JPH07506437A

JPH07506437A - 内因性のアルカリ性ホスファターゼの影響を減少させるための方法及び組成物

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Publication number: JPH07506437A
Application number: JP6519235A
Authority: JP
Inventors: シン，プラタップ; ジョンソン，ランディ，ダブリュー
Original assignee: デイド、ベーリング、インコーポレイテッド
Priority date: 1993-02-17
Filing date: 1994-02-14
Publication date: 1995-07-13
Anticipated expiration: 2017-11-25
Also published as: JP3350730B2; US5948630A; ATE170631T1; DE69412940D1; DK0636247T3; WO1994019691A1; EP0636247B1; ES2123774T3; CA2118231A1; EP0636247A1; AU6247494A; DE69412940T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】内因性のアルカリ性ホスファターゼの影響を減少させるための方法及び組成物発明の分野本発明は、一般的には、内因性のアルカリ性ホスファターゼの影響を減少させるための方法及び組成物に関する。特に、本発明は、ヒト体液サンプル中に見いたされることがある内因性のアルカリ性ホスファターゼか同相アッセイ系に対して有している影響を減少させるために、界面活性剤と阻害剤との組み合わせを含有した組成物を利用する。

背景アルカリ性ホスファターゼ（ＡＬＰｓ）は、殆と全ての生物体（二見いたされる、機能的に類似の一群の酵素である。それらはマグネシウム及び亜鉛含有酵素であり、金属キレート化剤によって阻害される。ＡＬＰｓは、第一級アルコール及びフェノールのリン酸エステルのようなモノリン酸エステルを加水分解するよう機能する。リン酸塩はＡＬＰの活性を阻害する。この加水分解反応は、ア／Ｌカリ性の至適ｐＨを有する。術語ＡＬＰ又はＡＬＰｓか使用されるときには常に、その術語はこれらの酵素群のいずれの一酵素をも意味する。

組織分化を呈している生物体においては、ＡＬＰｓは、種々の組織の多くに出現し、その由来組織にちなんで命名されている。異なった組織に由来するＡＬＰｓは、安定性、触媒特性及び種々の阻害剤に対する阻害感受性において僅かな差異を示す。Ｆｉｓｈｍａｎ、　Ｗ、Ｈ，。

、Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｉｓｏｚｙｍｅｓ：　Ｒｅｃｅｎｔ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９９０：　２３：　ｐｐ、　９９−１０４．　例えば、骨、肝臓及び腎臓からのヒトＡＬＰｓは、それらのシアル酸含量における違いのためにそれらの酵素的性質のため、ＡＬＰｓは、ヒト体液サンプル中に含有される分析対象物の存在又は濃度を検出するための標識又は指標分子として、固相診断アッセイにおける構成要素として使用されてきた。該標識は、分析対象物（又は分析対象物の類縁体）に共有結合により取り付けることができ、そして標識された分析対象物か、競合アッセイ方式において限られた数の分析対象物レセプター（例えば抗体）をめて競合する。代わりとして、ｆｆａは、サンドイッチアッセイ方式においては、第２の分析対象物レセプターに共有結合により取り付けることかできる。双方の場合において、共有結合により分析対象物又は分析対象物レセプターか取り付けられた標識は、しはしは接合体と呼ばれる。

接合体の標識は、測定可能な信号を直接に又は間接的に発生しなければならない。例えば、該接合体の標識は、蛍光若しくは比色的物質であることかてき、又はそれは、基質分子と反応したときに蛍光的、電気化学的、化学ルミネセンスの、温度測定的又は比色法的な信号を発生する酵素であることかてきる。形成される信号の量は、試験サンプル中の分析対象物の量と相関している。

酵素は、その増幅効果の故に、イムノアッセイ系において標識どして使用される。酵素の単一分子は、典型的には、毎分１０’乃至＋０４の基質分子を生成物へと変換する。酵素−基質反応の生成物は、比色法的に、蛍光光度法的に又は他の如何なる定量可能な方法によっても測定することができる。理想的には、酵素は、低い基質濃度において高い触媒活性を有しなければならない。酵素は、レセプター−分析対象物結合のために必要なｐＨにおいて安定でなければならない。酵素は、活性の損失を最小限に止めて共有結合により連結することができる反応性の基を有しなければならない。酵素は、日常的な貯蔵及びアッセイ条件下において安定でなければならない。

そして、試験サンプルは酵素活性を有してはならない。

子牛腸ＡＬＰは、標識として使用される最も普通のＡＬＰである。それは、酵素活性の損失なしに接合のために使用できる多数の遊離のアミノ基を有する。それは、通常使用される緩衝系において室温にて良好な安定性を有し、また高度な温度安定性を存する。その至適活性は、ｐＨ範囲９．５〜１０．５においてみられるが、しかし最大信号は緩衝剤組成、イオン強度、ｐＨ１基質及び基質濃度の複雑な関数である。ＡＬＰ−基質反応のための緩衝系は、しばしばジェタノールアミン又はトリスであり、通常、塩化マグネシウムのようなマグネシウム塩及び／又は酢酸亜鉛のような亜鉛塩を含む。通常の基質は、ｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐ−ＮＰＰ）、４−メチルウンベリフェリルホスフェート（４−ＭＵＰ）及び３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキン−４−（３１−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−シオギセタン（ＡＭＰＰＤ）である。

いくらかの活性なＡＬＰか、正常なヒト体液中に存在し、バソクグラウントシグナルに寄与し得る。一般に、特異的結合は、種々のアッセイ方式において見られるが、固相アッセイにおいて特に明らかである。Ｇｏｒｍａｎ、　Ｅｉｌｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎ　ｏｖｅｒｖｉｅｗ　ｏｆ　ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｐｒ１ｃｅ、Ｃ，ａｎｄ　Ｎｅｗｍａｎ。

