JPH07508309A - 制御可能な強化ストークスシフトを有する蛍光微小粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 制御可能な強化ストークスシフトを有する蛍光微小粒子発明の分野 本発明はストークスシフトの制御された強化を可能にするｔ；めに多重の蛍光染 料を含むポリマー物質に関する。特に詳しくは、本発明は、好ましい有効ストー クス／７トを有する蛍光微小粒子を生成するために、重複する励起スペクトルと 発光スプクトルとを有する２種以上の蛍光化合物の組合せを含む微小粒子を述べ る。この新規な蛍光微小粒子は例えば、非常に高い感度を要する、ＤＮＡとＲＮ Ａのような生体分子の検出と分析のような用途と、フローサイトメトリー及び顕 微鏡検査による分ｔｃｒ方法とに有用である。

発明の背景 蛍光染料で標識した微小粒子は広範囲な用途に用いられている。微小粒子は一般 に、球状又は不規則な形状であって、直径約５０ｐｍ未満であると考えられる。

微小粒子はスチレン、アクリレート、不飽和塩化物、エステル、アセテート、ア ミド、及びアルコールを含めた、多様な重合可能なモノマーから、幾つかの実用 的な方法によって製造される。微小粒子はさらに、１種以上の第２ポリマーによ って被覆して、粒子の表面特性を変えるように改質することができる。

蛍光微小粒子は、検出可能な蛍光を発光し、環境における特定の物質と結合する ことができる、単分散性で、化学的に不活性な生体適合性粒子の使用がら利益を 得ることができる用途に、最も一般的に用いられる。例えば、生物学的分子を付 着させることができる蛍光粒子はイムノアッセイに（米国特許第４，８０８゜５ ２４号（１９１ｊ））、核酸の検出と塩基配列決定に［ヴエナ−（ｖｔｎｅｒ） 等。

ＡＮＡＬＹＴ、Ｂ　ＩＯＣｌ（ＥＭ、↓且旦、３０８　（１９９１）；クレムス キー（（１９８７）］、細胞表面抗原ノ標識として［ＦＬＯＷ　ＣＹＴＯＭＥＴ ＲＹＡＮＤ　５ＯＲＴＩＮＧ、第２０章、第２版（１９９０）］、及び細胞代謝 プロ５．２７７　（１９８９）］用いられている。微小粒子の大きい表面積は生 物学的分子を取り付けるための優れたマトリックスを提供し、これらの粒子の蛍 光性は高い感度でのそれらの検出を可能にする。これらの微小粒子は水性懸濁液 中で、又は膜に捕捉されたときにそれらの蛍光によって定量されることができる 。

蛍光微小粒子は、通常の光学顕微鏡検査または蛍光顕微鏡検査、レーザー走査共 焦点（ｅｏｎｌｏｃ＊ｌ）顕微鏡検査を含めた、多様な結像（１鳳Ｂ１ｎ５）方 法によって可視化することができる。共焦点顕微鏡検査における三次元像分解方 法は、顕微鏡の点拡大機能（点源の像）の知識を利用して、焦点はずれの光線を その適当な遠近法に釣り合わせる。小さい、均一な蛍光標識ポリスチレン微小粒 子はこれらの顕微鏡に点源として用いられている（Ｃｏｎｆｏｃａｌ　Ｍｉｃｒ ｏｓｃｏｐｙＨａｎｄｂｏｏｋ　１５４頁（１９９０年、改訂版））。

多くの発光化合物が例えばポリスチレン及びポリメチルメタクリレートのような 種々のキャスト又は成形プラスチックに鮮やかな、目視的に魅力的な色を与える ために適することが知られている。均一な蛍光ラテックス微小粒子は特許に［米 国特許第２，９９４，６９７号（１９６１）；米国特許第３，０９６，３３３号 （１９６３）；英国特許第１，４３４，７４３号（１９７６））及び研究文献に ［モルダイ（ＭｏｌｄａＹ）等、Ｊ、ＣＥＬＬ、ＢＩＯＬ、、６４．７５　（１ ９７５）；マーゲル（Ｍａ＋Ｉｅｌ）等、Ｊ、ＣＥＬＬ　ＳＣ１，５６，１５７ （１９８２）］述べられている。発明者の最近の特許出願［Ｂｒ１ｎｋｌｅｙ等 、１９９０年１２月１８日出願の出願路０７／６２９，４６６号］は、蛍光微小 粒子の製造に有用な染料として化合物のジピロメテンホウ素ジフルオリド類（ｆ １組ＩＦ）の誘導体（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−５ −インダセンの誘導体）を開示する。この染料類は有利なスペクトルデータ、そ の他の性質を有して、優れた蛍光微小粒子を生成する。

ジピロメテンホウ素ジフルオリド標識物質は高度に蛍光性であり、光化学的に安 定であるが、これらの蛍光物質の欠点は、１種類のみを用いた場合の、それらの 比較的小さいストークスシフト（ピーク励起波長とピーク発光波長との差）であ る。励起光の最適波長はピーク発光に近いので、干渉を除去又は減少するｊ；め に、小さいストークスシフトを有する蛍光粒子には正確な励起及び発光フィルタ ーが必要である。励起フィルターの慣習的な使用が励起発光の部分をブロックす る、さもない場合には、この励起発光が蛍光の効率を高め、蛍光エステルの強度 を減する。ストークス７７トの大きい、光沢ある蛍光染料を含む蛍光物質は、大 きい蛍光シグナルを生ずる、有効な励起発光の最大利用を可能にする。

ストークスシフトの大きい蛍光物質の他の利点は、他の蛍光物質の存在下で容易 に検出可能であることである。例えばビリン、フラビン及び薬物のような、多く の内因性蛍光分子を含む体液中で、イムノアッセイが典型的に実施される。干渉 蛍光物質の大半は比較的短いストークスシフトを有するので、その励起波長より もはるかに大きい波長で発光する蛍光標識の使用は、大抵のバックグラウンド蛍 光が最小である波長において標識の蛍光エステルが発光するので、標識をバック グラウンド蛍光から区別することを容易にする。

ストークスソフトの大きい蛍光物質の第３の利点は、単一サンプル中の多重分析 物の単一励起波長を用いた検出におけるそれらの有用性である。それぞれが特定 波長（例えば、４８８ｎｍアルゴンレーザー主要発光）において励起されること ができる、２種類以上の蛍光標識を用いると、種々な標識の発光ピークは異なる 波長において検出され、各発光スペクトルは単一分析物の特徴である。これを上 首尾Ｉコ実施するためには、種々な染料の間の補正率が最小になるように、蛍光 標識の発光ピークが相互から良好に分離されなければならない。標識の高い光安 定性（ｐｈｏｌｏｓｌｉｂｉｌｉｌｙ）も有利である。ストークスシフトの大き い蛍光物質はスト−７ス／フトの小さい蛍光物質と組合せて用いることができ、 この場合に両方の物質は同一波長で励起し、異なる波長で発光し、多重のシグナ ルを生じ、これらのエステルは光学フィルター又はモノクロメータ−によって分 解されることができる。

５０〜１１００ｎのストークスシフトと、検出可能性のために必要な、高い蛍光 効率と５００ｎｍより大きい発光波長とを有する標識試薬として有用な、蛍光化 合物は、残念ながら、比較的稀である。［ハウグランド（Ｌｕ（ｌｚｏｄ）、顕 微鏡検査と結像のためのフルオレセイン代替え物、０ＰＴＩＣＡＬ　ＭＩＣＲＯ ５ＣＯＰＹ　ＦＯＲＢＩＯＬＯＧＹ、１４３−５７頁（１９９０）］。蛍光染料 におけるストークスシフトの大きさは、強いエステルを保証するために必要な、 高い吸光度に一般に逆比例することか判明している。例えばキサンチン、ジピロ メテンホウ素ジフルオリド、ローダミン及びカルボ／アニンのような生物学的分 子の標識試薬として用いる蛍光染料は一般に、約３０ｎｍ未満のストークスシフ トを存する。

大きいストークスシフトを有する適当な蛍光染料が存在しないことが、標識とし てのフィコビリ蛋白質として知られた蛋白質ベースド発蛍光団の開発と使用を導 いた［例えば、両方ともストリニル（Ｓ＋ｒｙｅｒ）等の米国特許第４，５２０ ，１１０号と第４，５４２，１０４号（１９８５）を参照のこと］ｅ他の発蛍光 団と同様に、これらはビーズ及びマクロ分子に共有結合されている０例えば、オ イ（Ｏｉ）等のＪ、ＣＥＬＬ　ＢＩＯ，主３，９８１　（１９８２）を参照のこ と。これらの大きいビリン含有分子は非常に高い吸光係数と言う好ましい特徴を 有し、共有結合した、異なる発蛍光団の間の内部エネルギー伝達を利用して、比 較的大きいストークス７７トを得る。これらは低い化学的安定性、光漂白に対す る不安定性、限定された長波長発光能力、大きい分子サイズ（ＭＷ＞１００，０ ００ダルトン）及び比較的高い費用と言う欠点を有する。さらに、この種のごく 僅かな蛋白質が知られているにすぎないので、それらのスペクトル特性を選択又 は適当に調節することができない。フィコビリ蛋白質の蛍光発光効率をそれらの 分子サイズを有意に高めずに改良しようと試みて、フィコビリ蛋白質は蛍光染料 アズーレ（ム！糟ｎ）Ａに共有結合されている（チャン（Ｃｈｌｍ）への米国特 許第４，６６６．８６２号（１９８７））。

１対の発蛍光口の共有結合が個々の染料のいずれよりも大きいストークスシフト ををする蛍光染料を生ずることは知られている（例えば、ゴレレンコ（Ｇｏｒｅ ｌｅａｋｏ）等、溶液及びポリマー中のレーザー染料に基づく二色発色団の７オ トニクス、ＥＸＰＥＲＩＭＥＮ置ＬＥ　ＴＥＣＨＮＩＫ　ＤＥＲＰＨＹＳＩＫ　 ３７．３４３　（１９８９））。このアプローチは、報告ではストークスシフト の増大に効果的であるが、２種の染料を化学的に結合させるために、有効な反応 部位の数と位置によって限定される、複雑な合成方法を必要とする。３種、４種 又はそれ以上の染料を充分に密接に結合させ、適当な形態で実質的なエネルギー 伝達を行わせるために必要な合成操作を実施する方法は、不可能ではないとして も、非常に困難である。さらに、共有結合した分子は典型的に、有意な衝突不活 化が生ずるほど充分な運動の自由を有し、蛍光よりもむしろ振動緩和によってエ ネルギー損失を生ずる。強化された有効ストークスラフトを有する、有用な蛍光 標識を得るために複雑な共有結合以外の方法によって染料のスペクトル特性を結 合させる手段が必要である。

共有結合した染料対の間のエネルギー伝達の研究では、２種の蛍光染料間のエネ ルギー伝達の効率が、フェルスター（Ｆｏｒｓｕｒ）の理論に一致して、２種の 相互作用分子の間の距離の６乗に逆比例することが判明している（ストリニル（ Ｓｌａｙｅ「）とハウグランド（Ｈｘａ（ｌｓａｄ）、−１不ルギー伝達：分光 器ルーラ−、ＰＲＯＣ，ＮＡＴ’　Ｌ　ＡＣＡＤ、ＳＣ１，ＵＳＡ５８，７１９ 　（１９６７））。この参考文献は、測定可能なエネルギー伝達％を用いて、１ ０〜６０人範囲内の共有結合した発蛍光団を分離して距離を測定することができ ることを示唆する。その後の論文、ハウグランド（口ａｕ（ｌｚｎｄ）、イグエ ラビド（Ｙ（ｕｓｒｚｂｉｄｔ）及びストリニル（Ｓｔｒｙｅｉ積分値の大きさ に依存することを報告している。

マクロ分子に結合した染料の開のエネルギー伝達は、生体分子におけるｒ例えは 、ジュリエンＱｕｌｌｉｅ＋＋）とガレル（Ｃａｒｅｔ）、ＢＩＯＣＨＥＭ、２ ２，３８２９　（１９８３）；ウーレイ（Ｗｏｏｌｅｙ）等の、Ｂ　ｌ０ＰＨＹ Ｓ、ＣＨＥＭ、旦、３６７（１９８７）］及びポリマー鎖と組織とにおける［例 えば、オーミン（ｏｈ醜１ｎｅ）等、ＭＡＣＲＯＭＯＬＥＣＵＬＥＳ　１０，８ ６２　（１９７７）、ドレイク（Ｄｒａｋｅ）等、５ＣＩＥＮＣＥ主Σよ、１３ ７４　（１９９１）］分子内距離及び配座の研究に実証されている。結果として の波長シフトを伴うエネルギー伝達はレーザー光線発生（ｌａｓｉｕ）溶液中の 染料混合物に関して述べられている１例えば、サイト（Ｓａｉｔｏ）等、ＡＰＰ Ｌ、））ＨＹＳ、ＬＥＴＴ、５６，８１１　（１９９０）、染料と他の組織化分 子アセンブリどの単分子層間のエネルギー伝達は実証されている、例えば、ター ン（ＫｕｈΩ）、簡単な組織化分子系の製造、ＰＵＲＥ　ＡＰＰＬ。

