子作用のための最適濃度のノンオキシツ ールー９またはＣ１３−Ｇを含有したチャネル＃４中では全く見られなかった。

実施例１５ 各末端でチャネル（長さ３．２５ｍｍ、幅１００μｍ、ｉさ２０１１ｍ）によっ て流入口に各々連結している２つのチャンバー（長さ５．２ｍｍ、幅７５０／ｌ 川、深さ１．５ｍｔｎ’）からなるデツプにおいて、メンスケール流動ンスデ１ １１−おける精−ｒ−試料の子宮粘液上の相互作用を試験した３、該チャネルに ＨＴ　Ｆ　−Ｂ　Ｓ　Ａ溶液を充填し、子宮粘液試料（患者の月経周期の約１４ ０目に採取した）を各中央ナヤンハー中に置いた。子宮粘液は、月経周期のこの 時点て精子に敵対することが知られているので、予想されるように、精子は、子 宮粘液中に移行せず、浸透しなかっｔ、−ものは死んだ。モヒソ、／（〜Ｉｏｇ ｈｉｓｓｉ）ら、アメリカン・ツヤ−ナル・オブ・ｔブス子ｌ−リクス・アント ・ガインコロノー（Ａｍ、ＪＯｂｓｔｅｔ、Ｇｙｎｅｃｏｌ　）、１１４：４０ ５　Ｃ２９７２）。

実施例１６ し、アルロン酸の精子試料との相互作用の試験をイテって、精子試料の子宮相互 作用特性を評価した。該試験は、各末端でメソスケール流動ナヤネル＃１、＃２ 、＃３および＃４（長さ３．２５ｍｍ、幅１００／７ｍ、深さ２０μｍ）によっ て流入口に谷ケ連結している２つのチャンバー（長さ５．２ｍｒｎ、幅７５０１ ｔｍ、ｉ朶さ１．５ｍｍ）からなる千・・ブ中て行った。チャネル＃１は、対照 チャネルであった・チャネルに、ＨＴ　Ｆ−Ｂ　Ｓ　Ａ溶液およびヒアルロン酸 （ノグマ（Ｓｉｇｍａ））のＨＴ　Ｆ　Ｂ　Ｓ　Ａ中溶液を充填した（チャネル ＃２、＃３、＃４、各々、５ｍｇ／ｍＬ、２．５ｍｇ／ｍＬおよび１．３ｍｇ／ ｍＬ）。各中央チャンバー中に精子試料を置いた。精子は、５ｍｇ／ｍＬのヒア ルロン酸をへ何するチャネル＃２中に移行しなかっｆｌか、チャネル＃３および ＃４中でヒアルロン酸の濃度が低下するにしたがって、移行度が増大した。

実施例１７ 精子試料中のＩｇＧ抗体の存在についでのイムノビーズ試験を行った。ヒトＴｇ Ｇに対する抗体を塗布したマイクロビーズであるイムノビーズ（カリフォルニア 州すッチモンドのバイオラッド（ＢｉｏＲＡＤ））をＨＴ　Ｆ　−Ｂ　Ｓ　Ａ溶 液（カリフォルニア州サンタナのアーヴイン・サイエンティフィク（ｌ　ｒｖｉ ｎｅＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））中で１ｍｇ／ｍＬに希釈した。ガラス−シリコン チップ中のマイクロチャネル（幅２５０　ｌｔ　ｍ、深さ２０　ｔＪｍ、長さ１ ０ｍｍ）にイムノビーズ溶液の試料を充填し、該チャネル入［コに精液試料（約 １２μＩ、）を添加した。該チャネル中で、精子試料中の抗体の？ｒ在によるイ ムノビーズによる精子の凝集が観察さｔまた。対照として、より多量のイムノビ ーズ試薬および精液試料を使用して顕微鏡スライドカラス上で実験を行い、これ も、陽性であった（凝集が観察された）。

