JPH07509138A - 培養ダイズ細胞のａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換の改良法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 培養ダイズ細胞の ＡＧＲＯＢＡＣＴＥＲｒＵＭ媒介形質転換の改良法発明の分野 本発明は、＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ媒介形質転換によるトランスジェニックダ イズ植物の生成に関する。

発明の背景 ダイズ（ｎ護１凹ｃｏａｘ）は、世界で最も重要な作物植物の１つである。油お よびタンパク質の生産のために、５０００万ヘクタールを超えて生育されている １年生マメ科植物である。作物の生産価値は、２００億ドルを越えると評価され る。毎年、１億メートルトンを超えるダイズが生産される。マメ科植物の遺伝子 転移技術の開発は、耐病性、除草剤に対する抵抗性、および栄養価を増大するよ うに改良した新規な栽培品種の開発が容易となるため、商業的に重要である。し かし、ダイズの改良のための分子学的アプローチは、トランスジェニックダイズ 植物を生成するのに利用可能な技術に制限される。

いくつかの重要な作物植物を包含する多くの植物は、■皿ｂａｃｔｅｒｉｕＩｌ ′ｌ媒介遺伝子転移を用いて遺伝的に改変されている。

ＭｃＣｏｒｆｆｌｉｃｋら、（１９８６）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ　、５ ．　８１−８４　；　Ｒａｄｋｅら。

（１９８８）　Ｔｈｅｏｒ、Ａ　１．　Ｇｅｎｅｔ、７５．　６８５−６９４　 ；　Ｌｌｍｂｅｃｋら、（１９８７）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　５．２６３ −２６６　；　ＢｏｔｔｅｍａｎおよびＬｅｅｍａｎｓ。

（１９８８）　Ｔｒｅｎｄ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　４．２１９−２２２゜不 運にも、これらの双子葉植物種のいくつかの遺伝子型はＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｆｆｌ感染に感受性であっても（Ｆａｃｃｉｏｔｔｉら、　（１９８５）　Ｂ ｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　３．２４１−２４６　；　０ｖｅｎｓおよびＣｒｅｓｓ 　（１９８５）　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ　５ｉｏ１．７７、８７−９４　ＨＢｙｒｎ ｅら、（１９８７）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ工Ｉ　Ｔｉ５ｓｕｅ　ａｎｄ　Ｏｒ　ａ ｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　８．３−１５）　、形質転換に＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ を使用することは、利用可能で有効な形質転換および再生の手順がないことによ り制限される。

最近まで、ダイズは＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの宿主範囲外にあると考えられて いた。ＤｅＣｌｅｅｎｅおよびＤｅＬｅｙ　（１９７６）　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ 　Ｒｅｖ。

４２、３８９−４６６゜最近の報告では、ダイズは、ダイズ遺壬子型およびＡｒ ｏｂａｃｔｅｒｉｕＩｎ株に依存して、＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍに対して感受 性が制限されていることを示唆した。Ｂｙｒｎｅら、　（１９８７）Ｐｌａｎｔ 　Ｃｅ１ｌ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｏｒ　ａｎ　Ｃｕ１ｔ、　８．３−１５゜たった１ 種のダイズのみ（Ｐｅｋｉｎｇ）が形質転換に成功しているが、この変種は市場 価値がない。この形質転換可能な変種のわずかなトランスジェニックダイズ植物 がＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｒｎと再生可能な外植片との共存培養により生成さ れている。Ｈｉｎｃｈｅｅら、　（１９８Ｂ）　Ｂｉｏ／に仕匣旦■６．９１５ −９２２゜＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介法によるダイズの形質転換が市販可能 になるためには、この方法は、より抜きの商業的栽培品種の直接的形質転換が可 能になるようにしなければならない。

これらの問題に加えて、ダイズは再生が最も困難な牡圧且９種であることが知ら れている。外植片は根を容易に生成せず、さらにトランスジェニック材料の栽培 を行うことはほとんど不可能である。このため、形質転換および再生に用いられ る方法は、現在まで信頼性がなく効果がないままであった。

従って、本発明の目的は、植物細胞に感染し、その植物細胞にＴ−ＤＮＡを転移 してそこで発現させる、組ｒｏｂａｃｔｅ旦朋種の改良法を提供することである 。

本発明の別の目的は、ダイズ植物細胞に感染し、この細胞を形質転換する＾ｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ種の能力を高めるための、この種の新規な誘導培地を提供 することである。