ＣＨＥＭ、１上、３４５　（１９６６）、ＣＨＥＭ、ＡＢＳＴＲＡＣＴＳ、見見 。

６７１　（１９６７）に要約：ヤマブキ（Ｙａｍｓｘａｋｉ）等、Ｊ、ＰＨＹＳ 、ＣＨＥＭ。

１±、５１６　（１９９０）。供与体と受容体との組合せの間のエネルギー伝達 も、エネルギー伝達動力学の研究手段としてポリマーフィルムにおいて実証され ている、例えば、マ々ガ（ＭｉｔＢｘ）等、Ｊ、ＰＨＹＳ、ＣＨＥＭ、７３，３ ７０　（１９６９）；べ不ノト（Ｂｅｎｏｔｔｌ）、Ｊ、ＣＨＥＭ、ＰＨＹＳ　 ＩＣ５，４１，３０３７（１９６４）。フェルスターの理論式への研究結果の適 合は広範囲に報告されているが、この理論の実用的な応用は限定されている。上 記参考文献は、染料組合せを配合した蛍光微小粒子を有効ストークスシフトが強 化された標識試薬として用いることを予想も示唆もしていない。

より有用な蛍光標識試薬を形成するために、衝突不活化を最小にし、効果的なエ ネルギー伝達を可能にし、有効ストークスソフトを増大させながら、多重の染料 のスペクトル特性を組合せるための復雑な共を結合よりも簡単な方法を提供する ことが、本発明の目的である。有効ストークスシフトが増大するのみでなく、ス ペクトル特性が重複する適当な染料の選択によって、有効ストークスシフトが選 択的に制御されうる物質を提供することが、本発明の他の目的である。

本発明によってポリマーマトリックス中にランダムに蛍光染料を固定することは 、制御可能な強化有効ストークスソフトを有する、新規な蛍光物質を製造するｌ ；めのごく簡単な方法を提供することになる。例えばジピロメテンホウ素ジフル オリド染料、クマリン染料及びポリオレフィン染料のような、ある種の蛍光染料 はポリマー物質中に導入されたときに高い蛍光効率を有し、広範囲な励起及び発 光最大値を有する多数の誘導体として利用可能である。これらの特徴は、微小粒 子に配合するために適当なスペクトル重複を有する染料を細心に選択することに よって、励起波長と有効ストークス／７ト増大の太ささとの容易な制御を可能に する。

図面の説明 図１はジピロメテンホウ素ジフルオリド染料の種々な組合せを含む、０．０９３ μｍポリスチレンラテックス粒子の発光スペクトルのグラフである。スペクトル Ａは４９０ｎｍ（好ましい励起波長）において励起した、１６μＭｏｌ／ｇ−ラ テックスの化合物１（下記表２参照）を示し、スペクトルＢはこの場合も４９０ ｎｍにおいて励起した、１６μＭｏｌ／ｇ−ラテックスの化合物ｌ（供与体）と ９．６μＭｏｌ／ｇの化合物２（受容体）との混合物を含む粒子によるものであ り、スペクトルＣは５４０ｎｍにおいて励起した、９．６μＭｏｌ／ｇ−ラテッ クスの化合物２を含む粒子の発光である。

図２は３種のジビロメテンホウ素ジフルオリド染料二化合物ｌ（供与体染料）、 化合物２（トランスファー染料）及び化合物３（受容体染料）を含む０．０９３ μｍポリスチレンラテックス粒子の発光スペクトルを示す。

図３は０．０９３μｍラテックス微小粒子における約１０ｎｍから７０ｎｍまで のストークスノットの増大によって得られる蛍光／グナルの増強をグラフ形で示 す。スペクトルＡ（図３Ａ）の微小粒子は１６μＭｏｌ／ｇ−ラテックスの化合 物１を含み、スペクトルＢＩＪ３Ｂ）の微小粒子は１６μＭｏｌ／ｇ−ラテ／ク スの化合物ｌ（供与体）と９．６μＭｏｌ／ｇ−ラテックスの化合物３（受容体 ）とを含む。対比的に陰影をつけた領域はこれらの微小粒子製剤の各々に用いる ことができる最適フィルター帯幅を示し、供与体−受容体染料対を含む微小粒子 から得られる／グナル増強を実証する。

発明の概要 本発明は有効ストークスノットの’Ｍｊ御された強化を可能にする多重蛍光染料 を含むポリマー微小粒子に関する。有効ストークスシフトは微小粒子のストーク スノットである、すなわち初期供与体染料のピーク励起波長と、微小粒子に配合 した後の最終受容体染料の発光ピークとの差である。特に、本発明は重複した励 起スペクトルと発光スペクトルを有する２種以上の蛍光化合物の組合せを含む微 小粒子を開示する。組合せ中の最後の染料の発光波長において再発光する、組合 せ中の第１染料の励起波長からの効果的なエネルギー伝達が、大きい、容易に制 御可能な有効スト−々ス／フトを生ずる。適当な染料の選択が好ましい励起及び ／又は発光波長と、所定の増大した有効ストークスノットとを有する蛍光プロー ブ微小粒子に配合するだめの蛍光染料の組合せはそれらの励起及び発光スペクト ル特性に基づいて選択される。組合せに含まれる染料は高エネルギー（短波長） から低エネルギー（長波長）へ伝達される励起エネルギーのカスケードを形成し 、そｉｔらの配合順序又は微小粒子中のそれらのランダムな物理的位置に拘わら ず、組合せ中の最終染料からの光学ルミネセンスの強化を生ずる。

蛍光染料の組合せのスペクトル特性は、それらが用いられるポリマー物質中で測 定すべきである。ある種の４．４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ −５−インタセンと４．４−；フルオロ−４−ボラ−３ａ、４ａ、８−トリアサ 〜Ｓ−インダセ・染料は溶液中でのそれらのスペクトル特性に匹敵するスペクト ル特性をポリマー物質中で示すことが判明しているが、大抵の染料はそれらを測 定する媒質に依存して、有意な、予測不能なストークスシフトを示す。一般に、 油溶性染料と中性染料とはポリマー物質と比較的容易に結合する。後述するよう な好ましい励起及び発光ピークに加え、本発明に有用な染料は一般に、約０゜２ より太きい、好ましくは約０．５より大きい量子収量と、約２５．ＯＯＯｃｍ− ’Ｍ−’より大きい、好ましくは約５０．ＯＯＯｃｍ−’Ｍ−’より大きい吸光 係数とを有する。

候補の染料の励起及び発光ピーク、その他の性質は通常の手段によって容易に測 定される。染料の励起ピークは吸収分光光度計で吸収スペクトルを走査すること によって、又は直接、走査蛍光分光光度計を用いて蛍光励起スペクトルを走査す ることによって大体測定することができる。染料の発光ピークを蛍光分光光度計 を用いて測定して、走査蛍光計を用いて発光スペクトルを得ることができる。

量子収量は典型的に、励起波長において未知染料と既知吸光度を有する基準染料 との両方のポリマー中での総蛍光発光を蛍光計によって測定することによって得 られる。吸光係数は典型的に、分光光度計を用いて、重量測定によって測定され た濃度を有する溶液の吸光度を測定し、ペール−ランベルトの法則に基づいて吸 光係数を算出する二とによって得られる。適当な染料のスペクトル特性を測定し た後に、好ましいスペクトル特性を有する染料を選択する。

水銀アーク　２５０〜６００　２５４．３０．４３６．５４６キセノンアーク　 ２５Ｇ−１０００、＋６７、＞８００の数本タノクステノフ（ラメノド　３５０ 〜１０００　なし［１ｓ−Ｃｄレーザー　３２５，４０　４４！Ａｒレーザー　 ３５０．３６０、ｆＨ，４７６、ＩＨ４Ｎ、５目１９６．５１１ Ｈｅ−ＣｄＬ−ザー　５１３，５９１．６３３　６３３Ｋｒレーザー　５３０， ５６８．６１７．６７６　６４７成する（例えばＮ２レーザー）又は０ｗイオン レーザ−によるボンピングを必要とする（例えば染料レーザー、Ｔｉ：サファイ アレーザー）他の幾つかのレーザー源も利用可能である。

（１〕）物質依存性、多重の種類が利用可能である。

蛍光染料の組合せは好ましい励起ピークを有する初期供与体染料を含む。この初 期供与体染料は例えばフォトン、Ｘ線、又は放射性物ｉ！［（例えばβ−エミッ ター）の崩壊からのような、外部励起エネルギーを受容する。本発明の１実施態 様では、初期供与体染料は、放射性物質の危険を避けるために、白熱励起源又は レーザーベースド励起源から励起エネルギーを受容する。アルゴンイオン、クリ プトンイオン、Ｈｅ−Ｃｄ、Ｈｅ−Ｎｅ、エキ７マー、ダイオード、金属蒸気、 ネオジミウム−ＹＡＧ、窒素等を含む１／−ザーは、蛍光励起のための充分なエ ネルギー（ｐｏｗｅ「）を含む、１〜数本の分離しｊニラインを生ずる。レーザ ー源は紫外線から赤外線までのスペクトルにわた）で多くの励起ラインを形成し 、広範囲な蛍光染料を励起させるために利用可能である。

組合セ中の初期供与体染料は好ま（７い励起源からのエネルギーの発光波長と重 複する励起ピークを有する。例えば、最も広範囲に用いられるビーム走査共焦点 顕微鏡は現在、空冷Ａｒイオンレーザ−を用いており、又はさらに最近では、Ａ ｒ−Ｋｒガス混合物を用いており、これらは約４５０ｎｍ〜６５０ｎｍの間で蛍 光染料励起を可能にする。好ましくは、励起ピークは励起源からのエネルギーの 吸収のために最適である、すなわち励起ピークは励起源の出力と有意に重複する 。表１は幾つかの通常の励起源の波長をリストする。

本発明に用いる蛍光染料の組合せは好ましい発光ピークを有する最終受容体染料 をも含む。一般に、好ましい発光ピークは所望の有効ストークスシフトの大きさ に基づく。バックグラウンド゛ノイズ″に比較しｔ−蛍光発光の強度（シグナル 対ノイズ比）が、感度と像対比の基本である。蛍光データのシグナル対ノイズ性 質は問題の発光蛍光とは異なる波長においてバンクグラウンドングナルによって ひどく妨害される。バックグラウンドフグナルは光散乱から生ずるか、又は多く の生物学的系に固有に存在する蛍光によるものであるが、又は分析的に有用な第 ２発光種から発生する。例えは、細胞の自己蛍光を避けること、又は共通の波長 によって励起されるが、好ましい有効ストークス／ブトを与える染料組合せの選 択によって異なる波長で検出されることができる、ある範囲の物質を形成するこ とが可能である。

好ましい大きさの有効ストークスシフトは、中間の供与体染料と受容体染料との 両方として作用するイ」加的又は“トランスファー″染料を蛍光染料の組合せに 含めることを必要とするであろう。好ましい励起及び発光ピークを正確に調整す るために、比較的狭いストークス／アトを有する個々の染料が、トランスファー 染料として好ましい。各トランスファー染料は組合せ中の上記染料からエネルギ ーを受容しく上記染料に対して受容体染料どして作用する）、受容しｊ；エネル ギーを組合せ中の次の染料に実質的に伝達する（次の染料に対して供与体染料と して作用する）。蛍光染料組合せ中の各染料は組合せ中の他の染料とのスペクト ル重複を有する、すなわち組合せ中の各供与体又はトランスファー染料の発光ピ ークは組合せ中の次の受容体又はトランスファー染料の励起ピークと重複する（ Ｅｘ、４／図２）。励起ピークと発光ピークとは充分に重複するので、励起時に 、各染料から次の染料への励起エネルギーの有意な（すなわち、約５０％を越え る）伝達が達成される。エネルギー伝達効率の測定は、供与体染料のみを負荷し たポリマーと同程度の染料負荷時に測定される供与体染料の発光ピークの蛍光強 度の低下によって評価される（図１）、典型的には、実質的に完全なエネルギー 伝達が達せられる（すなわち、約９０％を越える）。好ましくは、約９５％を越 えるエイ・ルギー伝達が達せられる。さらに好ましくは、約９８％を越えるエネ ルギー伝達が達せられ５゜エネルギー伝達効率が約９０％未満に低下する場合に 、トランスファー染料の添加が最も適当である。トランスファー染料の機能は初 期励起供与体染料から励起状態エネルギーを受容して、最終的に検出される受容 体染料へのこのエネルギーの伝達を容易にすることである。