Ｄ、、　Ｅｄｉｔｏｒｓ、　５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ：　１９９１：　ｐ、　２３４−２３６を参照。

非特異的結合を減少させるための方法が開発されてきた。固相アッセイ方式においては、一つの方法は、基質分子の添加に先立って、Ｔｗｅｅｎ又はＢｒ１ｊのような界面活性剤を含有する洗浄溶液で固相の反応区域（すなわちレセプター− 分析対象物複合体を上に有する固相支持体の領域）を洗浄することであった。この溶液はまた、塩類、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなたんばく質、又は変性剤を含み得る。

ヒトＡＬＰｓの影響を減少させるたせの他の一アプローチは、基質溶液中においてＡＬＰｓの阻害剤を使用することである。このアプローチは、固相支持体の反応区域が、非特異的に結合した妨害物質を除去するために洗浄されない場合には、特に有用である。例えば、独特のに、特性を有する阻害剤の使用は、ヒトＡＬＰｓの影響を減少させる得る。Ｋ、は、酵素活性を５０％だけ低下させる阻害剤濃度である（すなわちに、が低い程、その阻害剤は一層効果的である）。理想的には、阻害剤は、接合体中において使用されるＡＬＰに対しては高い■＜１を有するが、疾患状態において存在し得るヒトＡＬＰｓに対しては低いに、を有しなければならない。ＡＬＰｓに対する通常の阻害剤には、Ｌ−フェニルアラニン、ホモアルギニン、テトラミゾール及びレハミゾール及びそれらの誘導体が含まれる。最近、５．６−シヒドロー６−（２−ナフチル）イミダゾ−〔２，１−ｂ）チアゾールが、ヒトＡＬＰｓに対する阻害剤として使用されている。この最後の化合物は、Ｋ、として約１．ＯｌＩＭを有し、Ｓａｒｃｏｍａ　１８０／ＴＧ腹水細胞中のＡＬＰｓの阻害剤として最も有効であることか示されている。例えば、Ｂｈａｒｇａｖａ　Ｋ、に、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｔｅｔｒａｍｉｓ蛙虹並射因朋二ａＳす世…胆匝ｏｆ　Ａｌ態阻■ノ竺闇血山咀虹１Ｌ肪竺竪ユ竺担μ丈エリ堕ヒ咀旺壮肪匹」Ｌ樽朋ハ貝ゴ■匪…■迫」１厄卯ｕｒｉｎｅｓ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｃｈｅｍ、　１９７７；　２０：　ｐｐ、　５６３−５６６を参照。しかしながら、この阻害剤でさえそれだけでは種々の起源のヒトＡＬＰｓの影響を完全に除去することはない。

あるヒト体液試験サンプルは、種々の形の正常分子量ＡＬＰｓのレベルが上昇していることが見出された。これらのレベル上昇は、多くの臨床症状及び疾患状態に関連している。例えば、ＮａｒａｙａｎａｎＳ、、　Ｓｅｒｕｍ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ　ａｓ　Ｍａｒｋｅｒｓ　ｏｆ　Ｌｉｖｅｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ、　Ａｎｎａｌｓ　ｏｆ　Ｃｌ１ｎｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｃｉｅｎｃｅ　１９９１；　２１：　ｐｐ、１２−１８；　Ｓｅｖｅｒｉｍ　Ｇ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈＯｓｐｈａｔａｓｅ：　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ　ｉｎ　ｎｏｒｍａｌ　ａｎｄ　ｐａｔｈ。

包針９旦押郵工を狙県±Ｌ吐吐］肛匂」胛ｙ」上門互ｃｈｒ視蛙吐■仲ｙ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　１９９１：　５６３：　ｐｐ、＋４７−１５２及びＨａｒｍｅｎｂｅｒｇ　Ｕ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　Ｉｓｏｚｙｍｅｓ　ｉｎ　Ｈｕｍａｎ　Ｃｏ１ｏｒｅｃｔａｌ　Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ、　Ｔｕｍｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　＋９９１：　１２：　ｐｐ、　２３７−２４８を参照。

より高分子量形のＡＬＰｓが、あるヒト体液試験サンプル中に見出されており、そしてまたこれらの疾患状態の多くに関連することも見出されている。例えば、Ｗｅｉ　Ｊ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏ工匣」田匪県壮匹叶肛」旦他り復膿月μす典臣悲蛙笠虹■」蛙」但とμ旦ゴ囮四１山状匹肥並り披」剣」ｙ刀μ叫杖１蛙」尺弘朋Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９９１：　９６：　ｐｐ、　４７０−４７８．を参照。

疾患状態における高分子量形のＡＬＰの性質及び起源は明らかでない。それが単一の種であるが否か、又はそれが膜粒子又は抗体と複合体を形成した正常分子量のＡＬＰであるが否かに関して、問題提起されてきた。いずれにせよ、この一層高い分子量形は、固相から除去することが困難である。

診断アッセイにおいては、一層高い分子量のＡＬＰ又はレベルの上昇した正常分子量のＡＬＰを含有するヒト体液試験サンプルは、明瞭且つ一層重大な形であるが、関連した非特異的結合をもたらす。この問題は、血清媒介性非特異的結合といってよいであろう。Ｇ。