本発明のさらに別の目的は、ダイズ外植片から完全植物への再生のための、新規 な成長培地および方法を提供することである。

本発明のプロセスは、ダイズ組織でのＩ」坤旦型■朋媒介形質転換技術およびそ のトランスジェニックダイズ植物への再生において大きな改良を示す。

え見立１１ 本発明に従って、トランスジェニックダイズ植物の生成のための簡単で迅速な信 頼性のあるプロセスが提供される。方法は、より抜きの商業的栽培品種を包含す るすべてのダイズ変種に有効であり、今までに用いられたシステム以上に相当な 改良を示す。これは、この方法が、ダイズの形質転換および再生に必要でありこ れまで欠けていた要因を提供し、そして健常で可稔性のトランスジェニック植物 生成を成功させるために、これらおよび他の要因を最適化するからである。

本発明は、以下の工程を包含する、遺伝子型に依存しないトランスジェニックダ イズ植物の生成方法を包含する＝（ａ）発芽させたダイズ種子の下胚軸または培 養子葉節由来の外植片を、キメラ遺伝子を含む＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕＩＩ＋種 と共に、アセトシリンボン、α−ヒドロキシアセトシリンゴン、アセトバニロン 、シリンガアルデヒド、シリンガ酸、およびシナビン酸、ならびにそれらの混合 物からなる群から選択されるシグナル化合物の存在下で共存培養する工程；（ｂ ）２８℃より低い温度での共存培養によりＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ（９）の毒 性を誘導する工程；および （ｃ）植物培養培地のｐＨをｐＨ６、Ｏより低く低下させることにより＾ｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕ＋＋＋の毒性を誘導する工程。

このプロセスは、ダイズ下胚軸または子葉節外植片と、目的の１つまたは複数の 遺伝子を挿入されるプラスミドを有する＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種との共存培 養を包含する。ダイズ外植片は、供給植物から採取され、培養においてカルスを 生成し得る一片のダイズ組織である。ダイズ下胚軸組織は、子葉の下部で根の上 部のダイズ植物胚または実生の軸の部分である。子葉は肝葉であり、そして子葉 節は胚軸と子葉との間の実生部であり、これは下胚軸と上胚軸との区別を植物学 的に規定する（胚シュート）。

培養ダイズ細胞の形質転換にかなり影響するいくつかの要因が、本発明の達成に おいて同定された。これらのうち最も重要なことは、共存培養の間シグナル分子 の正しい使用による＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｆｆｌの毒性（ｖｉｒ）遺伝子の誘 導であると思われる。

培養ダイズ細胞は、形質転換プロセスを開始させるのに必要なシグナル分子を有 さないか、または限られた量で有する。

これらの結果は、一般に、ダイズ形質転換のためのｖｉｒ遺伝子の導入の重要性 を認めているがこの問題を解決していない他の研究と一致する。Ｄｅｌｚｅｒら 、　（１９９０）　９ＡＬ５リユ３０．３２０−３’１２；　０ｖｅｎｓおよび Ｓｍｉｇｏｃｋｉ　（１９８８）　Ｐｌａｎｔ二ＩＬ■匣工８８．５７０−５７ ３゜本発明は、アセトシリンボン（傷害を受けた植物細胞により生成されるフェ ノール性化合物）を用いて、ｖｉｒ遺伝子を誘導する。他のフェノール性化合物 、α−ヒドロキシアセトシリンゴン、アセトバニロン、シリンガアルデヒド、シ リンガ酸、およびシナビン酸もまたｖｉｒ遺伝子を誘導し、独立してまたはアセ トシリンボンと組み合わせたそれらの使用により、ダイズ形質転換の効果が改良 され得る。共存培養プロセスで十分な量のシグナル分子を使用することにより、 あらゆる場合において、形質転換頻度が高められた。

共存培養の温度が別の重要な要因であることが見出された。

ダイズ細胞培養の通常の温度（２６〜２８°Ｃ）は、有効な形質転換には不適切 である。温度をより低くすることにより、より有効な形質転換が行われる。２８ ℃で観察された阻害は、より高い温度の細菌の過増殖およびその結果化じる植物 細胞の生存の低下から生じるようではなかった。これは、硫酸カナマイシンを培 地から除去したとき、両温度で共存培養した外植片は大きなカルスを生成したか らである。共存培養中の培地ｐＨもまた、形質転換率に影響する。低ｐＨ（ｐＨ ５，５）に緩衝化するような処理により高い効果が確実となる。理論により制限 されることを意図しないが、これらの改良効果はシグナル分子反応作用に関連す ると思われる。ｖｉｒ遺伝子誘導は温度およびｐＨに依存し、最適条件は約２０ ℃およびｐｎｓ、ｓであることが知られている。＾ｉｔ−Ｍｏｅｒｌｅら、　（ １９８８）　Ｍｏ１．　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　２１３、１−８゜ ダイズ細胞の形質転換の成功はまた、接種物における細菌の濃度にも依存する。