典型的に、供与体染料とトランスファー及び／又は受容体染料との間の平均分子 内距離が約４０人〜約２５人になるように充分な量の染料がポリマー微小粒子に 負荷されるときに、好ましいエイ旬しギー伝達が達せられる。約４０人より大き い染料間の分子内距離は一般にあまり効果的でないエネルギー伝達を生じ、約２ ５人より小さい染料間の分子内距離は一般に、染料の蛍光発光を減するような、 非放射性エネルギー低下を生ずる。

組合せ中の初期染料から組合せ中の最終染料への効果的なエネルギー伝達が生ず るように、充分な数の供与体、受容体及びトランスファー染料が組合せ中に含ま れる。染料は等量で含むことができるが、染料総量があまりに多すぎると、非放 射性エネルギー低下のために、ポリマーの性質の劣化が生じ、物質の最適に及ば ない蛍光が生ずる。総染料濃度が約１０重量％未満であるときに；総染料濃度が 好ましくは約０５〜２重量％未満、より好ましくは、約０．８〜１．２重量％未 満であるときに、有意なエネルギー伝達と適合しうる発蛍光団間の平均ランダム 距離が一般に生ずる。時には、供与体染料及び受容体染料よりも少ない（少ない モル当量の）トランスファー染料を用いて、好ましいエネルギー伝達を得ること ができる。初期供与体染料よりも少ない（少ないモル当量の）最終受容体染料も 好ましいエネルギー伝達を達するために効果的である。最終受容体量を初期供与 体量に比例して増加させることは一般に、最終蛍光シグナルの改良に殆ど影響を 及はさないが、初期供与体の割合を高めることは最終受容体染料の有効吸光係数 を改良し、発光を増加させる。理論によって縛られることを望む訳ではないが、 初期供与体染料が多い程励起時に大きい吸光係数を生じ、これが次により強度な 蛍光／グナルを生ずるように、供与体染料は受容体染料にエネルギー出力を集中 させるための放射線回収機構として機能するように思われる。初期供与体染料対 最終受容体染料の実行可能な比は約１＝５と約１０＝１との間であり；好ましく は約１１と約８：１との間であり；より好ましくは約４・１と約６＝１との間で ある。

本発明の１実施態様では、新規な蛍光物質を２種以上のポリアザインダセン染料 （すなわち、４．４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−５−インタ セン又は４．４−’、；フルオロー４−ボラー３ａ、４ａ、８−トリアザ−５− インタセンの誘導体）から製造する。本発明による蛍光ポリマー微小粒子の製造 に適したポリアザインダセン誘導体は式（Ｉ）。

［式中、Ｒ１−Ｒ４は同−又は異なる基であり、単独の又は組合せた、水素、ハ ロゲン、アルキル、アルコキン、アルケニル、／クロアルキル、アリールアルキ ル、アンル、アリールもしくはヘテロアリールであり；Ｒ７は窒素、メチン、又 はハロゲ／−、アルキル−、アルコキ／−、アルケニル−、シクロアルキルー、 アリールアルキル−、アンルー、アリール−もしくはヘテロアリール−置換メチ ンである］で示される一般構造を有する。

ポリアザインダセン誘導体のアルキル、シクロアルキル、アリールアルキル、ア 乃し、アルコキン及びアルケニル置換基は一般にそれぞれ独立的に炭素数約２０ 未満、好ましくは炭素数約１０未満である。アルケニルなる用語には、エチニル 又は共役ジェニル又はトリエニルを含み、これらはざらに水素、ハロゲン、アル キル、シクロアルキル、アリールアルキル、アシル、（これらのアルキル部分は それぞれ炭素数約２０未満である）、シアノ、カルボキンレートエステル、カル ボキサミド、アリール又はヘテロアリールによって置換されてもよい。　ヘテロ アリール基は少なくとも１種のへテロ原子（環構造を形成する非炭素原子）を含 む複素環芳香族基である。ヘテロアリール基は単環構造又は融合した二環もしく は三環構造であることができる。各環は五員環若しくは六員環でありうる。ヘテ ロアリール基は１個以上のへテロ原子を含むことができる。ヘテロアリールなる 用語は、アルキル−、アリール−、アリールアルキル−又はヘテロアリール−置 換誘導体を含む。例えば、ヘテロアリール置換基はビロール、チオフェンもしく はフラン（単環、単ヘテロ原子）、又はオキサゾール、インオキサゾール、オキ サシア／−ルもしくはイミダゾール（単環、多重へテロ原子）である。或いは、 ヘテロアリール基は１種以上のへテロ原子を含む多環構造であり、例えばヘテロ アリール置換基はベンツキサゾール、ベンゾチアゾールもしくはベンズイミダゾ ール（多環、多重へテロ原子）、又はベンゾフランもしくはインドール（多環、 単ヘテロ原子）である。

一般に、４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−５−インダセン 誘導体染料は適当などロール先駆体から、技術上公知の方法［例えば、ボイヤー （ＢＢｅｒ）等への米国特許菓４．９１６，７１１号（１９９０）とハウグラン ド（Ｈａｕ（ｆｉｎｄ）等への米国特許第４．７７４，３３９号（１９８８）、 これらの各々は参考文献として関係する〕に従って製造される。典型的には、は ぼ化学量論的割合のピロール先駆体（これらの１種は２−位置にアルデヒド又は ケトン官能基を含む）を、例えば臭化水素のような、適当な酸によって仲介され る反応において縮合させて、中間体のピロメチン塩を得る。例えばトリメチルア ミンのような強塩基と組合せて三フッ化ホウ素を加入ることによって、複素環形 成の環化が完成する。４．４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ、４ａ、８−トリア ザ−５−インダセン誘４体は、例えばＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンのよ うな塩基の存在下での三フッ化ホウ素によるアザピロメチンの環化によって合成 される。アザピロメチン中間体は２−ニトロソピロール誘導体と、２−位置に水 素を有する、適当なピロール先駆体との酸触媒作用縮合によって製造される。

制御された有効ストークスノットを有する蛍光微小粒子の製造に適したポリアザ インダセン染料の代表的なサンプルとそれらのスペクトル特性の要約とを表２に 含める。他の有用なジビロメテンホウ素ジフルオリド染料は１９９１年５月２２ 日出願のカンタ（ＫｉｎＯ等への同時係属特許出願第０７／７０４，２８７号と 、１９９０年１２月１８日出願のハウグランド（Ｈｓｕｌｌｚｎｄ）等への出願 第０７／６２９．５９６号（これらの各々は参考文献として関係する）とに述べ られている。

ポリマー微小粒子中に共に配合する場合に、供与体から受容体への効果的なエネ ルギー伝達が行われるように充分に重複する、望ましい励起波長と発光波長を有 するポリアザインダセン誘導体の適当な選択は、（１）供与体、トランスファー 及び／又は受容体染料の励起と発光との波長と；　（２）供与体染料発光とトラ ンスファー及び／又は受容体励起との重複：　（３）供与体、トランスファー及 び／又（ま受容体染料の相対的濃度：及び（４）染料分子間の平均距離を考慮し て、達せられる。

表２．ポリアザインダセンの例＊と関連するスペクトルデータ化合物　Ｒ＋　Ｒ ２Ｒｓ　Ｒ４Ｒｓ　Ｒｓ　ＲｙＩ　ＨＨＨＣＬ（ｉ　ＨＣＨ３ＣＨ ２ＣＨ，ＨＣＨ，ＣＨ，ＨＣＨｌ　ＣＨ３ＣＨ，ＨＣＨＩ　Ｐｈ　ＨＰｈ　ＣＨ ４Ｐｈ　ＨＰｈ　Ｐｈ　ＨＰｈ　ＣＨ ５Ｐｈ　ＨＰｈ　Ｐｈ　ＨＰｈ　Ｎ ６　Ｐｈ　ＨＰｈ　Ｐｙｒ↑　ＨＨＣＨ本本代表扉、非排他的例 ↑２−ピロリル ↑メタノール中の遊離染料の吸収最大（λ＾’、、、）と発光最大（Ａ″“１５ ．）測定値 キ　ラテックス水性二濁液中の染料の吸収最大（λＡｍ＋＝、、）と発光最大（ λ１“６．。

）測定値。光学密度７００ｎｍにおいて０．１に設定。

特定用途に適用するために、励起特性と発光特性の両方を用いて、励起源と検出 器との特定必要条件を満たすように蛍光物質は容易に調整される。例えば、化合 物１はアルゴンレーザーの本質発光に相当する約４８８ｎｍの非常に有用な励起 を有する染料として、供与体染料どして選択され、表２の他の染料は所望の発光 ピーク？得るためのトランスファー染料又は受容体染料として選択される。

化合物１によってのみ標識されたポリスチレン微小粒子は５０４ｎｍにおける最 大励起と約５１２ｎｍに集中する黄〜緑色蛍光発光とを有する。粒子を化合物３ によってのみ標識する場合は、粒子は５５７ｎｍに集中する橙色蛍光発光を有す る。化合物１　（供与体）と化合物３（受容体）とを適当なモル比で混合して、 ポリスチレン微小粒子中に配合する場合には（Ｅｘ、３）、５１２ｎｍにおける 化合物ｌの黄−緑色発光は約９５％より大きい効率で化合物３に伝達されて、５ ５７ｎｍｌ：８ける橙色発光を生ずる。有効ストークスシフトは８ｎｍから５６ ｎｍへ増大する（図１）。宵効ストークス／フトをさらに高めるために、トラン スファー染料を加入る二とかできる。化合物ｌ（供与体）、化合物３（トランス ファー染料）及び化合物４（受容体）とを適当なモル比で混合して、ラテックス 微小杓子中！こ配合する場合には（Ｅｘ、４）、エネルギー伝達（約９５％より 大きり・効率１こよる）か６０５ｎｍにおける赤色発光を生ずる。有効ストーク スシフトＩｉ８　ｎ　ｍからｌ　０１　ｎｍへ増大する（図２）。化合物１（初 期供与体）、化合物３（１−ランス７アー染料）、化合物４（トランスファー染 料）及び化合物６（最終受容体）とを混合して、ラテックス微小杓子中に配合す る場合には、エネルギー伝達（約９０％より大きい効率による）が６４５ｎｍに おける暗赤色発光を生ずる。有効ストークスシフトは８ｎｍから１４１　ｎｍへ 増大する。

或いは、化合物３を供与体として用い、化合物４を受容体として用いた場合に、 この場合にも共通アルゴンレーザー（第２ライン）を用い、ヒト血清の自己蛍光 の大部分を避けるならば、約５３０ｎｍにおいて励起することができ、約６０５ ｎｍにおいて発光することができる（有効ストークスシフト約７５ｎｍ）ラテッ クス粒子を得ることができる。染料の発光ピークと励起ピークとの間にスペクト ル重複が生ずる限り、多くの他の染料組合せが可能である。

本発明の他の実施態様では、蛍光染料はクマリン染料の組合せである。適当な染 料には、表３にリストした商業的に入手可能な染料がある。既述したポリアザイ ンダセン染料の場合と同様に、ポリマー微小粒子中に共に配合するときに、供与 体から受容体への効果的なエネルギー伝達が達せられるように充分に重複する、 好ましい励起波長と発光波長とを有するクマリン誘導体の適当な組合せを選択す ることができる。例えば、３６０ｎｍにおいて励起し、約４１５１ｍに集中する 発光を示す（ポリスチレンラテックス中）初期供与体クマリン１３Ｂ（７−シメ チルアミノ／りロペンタ　［Ｃ］　クマリン）を適当なモル比で、４３０　ｎｍ において吸収し、約４６０ｎｍに集中する発光を示す（ポリスチレンラテックス 中）最終受容体クマリン３１４　（２，３，５，６−ＬＨ，４Ｈ−テトラヒドロ −９−カルポエトキ／キノリジノ−（９，９ａ、１　ｇｈ＞クマリン）と混合し て、ラテックス微小粒子中に配合する場合には（Ｅｘ、５）、クマリン１３８の 置き発光がクマリン３１４に伝達されて、約４６０ｎｍに集中する青−緑色発光 が生ずる。有効ストークス、フトは５５ｎｍから１１００ｎへ増大する。

新規な微小粒子は非常に高い蛍光効率を有し、典型的に、分子間のエネルギー伝 達プロセスを通しての、エチル強度の見かけの（ａｐｐｕｅｎ＋）損失は生じな い。例民は、吸光度か０５８である場合に４９０ｎｍにおいて図１に示した蛍光 微小粒子中の供与体染料の励起は、吸光度か同様に０．５８である場合に５４０ ｎｍにおける受容体染料の励起に起因する５５７ｎｍにおける対応シグナルに等 しい／エチルを５５７ｎｍにおいて生ずる。この極度に高い伝達効率は、図１の 蛍光スペクトルにおいて供与体染料からの検出可能な発光シグナルが殆ど存在し ないと言う観察に一致する。図１１スペクトルＡの４９０ｎｍ〜５２０ｎｍの発 光シグナルの積分面積と図１、スペクトルＢの４９０ｎｍ〜５２０ｎｍの発光シ グナルの積分面積との比較は、伝達効率が約９９％であることを実証する。