前記の記載は、説明のためになされたものであり、本発明は、本明細書中に記載 した構造および方法の意図する範囲内で別の形態を取り得ると解される。

変形および修飾は、当業者が考えつくてあろし、二のよ）な変形および修飾の全 ては、請求の範囲に定義されている本発明の一部であると考えられる。

ＦＩＧ、１ ＦＩＧ、５ ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、ｌ０Ｂ ＦＩＧ、　ｌ０ｃ ＦＩＧ、ｌ０Ｄ ＦＩＧ、１ｌＢ ＦＩＧ、ＩＩｃ ＦＩＧ、１ｌＤ ＦＩＧ、１２ ＦＩＧ、１４ ＦＩＧ、１５ ＦＩＧ、　１７ｂ 田も慣審＊ＩＩ！＃ ＰＣＴハＩｓ　９３１０４０１３ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５４３ 　５８１　Ｚ　７０５５−２Ｊ（３１）優先権主張番号　８７７．６６２（３２ ）優先日　１９９２年５月１日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （３１）優先権主張番号　８７７．７０１（３２）優先日　１９９２年５月１日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） Ｉ （３１）優先権主張番号　８７７．７０２（３２）優先日　１９９２年５月１日 （３３）優先権主張国　米国（ＵＳ） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＰＴ、　Ｓ Ｅ）、　ＡＵ、　ＣＡ、ＪＰ（７２）発明者　ゼメル、ジェイ・エヌアメリカ合 衆国１９０４６ペンシルベニア州、ジエンキンタウン、ミーティングハウス・ロ ード２２旙

Claims (42)