一般に、細菌数が大きくなることにより、より多くの形質転換が達成される。飽 和濃度の細菌が存在し得るが、ここではダイズ細胞ではさらなる形質転換は生じ ず、この数は非常に大きいと思われる。本発明者らの実験は、この数が、３　Ｘ 　１０’生存細胞／、ｒ＋　１で、あるいはそれを超える濃度で細菌を１回３０ 分接種することにより行い得、そして３ｘｌＱ７細胞／Ｉｎｌの従来濃度（Ｄｅ ｂｌａｅｒｅら、　（１９８７）　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚ■ｏｌｏ■１５３．２． ７７−２９３）では、かなり低すぎることを示唆した。

しかし、本発明者らの実験で、は、真の接種飽和条件は特定され得なかった。連 続接種により形質転換可能なダイズ細胞は、接種が非常に高い細菌濃度で行われ るときであっても標的されることがないことが示された。高濃度の細菌を接種し の傾向であった。凝集により、植物細胞に付着するのに用いられ得る細菌数が減 少した。沈降した細菌を再懸濁するとすぐに凝集が始まり、この凝集率は濃度依 存性であった。これはまた、培地の機械的混合の程度にも依存した。共存培養培 地（細菌が再懸濁される）の組成もまた凝集に影響し得る。

従って、植物細胞の急速な分裂の誘導および＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｖｉｒ遺 伝子の高レベル誘導に適切な完全植物細胞培地のみがこのプロセスにおいて用い られた。

形質転換頻度の相当な増大は、凝集現象を制限し、その効果による接種条件を用 いて達成された。第一に、接種は、混合を最小限にして、室温で高い開始濃度で 行った。第二に、それらは、各外植片に対し新しく再懸濁した対数増殖期の絃ｒ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍのペレットを接種するように、バッチ式で行った。

外植片は、可能な限り最も高い濃度での利用可能な細菌の存在下で（すなわち、 個々の細胞数をかなり減少させる凝集をする前に）、接種物で傷つけた。

第三に、接種期間は、所定のバッチの最後の外植片を傷害してから開始して３０ 分ぐらいとした。時間をこれより長くしても形質転換頻度を増大することはなか ７た。連続接種により、頻度を適度に増大させた。この増大は、おそらく植物細 胞を形質転換するのに利用可能な細菌の数の増加によると思われた。これらの実 験から、ダイズ細胞は、高濃度の狂二堕ｃｔｅｒｉｕｎに長期間さらされること に耐え得ることが明らかである。

ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを提供することにより、本発明者らは、初めて高頻度の ダイズ形質転換を一貫して達成することができた。

本発明の方法により、いくつかの異なる猛胚畑Ｊ至■四株でこれらの頻度を得、 そしてこの方法は、Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ感染に対するダイズ変種の本来 の感受性により最低限の影響を受けるのみである。

形質転換後、外植片は、液体逆選択培地で培養され、次いで固形の選択培地に移 される。このプロセスは、ｇｕｓのようなトランスジェニックマーカーによる同 定に関して、当該分野で記載されるように繰り返される。ｊｌｃｃａｂｅら、　 （１９８８）　Ｂｊｇα匹加庶国訂６．９２２−９２６゜シュートは、トランス ジェニック外植片で公知の方法により誘導される。ｆｒｉｇｈｔら、　（１９８ Ｇ）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ　ａｒｔｓ　５．　１５０−１５４　；　Ｂ ａｒｖａｌｅら、（１９８６）　Ｐｌａｎｔａ　１６７、４７３−４８１．シュ ートを切り取り、モしてピログルタミン酸をホルモン富化成長培地に加えること により、根が容易に誘導される。これは、根はダイズ組織からまれにしか誘導さ れず、従ってホルモンフリー培地でのみ誘導されるという報告に反する。完全な 成熟再生植物は、土壌での温室栽培に移された後に生成される。

え五二■豊立翌■ 本発明者らは、ｇｕｓ遺伝子を有する几旦勉旦型■Ｌｌｆｆｌ　ｔｕｆｆｌｅｆ ａｃｉｅｎｓとの共存培養後、ダイズ下胚軸細胞においてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ａ　ｃｏｌｉからβ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）遺伝子を発現させた。

キメラのｇｕｓおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼ１１（ｎｐｔｌｌ ）遺伝子を有するバイナリ−プラスミドを中に含んでいる無害化したＡ　ｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｒｒ株が、ＤＮＡ転移のためのベクターであった。共存培養後、 表１に挙げた市販栽培品種由来のダイズ下胚軸外植片を、１００μｇ／ｌ１１Ｍ 酸カナマイシンを含有するカルス誘導培地（Ｈｉｎｃｈｅｅら、　（１９８８） 　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　６．９１５−９２２）で培養した。形質転換は、 下胚軸外植片がｇｕｓ活性に対して組織化学的にアッセイされたときに、共存培 養後３週間に評価づけされた。形質転換は、解剖顕微鏡（倍率１０ｘ）を用いて 可視化された。これらの形質転換は、染色植物細胞のセクター（ｓｅｃｔｏｒ） として現れた。ｇｕｓ遺伝子のダイズ染色体への安定した組み込みは、染色セク ター内の子孫の細胞集団における遺伝子活性の保持により示唆された。複数の別 個の事象がいくつかの外植片で検出され得た。これらは、ｇｕｓ遺伝子を発現し ない細胞により至る所で飛び出した。移植片の組は共に接種され、共存培養され 、選択され、そして組織化学的にアッセイされた。各組は独立した実験単位であ り、遺伝的差異（種子ロフト内の）、外植片の配置（幼植物内の）、および外植 片の大きさによる変化を補うのに十分な外植片数である。

処理は、その中の外植片で検出された事象の総数を記録することにより評価され た。この方法を用いて、持続した分裂が可能な形質転換細胞のみが評価された。

この測定値は、バックグラウンドｇｕｓ活性およびあらゆる残留細菌混入とも明 らかに区別された。

２久土西差ｌｏ表１は、８つの異なるダイズ変種の下胚軸外植片を、アセトシリ ンボン（１００μＭ）の存在下および不在下で、接種しく３０分）そして共存培 養した（３日）実験の結果を示す。接種物は、最終濃度３　Ｘ　１０’生存細胞 ＃＋１で、アセトシリンボンを添加してまたは添加しないで、１０Ｉｌ＋Ｍ　Ｍ ＥＳでｐＨ５，５に緩衝化した液体植物細胞培地中に、対数期＾ｒｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍを再懸濁することにより調製された。外植片は、接種物中で調製され、 そこに３０分間保持され、次いで３日間共存培養のために寒天固形化培地に移さ れた。共存培養は２２℃で行った。共存培養後、外植片は洗浄され、形質転換植 物細胞の選択および＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉａの逆選択のために抗生物質（カナマ イシン）を含有する固形培地に移された。継代培養は２８℃であった。形質転換 セクターは、アセトシリンボンが接種培地および共存培養培地に添加されたとき にのみ生成された。形質転換セクターは、すべての変種で生成された。各変種（ ４８外植片）で生成された形質転換セクターの平均数は、１０７であった。形質 転換セクター数は、最低４４（Ｃａｒｔｔｅｒ変種）から最高１５３（９３９１ 変種）までの範囲であった。継代実験では、少数の形質転換セクターが、アセト シリンボンを経験しなかった外植片で生成されたが、このような事象の頻度は低 すぎて実際に測定することはできなかった。

一晩細菌培養および植讐培地を用いる細菌プレ培養期にアセトシリンボンを含め ても、形質転換頻度は増大しなかった。

単糖類グルコースが接種培地および共存培養培地に取り入れられたとき、同様の 結果が得られた（データ示さず）。すべての継代実験は、接種培地および共存培 養培地に１００μ舅でアセトシリンボンを含んで行った。

表１．アセトシリンゴンの存在下または不在下でのダイズ下胚軸外植片の共存培 養により生成された形質転換セクターの数。

アセトシリンボン　（μ刑 ダイズ遺壬子型　１００ １厘。表２は、共通ペトリ皿に接種される下胚軸外植片を無作為に２組に分けた 実験の結果を示す。この組（各２４外植片）を、固形培地上で異なる温度（２２ °Ｃおよび２８°Ｃ）で、３日間共存培養した。共存培養後、すべての外植片を ２８°Ｃで培養した。１２回の別個の接種は、９３４１ｉ種を用いて、３　Ｘ　 ｔｏ’生存細胞／＋ｎｌの＾ｒｏｂａｃｔｃｒｉｕｎで３０分間行われた。２２ ℃で共存培養した２４個の外植片で生成された形質転換セクターの平均数は１０ ９であった。２８℃形質転換セクターの平均数は１．４であった。