供与体染料の発光ピークとトランスファー及び／又は受容体染料の励起ピークと の間の重複度は完全である必要はない。例えば、図４に示しｔ；微小球では、ジ フェニルヘキサトリエン（ＤＰＩ）の発光ピークと化合物１の励起ピークとの間 に完全ではない重複が存在する。それにも拘わらず、この重複はＤＰＨから化合 物ｌへの発光の約７５％の伝達をもたらす。

例えば上記ポリアザインダセン又はクマリンのように、染料は典を的に同じ種類 から選択される。他の適当な染料の種類には、炭化水素と置換炭化水素染料；／ ンチレーンヨン染料（通常は、オキサゾールとオキサジアゾール）；アリール− 及びヘテロアリール−置換ポリオレフィン（Ｃｚ−Ｃａオレフィン部分）；カル ボ／アニン：フタロ／アニン；オキサジン；カルボスチリル：及びポルフィリン 染料がある（表３参照）。しかし、例えばポリオレフィン染料とジビロメテンホ ウ素ノフルオリド染料（Ｅｘ、６）；クマリン染料とジビロメテンホウ素ジフル オリド染料（Ｅｘ、７）；ポリオレフィン染料とクマリン染料；ジピロメテンホ ウ素ノフルオリド染料とオキサジン染料：及びその他の多くの組合せのような、 構造的に異なる染料の間で効果的な二手ルギー伝達を得ることも可能である。表 ３は商業的に入手可能な、適当な蛍光染料の部分的なリストを含む。

表３．商業的に入手可能な染料 ５−アミノ−９−ジエチルイミノベンゾ（ａ）フェノキサシニウムパータロレー ト ７−アミノ−４−メチルカルボスチリル７−アミノ−４−メチルクマリン ７−アミノ−４−、トリフルオロメチルクマリン３−（２’−ベンズイミダゾリ ル）−７−Ｎ、Ｎ−ジエチルアミノクマリン３−（２’−ベンゾチアゾリル）− ７−ジエチルアミノクマリン２−（４−ビフェニリル）−５−（４−ｔ−ブチル フェニル）　−１，３，４−オキサジアゾール ２−（４−ビフェニリル）−５−フェニルー１．３．４−オキサジアゾール２− （＋−ビフェニリル）−６−フエニルペンゾキサソールー１．３２．５−ビス− （４−ビフェニリル）−１，３，４−オキサジアゾール２．５−ビス−（４−ビ フェニリル）−オキサゾール４．４”−ビス−（２−ブチルオクチルオキシ）− ｐ−クォーターフェニルルービス（０−メチルスチリル ５、９−ジアミノベンゾ（ａ）フェノキサシニウムバークロレート４−ジノアノ メチレン−２−メチル−６−（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−４Ｈ−ピラン １、１′−ジエチル−２．２′　−カルボシアニンヨーシト１、１′−ジエチル −４．４′　−カルボシアニンヨーシト３、３′−ジエチル−４．４’　、５． ５’　−ジベンゾチアトリ力ルポシアニンヨージド １、１′−ジエチル−４．４゛　−ジカルボンアニンヨーシト１、ｌ゛−ジエチ ル−２．２″　−ジカルボンアニンヨーシト３、３′−ジエチル−９．１１−不 才ペンチレンチアトリカルポシアニンヨージド １、３゛−ジエチル−４．２′　−キノリルオキサカルボシアニンヨージド１、 ３′−ジエチル−４．２′　−キノリルチアカルボンアニンヨーシト３−ジエチ ルアミノ−７−ジエチルイミノフェノキサゾニウムパークロレート７−ジエチル アミノ−４−メチルクマリン７−ジエチルアミノ−４−トリフルオロメチルクマ リン７−ジエチルアミノクマリン ３、３′　−ジエチルオキサジ力ルポシアニンヨージド３、３′　−ジエチルチ アカルポンアニンヨージド３、３′　−ジエチルチアジカルボンアニンヨーシト ３、３′　−ジエチルチアトリ力ルポシアニンヨージド４、６−シメチルー７ー エチルアミノクマリン２、２”’　−ジメチル−ｐ−クォーターフェニル２、２ ”’　−ジメチル−ｐ−ターフェニル７−シメチルアミノー１−メチル−４−メ トキシ−８−アザキノロン−２７−ノメチルアミノー４−メチルキノロン−２７ −シメチルアミノー４−トリフルオロメチルクマリン２−　（４−　（４−ジメ チルアミノフェニル）−１．３−ブタジェニル）−３−エチルベンゾチアゾリウ ムパークロレート２−　（６−　（ｐ−ジメチルアミノフェニル、５−ヘキサト リエンル）−３−メチルベンゾチアゾリウムバークロレート２−（４−（ｐ−ジ メチルアミノフェニル）−１．３−ブタジェニル）−１．３、３−トリメチル− ３Ｈ−インドリウムバークロレート３、３°　−ジメチルオキサトリカルポンア ニンヨージド２、５−ジフェニルブラン ２、５−ジフェニルオキサゾール ４、４′　−ジフェニルスチルベン ｌ−エチル−４−（４−（ｐ−ジメチルアミノフェニル）−１．３−ブタジェニ ル）−ピリジニウムバークロレート １−エチル−２−　（４−　（ｐ−ジメチルアミノスチリル）−１．３−ブタジ ェニル）−ピリジニウムパータロレート １−エチル−４−　（４−　（ｐ−ジメチルアミノフェニル）−１．３−ブタジ ェニル）−キノリウムバークロレート ３−エチルアミノ−７−エチルイミノ−２．８ージメチルフエノキサジン−５＝ イウムバークロレート ９−エチルアミノ−５−エチルアミノ−１０−メチル−５Ｈ−ベンゾ（ａ）フェ ノキサシニウムパータロレート ７−エチルアミノ−６−メチル−４−トリフルオロメチルクマリン７−エチルア ミノ−４−トリフルオロメチルクマリン１、１’　、３，３．３’　、３’−へ キサメチル−４．４″，５．５’　−ジベンゾ−２．２’　−インドトリカルボ ／アニンヨーシト１、１’　、３，３．３’　、３’　−へキサメチルインドジ カルボンアニンヨーシト１、１’　、３．３．３″．３゛　−ヘキサメチルイン ドトリカルポンアニンヨージド ２−メチル−５−ｔ−ブチル−ｐ−クォーターフェニルＮ−メチル−４−トリフ ルオロメチルピペリジノ−＜３．２−ｇ＞クマリン３−　（２’−Ｎ−メチルベ ンズイミダゾリル）−７−Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノクマリン ２−（１−ナフチル）−５−フェニルオキサゾール２、２’　−１）−フェニレ ン−ビス（５−フェニルオキサゾール）３、５．３””’　、５″′パ　−テト ラ−ｔ−ブチル−ｐ−セクシフェニル３、５．３””　＋５”′　−テトラ−ｔ −ブチル−ｐ−キンキフェニル２、３，５，６−ＩＨ，４Ｈ−テトラヒドロ−９ −アセチルキノリジノ−く９。

９ａ，１−ｇｈ）クマリン ２、３，５．６−ＩＨ，４Ｈ−テトラヒドロ−９−カルボエトキシキノリジノ− （９，９ａ．ｌ−ｇｈ＞クマリン ２、３．５．６−ＩＨ，４Ｈ−テトラヒドロ−８−メチルキノリジノ−＜９．９ ａ．ｌ−ｇｈ）クマリン ２、３，５．６−ＩＨ．４Ｈ−テトラヒドロ−９−（３−ピリジル）−キノリジ ノ−（９，９ａ，１−ｇｈ）クマリン ２、３，５．６−ＩＨ，４１−１−テトラヒドロ−８−トリフルオロメチルキノ リジノ−＜９．９ａ，１−ｇｈ＞クマリン ２．３，５．６−１．Ｈ，４Ｈ−テトラヒドロキノリジノ−〈９．９ａ、１−ｇ ｈ〉クマリン ３．３″、２”、３”　−テトラメチル−ｐ−クォーターフェニル２．５．２” ”、５”’−テトラメチルーｐ−キンキフェニルニル　レッド（Ｎｉｌｅ　Ｒｅ ｄ） ローダミン（ＲｈｏｄａｍｉＩｌｅ）７００オキサジン（Ｏｘ！ｚｉｎｅ）７５ ０ ローダミン８００ 夏Ｒ１３２ Ｒ２６ Ｒ５ ジフェニルヘキサトリエン ピレン アルミニウムフタロンアニン 白金オクタエチルポルフィリン 上述したように、ポリマー物質中の染料のスペクトル特性を測定したならば、そ れらの特性を用いて、使用すべき励起源と利用可能な検出系とその物質を用いる 環境とを考慮して、一定周速のための最適の染料組合せを選択することができる 。

微小粒子中への配合 好ましいスペクトル特性を有する染料の組合せを選択した後に、染料をポリマー 微小粒子中へ配合する。ポリマー微小粒子はスチレン、アクリレート並びに不飽 和塩化物、エステル、アセテート、アミド及びアルコールを含めた、多様な重合 可能な七ツマ−から、非限定的にニトロセルロース、ポリスチレン（例えば臭化 ポリスチレンのような高密度ポリスチレンラテックスを含む）、ポリメチルメタ クリレートその他のポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミ ド、ポリアクロレイン、ポリジメチルシロキサン、ポリブタジェン、ポリイソプ レン、ポリウレタン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルピリジン、 ポリビニルベンジルクロリド、ポリビニルトルエン、ポリビニリデンクロリド、 及びポリジビニルベンゼンを含めたポリマーから製造することができる。

本発明の１実施態様では、染料を含まない微小粒子から新規な蛍光物質を製造す る。この微小粒子は多様な、有用なサイズと形状で製造することができる。これ らの形状は球状又は不規則形であり、サイズは約０．０１μｍ〜約５０μｍの範 囲である。標識された微小粒子は典型的に直径約１５μｍ未満であり、球状であ る。より典型的には、微小粒子は直径５μｍ未満の微小球状である。微小粒子は 均一なサイズ及び／又は形状、又は不規則である。或いは、例えば商業的に入手 可能な、多様な種類の蛍光微小球のような、予め着色した微小粒子に１種以上の 染料を、既存染料と追加染料との間にスペクトル重複の必要条件が満たされる限 り、加える。

例えば七ツマ−と染料含有コモノマーとの共重合又はポリマー微小粒子の水性懸 濁液への適当な有機溶媒中の適当な染料誘導体の添加のような、技術上公知の方 法のいずれかによって、蛍光染料を微小粒子中に配合する。例えば、カルボキシ ル、アミノ又はヒドロキシルのような共有結合基を含む又は含まない本手飽和（ ｏ＋ｏｎｏ−ａｎｓａ＋ｕｒ！ｔｓｄ）モノマーの水性懸濁液と、供与体染料部 分、トランスファー染料部分及び／又は受容体染料部分の適当な混合物を含むモ ノマー　少なくとも１０重量％を含む蛍光モノマー混合物とのフリーラジカル開 始嫌気性共重合によって、レンバウム（にｅｍｂａｕｍ）の方法（参考文献とし て関係する米国特許第４，３２６．００８号（１９８２））に従って、蛍光微小 粒子を製造することができる。蛍光微小粒子は、パンゲス（Ｂａｎｇｓ）（ＵＮ Ｉ　ＦＯＲＭ　ＬＡＴＥＸ　ＰＡＲＴＩＣＬＥＳ　（１９８４，サラジエン社（ Ｓ＊ｒａｇｅｎ、　ｔｏｅ、））が述べているように、微小粒子の撹拌水性懸濁 液に適当な溶媒中の適当な蛍光染料の溶液を徐々に加えることによっても製造す ることかできる。

本発明の微小粒子の主な利点は、微小粒子の有効ストークスソフトを増大させて 、微小粒子を特定用途に応するように調整するために、多重トランスファー染料 を初期供与体染料及び最終受容体染料と容易に混合することができることである 。このことは例えば染料相互の共有結合のような化学的手段によっては容易に達 成することができない。さらに、染料は粒子中に、共何化学結合によって実際に 碍ら７するよりも小さい分子間分離を生ずるような濃度で分布されるので、エネ ルギー伝達の見込みが改良される。さらに、染料はポリマー中に存在するので、 このポリマーが染料の自由運動を制限し、染料分子が振動的に相互を不活化する ことを防止するように思われる。さらに、ポリで−ａ小粒子への染料の配合は通 常、染料の照射１７対する安定性を高め、染料を微小粒子を囲む媒質中の成分か ら保護する。