ｒｍａｎ、　Ｅｉｌｅｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎ　ｏｖｅｒｖｉｅｗ　ｏｆ　ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｐｒ１ｃｅ、Ｃ，ａｎｄ　Ｎｅ＋ｖｍａｎ、Ｄ、Ｅｄｉｔｏｒｓ、　５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ：　１９９１：　ｐ、　２３４．を参照。これらのサンプルのＡＬＰは、診断アッセイのバックグラウンド信号に寄与し得るのみならず、それは関係分析対象物の不存在下においてさえ偽の陽性結果を与え得る。

固相診断アッセイにおいて利用されている現行の洗浄液組成物は、界面活性剤及び阻害剤を含有してぃたがも知れないが、血清媒介性結合を減少させるのには完全には有効でない。特に、高分子量ＡＬＰｓは、低い洗浄性を有し、固相支持体の反応区域がら除去されないか又は部分的にしが除去されない。

もしも、ヒトＡＬＰの影響が減少されないならば、これらの試験サンプルのし１ −ΔＬ　Ｐは、基質分子と反応して追加の信号を発生し得る。これは、接合体のＡＬＰから発生される信号に寄与するであろう。この過剰の信号は、分析対象物の濃度の測定において、誤った結果に導くであろう。これらの偽の陽性結果は、非ＡＬＰ参照アッセイとの比較によるか又は患者の医療歴における因子分けによるのてなければ、検出困雑である。

こうして１、安定であり、信頼性か高く、そしてヒト高分子量ＡＬＰ及びレベルの上昇したヒトＡＬＰを同相アッセイの反応区域から除去するのに効果的な洗浄溶液かめられている。

上記欠陥を正すための改良された方法及び組成物に対する持続的需要かある。

発明の要約本発明は、同相イムノアッセイにおけるヒト体液サンプルからの内因性のＡＬＰの影響を減少させるための、方法及び組成物に関する。該組成物は、界面活性剤、ヒトＡＬＰに対する阻害剤、緩衝組成物の水溶液を含んでなり、ＡＬＰ又はＡＬＰ接合体に対する基質を含むことかできる。該界面活性剤には、ＮＰ−４０若しくはＴｒｉｔｏｎ−１００又は同等の界面活性剤又はそれらの組み合わせが含まれ、そしてＢｒ１ｊ−３５を追加の界面活性剤どして含むことかできるか、それらに限定はさオ］ない。該阻害剤には、テトラミゾール、レバミゾール、５　Ｇ−ノヒトロー６−（２−ナフチル）イミダゾ−（２，］−ｂ〕チアゾール、他の同等の阻害剤及びそれらの誘導体か含まれか、それらに限られることはない。

該緩衝組成物は、ＡＬＰ−基質反応及び他のアッセイ試薬と適合性のあるものでなければならない。該基質は、ＡＬＰと反応して測定可能な信号を与えるいかなる基質分子であってもよい。測定可能な信号のタイプは、比色法的、蛍光測定法的、化学ルミネセンス的、電気化学的、又は温度測定的な信号であってよいか、それらに限られない。効果的な緩衝溶液中における阻害剤と特定の界面活性剤との組み合わせは、アッセイ結果に対する、ヒト体液サンプル中に存在するかも知れない内因性の高分子量ＡＬＰ及びレベルの上界したＡＬＰの影響を減少させ又は排除する性質を有する。

本発明はまた、固相アッセイ系において内因性の正常な及び高分子量ヒトＡＬＰｓの影響を減少させ又は排除するための方法を含んでなる。該方法は、特異的に修飾された固相アッセイ支持体と体液サンプルを接触させ、そして該固相支持体を、界面活性剤、ＡＬＰに対する阻害剤、ＡＬＰに対する基質、及びＡＬＰの反応性と適合性の緩衝剤を含んでなる洗浄溶液で洗浄することを含む。該洗浄段階は、診断アッセイにおけるいかなる高分子１ＡＬＰ又はレベルの上昇した正常分子量のＡＬＰの影響をも減少させる。こうして、信号分子か該ＡＬＰ−基質反応によって発生されると、信号へのいかなる内因性のＡＬＰからの寄与も排除されるか又は実質的に減少される。

本発明の組成物及び方法の利点は、以下の詳細な記述及び実施例を参照することによって一層よく理解されよう。

発明の詳細な記述本発明の組成物は、診断アッセイにおいて使用するための洗浄溶液である。本発明か先行技術に対して有する利点は、本発明の洗浄溶液が、固相アッセイにおいてサンプルが評価される場合に、ヒト体液試験サンプル中に存在しているかも知れない高分子１ＡＬＰ及びレベルの上昇した正常分子量の内因性のＡＬＰの影響を減少させることである。

本発明の組成物は、界面活性剤、ヒトＡＬＰに対する阻害剤、緩衝組成物を含んでなり、そしてＡＬＰ又はＡＬＰ接合体に対する基質を含むことができる。

本発明の界面活性剤には、一般式Ｒ−Ｃ，ｌ＋、−（ＯＣＨ□ＣＨ□）、０１］（式中、Ｒはアルキル基であり、ｎはオキシエチレンモノマー平均数である）のアルキルフェノキシポリエチレングリコールエーテルか含まれるか、これに限定はされない。。好ましい一具体例においては、Ｒは、８個の炭素を含むイソオクチル基であり、平均ｎは、約９乃至１０である。最も好ましい一旦体例においては、該界面活性剤には、通常知られている市販の製品、ＮＰ−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０）及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００若しくは同等の界面活性剤又はそれらの組み合わせが含まれるか、それらに限定はされない。