この実験において、低温での共存培養から生じる形質転換頻度の増大は、約８０ 倍である。すべての継代共存培養は２２℃で行った。

表２．２２℃および２８６Ｃでのダイズ下胚軸外植片の共存培養により生成され た形質転換セクターの数。

温度（’Ｃ） 吐。表３は、外植片を異なるｐＨレベル（５，５，５，７５、および６．０）で 接種し共存培養した実験の結果を示す。１４回の別個の接種は、各ｐＨで行われ た。培地をＩＯμＭ　ＩＩＥＳで緩衝化してｐＨの安定を確実にした。次いで共 存培養が、同様に緩衝化した固形化培地で３日間行われた。ｐＨ６，０で２４外 植片で生成された形質転換セクターの平均数は、ｐＨ５，５（２８６）またはｐ Ｈ５，７５（２８８）のいずれかで生成されたよりも有意に低かった（２０３） 。これは、公表された結果では、アセトシリンボンを用いたときに、阻方郵凹ｍ ａｘにおいてｐｌ＋の表示効果が全く示されなかったことに反する。Ｇｏｄｗｉ ｎら、　（１９９１）　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ　、　９．６７１６７５゜ すべての継代接種および共存培養は、ｐｉ（５，５に調整され、ｌＯμＭ　ＭＥ Ｓで緩衝化された培地で行った。

表３．　ｐＨ５，５０，５，７５、および６．００でのダイズ下胚軸外植片の共 存培養により生成された形質転換セクターの数。

ｐＨ 接種　５．５０　５．７５　６．００ 平均　２８６　２８８　２０３ 種　にお番る生　細　濃　。表４は、外植片に異なる濃度の細菌を接種した２つ の実験の結果を示す。これらの実験に関し、対数期の一晩細菌培養物を沈降し、 次いで適切な濃度への順次希釈により再懸濁した。各実験において、３つの別個 の細菌希釈系列を共通−晩培養から調製した。前述の実験におけるように、４８ 個の外植片を各接種物において調製し、そこで３０分間保持し、固形培地で３日 間共存培養した。４８個の外植片の各接種に対して生成された形質転換セクター の総数を記録した。最初の３つの接種濃度：　３　Ｘ　ｔｏ’、１０’、および ３　Ｘ　１０’細胞／ｍｌについて、より多くの形質転換セクターが、より多い 細菌により生成された。これは、両実験およびすべての希釈系列に関していえる 。

表４９種々の濃度の猛三抑且迫■朋でのダイズ下胚軸外植片の接種により生成さ れた形質転換セクターの数。

より高い接種濃度（１０９細胞／ａ＋１．）では、形質転換頻度の増大は検出さ れなかった。この濃度で生成されたセクターの平均数は、それ以下の濃度の平均 数と有意に違わなかった。従って、投与量／反応プロフィールは、細菌数が制限 される濃度から細菌が飽和である濃度まで、３ｘｌＯ″細胞／ｍ１で変化する。

所定の濃度で生成される形質転換体の絶対数は、実験間でかなり変化する。各実 験においてプラトーが見かけ上達成されるので、＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉａの数よ りもむしろその状態が限定要因となるようである。異なるダイズ外植片調製物が 形質転換の能力により変化したことも考えられる。第三に考えられることは、接 種の真の長さが実験間で変化していることである。

これはありそうにないことであるが、実験は、所定の濃度を飽和させるのに十分 な接種期間を規定して行った。３０分の期間は、最大数の事象を生じるように決 定され、さらに時間を加えても何の効果も生じなかった（データ示さず）。

１挾盗１゜ＡｇｒＯｂａＣｔｅｒｌａをダイズ細胞に感染させる試みにおいて、 ４８個のダイズ下胚軸外植片（９３４１変種）の組を、５ＸＩＯ１生存細胞／１ １で細菌を３０分間、１回または２回接種した実験を行った。すべての外植片は ３日間共存培養した。結果は表５に示す。形質転換セクターの平均数は、２回処 理（３１５）の方が１回処理（２８６）よりも有意に高かった。連続接種により 、さらに形質転換は生じ得ないようである。形質転換可能なダイズ細胞プールの 真の飽和は１回接種により達成され、そして生存細菌数は、接種が非常に高濃度 でなされたときであっても制限されたままである。しかし、形質転換に至る連合 の大部分は、最初の３０分接種で生じている。

（以下余白） 表５．ダイズ下胚軸のＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋媒介形質転換における連続 接種の効果。

感爪　および耐　゛イズ　−　。表１に示した結果は、試験したすべてのダイズ 変種は、本発明の方法を用いてｕ朋ｂａｃｔｅｒｉｕのにより形質転換され得る ことを示した。絃二自狙叩■凹媒介形質転換に対するダイズ変種の相対的感受性 を決定するために、推定耐性変種（Ｃｏｒｓｏｙ　７９およびＣｅｎｔｕｒｙ） の交雑組み合わせ検定を、感受性パートナ−としてＰｅｋｉｎｇ変種を用いて行 った。接種は、異なる変種の外植片が共通の接種物において調製され得るように 、ステンレスメツシュ分離器（０゜５０１０１孔）を有するペトリ皿で行った。