【特許請求の範囲】
1. １．流体試料中の分析物の存在を検討するための装置であって、試料流入ポート ；および 該流入ポートから伸びる試料流動チャネルと；該分析物と特異的に結合する結合 部からなる流動チャネルと流体連絡している分析物検出領域とからなり、該検出 領域がメソスケールの寸法を有するメソスケール流動システム を形成するように微細加工された固体基材からなる該装置。
2. ２．該結合部が該検出領域に固定化されている請求項１記載の装置。
3. ３．装置が、さらに、該基材の該領域上に配置された該検出領域を光学的に観察 するためのウインドーを包含する請求項１記載の装置。
4. ４．該基材が、さらに、該分析物と結合して、該分析物の存在を示す検出可能な シグナルを発する標識化物質を該検出領域にデリバリーするための手段を形成す る請求項１記載の装置。
5. ５．さらに、 該基材の該領域上に配置された該検出領域を光学的に観察するためのウインドー と、 該ウインドーを介して該検出可能なシグナルの存在を検出するための光学手段と からなる請求項４記載の装置。
6. ６．該分析物が抗原であって、該結合部が抗原結合蛋白質である請求項１記載の 装置。
7. ７．該分析物がポリヌクレオチドであって、該結合部が該ポリヌクレオチドと雑 種形成する相補的ポリヌクレオチドである請求項１記載の装置。
8. ８．該分析物と該固定化結合部がリガンド／レセプター対よりなる請求項１記載 の装置。
9. ９．該光学的に検出可能なシグナルが発光シグナルである請求項４記載の装置。
10. １０．該光学的に検出可能なシグナルが蛍光シグナルである請求項９記載の装置 。
11. １１．該分析物検出領域がその表面に分析物結合部位を有する粒子からなり、そ の粒子が分析物の存在にて、該ウインドーを介して光学的に検出可能な粒子凝塊 形成を誘発する請求項３記載の装置。
12. １２．該基材が、さらに、対照領域を光学的にプローブし、それにより該対照領 域および検出領域において光学的に検出されたデータを比較することができる、 該基材上の該対照領域上方に設けられた、試料流入ポートおよび対照領域ウイン ドーと流体連絡した当該対照領域を形成する請求項３記載の装置。
13. １３．該分析物が該試料中の細胞集団であって、ここに、該結合部が該細胞集団 のメンバー上の表面蛋白質に結合して、該細胞集団の凝集を誘発し；および 該凝集が該ウインドーを介して光学的に検出できる請求項３記載の装置。
14. １４．該基材が少なくとも第２のメソスケール流動システムを形成する請求項１ 記載の装置。
15. １５．該流動システムの分析物検出領域が種々の固定化結合部からなる請求項１ ４記載の装置。
16. １６．該分析物が含細胞液体生物学的試料中の細胞内分子成分であって、装置が 、さらに、 該流動チャネルと流体連絡している該メソスケール流動システム中の細胞溶解手 段と、 該基材中の含細胞微小試料中の細胞を該細胞溶解手段に押し進め、それにより該 細胞内分子成分を放出させるための手段とからなる請求項１記載の装置。
17. １７．該細胞溶解手段が流動チャネルの壁から伸びている細胞膜貫通突起部を有 する該流動チャネルの一部からなる請求項１６記載の装置。
18. １８．該細胞溶解手段が、細胞の通過を阻止しつつ、細胞内分子を通過させるの に十分な制限された断面寸法の領域からなる請求項１６記載の装置。
19. １９．該分析物が該試料中の細胞集団であって、装置が、さらに、該分離領域の 壁上に固定化された細胞表面蛋白質を結合させるための部位からなる細胞分離領 域と； 該微小試料の該分離領域への流れを、該結合部位により試料中の該細胞集団を捕 獲して、該微小試料から該細胞集団を分離することを可能とするに十分に遅い第 １の流速；次いで該分離された細胞画分を該領域から放出させるのに十分速い第 ２の流速にて誘導する手段と；からなる請求項１記載の装置。
20. ２０．該流動システムが、さらに； 複数の第２の流動チャネルに至る分岐部からなる該流動チャネルと流体連絡して いるフラクタル領域と； 生物学的試料の、該流動チャネルと該フラクタル領域を通っての流れを誘導する ための手段と からなる請求項３記載の装置。
21. ２１．該固体基材が微細加工されたシリコンからなる請求項１記載の装置。
22. ２２．該試料流動チャネルおよび該検出領域が固体基材の表面に微細加工されて おり、かつ該表面に付着されたカバーによって囲まれている請求項１記載の装置 。
23. ２３．さらに、該基材と組み合わせて用いるための器具からなる装置であって、 該器具が： 該基材を保持するための手段と、 該基材上の流入ポートと相互適合する流体投入手段と、該保持手段に保持されて いる場合、流体を該基材の流動システムを通過させるためのポンプ手段と からなる請求項１記載の装置。
24. ２４．該器具が、さらに、試薬溜めと、試薬を流動システムにデリバリーするた めの手段とからなる請求項２３記載の装置。
25. ２５．さらに、該基材と組み合わせて用いるための器具からなり、該器具が： 該基材を保持するための手段と、 該基材中の該メソスケール流動システムの内容物を観察するための光学手段とか らなる請求項１記載の装置。