本発明の更なる一具体例においては、該組成物は追加の界面活性剤を含む。この追加の界面活性剤には、式Ｒ（ＯＣＨｚＣＨ２）、ＯＨ（式中、Ｒはアルキル基であり、ｎはオキシエチレンモノマーの平均数である）のポリエチレングリコール脂肪アルコールエーテルが含まれるが、これに限定はされない。好ましい一具体例においては、該追加の界面活性剤のＲ基は約１０個より多くの炭素を含み、そしてｎは約２０より大きい。最も好ましい一具体例においては、該追加の界面活性剤は、Ｂｒ１ｊ−３５として知られている商業的に入手できる製品又は同等な界面活性剤である。該追加の界面活性剤は、診断アッセイにおける正常の及び高分子量のヒトＡＬＰの影響を最小にする量添加される。該界面活性剤及び該追加の界面活性剤の好ましい濃度範囲は、約１５〜４％の界面活性剤であり、最も好ましくは約０．５〜２％の界面活性剤である。最も好ましい一具体例においては、該界面活性剤の組み合わせには、１〜２％のＢｒ１ｊ−３５を伴った、１〜２％のＮＰ−４０及び／又はＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００が含まれるが、これに限定はされない。

本発明のためのＡＬＰ阻害剤には、接合体において使用されるＡＬＰに対しては高いに、を存するがしかしヒト体液試験サンプル中に存在するかも知れないヒトＡＬＰに対しては低いに１を有する阻害剤か含まれる。例えば表１を参照。

表１幾つかの阻害剤は、臓器特異的であり（例えば、Ｖａｎ　Ｂｅ１ｌ　Ｈ，ｅｔ　ａｌｌ、しｐ−ＢｒＯｍＯｌｅｔｒａｍｉＳＯｌｅ、　ａ　ｎｅＷ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｆｏｒ　ｕｓｅ　ｉｎ　ｍｅａｓｕｒｉｎｇｐｌａｃｅｎｔａｌ　ｏｒ　１ｎｔｅｓｔｉｎａｌ　ｉｓｏｅｎｚｙｍｅｓ　ｏｆ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ、　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９７７：　２３：　ｐｐ、　４５４−４５９）、従って、１種類の阻害剤より多くか該組成物に加えられてよい。非常に種々の有機の及び無機の分子が、ＡＬＰに対する阻害剤である。それらには、オルト燐酸塩、ヒ酸塩、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホモアルギニン、テラミゾール、レハミゾール、Ｌ−ｐ−プロモテトラミゾール、５．５−ノヒトロ−６−（２−ナフチル）イミダシー（２，１−ｂ）チアゾール（ナフチル）及びそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定はされない。好ましい阻害剤には、レバミゾール、プロモチラミゾール、及び５．６−シヒドロー６−（２−ナフチル）イミダゾ−（２，１−ｂ）チアゾール及びそれらの誘導体が含まれるが、それらに限定はされない。最も好ましい阻害剤には、５．６−シヒドロー６−（２−ナフチル）イミダゾ−〔２゜１−ｂ）チアゾール及びそれらの誘導体が含まれるが、それらに限定はされない。

該阻害剤は、診断アッセイにおいてヒト体液試験サンプル中に存在するかも知れない内因性の高分子ｆｉＡＬＰ及び／又はレベルの上昇した正常ＡＬＰの影響を最小にするのに有効な量加えられる。好ましい濃度範囲は、約０．２ｍＭ乃至５ｍＭであり、そして最も好ましい濃度範囲は約０．５ｍＭ乃至１．５ｍＭである。反応区域から洗い去られなかった如何なるＡＬＰも、阻害されるであろう。

緩衝剤は、接合体−基質反応と適合性であるように選択される。

該洗浄組成物は、ＡＬＰ接合体又は基質を含むことができ、そしてアッセイ方式によっては、該組成物と共にＡＬＰ接合体又は基質の何れかを含むことが特に有利であり得る。例えば、基質溶液の添加が洗浄段階として機能し得るならば、該洗浄組成物に基質を含ませることは特に有利である。

緩衝剤の選択は、ＡＬＰ接合体又は基質か該洗浄組成物中に含まれているか否かということに依存する。好ましくは、該緩衝剤は、ＡＬＰ接合体−基質反応を最大にするよう選択される。

本発明の組成物は、単に洗浄溶液であることができ、ＡＬＰ接合体又は基質分子を含む必要はない。該緩衝組成物は、診断アッセイの過程において利用され又は形成される他の成分と、適合性てなければならない。該緩衝剤には、バルビツール、炭酸塩−重炭酸塩、グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＴＲＩＳ）、エチルアミノエタノール（ＥＡＥ）　、ジェタノールアミン（ＤＥＡ）及び他のリン酸転移緩衝剤、及び、２−アミノ−２−メチル−１−プロパツール（ＡＭＰ）のようなアミノアルコール緩衝剤が含まれるが、それらに限定はされない。好ましい緩衝剤にはＤＥＡ。

ＴＲｌ５、及びＥＡＥのようなリン酸転移緩衝剤が含まれるがそれらに限定はされず、そして最も好ましい緩衝剤にはＤＥＡが含まれるが、ＤＥＡに限定はされない。ｐＨ範囲は、約７．０乃至１０．　Ｏ１好ましくは約８．０乃至９．０の範囲にわたることができる。該緩衝剤の濃度は、約０．１Ｍ乃至２．０Ｍ、好ましくは約０．５Ｍ乃至１．５　Ｍ、そして最も好ましくは約０．８Ｍ乃至１．５Ｍの範囲であることができる。塩化ナトリウム及び塩化カリウム又は同等な塩類のような塩類、及び牛血清アルブミン及びゼラチン又は同等なタンパク質のようなタンパク質もまた含めることができる。