「耐性」変種の２４個の外植片を、等しい数の「感受性」外植片を含む各１２個 の別個のベトリ皿中で調製した。結果は表６に示す。変種Ｐｅｋｉｎｇは、変種 ｃｅｎｔｕｒｙの約２倍の頻度および変種Ｃｏｒｓｏｙ　７９の約３倍の頻度で 形質転換された。変種に依存する感受性がこれらの実験により確認されているが 、その程度（２〜３倍）は小さいので、多様なダイズ生殖質の形質転換にＡ　ｒ ｏｂａｃｔｅｒｉｕＩｌ′ｌを用いることに関して重大な示唆を与えるほどでは ない。

表６１選択されたダイズ遺壬子型の＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕＩｎ媒介形質転換に 対する感受性の比較。

Ｐｅｋｉｎｇ　Ｃｅｎセｕｒｙ　Ｐｅｋｉｎｇ　Ｃｏｒｓｏｙ　７９組阻Ｉ山田 上巷。２つの互いの無害化された組団裏還り四株と、オクトバイン（ｏｃｔｏｐ ｉｎｅ）株であるＬＢ＾４４０４とを、ダイズ下胚軸細胞の形質転換を媒介する 能力について比較した；それらは、Ｌ、Ｌ−スクシナモパイン（ｓｕｃｃｉｎａ ｍｏｐｉｎｅ）株Ｅｌ＾１０１およびツバリン（ｎｏｐａｌｉｎｅ）株Ｃ５８− ｐｚ７０７であった。表７は、これらの各株の濃度を増大させて、Ｖｉｌｌｉａ ｉｓ　８２の下胚軸外植片への接種に用いる実験の結果を示す。４８個の外植片 を各濃度の各株に接種した。ＬＢ＾４４０４をコントロールとして３ＸＩＯ’生 存細胞／ｍｌで含有させた。両方の株で形質転換セクターが生じた。両方の場合 において、形質転換頻度は、接種物における細菌濃度に依存し、細菌数が多いほ ど形質転換は多（生じた。試験したレベルでは、形質転換において、どちらもＬ ＢＡ４４０４と比較して相当な変化はみられなかった。

表７．＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｌＩｌｅｆａｃｉｅｎｓ選抜株によるダ イズ下胚軸の形質転換の比較。

生存細胞／ｍ！ 株　１０’　３　ｘ　１０７１０”　３　ｘ　１０　１０゜ＬＢＡ４４０４　− 　−　−　２５８　−ＥＨＡＩＯＩ　ｉｓ　３８　５１　１５５　２７４Ｃ５８ −ｐＺ７０７　１１　１３　１１８　２６２　−以下の実施例は、本発明に従っ て種々の適用を説明するが、決して本発明の範囲を限定する意図はない。

火」１例」２ ダイズ（飢三力ｌユ■）種子（Ｐｉｏｎｅｅｅｒ変種９３４１）は、鐘状ガラス 容器中で放出された塩素ガスに曝すことにより表面を滅菌した。ガスを、３．５ ａ＋１の塩酸（３４〜３７％ｗ／ｗ）を１００ｍ１の次亜塩素酸ナトリウム（５ ，２５％ｖ／ｖ）に加えることにより作製した。

約１立方フイートの容量のコンテナ中で１６〜２０時間曝した。

表面滅菌した種子を、室温でペトリ皿中に保存した。種子は、植物成長調節剤を 含まないＧａＩｎｂｏｒｇに従う１／１０強度の寒天固形化培地［最小有機物を 含むＢ５塩本培地、Ｓｉｇｎａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、。

カタログ番号Ｇ５８９３．０．３２　ｇａ＋／Ｌ　；ショ糖、０．２％ｖ／ｖお よび２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３．ｈＭ］のプレー トに置き、２８℃で昼の長さを１６時間にして、約２０μＥ釦２ｓｌの弱い白色 蛍光照明をあてて培養することにより、発芽させた。３．４日後、種子を共存培 養用に調製し得た。種子の外皮を取り除き、伸長している幼根を子葉の下部３〜 ４ｎＩＩｌで取り除いた。

いくつかのペトリ皿のそれぞれにつき１０個の得られた種子を保持した。

火胤勇ユ １．０μｇ／１１のテトラサイクリンを含む最小Ａ培地で対数期へと増殖した、 バイナリ−プラスミドｐ１２ＧＵｓＢＮ１７（ＤＰ１８１６）またはｐ１２−４ Ｘ（ＤＰ１８１３）を有する＾ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｎｅｆａｃｉｅｎ ｓ　ＬＢ＾４４０４株の終夜培養物をプールし、５５０μｍでの吸光度測定を行 った。かなりの容量の培養物を、沈澱してｔ、ｏｘｔｏ”細胞と２゜ＯＸ　ｔｏ ”細胞との間の細胞が各管に集められるように、１５１１の円錐形遠沈管に入れ た。ここで、ｏ、　Ｄ、　５５０１．０＝１．４　ｘ　１０”細胞／ｆｆ１１で ある。沈澱は６０００ｇで１０分間の遠心により得た。遠心後、上清をデカント し、接種物が必要になるまで（しかし１時間は超えない）管を室温で保持した。