有機溶媒に易溶であるが、水中には非常に離溶である油溶性蛍光染料は、予めＶ 造されたポリマー微小粒子への染料の溶液型（ｓｏｌｖｅｎｔ−ｂ為５ｅｄ）添 加によ−〕で容易に導入することかできる。このことは操作の細心の最適化とそ の後の選択した蛍光染料組合せの添加とによって、好ましい性質を有する均一な ポリマー微小粒子を製造することかできると言う大きな利点を提供する。さらに 、溶液型添加プロセスは効果的なエネルギー伝達を達成する上での重要なパラメ ータ・−である、染料の相対的濃度の調節に大きな柔軟性を与える。

此のよう１こして、例えばサイズと電荷密度のような、好ましい物理的性質を有 −する微小υ子の大きいバッチを得ることができる。次に、このバッチの少量部 分Ｊこ種々な蛍光染料を加えて、例えは診断試験の開発のような用途に矛盾のな い、再現可能な性能を導入る、好ましい有効スト−クス／フトを有する蛍光ポリ マー微小粒子のサブバ・チを得ることができる。予め製造したポリマー微小粒子 に染料を溶液型添加することによって製造する蛍光微小粒子の場合には、本発明 の蛍光微小粒子の表面特性は対応する、染料を含まない微小粒子の表面特性と実 質的に異ならない。微小粒子の蛍光標識は微小粒子を囲む媒質のｐＨの変化によ っても影響を受けない。

さらに、本発明の微小粒子に用いる染料は微小粒子の懸濁媒質として一般に用い られる水性溶媒によって微小粒子から有意に除去さねない。例えば、化合物４と 化合物６（表２）を含む蛍光微小粒子の水性懸濁液を０．２％ドデシル硫酸ナト リウムの存在下で６０℃の温度にさらす場合に、粒子から検出可能な染料が抽出 されない。均一な微小粒子を細心に製造する場合には、蛍光微小粒子が水性懸濁 液中の単分散される。例えば、化合物１と化合物３とによって染色した１、。

９ｐｍポリスチレン微小球は目視検査（エビ蛍光８微鏡検査）によって単分散す ることが判明している。

袋口的改質（辱４現止呼復ヲ鋭堕−息シ工阻り大きくか′つ制御可能な有効スト ークス／アトを有する、本発明の蛍光ポリマー微小粒子の製造に用いられる蛍光 化合物は、一般に親油性であり、通常は正味の中性電荷を有するので、例えば、 通常、蛍光微小粒子の製造に使用されるフルオレセイン及びローダミン６Ｇのよ うな、他の蛍光染料のようには、ポリマー微小粒子の荷電特性に寄与しない又は この荷電特性を変化させない。その結果、本発明の蛍光微小粒子は蛍光染料の他 に、例えば生体反応性物質のような、他の多くの物質を含むことができる。生体 反応性物質は生物学的系に由来する分子と、このような分子が天然に生成するか 又は該系の何らかの外部妨害（例えば、疾患、中毒、遺伝的操作）から生ずるか のいずれであっても、反応する又は結合する物質である。説明のために、生体反 応性物質は生体分子（すなわち、限定する訳ではなく、例えはペプチド、蛋白質 、多糖類、オリゴヌクレオチド、アビジン、スＩ−レブ１−アヒジン、ＤＮＡ及 びＲ，Ｎ　Ａのようなポリマー生体分子並びに、例えばヒ」チン及びノゴキ、ゲ ニンのような、非ポリマー生体分子を含む生物学的起源の分子）、例えはウィル ス及びハブテン（例えばホルモン、ビタミン又は薬物）のような顕微鏡的微生物 を含むものとする。蛍光微小粒子の他の実施態様は微小粒子の表面に共有結合又 は不動吸着した（ｐａｓｓｉｖｅｌｙ　ｘｄｓｏｒｂｅｄ）生体反応性物質を含 むものどする。この付加的な生体反応性物質は一般に技術上公知の方法によって 加入らｔｌ、蛍光標識微小粒子の表面に共有結合する（例えば、ＣＨＥＭ、Ｓ。

Ｃ，ＲＥＶ、２，２４９　（１９７３））又は非共有的に吸着する（例えば、Ｊ 。

ＥＸＰ、ＭＥＤ、±１土、１５３９　（１９８１））。これらの表面結合又は吸 着分子は、蛍光染料を配合した後に、微小粒子に加えるのが最もよい。これらの 改質は、制御可能な有効ストークスシフトと共に、本発明の微小粒子を広範囲な 診断試験に有用にする。

さらに、蛍光微小粒子の製造に用いられる微小粒子は多様な表面特性を有し、非 限定的にスルフェート、ホスフェート、ヒドロキシル、カルボキシル、エステル 、アミド、アミジン、アミン、スルフヒドリル、及びアルデヒドを含めた官能基 を有するものとして、製造又は購入することができる。表面基は微小粒子の表面 への付加的物質の共有結合又は非共有結合に用いるために重要である。この表面 基は粒子に例えば種々な親水性度のような、好ましい物理的性質を与えるように 選択することもできる。

核酸の検出 本発明の蛍光微小粒子はハイブリッド形成による核酸（例えばＲＮＡ及びＤＮＡ ）の検出のための理想的な試薬である。この微小粒子は、このような検出のため に用いられる標準的試薬である放射能に比べて、比較的安全であり、無毒であり 、しかもこれらの微小粒子の検出限界は放射能の検出限界に匹敵する。これらの 微小粒子は現在用いられている発蛍光団よりも化学的に安定であり、結合した酵 素活性又は抗体による二次（ｓｅｃｏｎｄλ＋ｙ）検出を必要とする試薬よりも 使用し易い。さらに、シグナル強化が必要である場合には、これらは二次検出の ために抗体に結合させることができる。最後に、この新規な微小粒子は種々な波 長において発光し、幾つかの選択可能な波長のいずれかにおいて有意な強度を有 するように調整することができるので、種々な核酸ｌ又は種々な抗原の同時の又 は逐次の多色検出を行うために容易に使用することができる。

核酸の検出又は同定に標識微小粒子を用いることは知られているが（上記参考文 献を参照のこと）、本発明の微小粒子は今までに述べられた他の微小粒子を凌駕 する多くの利点を有する。長い有効ストークスシフトを得ることができるので、 本発明の微小粒子をサンプルの固有の自己蛍光（例えば、藻類又はその他の植物 細胞中に存在するような）又は顔料の存在（例えば、ヘム又はキサンチン）が通 常シグナルを妨害するような用途に用いることができる。さらに、本発明の微小 粒子は非特異的結合を減するように改質された表面を有して製造されることがで きる。この特徴はハイブリッド形成方法のためにバックグラウンドに対してシグ ナルを非常に高めるので、著しく改質した表面を有する膜の使用を必要とする標 識微小粒子を用いる、今までに発表されたプロトコールとは対照的に、標準的な ハイプリント形成フィルターの使用を可能にする。さらに、本発明の微小粒子は 現在入手可能な微小粒子よりも有意に光沢があるので、他の標識微小粒子によっ て可能であるよりも一桁低い大きさまでの検出範囲を生ずる。

核酸検出は一般に、核酸グローブと標的核酸との組合せがハイブリッド形成対を 形成するように、標的核酸の塩基配列を特異的に識別する核酸塩基配列を含む核 酸プローブを用いて、標的核酸を含むと考えられるサンプルを試験することを含 む。この核酸グローブは典型的に約４塩基より多くから数万塩基程度までを含む が、全染色体の試験は数百万塩基を含むことになる。

検出シグナルを与えるために、１個以上の本発明の蛍光微小粒子を核酸プローブ に付着させて微小粒子標識プローブを形成する。或いは、１個以上の核酸グロー ブを単一微小粒子に結合させる。核酸プローブの微小粒子への結合は典型的に、 相互に特異的に識別し、緊密に結合する分子対を用いて、すなわち特異的に結合 する対要素（例えば、アビジンとビオチン又はジゴキンゲニンと抗ジゴキシゲニ ン抗体）を用いて実施される。特異的に結合する対の１要素は直接に（酵素的も しくは化学的合成中の配合によって又は５′　もしくは３′末端結合として）又 はリンカ−分子を介してのいずれかで、核酸プローブに結合する。特異的に結合 する対の他方の要素は直接に又はリンカ−分子によって蛍光微小粒子に結合する 。或いは、特異的結合対要素の介在を用いずに技術上公知の方法によって、核酸 プローブを蛍光微小粒子に共有結合させることができる［例えば、タレムスキー （Ｋｒｕ＋５ｋｙ）等、ＮＵＣＬＥｒＣＡＣＩＤＳ　ＲＥＳ、よ５，２８９１　 （１９８７）、参考文献として引用する］。

全てのプローブか初期供与体染料の同一励起ピークを有するが、各プローブが他 のプローブの発光ピークとは検出可能に識別される、異なる発光ピークを有する 、数種の微小粒子標識グローブを製造できることが、本発明の微小粒子の特別な 利点である。この結果、これらの微小粒子は多重の核酸種の同時検出に特に適す る。放射性方法、化学発光標識又は直接発蛍光団結合体とは異なり、本発明の微 小粒子は例えば、手で支えるＵＶ灯のような、安価で、容易に入手可能な装置に よって同時に励起可能であり、スペクトル的に識別可能な、広範囲な色で製造す ることができ、その発光は眼によって容易に検出され、識別されることができる 。

蛍光シグナルの単離のために機器手段を加えると、検出可能に異なる標識の可能 な数は膨大に増加する。本発明の方法を用いると、例えばフィルター、モノクロ メータ−１又は７オトダイオードアレイ、又は例えばパルスもしくは位相変調手 段によるような蛍光シグナルの他の識別方法のような、波長選択要素の適当な選 択によって分解可能である限り多くの、異なる標識を作成することができ、各式 なる標識か異なる分析物の検出を可能にする。このように、検出可能なＸ”種の 染料を含むことはＸ種の核酸グローブを異なる染料によって独立的に標識し、単 −核酔漂的混合物にハイブリッド形成させて、その混合物中のＸ種の独立的な標 的種を検出することを可能にする。例えば、細胞質中のマイコプラズマ、ウィル ス又はプラスミドの存在を単細胞の核中（又は発生する胚の部分中）の染色体も しくはプラスミドに含ま１１る遺伝子から、ｉｎ　５ｉｔｕ　ハイブリッド形成 を用いて、目視的に識別することができる；又はＸ種と同程度の異なる遺伝子に 相当するＲＮＡもしくはＤＮＡ分子をノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）、サザン（ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）もしくはスポットプロットにおいて又は溶液ハイブリッド形 成によって、同時に分析することができる。又はＸ種と同程度の異なる遺伝子の 位置を、ｉｎ　５ｉｔｕ　ハイブリッド形成を用いて、染色体スカソンユ（ｓｑ ｕｘｓｈ）もしくはスプレ・ソド（ｓｐ「ｅａｄ）上の真核細胞染色体上で相互 に関して測定することができる。

このような多色検出のための微小粒子標識グローブは種々な形式で仲介されるこ とができる。これらには（ａ）直接の核酸−微小粒子結合体（リンカ−分子を含 む又は含まない）、（ｂ）ビオチニル化核酸とアビジン標識微小粒子との使用、 又はビオチニル化核酸とストレプトアビジンとビオチニル化微小粒子との使用に よる結合、（ｃ）ジゴキ／ケニン標識核酸と、微小粒子に結合したジゴキシゲニ ンに対する抗体、（ｄ）微小粒子に結合した抗体によって検出される、フルオレ セインもしくはジニトロフェニル基のような、他の抗原物質によって標識された 核酸、又は（ｅ）抗原物質による標識後に、適当な抗体との反応、その後にプロ ティンＡ結合微小粒子によって検出される核酸がある。これらの種々な検出方法 を組合せて、多重に仲介される多色検出を行うこともできる。

微小粒子標識プローブは、単色検出系用又は多色検出系用のいずれであっても、 標的核酸を含むと考えられるサンプルと組合せる。典を的に、このサンプルを微 小粒子標識プローブの水性懸濁液と共にインキュベートする。単色系を用いる場 合には、この水性懸濁液は実質的に同一微小粒子標識グローブを含むことができ る。多色系を用いる場合には、この水性懸濁液は数種類の検出可能な微小粒子標 識プローブを含むことができる。各場合に、微小粒子標識プローブは特定の被酸 標識又は核酸標的の組合せに対して特異的である。

微小粒子標識グローブと組合せる前に、サンプル中の核酸をプローブに接近可能 にする方法でサンプルを調製する。サンプルは混合物として又は個別の核酸種と して精製核酸を含むことができる：サンプルは溶解した細胞中の核酸を他の細胞 成分と共に含むことができる；又はサンプルは透過性細胞全体として核酸を含む ことができる。サンプルの調製はサンプル中の核酸を利用可能にする方法に依存 する。