もしも本発明の洗浄溶液がアッセイ接合体を含有するならば、該緩衝剤成分は、該接合体（酵素−抗体であろうと酵素−ハブテンであろうと）の安定性か最大となり且つＡＬＰ接合体−基質反応が城弱しないように選択される。該緩衝剤成分には、ＴＲＩＳ、ＤＥＡ、ＥＡＥ、及びＮ−（カルバモイルメチル）タウリンを含めることがかできるが、それらに限定はされない。最も好ましい緩衝剤はＴＲｌ５である。ｐＨは約７．０乃至１Ｏ９０の範囲、最も好ましくは約８゜０乃至９．０の範囲である。緩衝剤の濃度は、約０．１Ｍ乃至２．０Ｍの範囲、好ましくは約０．５Ｍ乃至１．５Ｍの範囲、そして最も好ましくは約０．８Ｍ乃至１．５Ｍであることができる。

本発明の最も好ましい一具体例においては、該洗浄組成物は、ＡＬＰ接合体に対する基質を含む。この緩衝剤条件は、接合体−基質ｅｍｉｓｔｒｙ、　１８（２）：　ｐｐ、　９７−１０４　（１９７２）、を参照。緩衝剤には、バルビツール、炭酸塩−重炭酸塩、グリシン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノエタン（ＴＲＩｓ）　、エチルアミノエタノール（ＥＡＥ）、ジェタノールアミン（ＤＥＡ）及び他のリン酸転移緩衝剤、及び２−アミノ−２−メチル−１−プロパツール（ＡＭＰ）のようなアミノアルコール緩衝剤か含まれるが、それらに限定はされない。好ましい緩衝剤にはＤＥＡ、ＴＲｌ５及びＥＡＥのようなリン酸転移緩衝剤が含まれるが、それらに限定はされず、そして最も好ましい緩衝剤にはＤＥＡか含まれるか、それらに限定はされない。リン酸移転緩衝剤か好ましいのは、接合体−基質反応において形成されるリン酸塩か、リン酸エステルか水によって加水分解されるより遠くに、リン酸転移緩衝剤のヒドロキシル基に転移されるからである。

こうして、リン酸塩有効濃度が低下し、ＡＬＰ接合体の活性の上昇か得られる。

該緩衝剤の濃度は、約０．１Ｍ乃至２．０Ｍの範囲、好ましくは約０．５Ｍ乃至１．５Ｍの範囲、そして最も好ましくは約０．８Ｍ乃至１．５　Ｍの範囲である。ｐＨは約７．０乃至ｌ０９０であり、最も好ましくは約８．０乃至９．０である。該緩衝剤は、塩化ナトリウム又は塩化カリウムのような塩類を含有することができ、そして最大活性を得るためには、塩化マグネシウム又は酢酸マグネシウムのようなマグネシウム塩及び硫酸亜鉛のような亜鉛塩を含有しなければならない。

基質分子は、蛍光的、電気化学的、化学ルミネセンス的、温度測定法的、又は比色法的分子のような測定可能な分子を産生ずる如何なる基質であってもよい。好ましい基質には、ｐ−ＮＰＰのような比色法的基質、４−ＭＵＰのような蛍光性基質、又はＡＭＰＰＤのような化学ルミネセンス的基質が含まれる。基質分子の濃度は、約１ｍＭ乃至１６ｍＭの範囲、好ましくは１ｍＭ乃至２ｍＭの範囲である。

本発明の方法は、診断アッセイにおいである分析対象物の存在又は濃度を測定するためにヒト体液試験サンプルが評価されるときに、ヒト体液試験サンプル中に存在するかも知れないヒト高分子量ＡＬＰ及び／又はレベルの上昇した正常分子ｆｌＡＬＰの影響を減少させるだめの方法であって、ａ）ヒト体液試験サンプルを固相支持体と接触させて該固相支持体上に反応区域を形成し、ｂ）（結合を促進する条件下に）ヒト体液試験サンプルの該分析対象物を該分析対象物に対するレセプターに接触させ、そしてｂ）洗浄溶液て該固相支持体の該反応区域を洗浄することを含んでなり、該洗浄溶液が、界面活性剤、ヒトＡ　Ｌ　Ｐ’に対する阻害剤、及び緩衝組成物を含んでなるものである、方法である。該試験サンプルは、該固相支持体と接触させられ、その上に固定化される。次いで該固相が、該洗浄溶液で１回又は数回洗浄される。該洗浄溶液の量は、該固相の該反応区域を覆うのに、そして診断アッセイにおいてヒト体液試験サンプル中に存在するかも知れない高分子量ＡＬＰ及び／又はレベルの上昇した正常分子ｆｉＡＬＰの影響を減少させるのに十分な量である。

例えば、もしもアッセイの該固相がＥＬＴＳＡプレート、ビーズ、又はチューブであるならば、該同相の反応区域を浸漬するに十分な該洗浄組成物のＪｉｋが、該固相に加えられ、次いて該固相から吸引される。該洗浄段階は繰り返すことができる。