26. ２６．該光学手段が拡大オプティックスと、ビデオカメラとからなる装置であっ て、ここに該器具が、さらに、 該装置の角度および位置を手動調整するための傾斜機構と、該流動システムの内 容物を観察するためのビデオスクリーンとからなる請求項２５記載の装置。
27. ２７．流体試料中の分析物の存在を検討するための方法であって、（ｉ）試料流 入ポート；および 該流入ポートから伸びる試料流動チャネルと；該分析物と特異的に結合する結合 部からなる流動チャネルと流体連絡している分析物検出領域とからなり、該検出 領域がメソスケールの寸法を有する メソスケール流動システム を形成するように微細加工された固体基材からなる装置を供し；（ｉｉ）該試料 を該流入ポートヘと、次いで、該流動システムを介して該検出領域へとデリバリ ーし；次いで、 （ｉｉｉ）該検出領域における該結合部への該分析物の結合を検出する工程から なることを特徴とする該検出方法。
28. ２８．工程（ｉ）にて供される装置中の該結合部が該検出領域に固定化されてお り、 工程（ｉｉｉ）が該分析物と該固定化結合部との結合を検出する工程を包含する 請求項２７記載の方法。
29. ２９．工程（ｉ）にて供される装置が、さらに、該基材の該検出領域上方に設け られたウインドーからなり、 工程（ｉｉｉ）が該ウインドーを介して該検出領域を光学的に観察する工程を包 含する請求項２７記載の方法。
30. ３０．工程（ｉ）にて供される装置が、さらに、該分析物に結合して、該分析物 の存在を示す検出可能なシグナルを発する標識化物質を該検出領域にデリバリー するための手段からなる方法であって、さらに：（ｉｖ）標識化物質を該検出領 域にデリバリーし；次いで、（ｖ）該検出領域における該検出可能なシグナルを 光学的に観察することからなる請求項２７記載の方法。
31. ３１．該光学的観察工程が発光シグナルを検出する工程を包含する請求項３０記 載の方法。
32. ３２．工程（ｉ）にて供される装置において、該分析物検出領域が、その表面に 分析物結合部位を有する粒子からなり、それが、分析物の存在にて、粒子凝塊を 誘発する方法であって；ここに、 工程（ｉｉ）にて、該分析物が該粒子に結合して、凝塊形成を誘発し；かつ工程 （ｉｉｉ）にて、凝塊形成を検出する請求項２７記載の方法。
33. ３３．工程（ｉ）にて供される該基材が、さらに、該対照領域を光学的にプロー ブし、それにより、該対照領域および検出領域において光学的に測定されるデー タを比較できるための、該基材上の該対照領域上方に設けられた、試料流入ポー トおよび対照領域ウインドーと流体連絡した当該対照領域を形成する方法であっ て、 工程（ｉｉｉ）が該対照領域と該検出領域を光学的に観察し、比較する工程を包 含する請求項２９記載の方法。
34. ３４．該分析物が該試料中の細胞集団である方法であって、工程（ｉｉ）にて、 該結合部が該細胞集団のメンバー上の表面蛋白質に結合して該細胞集団の凝集を 誘発し； 工程（ｉｉｉ）にて、該凝集を該ウインドーを介して光学的に検出する請求項２ ９記載の方法。
35. ３５．工程（ｉ）にて供される該基材が少なくとも第２の該メソスケール流動シ ステムを形成する方法であって、 工程（ｉｉｉ）にて、第１の、および少なくとも第２のシステム中の検出領域に おける結合を検出する請求項２７記載の方法。
36. ３６．分析物が含細胞液体生物学的試料中の細胞内分子成分である方法であって 、該基材内で細胞を溶解する付加工程からなり、工程（ｉｉｉ）の前に該細胞内 分析物を放出させる請求項２７記載の方法。
37. ３７．該分析物が該試料中の細胞集団である方法であって、工程（ｉｉｉ）の前 に該基材内で他の細胞から該細胞集団を分離する付加工程からなる請求項２７記 載の方法。
38. ３８．少なくとも１つの流入ポートおよび該基材上の流入ポートから伸びるメソ スケール流動システムを形成するように微細加工された固体基材を包含する分析 装置と一緒に用いるための器具であって、該器具が；該基材を保持するための手 段； 該基材上の流入ポートと相互適合する流体投入手段；および該保持手段に保持さ れている場合、流体を該基材の流動システムを通過させるためのポンプ手段 からなることを特徴とする器具。
39. ３９．さらに、試薬溜めと、試薬を該流動システムにデリバリーするための手段 とからなる請求項３８記載の器具。
40. ４０．さらに、該流動システム中の流体試料のパラメーターを検出するための検 出手段からなる請求項３９記載の器具。
41. ４１．該分析物検出領域が曲がりくねったメソスケール流動チャネルからなり、 該曲がりくねったチャネルが、該チャネルを流れる流体の混合および反応の時間 を設定するような長さに微細加工されている請求項１記載の装置。
42. ４２．該分析物検出領域が、さらに、該検出領域より上流の、曲がりくねったメ ソスケール流動チャネルからなる方法であって、該曲がりくねったチャネルが、 該検出領域にデリバリーされる前に該チャネルを介して流れる流体の混合および 反応時間を設定するような長さに微細加工されており、かつ 工程（ｉｉ）が該試料を該曲がりくねったチャネルに、ついで該検出領域へとデ リバリーする工程を包含する請求項２７記載の方法。