サンプルが精製核酸を含む場合に、精製核酸は種々な核酸の混合物であることが できる。或いは、この精製核酸をアガロースゲル又はポリアクリルアミドゲル上 で電気泳動して、個別の核酸種にすることもできる。精製核酸を含むサンプルの 調製は変性と中和を含む。塩基（例えば水酸化ナトリウム）とのインキュベーシ ョン又は熱によって、ＤＮＡを変性させることができる。ＲＮＡも加熱（スポッ トプロットのために）又は、塩基への暴露によってではなく、例えば尿素、グリ オキサルもしくはホルムアルデヒドのような変性剤の存在下での電気泳動（ノザ ンブロノトのために）によって変性させることができる。次に、任意に、酸（例 えば、塩酸）の添加、急冷、又は緩衝液（例えば、トリス、リン酸塩又はクエン 酸塩緩衝液）の添加によって、核酸を中和する。

精製核酸を含むサンプルの調製は典型的にさらに、固体担体への核酸の固定を含 む。績製酸を一般に、例えはニトロセルロースフィルター又はナイロン膜のよう なフィルター膜上に、ＤＮＡスポットプロットのためには適当な塩（例えば塩化 ナトリウム又は酢酸アンモニウム）の存在下でスポットする。或いは、適当な緩 衝剤条件下での毛管ブロッティング（ｂ＋ｏ＋ｔＩＢ）又はエレクトロブロッテ ィング（ｅｌｅｃｔｒｏｂｌｏ口１ｎ）（サザンブロントのために）によって、 精製核酸をニトロセルロースフィルターに移す。核酸をフィルター膜に永久的に 結合させるために、標準架橋方法を用いる（例えば、ニトロセルロースフィルタ ーを真空中で８０℃において焼成する；ナイロン膜を３６０ｎｍ光線によって照 射する）。次に、フィルター膜を核酸プローブの非特異的結合を阻止するように 設計された溶液（例えば、Ｂ５Ａ１カゼイン加水分解物、プローブに関係しない 種からの一重鎖核酸等）と共にインキュベートし、同じ溶液内でプローブとハイ ブリッド形成させる。非特異的結合プローブをフィルターから、例えばクエン酸 塩生理食塩水又はリン酸塩ＭｉＬ剤のような溶液によってフィルターから、非特 異的結合プローブを洗い流す。微小粒子（例えば洗剤）の非特異的付着を阻止す るために、フィルターをブロックする。最後に、サンプルを標識微小粒子によっ てプロービングし、さらにブロッキング緩衝剤による洗浄によって非特異的結合 した微小粒子を除去する。　サンプルが細胞核酸（例えば、細胞、ＲＮＡもしく はＤＮＡウィルス又はマイコプラズマ感染細胞内の染色体又はズラスミドに含ま れる遺伝子、又は細胞内ＲＮＡ）を含む場合には、サンプルの調製は既述した変 性と中和の他に、細胞の溶解又は透過性化を含む。細胞を例えば洗剤（例えば、 ドデシル硫酸ナトリウム、ツイーン（Ｔｖｅｅｏ）、サルコ／ル（Ｓｚｒｋｏｓ ｙｌ、）又はトライトン（Ｔｒｉ＋ｏｎ））、リゾチーム、塩基（例えば、ナト リウム、リチウム又はカリウムの水酸化物）、クロロホルム、又は熱のような作 用剤への暴露によって溶解する。細胞を例えば緩衝剤中のホルムアルデヒドによ るような、通常の方法によって透過性化する。

精製核酸を含むサンプルの場合と同様に、細胞核酸を含むサンプルの調製は典型 的にさらに固体担体上の核酸の固定を含む。溶解した細胞では、懸濁液中の細胞 をニトロセルロースもしくはナイロン膜上にスポットする、又はニトロセルロー スもしくはナイロン膜を通して濾過する、或いは細胞コロニーを適当な増殖培地 と接触する膜上で直接増殖させて、核酸を上述のようにフィルターに永久的に固 定する。透過性化細胞は典型的に顕微鏡スライド上に、染色体“スカッシュ”又 は“スプレッド”へのｉｎ　ｓｉｔυ　ハイブリッド形成及びハイブリッド形成 のために用いられる公知の方法（例えば、緩衝化溶液中のホルムアルデヒドのよ うな試薬による）によって固定される。次に、スライドを溶液（例えば、トリエ タノールアミンと無水酢酸）によって処理して、微小粒子の非特異的結合を阻止 し、緩衝溶液（例えば、トリス／グリシン、リン酸塩緩衝化した生理的食塩水又 はクエン酸塩生理食塩水）によって処理する。最後に、顕微鏡検査のためのサン プルを調製するために、サンプルを脱水して（例えば、エタノールの段階的希釈 物ンリーズのような試薬による）、乾燥させる。予備ノλイブリッド形成及びハ イブリッド形成溶液、ブロッキング、ブロービング（ｐｒｏｂｉｕ）、固体担体 上での洗浄は本質的に上述した通りである。

微小粒子標識プローブによるサンプルのブロービング後に、非結合プローブを例 えば洗浄のような通常の方法によってサンプルから除去する。次に、微小粒子標 識プローブの初期供与体染料の励起ピークの範囲内の励起エネルギー放出源によ って、サンプルを照射し、その後に照射されたプローブに由来する蛍光を検出す る。

下記説明１こよって、本発明の実施を述べるが、この説明は例示のためであり、 限定のためではない。

寥１男工゛４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−３−（ピロール−２−イ ル）−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−５−インダセン（化合物６）の調製ン゛ りロロメタン　１５ｍ１中の３，５−ジフェニルピロール−２−カルボキサアル デヒド９０ｍｇ　（０，３６ｍｍｏ　ｌ）と２．２゛　−ビビロール５ｏｍｇ（ ０３７ｍｍｏｌ）との溶液に、オキシ塩化リン４Ｑｐ　ｌ　（Ｑ、４５ｍｍｏ　 ｌ）を加える。この反応混合物を室温において１２時間撹拌し、Ｎ、Ｎ−ジイソ プロピルエチルアミン２２５μＩ　（１，６２ｍｍｏ　ｌ）を加え、次に＝フッ 化ホウ素エーテレート２００μｌ　（１，６２ｍｍｏ　ｌ）を加える。全混合物 を室温において２時間撹拌した後に、水２０ｍ１ずつで２回洗浄する。有機層を 分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、暗青紫色固体を 得る。粗生成物を溶離剤としてヘキサン中３０％クロロホルムを用いて、シリカ ゲル上でのクロマトグラフィーによって精製して、暗青紫色固体４９ｍｇ（３３ ％）を得る。

Ｈ，ラバポルｈ（Ｒａｐｐａｐｏｒ＋）等、Ｊ、ＡＭ、ＣＨＥＭ、ＳＯＣ，８４ ，２１７８（１９６２）に述べられているように、２．２′−ビピロールを製造 する。ＲＭ、／ルバースタイン（Ｓｉｌｖｒｒｓｔｅｉｎ）等、ＯＲＧ、５ＹＮ ＴＨ，Ｃ０ＬＬ、ＩＶ巻、８３１頁に従って、ビルスマイヤー　ハーク（Ｊｉｌ ｓｍｅｙｅｒ　Ｈ１直ｋ）ホルミル化によって、３．５−ジフェニル−２−ピロ ールカルボキサアルデヒドを２．４−ジフェニルビロールから製造する。

化合物１と２を、実施例１に述べたように、ピロール−２−カルボキサアルデヒ ドと３．５−ジメチルピロール−２−カルボキサアルデヒドのそれぞれ２，４− ツメチルピロールとの反応によって製造する。化合物３と４を、実施例１に述へ ｔ二よう１こ、２．４−ジメチルヒ“ロールと２，４−ジフェニルビロールれ３ ，５−ジフェニルビロール−２−カルボキサアルデヒドとの反応によって製３ａ ，４ａー８ートリアザーＳーインダセン（化合物５）の調製氷酢酸５ｍｌ中の２ ．４−ジフェニルビロール８５ｍｇ　（０．４０ｍｍｏ　Ｉ）と２−ニトロソ− ３．５−ジフェニルビロールｌｏｏｍｇ　（０．４０ｍｍｏ　ｌ）どの混合物を ３時間還流加熱する。反応混合物が室温に冷却した後に、これをエーテル２０ｍ １中に注入する。生ずる混合物を濾過によって回収し、エーテルによって洗浄し 、乾燥させて、青色固体８９ｍｇを得る。この固体をジクロロメタン１０ｍｌ中 に溶解し、Ｎ．Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン１００μｌ　（０。

５７ｍｍｏｌ）と、三フッ化ホウ素ニーテレードア　Ｑ　ｐ　ｌ　（０．　５　 １ｍｍｏ　＋）とを加える。反応混合物を室温において２時間撹拌した後に、反 応混合物を実施例１に述べたように処理し、精製して、暗冑色固体として化合物 ８０ｍｇ（４００、０９３μｍカルポキ，レート改質ラテックスの激しく撹拌し た懸濁液［インターフエイ／セル　ダイナミ／クス社（Ｉｎｌｅｒｌａｃｉａｌ 　Ｄｙｎａｍｉｃｓ　Ｃｏ「ｐ．）、オレゴン州．ボートランド：５０％ｖ　／ 　ｖ蒸留水／メタノール中の３．０５％固体］２００ｍｌに、ジクロロメタン９ ｍｌと無水エタノール１６ｍｌとの均質な混合物中に溶解した化合物１　５０ｍ ｇと化合物３　１７ｍｇとの溶液を加える。染料の添加はテフロン分配管（内径 ０．０３８インチ）を装備した注射器ポンプによって実施し、染料溶液を６ｍ　 ｌ／時の流量で供給する。添加が終了した後に、ゆるやかに充填しｔニガラスウ ールに通して、この懸濁液を濾過して、デブリ（ｄｅｂｒｉ）を除去し、回転蒸 発器上で室温において部分的に蒸発させて、ジクロロメタンとアルコールとを途 去する。次に、染色したラテックスの水性懸濁液を再びガラスウールに通して付 加的デブリを除去し、透析して（２５ｍｍ管、ＭＷカットオフ１２、０００〜１ ４，０００）、残留染料を除去する。透析物の蛍光測定分析による検出時に遊離 染料が粒子からもはや除去されなくなるまで、透析を実施する。透析から蛍光ラ テックス懸濁液を取り出し、再びガラスクールに通して濾過して、残留凝集物と その他のデブリを除去する。次に、この懸濁液を浴音波処理装置中で１０分間音 波処理して、単分散を確実にする。標準ローダミンフィルターを用いた蛍光ｆＪ Ａ微鏡検鏡検査る、生成物の希薄な水性懸濁液の目視分析は、高度に単分散性で ある、均一に染色された粒子を示す。４８０ｎｍにおいて励起する生成物のスペ クトル分析は、５５７ｎｍに集中する単一発光ピークを示す。

実施例４：３種のポリアザインダセン染料を用いた新規な微小粒子の製造０、０ ３０μｍカルボキンレート改質ラテックスの激しく撹拌した懸濁液［インターフ ェイシャル　ダイナミックス社，オレゴン州．ポートランド；５０％Ｖ／Ｖ蒸留 水／メタノール中の３．６７％固体］　２００ｍｌに、ジクロロメタン７、５ｍ ｌと無水エタノール１７．５ｍｌとの均質な混合物中に溶解した化合物１５０ｍ ｇと、化合物３　１７ｍｇと、化合物４　２２ｍｇとの溶液を加える。染料の添 加と生成物の精製とは、実施例３に述べた通りに実施する。標準テキサスレッド 　１ン″−チブル　フ（Ｊレター（Ｔｅｘｔｓ　１ｓｄ　ｃｏｍｐｉｒｌｉｂｌ ！（ｉｌｔｓｒ）を用ｌ／また蛍光顕微鏡検査による、生成物の希薄な水性懸濁 液の目視分析は、高度に単分散性である、均一に染色された粒子を示す。４８０ ｎｍにおいて励起する生成物のスペクトル分析は、６０５ｎｍに集中する単一発 光ピークを示す。

実施例５：２種のクマリン染料を用いた新規な微小粒子の製造０、２８２μｍカ ルボキンレート改質ラテックスの激しく撹拌した懸濁液［インター７エイ／ヤル 　ダイナミックス社，オレゴン州，ポートランド；５０％Ｖ／Ｖｉ留水／メタノ ール中の２．７５％固体］２００ｍｌに、ジクロロメタン７、５ｍｌと無水エタ ノール１７．５ｍｌとの均質な混合物中に溶解しｌ：クマリン１３８　Ｃイース トマン　コダノク（Ｅａｓ＋ｍ＊口Ｋｏ＋ｌｓｋ）、ニューヨーク州，ロチェス ター］３０ｍｇと、クマリン３１４（イーストマンコダック）３０ｍｇとの溶液 を加える。染料の添加と生成物の精製とは、実施例３に述べた通りに実施する。