上述のように、該洗浄組成物の該好ましい具体例は、１〜２％のＮＰ−４０及び／又はＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００又は同等な界面活性剤、５，６−ノヒ１−ｌツー６−（２−ナフチル）イミダゾ−（２，Ｉ−ｂ）チアゾール又は同等なＡＬＰ阻害剤、及び、利用される試薬又は該アッセイ段階において形成される生成物と適合性である緩衝剤を含んでなり、接合体ＡＬＰ−基質反１．ζを最大にし且つ内因性のＡＬＰ−基質反応を最小にする。該洗浄組成物は、追加の界面活性剤として、約２％のＢｒｉ　ｊ−３５又は同等な界面活性剤を含有してもよい。先に示したように、該洗浄組成物はまた、ＡＬＰ接合体又は基質を含有することもてきる。こうして、それらの組成物は、二重の機能を遂行する。第１の機能は、内因性のＡＬＰの影響を減少させることである。

第２の機能は、該洗浄溶液か該固相支持体に加えられたときに接合体−分析対象物若しくは接合体−レセプター反応又は接合体−基質反応を開始させることである。該洗浄溶液がＡＬＰ接合体を含有しているならは、該溶液はここに、接合体／洗浄溶液という。該洗浄溶液か基質を含有しているならは、該溶液はここに、基質／洗浄溶液という。こうして、ヒト体液サンプルからの高分子量ＡＬＰ及びレベルのｈ　’Ｒ−シた正常分子ｆｆｉ　Ａ　Ｌ　Ｐの影響か、更に減少され、または代わりに、アッセイ手順の洗浄段階か削除できる。

もし該洗浄組成物かＡＬＰ接合体を含有するなら、本発明の方法は、ヒト体液試験サンプル中に存在するかも知れない内因性の高分子ｆｆ１ＡＬＰ及び／又はレベルの」二重した正常ＡＬＰの影響を、該試験サンプルかある診断アッセイにおいである分８１１対象物の存在又は濃度を測定するために評価されるときに、減少させるだめの方法であって、ａ）ヒト体液サンプルを同相支持体と接触させて該固相支持体上に反応区域を形成し、ｂ）該ヒト体液試験サンプルの分析対象物を該分析対象物に対するレセプターに接触させ、Ｃ）接合体／′洗浄溶液を該固相支持体上の該反応区域に適用することを含んでなり、該接合体／洗浄溶液が、界面活性剤、ヒトＡＬＰに対する阻害剤、緩衝組成物、及びＡＬＰ接合体を含んでなるものである、方法である。

上述のように、接合体／洗浄溶液の該好ましい具体例は、約１〜２％のＮＰ−４０及び／又はＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００又は同等な界面活性剤と、５．６−シヒドロー６−（２−ナフチル）イミダゾ−（２，１−ｂ）チアゾール又は同等なＡ　Ｌ　Ｐ　Ｉ’ｌｌ害剤と、該接合体（それか酵素−レセプターであろうと酵素 −ハブテンであろうと）の安定性を最大にし且つ該接合体−基質反応を減弱させることのない緩衝剤と、そしてＡＬＰ整合体とを含んでなる。該接合体／洗浄組成物は、追加の界面活性剤として約２％のＢｒ１ｊ−３５又は同等な界面活性剤を含んでよい。該ＡＬＰ−接合体の濃度は、アッセイのタイプと共に相当変動するが、現行の接合体組成物において見出されている濃度に一致するであろう。

本発明の該好ましい具体例は、ヒト体液試験サンプル中に存在するかも知れない内因性の高分子ｆｆ１ＡＬＰ及びレベルの上昇した正常分子量の内因性のＡＬＰの影響を、診断アッセイにおいである分析対象物の存在又は濃度を測定するために該ヒト体液試験サンプルが評価されるときに、減少させるだめの方法であり、該方法は、ａ）ヒＩ・体液試験サンプルを同相支持体と接触させて該同相支持体上に反応区域を形成させ、ｂ）該ヒト体液試験サンプルの分析対象物を該分析対象物に対するレセプターに接触させ、Ｃ）該反応区域にＡＬＰ接合体試薬を適用し、ｄ）基質／洗浄溶液を適用することを含んでなり、該基質／洗浄溶液か、ＡＬＰに対する基質、緩衝溶液、界面活性剤及びＡＬＰに対する阻害剤を含んでなるものである、方法である。

該基質／洗浄溶液は、ヒト試験サンプル中に存在するかも知れない如何なる高分子１ＡＬＰ及び／又はレベルの上昇した正常分子量Ａ　Ｌ　Ｐの影響をも減少させそして該ＡＬＰ接合体−基質反応を開始させる、という二重の機能を有する。

上述のように、基質／洗浄溶液の該好ましい具体例は、約１〜２％のＮＰ−１０及び／又はＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００又は同等な界面活性剤と、５゜６−ジヒトロー６−（２−ナフチル）イミダゾ−Ｃ２，１−ｂ）チアゾール又は同等なＡＬＰ阻害剤と、ＤＥＡ、ＴＲｌ５及びＥＡＥのようなリン酸転移緩衝剤又は同等な緩衝剤と、そしてｐ−ＮＰＰ、４−ＭＵＰ　、　ＡＭＰＰＤのようなＡＬＰに対する基質又は同等なＡＬＰ基質と、を含んでなる。該基質／洗浄溶液は、追加の界面活性剤とし、約２９６のＢｒ１ｊ−３５又は同等な界面活性剤を含んでよい。基質の濃度は、アッセイのタイプと共に変動し得るが、現行の組成物において見出されている基質濃度と一致するであろう。