爽１斑ｌ 接種を、各プレートの種子を新たに再懸濁した狂皿碩虱肛迩のペレットで処理す るようなバッチで行った。ペレットを２０ｎｌの接種培地中に一度に再懸濁した 。接種培地は、Ｂ５塩（０５８９３）、３．２ｇｆｆＩ／Ｌ　；ショ糖、２．０ ％ｖ／ｖ　；　５−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）、４４μＭ；インドール酪 酸（ＩＢＡ）、０．５μｖ；７セトシリンゴン（ＡＳ）、１００μＭからなり、 １ｈ＋ＭのＭＥＳでｐＨ５，５に緩衝化した。再懸濁はポルテックスにより行っ た。次いで接種物を、調製した種子を含むペトリ皿に注ぎ、子葉節を外科用メス で浸軟させた。これは、２つの子葉全体を保護する茎頂（ｓｈｏｏｔａｐｅｘ） を通り、経線部分で半分に種子を分けることにより行った。次いで２つの半分の 茎頂は、外科用メスでそれらを取り除くことによりそれぞれの子葉を分解した。

次いで子葉節を、外科用メスで対称な尖にそって切れ目を繰り返し付けることに より浸軟した。外植片から軸外側をまったく切断しないように気を付ける。２０ 個の外植片をざっと５分間で調製し、次いで室温で３０分間撹拌せずにインキュ ベートした。追加のプレートをこの間に調製した。外植片を０．２％ｖ／ｖのＧ ｅｌｒｉｔｅ（Ｍｅｒｃｋ　＆　Ｃｏ、、Ｉｎｃ、）で固形化させた同じ培地の プレートに移して３０分後に、この外植片を軸方向側を上にして培地の表面層に 埋め、２２℃で３日間、約２０μＥｉ″ｓ＋の弱い白色蛍光下で培養した。

実ＪＥ例」工 ３日後に、外植片を液体逆選択培地に移した。逆選択培地は、Ｂ５塩（Ｇ５８９ ３）、３．２ｇｉ／Ｌ　；ショ糖、２．０％ｖ／ｖ　；　ＢＡＰ、　５．０μ賛 、　ＩＢＡ、　０．５μ輩；バンコマイシン、２００μｇ／ｎｌ　；セフォタキ シム、５００μｇ／ｎｌからなり、３ａ＋ＭのソＥＳでｐＨ５，７に緩衝化した 。１０個の外植片を各ペトリ皿中で、一定のゆっくりした旋回撹拌しながら室温 で４日間洗浄した。逆選択培地は４回交換した。

１庭透ｊ 次いで外植片を寒天固形化選択培地に取り出した。選択培地は、Ｂ５塩（Ｇ５８ ９３）、３．２ｇ＋ｏル；ショ糖、２．０％Ｗ／Ｖ　；　ＢＡＰ、　５゜０μＭ 、ＩＢ＾、０．５μ電；硫酸カナマイシン、５０μｇ／ｍｌ　；バンコマイシン 、１００μｇ／ｆｆ１ｌ　；セフォタキシム、３０μｇ／ｍｌ　；チメンチン（ ｔｉｍｅｎｔｉｎ）、３０　μｇ／ｎｌからなり、３−　Ｏａ＋ＭのＭＥＳ′″ ｃｐＨ５，７に緩衝化した。選択培地を０．３％ｖ／ｖのＳｅａＫｅｍアガロー スで固形化した。

外植片を軸方向を下にして培地に埋め、２８℃で昼の長さを１６時間にして６０ 〜８０μＥＩｌ＋ｔＳ′の弱い白色蛍光照明をあてて培養した。

実１目引立 ２週間後、外植片を再び旋回シェーカー上で液体培地で洗浄した。今回は、洗浄 を５０μｇ／ｉｌｌの硫酸カナマイシンを含む逆選択培地中で終夜で行った。次 の日、外植片を寒天固形化選択培地に取り出した。再びそれらを培地中に軸方向 を下に埋めた。培養をもう２週間、前のように行った。