標準ＡＭＣＡ励起及び発光フィルターを用いた蛍光顕微鏡検査による、生成物の 希薄な水性懸濁液の目視分析は、高度に単分散性である、均一に染色された粒子 を示す。３６０ｎｍにおいて励起する生成物のスペクトル分析は、４１０ｎｍに 集中する発光ピークと４６０ｎｍに集中する発光ピークとを示す。４６０ｎｍビ ーク（クマリン３１４から）対４１０ｎｍビーク（クマリン１３８）の積分比は ９２：８であり、このことはクマリン１３Ｂからクマリン３１４への発光エネル ギーの効果的な伝達を実証する。

実施例６：１種のポリオレフィン染料と１種のポリアザインダセン染料とを用い た新規な微小粒子の製造 ０．９７７μｍ７７μｍカルホキ／レートックスの激しく撹拌した懸濁液［イ／ ターフエイ／ヤル　ダイナミックス社、オレゴン州、ポートランド：５０％Ｖ／ Ｖ蒸留水／メタノール中の２．１０％固体］２００ｍ１に、ジクロロメタン９ｍ ｌと無水エタノール１６ｍ１との均質な混合物中に溶解したジフェニルヘキサト リエン（ＤＰＨ）５０ｍｇと、化合物１　１０ｍｇとの溶液を加える。染料の添 加と生成物の精製とは、実施例３に述べた通りに実施する。標準フルオレセイン フィルターを用いた蛍光顕微鏡検査による、生成物の希薄な水性懸濁液の目視分 析は、高度に単分散性である、均一に染色された粒子を示す。３６５ｎｍにおい て励起する生成物のスペクトル分析は、４３０ｎｍに集中する発光ピークと５１ ２ｎｍに集中する第２発光ピークとを示す。４３０ｎｍピーク（ＤＰＩから）対 ５１２ｎｍピーク（化合物１から）の積分比は７４　：　２６であり、このこと はＤ　Ｐ　Ｉ−１から化合物１への発光エネルギーの効果的な伝達を実証する。

エネルギー伝達の効果の他の確証として、化合物ｌのみによって上述のように０ ．０９３ミクロンラテックス粒子を製造する。これらのラテックス粒子をＤＰＩ と化合物ｌとの両方を含む粒子と同じ条件下で３６５ｎｍにおいて励起させる場 合に、５１２ｎｍピークの積分面積は２種染料系で得られる積分面積の１０％未 満である。

実施例７・１種のクマリン染料と１種のポリアザインダセン染料とを用いた新規 な微小粒子の製造 ０．２８２μｍ力ルポキル−ト改質ラテックスの激しく撹拌した懸濁液［インタ ーフエイ／ケル　ダイナミックス社、オレゴン州、ボートランド；５０％Ｖ／Ｖ 蒸留水／メタノール中の２．１０％固体］２００ｍ１に、ジクロロメタン９ｍｌ と無水エタノール１６ｍ１との均質な混合物中に溶解したクマリン６５０ｍｇと 、化合物１　５０ｍｇとの溶液を加える。染料の添加と生成物の精製とは、実施 例３に述へた通りに実施する。標準フルオレセイン励起及び発光フィルターを用 いた蛍光Ｗｉ微鏡検査による、生成物の希薄な水性懸濁液の目視分析は、高度に 単分散性である、均一に染色された粒子を示す。４３０ｎｍにおいて励起する生 成物のスペクトル分析は、５１２ｎｍに集中する主要発光ピークを示す。クマリ ン６からの５２０ｎｍに集中する小発光ピークが存在し、このことは実質的では あるが、完全ではないエネルギー伝達を実証する。

実施例８：２種のポリアザインダセン染料を用いた新規なアビジン標識微小粒子 の製造 １５ｍ１ガラス遠心管に、１５ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，０）　２ｍ 　ｌと、アビジン（完全溶解可能）４ｍｇと、実施例６で製造したラテックス微 小粒子の２％水性懸濁液５ｍｌとを加える。この混合物を撹拌し、室温において １５分間インキュベートする。次に、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピ ル）−力ルポジイミド（ＥＤＡＣ）４０ｍｇを加え、管を揺り動かして、内容物 を混合する。ｐＨを希Ｎ　ｎ　ＯＨによって６．５±０．２に調節し、反応混合 物をロケ／上又は軌道シェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ　５ｂｓｋｅｒ）上で室温に おいて２時間積やかに撹拌しながらインキュベ−１・する。アビジン標識ラテッ クス微小粒子を非結合アビジンから２．ＯＯＯＲＰＭにおける２０分間の遠心に よって分離する。上澄み液をデカンテーンヨンし、アビジン標識ラテックスベレ ットを１００ｍＭ　ＰＢＳ　（ｐＨ７，４）中に再懸濁させ、遠心／デカンテー ションによって３回洗浄する。アビジン標識ラテックスを１００ｍＭ　ＰＢＳ　 （ｐＨ７，４）５ｍｌの最終量中に懸濁させる。

アビジンの代わりに６−（（６−（ビオチノイノリアミノ）ヘキサノイノリアミ ノ）ヘキサン酸に結合したＢＳＡを用いて、実施例８の方法に従って、ビオチニ ル化うテ／クス微小粒子を製造する。

実Ｎ例９：ニトロセルロースフィルター上にスポットしたＭ１３ＤＮＡの、新規 な微小粒子を用いた検出 ニトロセルロースフィルター［ＢＡ８５，０．４５ミクロン孔、シュライへルア ンド　／ユエル（Ｓｃｂｌｅｉｃｈｅｒ　ｉｎｄ　５ｃｈｕｔｌｌ）、ニューノ １ンプシャー州、キーン］を水とのインキュベーション、次に２０ＸＳＳＣ（１ リツトルにつきＮａＣ１１７５ｇ、クエン酸ナトリウム８８ｇ、Ｉ）Ｈ７，０） とのインキュベージ１ンによって前処理し、風乾させる。Ｍ１３−＠鎖ＤＮＡを ミクロ７ユージ（扉１ｃｒｏｌＢｅ）管中でＴ、Ｅ、（１０ｍＭ　トリス−ＣＩ 、ｐＨ７，８；　１ｍＭ　ＥＤＴＡ）によって連続的に希釈して、これらのフィ ルター上にスポットする。フィルターを風乾させ、真空オーブン中で８０℃にお いて１時間焼成する。６ＸＳＳＣ（１リツトルにつきＮａＣ１５２，５ｇ、クエ ン酸ナトリウム２６．４ｇ、ｐＨ７，０）、０．５％ドデンル硫酸ナトリウム（ ＳＤＳ）、５Ｘデンハート（Ｄｔｎｈｉｒｄ＋）（０，１％フィコール（Ｆｉｃ ｏｌｌ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％つ・７血清アルブミン（Ｂ ＳＡ））及び−ｍ鎖ＤＮＡ　ｌｏｏμｇ／ｍ＋中での６０°Ｃにおける１時間の インキュベーションによって予備ハイブリッド形成を実施する。Ｍ１３ビオチニ ル化オリゴヌクオチドブローブ３０ｎｇ／ｍｌを添加した同じ溶液中で同じ温度 におし・て３時間、ハイブリッド形成を実施する。このフィルターを６ＸＳＳＣ １０，１％ＳＤＳ中での室温における２０分間のインキュベーション、次に６０ ℃における５分間のインキュベーションによって洗浄する。次に、フィルターを １００ｍＭ！・リス、１５０ｍＭ　ＮａＣ１，ｐＨ７，８，０゜０５％乾燥脱脂 乳、０．５％ツイーン−２０中での１時間のインキュベーン腫ンによってブロッ クする。アビジン結合され、蛍光標識された、実施例８で製造された微小粒子の ｌ　：　１０００希釈物（２％固体）？含む、同じ溶液中での室温にＪ、ける１ 時間のインキュベーションによって標識付は全実施する。最後に、乾燥脱脂乳を 含まな（・同じ溶液中で室温において１０分間、フィルターを洗浄すること１こ よって、非特異的に吸着した微小粒子を除去する。３６０ｎｍ光線による照射に よってスポットを可視化する。

実施例１０　溶解した組織培養物細胞中のＬａｃＺ遺伝子特異的ｍＲＮＡの、新 規な微小粒子を用いた検出 ＩＸｌ　０’ＣＲＥＢＡＧ細胞（ＩａｃＺ遺伝子に関して陽性）又はＮＩＨ３Ｔ ３細胞（ｌａｃＺ遺伝子に関して陰性）の懸濁液をニトロセルロースフィルター （ＢＡ８５，０．４５ミクロン孔、ツユライへル　アンド　ンユエル、ニューノ ＼ンブ／ヤー州、−Ｆ−ン）上にスポットする。１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍ Ｍトリス−Ｃ１、ｐ＋−１７，８，２５ｍＭ　ＥＤＴＡ及び０．５％ドデンル硫 酸ナトリウム（ＳＤＳ）とのインキュベーションによって、細胞を溶解する。Ｄ ＮＡを１５ＭＮａＣ１，０、５Ｍ　Ｎ　ａ　ＯＩ−１との５分間のインキュベー ションによって変１生させ、次に１００　ｍＭ　トリス−ＣＩ、ｐＨ７，８，１ ５０ｍＭ　ＮａＣ１との５分間のインキュベーションによって中和する。フィル ターを真空オーブン中で８０℃において１時間焼成する。次に、フィルターを６ ＸＳＳＣ，５Ｘデンハート、０，５％ＳＤＳ及びサケ精子ＤＮＡ　１００μｇ／ ｍ＋との６０℃における１時間のインキュベーションによって予備ハイブリッド 形成させる。Ｍ１３ビオチニル化オリゴヌクオチドプローブ（ｌａｃＺ遺伝子と ハイブリッド形成）３０ｎｇ／ｍｌを添加した同じ溶液中で、ハイブリッド形成 を実施し、６０℃において１時間インキュベーションする。０．１％ＳＤＳを含 む６ＸＳＳＣ中でフィルターを室温において２０分間洗浄し、次に同じ溶液中で ６０°Ｃにおいて５分間洗浄する。次に、フィルターを１００ｍＭトリス−ＣＩ 、ｐＨ７，８，１５０ｍＭＮａｃｌ、Ｏ，Ｓ％ツイーン−２０及び３％Ｗ　／　 Ｖウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共にの室温における１時間のインキュベーシ ョンによってブロックする。このブロックした緩衝液に、実施例８で製造した微 小粒子（ビオチニル化し、蛍光標識した微小粒子、２％固体）を最終希釈度１　 ：　１０００で加え、フィルターと共に室温において３０分間インキュベートす る。次に、フィルターを１００ｍＭ　トリス、ｐＨ７，８，１，５０ｍＭ　Ｎａ Ｃｌによって室温において３０分間洗浄し、シグナルを約３６０ｎｍに集中する 広帯域フィルター付きの手で支えるＵＶｆｌ　［ＵＶＰ社（ＬＩＶＰ、　Ｉｎｃ 、）、カルフォルニア州、サンガブリエル］による照射によって可視化する。Ｃ ＲＥＢＡＧ細胞は明確に見える黄緑色蛍光を示すが、ＮＩＨ３Ｔ３細胞は示さな い。

実施例１１：新規な微小粒子を用いるｉｎ　５ｉｔｕ　／’イブリ・ンド形成に よるＬａｃＺ遺伝子特異的ｍＲＮＡの検出 顕微鏡スライド上で増殖するＣＲＥＢＡＧ　（ｌａｃＺ陽性）とＮＩＨ３Ｔ３　 （ｌａｃＺ陰性）細胞をＰＢＳ　（１リツトルにつき塩化ナトリウム８ｇ、ＫＣ ｌ０．２ｇ、Ｎａ、ＨＰｏ、１．４４ｇ、ＫＨ，ＰＯ，０，２４ｇ％ｐＨ７，４ ）中の３．７％ホルムアルデヒド中での１５分間のインキュベーションによって 、透過性化し、固定する。スライドを２ＸＳＳＣ（１リンドルにつき塩化ナトリ ウム１７．５ｇ、クエン酸ナトリウム８．８ｇ、ｐＨ７，０）中で１分間２回す すぎ洗いし、次に０．ＩＭＩ−リエタノールアミン７０．２５％無水酢酸中で１ ０分間インキュベートする。次に、細胞を２ＸＳＳＣ中で１分間、ＰＢＳ中で１ 分間、Ｏ，ＩＭＩ−リス／グリシン緩衝剤（ｐＨ７，０）中で３０分間平衡させ る。スライドを２ＸＳＳＣ中で２回すすぎ洗いし、次に７０％と９５％エタノー ル中で脱水してから、風乾させる。次に、５０％ホルムアミド、５Ｘデンハート （ｏ。

１％フィコール、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ウシ血清アルブミン （ＢＳＡ））、６ＸＳＳＰＥ　（１，０８Ｍ塩化ナトリウム、６０　Ｍ　Ｎ　ａ 　Ｈ＊　ＳＱ、、ｐＨ７，４，６ｍＭ　ＥＤＴＡ）、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ｔ 　ＲＮＡ　２５０μｇ／ｍｌ、ラン胸腺ＤＮＡ　５００μｇ／ｍｌを含む溶液３ ００ｍ１と共にの室温における１時間のインキュベーションによって予備ハイブ リッド形成を実施する。