該同相は決定的なものではなく、プレート、ヒープ、紙及び粒子のような既知の同相の如何なるものをも含む。しかしながら、ある内相については、別個の洗浄段階を伴って又は佳うことなく、接合体／洗浄溶液、基質／洗浄溶液又は双方を利用するのか特に有利である。これらのアッセイ系は、同相支持体として通常、フィルム、紙、又は繊維（例えば、Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｉｎｃ、の５ｔｒａｔｕｓ　＠Ｓｙｓｔｅｍ及びＰｏｌａｒｏｉｄ−Ｂｅｈｒｉｎｇの０ＰＵＳ＠　Ｓｙｓｔｅｍ　）を、又は該紙又は繊維中に埋め込むことのできる微粒子（例えば、Ａｂｂｏｔｔの１Ｍｘ■Ｓｙｓｔｅｍ）を利用する。該溶液は該固相支持体を覆って又は通って流れ、内因性のＡＬＰを該反応区域から運び出す。同時に、該接合体−レセプター又は接合体分析対象物反応又は基質−接合体反応が起こる本発明の組成物及び方法は、次の実施例によって更に示されることかできる。

実施例１３名の癌胎児性抗原（ＣＥＡ）陽性患者の血清サンプル（サンプルＩ、２、及び３）か、高分子ＨＡ　Ｌ　Ｐ及び／又はレベルの上昇した正常ＡＬＰを有すると同定された。これらのサンプルは、本発明の組成物を用いて試験された。これらの患者サンプルは、ＡＬＰ接合体と４−λ１ｔＪＰ基質とを利用する自動化されたイムノアッセイ分析装置（Ｂａｘｔｅｒ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ　［ｎｃ、　からの５ｔｒａｔｕｓ　＠　Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ）にかけて評価された。この自動的分析装置は、洗浄段階を基質添加段階とを組み合わせる。米国特許第４．５１７．２８８号を参照のこと。この商業的に入手できる基質組成物（Ｘ　Ｗ　Ｓ　）は、該両相を洗浄し及びＡＬＰ反応を開始させるという、二重の機能を有する。

該基質組成物は、４−八ＩＬＩＰ、レハミゾール、Ｂｒ１ｇ−３５及び安定化剤をＤＥＡ緩衝液中に含んでなる、水溶液である。

ＸＷＳのレハミゾールを約１ｍＭの５．６−ジヒトロー６−（２−ナフチル）イミダゾ−［２，１−ｂ）チアゾール（ナフチル）て置き換えることによって、本発明の７種の基質／洗浄組成物（組成物１〜７）が調製された。加えて、該商業的に入手できる基質に対してこれらの組成物は、組成物ｌは界面活性剤を含有せず、組成物２は約１．０％のＢｒ１ｊ−３５を含有し、組成物３は２％のＢｒｉ　ｊ−３５を含有し、組成物４は１％のＢｒｉ　ｊ−３５と２％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００とを含有し、組成物５は１％のＢｒ１ｊ−３５と２％のＮＰ−４０とを含有し、組成物６は２％のＢｒ１ｊ−３５と２％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００とを含有し、そして組成物７は２％のＢｒ１ｊ−３５と２％のＮＰ−４０とを含有した、という点て異なっていた。これらの組成物の要約は次に表２に提示されている。Ｌは阻害剤レバミゾールを表し、そしてナフチルは阻害剤５．６−シヒドロー６−（２−ナフチル）イミダゾ−［２，１−ｂ）チアゾールを表す。

表２これらのサンプルは、各組成物を基質／洗浄液として用いて分析装置にかけて評価した。該分析装置は、接合体ＡＬＰと基質との間の反応から生じた蛍光信号の変化の速度を測定した。その結果は、分当たりのミリボルト（ｍＶ／分）で表されている。通常、該信号は、サンプル中に存在する分析対象物の量に関連づけられる。

これらの実施例につき、ＸＷＳを用いて生じた信号は、界面活性剤の欠如のために洗浄もされず、レバミゾールによる阻害も受けなかった、内因性のＡＬＰの結果である。これらのサンプルは、ＸＷＳを用いて評価したなら偽の陽性結果を与えた。同じサンプルにつき、組成物ｌを用いて生じた信号は、界面活性剤の欠如のために洗い去られなかった内因性のＡＬＰの結果である。

サンプル１，２、及び３の結果は、図１，２、及び３にそれぞれ示されている。

これらの図から分かるように、阻害剤としての５゜６−シヒドロー６−（２−ナフチル）イミダゾ−（２，Ｉ−ｂ）チアゾールは、サンプル中の内因性のＡＬＰから生ずるバックグラウンド信号を減少させ、こうして偽の陽性信号を除去するか又は実質的に減少させる。５．６−シヒドロー６−（２−ナフチル）イミダゾ −（２，１−ｂ）チアゾールをも含有している組成物へのＢｒ１ｊ−３５の添加もまた、バックグラウンド信号を減少させるのに役立つ。

更に、該組成物中にＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００又はＮＰ−４０のような追加の界面活性剤か含有されているときは、バックグラウンド信号は更に減少される。更には、ある例においては、この減少は、商業的に入手できる基質／洗浄組成物と比較したとき、９０％を超える。従って、Ｂｒ１ｊ−３５を伴い又は伴わないＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００又はＮＰ−４０のような界面活性剤の存在下における阻害剤としての５．６−シヒドロー６−（２−ナフチル）イミダゾ−（２，１−ｂ）チアゾールの使用は、内因性のＡＬＰの影響を除去し又は実質的に減少させるために有効である実施例２５名の患者サンプル、サンプルｌ、２、及び３（実施例に記述したのに同し）、サンプル４（これは結腸癌に対し試験が陽性であった患者に由来した）及びサンプル５（これは乳癌に対し試験か陽性であった患者に由来した）が、高分子量ＡＬＰ及び／又はレベルの上昇した正常ＡＬＰを有すると同定された。これらのサンプルは、本発明の組成物を用いて評価された。これらのサンプルは、実施例１に記載した自動化されたイムノアッセイ分析装置にかけて評価された。