爽呈Ｊ［ １力月後選択培地上で、形質転換組織は、バックグラウンドの退色したあまり健 常ではない組織に対して緑色セクターの再生組織として認められるようになった 。緑色セクターのない外植片を放棄し、緑色セクターのある外植片を伸長培地（ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　１ｅｄｉｕｉ＋）に移した。伸長培地は、Ｂ５塩（Ｇ５ ８９３）、３、２ｇｉ／Ｌ　；ショ糖、２．０％ｗ／ｖ　；　ＩＢＡ、３．３ｉ ；ジベレリン酸、１．７μソ：バンコマイシン、１００μｇ／ｍｌ　；セフォタ キシン、３０μｇ１０１　；およびチメンチン、３０μｇ／！＋１からなり、３ ．０＋ｎＭのＭＥＳでｐＨ５，７に緩衝化した。伸長培地は、０．２％ｖ／ｖの ｇｅｌｒｉｔｅで固形化した。それらは、軸方向を上にして埋め、前のように培 養した。培養を、この培地で２週問おきに新鮮なプレートに移して継続した。シ ュートが０．５ｃ＋ｎの長さになった場合、それを根元で切除し、１３ｘ　１０ ０ｍｍの試験管中の発根培地に置いた。発根培地は、Ｂ５塩（Ｇ５８９３）、３ ．２ｇ１Ｉｌ／Ｌ　；ショ糖、１５ｇｏル；ニコチン酸、２０μ舅、ピログルタ ミン酸（ＰＧ＾）、９００ｍｇ／Ｌ、およびＩＢＡ、１０μＭからなっていた。

それは、３．０＋ｎＭのＩＩＥＳでｐＨｓ、　７に緩衝化し、０．２％ｗ／ｖの Ｇｅ１ｒｉｔｅで固形化した。１０日後、シュートをＩＢＡまたはＰＧ＾を含ま ない同培地に移した。シュートを発根させ、前と同じ環境条件下でこれらの管内 に保持した。

冥］１外」− 根糸がうまく樹立した場合、幼植物をプラントコン（ｐｌａｎｔｃａｎ）（ＩＣ Ｎ　Ｂｉｏｉ＋ｅｄｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ、、カタログ番号２６−７２０＆　ｌ− ０２）の中の滅菌した混合土に移した。温度、日長、および光強度は前のまま維 持した。これらの条件下で、再生植物は、育ちが良く（小さいが）はとんど正常 の植物となった。それらの根糸が再びうまく樹立された場合、プラントコンのコ ーナーを切り落とし、植物を環境チャンバーまたは温室で徐々に寒気に慣らした 。最終的に、それらは混合土に鉢土げし、温室で成熟して種子を生じるまで生育 させた。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ１：０１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、　ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、 　ＭＲ，ＮＥ、　ＳＮ。

ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＢＹ。

ＣＡ、ＣＨ，ＣＺ、ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ， ＫＺ、ＬＫ、ＬＵ、ＭＧ、ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＮＺ、　ＰＬ、　 ＰＴ、　ＲＯ，ＲＵ。

ＳＤ、ＳＥ、ＳＫ、ＵＡ、ＶＮ Ｉ

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の工程を包含する、遺伝子型に依存しない、トランスジェニックダイズ 植物の生成方法：ａ．発芽させたダイズ種子の下胚軸または培養子葉節由来の外 植片を、１０８から３×１０６細胞／ｍｌの濃度のキメラ遺伝子を含むＡｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ種細胞と共に、アセトシリンゴン、α−ヒドロキシアセトシ リンゴン、アセトバニロン、シリンガァルデヒド、シリンが酸、シナピン酸、お よびそれらの混合物からなる群から選択されるシグナル化合物の存在下で共存培 養する工程； ｂ．１８〜２８℃の共存培養温度を維持する工程；およびｃ．植物培養培地ｐＨ をｐＨ６．０未満にまで低下させることにより該Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの 毒性を誘導する工程。
2. ２．前記共存培養がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの順次接種により行われる、請 求項１に記載の方法。
3. ３．前記キメラ遺伝子が種子貯蔵タンパク質遺伝子である、請求項１に記載の方 法。
4. ４．前記キメラ遺伝子がＢｅｒｔｈｏｌｌｅｔｉａｅｘｃｅｌｓａ由来の２Ｓ貯 蔵タンパク質である、請求項１に記載の方法。
5. ５．以下の工程を包含する、子葉節からダイズ植物を再生する方法： ａ．該節を分割する工程； ｂ．該分割した節を、栄養培地上でカルス組織が発達するまで培養する工程であ って、該組織がシエードを含む、工程；および ｃ．該カルスから該シュートを切り取り、そしてホルモンおよびピログルタミン 酸を含有する栄養培地上で該シュートを発根させて幼植物を形成する工程。
6. ６．前記発根培地がＧａｍｂｏｒｇ培地である、請求項５に記載の方法。
7. ７．前記幼植物が、土を含む培地に移され、該幼植物から完全植物が生じるまで 該培地上で生育される、請求項５に記載の方法。