ビオチニル化オリゴヌクオチドブローブ２μｇ／ｍ＋を添加しＩ；同じ溶液の同 量を用いて、ハイブリッド形成を実施し、４２℃において一晩インキュベーン膠 ンする。次に、フィルターを２ＸＳＳＣによって数回洗浄し、３％ＢＳＡと０１ １％ツイーン２０とを含むＰＢＳとのインキュベーションによってブロックして 、上記実施例８で製造した微小粒子（アビジン標識蛍光微小粒子、２％固体）の ｌ：１０００希釈物と共に室温において３０分間インキュベートする。スライド をＰＢＳによって開渠に洗浄して、可視化する。ＵＶ光源によって顕微鏡を照明 すると、ＣＲＥＢＡＧ細胞は容易に検出可能な黄緑色蛍光を示すが、ＮＩＨ３Ｔ ３細胞は示さない。

実施例１２：新規な微小粒子を用いるノーザンブロノティングによるゼブラフイ ソンユ（２ｅｂｒｓｌｉｓｈ）胚における発生的に重要なｍＲＮＡ分子の検出ゼ ブラフイノ７ユのエングレイルド（Ｈ（＋５ｉｌｔｄ）遺伝子、インバーテツド （ｉｎｖｅｋｅｄ）遺伝子とＨＯＸ　（ホメオポンクス（ｈｏｍｅｏｂｏｘ）遺 伝子並びにＣＡＴ　（クロラムフェニ力ルアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子 に対するオリゴヌクレオチドプローブに、文献に述べられた方法のいずれかを用 いて、微小粒子を直接結合させる。オリゴヌクレオチド　プローブは、異なって 標識された０、１ミクロン微小粒子にそ１ｔそれ結合させる・ エングレイルドは黄緑色（発光５１２ｎｍ、化合物１含有ラテックス）へ、イン バーテツドは橙色（発光５５７ｎｍ、実施例３におけるような、化合物１と３と を含むラテックス）へ、ＨＯＸは赤色（発光６０５ｎｍ、実施例４におけるよう な、化合物１．３．及び４を含むラテックス）へ、ＣＡＴは深紅色（発光６５０ ｎｍ、化合物１．３．４及び６を含むラテックス）へ結合させる。総細胞ＲＮＡ は幾つかの異なる発生期におけるゼブラフイソンユ胚から調製する。ＲＮＡは細 胞破壊から調製しく５０ｍＭ　ＮａＣｌ、５０ｍＭ）リス−０１、ｐＨ７，５， ５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及びプロテイナ ーゼＫ　２００μｇ／ｍｌから成る均質化緩衝液の存在下で、ベークトガラス（ ｂａｋｅｄ　（ｌａｓｓ）ホモジェナイザーを使用）、３７℃において１時間イ ンキュベートして、蛋白質を消化させる。ホモジェネートを等量のフェノール： クロロホルム１：ｌによって抽出し、水相を同じ溶液によってさらに２回抽出す る。０．１倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）と２．５倍量の水冷エタノ ールとを加え、氷上で２時間インキュベートすることによって、核酸を沈殿させ る。核酸を４°Ｃにおける１５分間の５０００ｇでの遠心・分離によってベレッ ト化させ、上澄み液を捨て、ペレットを風乾させる。全核酸（主としてＲＮＡか ら成る）を無菌水中に溶解する。　ル−ンにつきＲＮＡ　ｌｏｐｇを標準方法を 用いてグリオキシル化し、アガロースゲル（０，ＯＩＭリン酸ナトリウム中１％ アガロース、ｐＨ７，９）上で電気泳動する。ＲＮＡを２０ＸＳＳＰＥ　（１リ ツトルにつきＮａｃＩ　１７４ｇ、ＮａＨ２Ｓ０ｔ・ＨｌＯ２７，６ｇ及びＥＤ ＴＡ　７．４ｇ、ｐＨ７，４）に含めて、２ＸＳＳＣ（１リツトルにつきＮａＣ ｌ　１７．５ｇ、クエン酸ナトリウム８．８、ｐＨ７，０）中で予備平衡化させ たニトロセルロースフィルター［（ＢＡ８５，０．４５ミクロン孔、ンユライへ ル　アンド　ンユエル、ニューハンプシャー州、キーン）上に毛管転移させる。

このニトロセルロースフィルター膜を真空オーブン中で８０°Ｃにおいて１時間 焼成して、核酸を永久的に結合させる。次に、プロントを６ＸＳＳＣ（１リツト ルにつきＮａＣ１５２，５ｇ、クエン酸ナトリウム２６．４ｇ、ｐＨ７，０）、 ０．５％ＳＤＳ、５Ｘデンハート（０，１％フィコール、０．１％ポリビニルピ ロリドン、０゜１％つ／血清アルブミン（ＢＳＡ））、０．０５％乾燥脱脂乳、 ０．５％ツイーン−２０及び−重鎮標準ＤＮＡ　１００μｇ／ｍ＋と共にの６０ ℃における１時間のインキュベーションによって予備ハイブリッド形成させる。

次に、フィルターを各微小粒子結合オリゴヌクオチドプローブ３０ｎｇ／ｍｌを 添加した同じ溶液中で、同温度において３時間、ハイブリッド形成させる。次に 、フィルターを６ＸＳＳＣ，Ｏ，１％ＳＤＳによって室温において２０分間洗浄 し、次に６０℃において５分間洗浄して、非特異的に吸着したプローブを除去す る。個々のＲＮＡ種に相当する帯を、約３６０ｎｍに集中する広帯域フィルター 付きの手で支えるＵＶ光源（ＵＶＰ社、カルフォルニア州、サンガブリエル）に よる照射によって可視化する。各ＲＮＡＩは明確な色を有し、ＣＡＴ遺伝子に対 応するＲＮＡは発生中の全ての段階において製造されるが、エングレイルド遺伝 子、ＨＯＸ及びインバーテツド遺伝子に対応するＲＮＡは発生中の限定された期 間にのみ存在することを示す。

上記発明を例証及び実施例どして詳述したが、好ましい又は特定の実施態様のみ を明らかにしたにすぎず、多くの変更、置換及び変化が下記請求の範囲に述べる 本発明の要旨又は範囲から逸脱せずに全て可能であることを理解すべきである、 ？ペボミ″ 保七呑労 Ｆ１３．３ 波長（ｎｍ） フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号／／Ｃ０９Ｂ　６７／ ２２　Ｚ　７３０６−４ＨＣ１２Ｎ　１５１０９ （７２）発明者　シンガー、ヴイクトリア・エルアメリカ合衆国オレゴン州９７ ４０５．ニージーン、アルダ−２３６０ Ｉ

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．下記工程： （ａ）好ましい励起ピークを有する初期供与体染料と、好ましい発光ピークを有 する最終受容体染料とを含み、組合せ中の各染料が励起エネルギーの有意なエネ ルギ−伝達を可能にするために充分なスペクトル重複を有する染料組合せを選択 する工程と； （ｂ）前記染料組合せをポリマー微小粒子中に配合する工程とを含む方法によっ て製造される蛍光微小粒子。
2. ２．スペクトル重複が、約９０％より大きいエネルギー伝達を可能にする請求項 １記載の微小粒子。
3. ３．ポリマー微小粒子がポリスチレン、臭素化ポリスチレン、ニトロセルロース 、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレ イン、ポリジメチルシロキサン、ポリブタジエン、ポリイソブレン、ポリウレタ ン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルビリジン、ポリビニルペンジ ルクロリド、ポリビニルトルエン、ポリビニリデンクロリド、又はポリジビニル ベンゼンである請求項１記載の微小粒子。
4. ４．蛍光染料がポリアザインダセン、クマリン、炭化水素もしくは置換炭化水素 染料；オキサゾールもしくはオキサジアゾール；アリール置換もしくはヘテロア リール置換ポリオレフィン（Ｃ２−Ｃ５オレフィン部分）；カルボシアニン；フ タロシアニン；オキサジン；カルボスチリル；ポルフィリン染料；又はこれらの 組合せである請求項１記載の微小粒子。
5. ５．少なくとも１種の蛍光染料が式： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔式中、Ｒ１〜Ｒ６は同一又は異なる基であり、単独の又は組合せた、水素、ハ ロゲン、アルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリールアルキ ル、アシル（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、ア リールもしくはヘテロアリールであり；Ｒ７は窒素、メチン、又はハロゲン−、 アルキル−、アルコキシ−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリールアルキ ルー、アシル−（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である） 、アリール−もしくはヘテロアリール−置換メチンである］で示されるポリアザ インダセン染料である請求項４記載の微小粒子。
6. ６．スペクトル重複が、約９５％より大きいエネルギ−伝達を可能にする請求項 ５記載の微小粒子。
7. ７．蛍光染料組合せが約６種未満の染料を約０．５重量％〜２重量％の総染料濃 度で含む請求項１記載の微小粒子。
8. ８．初期供与体対最終受容体の比が約１：５と約１０：１との間である請求項１ 記載の微小粒子。
9. ９．ポリマ−微小粒子がポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリ ロニトリル、ポリアクリルアミド又はポリアクロレインであり；蛍光染料の組合 せが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１〜Ｒ６は同一又は異なる基であり、単独の又は組合せた、水素、ハ ロゲン、アルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリールアルキ ルアシル（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、アリ ールもしくはヘテロアリールであり；Ｒ７は窒素、メチン、又はハロゲン−、ア ルキル−、アルコキシ−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリールアルキル −、アシル−（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、 アリール−もしくはヘテロアリール−置換メチンである］で示される、種々なポ リアザインダセン染料である、約６種未満の染料を含み；総染料濃度が約０．８ 〜１．２重量％であり；初期供与体染料と最終受容体染料との比が約４：１と約 ６：１との間である請求項１記載の微小粒子。
10. １０．請求項９記載の蛍光微小粒子の製造方法。
11. １１．好ましい励起ピークを有する初期供与体染料と、好ましい発光ピークを有 する最終受容体染料とを含み、組合せ中の各染料が励起エネルギーの有意なエネ ルギ−伝達を可能にするために充分なスペクトル重複を有する蛍光染料組合せを 含み；総染料濃度が約１０重量％未満になり、初期供与体対最終受容体の比が約 １：５と約１０：１との間になるように、前記染料組合せがポリマ−微小粒子中 に配合される蛍光微小粒子。
12. １２．微小粒子がニトロセルロース、ポリスチレン、臭素化ポリスチレン、ポリ アクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリアクロレイン、 ポリジメチルシロキサン、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリウレタンポリ 酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリビニルビリジン、ポリビニルベンジルクロリ ド、ポリビニルトルエン、ポリビニリデンクロリド、又はポリジビニルベンゼン であり、直径約１５μｍ未満である請求項１１記載の微小粒子。
13. １３．蛍光染料の組合せが式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ１〜Ｒ６は同一又は異なる基であり、単独の又は組合せた、水素、ハ ロゲン、アルキル、アルコキシ、アルケニル、シクロアルキル、アリールアルキ ルアシル（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、アリ ールもしくはヘテロアリールであり；Ｒ７は窒素、メチン、又はハロゲン−、ア ルキル−、アルコキシ−、アルケニル−、シクロアルキル−、アリールアルキル −、アシル−（これらのアルキル部分はそれぞれ、炭素数約２０未満である）、 アリール−もしくはヘテロアリール−置換メチンである］で示される、約６種未 満のポリアザインダセン染料を含む請求項１２記載の微小粒子。
14. １４．共有結合した又は不動吸着した（ｐａｓｓｉｖｅｌｙ　ａｄｓｏｒｂｅｄ ）生体反応性物質をさらに含む請求項１３記載の微小粒子。
15. １５．前記生体反応性物質が生体分子である、すなわちビオチン、アビジンスト レプトアビジン、ジゴキシゲニン、又は核酸化合物である請求項１４記載の微小 粒子。
16. １６．核酸検出方法において、 （ａ）標的核酸を含むと考えられるサンプルを調製する工程と；（ｂ）好ましい 励起ピークを有する初期供与体染料と、好ましい発光ピークを有する最終受容体 染料とを含み、組合せ中の各染料が励起エネルギーの有意なエネルギー伝達を可 能にするために充分なスペクトル重複を有する染料組合せを配合し、かつ標的核 酸を特異的に認識する核酸配列に結合しているポリマー微小粒子を各プローブが 含む、微小粒子標識プローブの懸濁液を調製する工程と；（ｃ）微小粒子標識プ ローブの懸濁液をサンプルと一緒にする工程と；（ｄ）結合しないプローブを除 去する工程と；（ｅ）微小粒子の初期供与体染料の励起ピークの範囲内で発光す る励起源でプローブを照射する工程と； （ｆ）照射されたプローブから生ずる蛍光を検出する工程とを含む方法。