これらのサンプルに対するＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００及びＮＰ−４０の効果か、内因性のＡＬＰの阻害剤として約１ｍＭの５，６−シヒドロー６−（２−ナフチル）イミダゾ−（２，１−ｂ）チアゾール、約１ｍＭの４−λ１ｔＪＰ　、及び安定化剤を約ＩＭのＤＥＡ中に含んでなる本発明の基質／洗浄組成物（実施例１に記載の組成物ｌ）を調製することによって、検討された。

本発明の他の４種の基質／洗浄組成物は、組成物８が更に約１％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を、組成物９か更に２％のＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を、組成物ＩＯか更に１％のＮＰ−４０を、そして組成物１１か更に２％のＮＰ−４０を含有することを除いては、組成物ｌと同じ仕方で調製された。該組成物の要約か、下の表３に提示されている。ナフチルは、５．６−ンヒトロー６−（２−ナフチル）イミダゾ−Ｃ２，Ｉ−ｂ）チアゾ−表３これらのサンプルは、各組成物を基質／洗浄液として用いて該分析装置にかけて評価した。該分析装置は、接合体ＡＬＰと基質との間の反応により発生する蛍光信号の変化の速度を測定する。その結果は、分当たりのミリボルト（ｍ　Ｖ／分）で表現される。

サンプルｌ乃至５についての結果が、図４乃至８に、それぞれ示されている。Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００又はＮＰ−４０のような界面活性剤が該組成物に含有されている場合には、内因性のＡＬＰによるバックグラウンド信号は実質的に減少されている。更に、ある例においては、この減少は、界面活性剤を含有しないサンプルに比して約９０％を超えている。これらの界面活性剤は、内因性のＡＬＰの影響を除去し又は減少させるのに有効である。従って、Ｂｒ１ｊ−３５を伴った若しくは伴わないＴｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００及び／又はＮＰ−４０のような界面活性剤の存在下における、阻害剤としての５，６−シヒドロー６−（２−ナフチル）イミダゾ−（１，２−ｂ）チアゾールの使用は、内因性のＡＬＰの影響を除去し又は実質的に減少させるのに有効である。

サンプル４の改善が最低であることに注意。このサンプルは、結腸癌を有すると診断された患者に由来しており、このためその高分子量の内因性のＡＬＰは腸由来かも知れない。この試験で使用された接合体は腸由来のものであることから、各阻害剤は、腸ΔＬＰを阻害しないように選択されている。

工匡仔／△田ムー工仔／△Ｗ工仔／△山仔／△山仔／Δ山

Claims

【特許請求の範囲】

１．ＡＬＰ接合体を有する固相イムノアッセイにおいて使用するための洗浄組成物であって、液体試験サンプル中に存在するかも知れない高分子量ＡＬＰ又はレベルの上昇した正常分子量ＡＬＰの影響を減少させる洗浄組成物であり、ａ）式Ｒ−Ｃ６Ｈ４−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（式中、Ｒはアルキル基であり、ｎはオキシエチレンモノマーの平均数である。）を有する少なくとも１の界面活性剤と、ｂ）ＡＬＰに対する少なくとも１の阻害剤と、そしてｃ）緩衡剤と、を含んでなる洗浄組成物。
２．該界面活性剤のＲ基が、８個の炭素を含むイソオクチル基でありそして平均ｎが９乃至１０である、請求項１の洗浄組成物。
３．追加の界面活性剤を更に含み、該追加の界面活性剤が、Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（式中、Ｒはアルキル基であり、ｎはオキシエチレンモノマーの数である。）を有するものである、請求項１の洗浄組成物。
４．式Ｒ−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯＨ（式中、Ｒはアルキル基であり、ｎはオキシエチレンモノマーの数である。）を有する第２の界面活性剤を更に含むものである、請求項２の洗浄組成物。
５．該第２の界面活性剤の該Ｒ基が少なくとも１０個の炭素を含み且つ該第２の界面活性剤の該ｎが少なくとも１０である、請求項３の洗浄組成物。
６．該第２の界面活性剤の該Ｒ基が少なくとも１０個の炭素を含み且つ該第２の界面活性剤の該ｎが少なくとも１０である、請求項４の洗浄組成物。
７．ＡＬＰに対する基質を更に含んでなる、請求項１乃至６のいずれかの洗浄組成物。
８．該阻害剤が、該サンプルのＡＬＰに対するＫ１より実質的に大きいＡＬＰ接合体に対するＫ１を有するものである、請求項７の洗浄組成物。
９．該阻害剤が、レバミゾール、プロモテトラミゾール、テトラミゾール、及び５，６−ジヒドロ−６−（２−ナフチル）イミダゾー〔２，１−ｂ〕チアゾールよりなる群より選ばれるものである、請求項８の洗浄組成物。
１０．該緩衝剤がリン酸転移緩衝剤である、請求項７乃至９のいずれかの洗浄組成物。
１１．患者サンプル中に存在しているかも知れない高分子量ＡＬＰ及びレベルの上昇した正常ＡＬＰの影響を実質的に減少させるために、ＡＬＰ接合体を利用する、固相イムノアッセイにおいて使用するための方法であって、ａ）該サンプルを固相支持体と接触させて該固相支持体上に反応区域を形成し、ｂ）該サンプルの分析対象物を該分析対象物に対するレセプターに接触させ、そしてｃ）該固相支持体の該反応区域を、請求項１乃至１０のいずれかの組成物で洗浄する、ことを含んでなる方法。