JPH07509365A

JPH07509365A - ポリヌクレオチド類の３’末端に特定配列を導入する方法

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Publication number: JPH07509365A
Application number: JP6505390A
Authority: JP
Inventors: ラニー、モーリーン; チェン、ヤン; ウルマン、エドウィン・エフ; ハーネンバーガー、カレン・エヌ
Original assignee: デイド・ベーリング・マルブルク・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング
Priority date: 1992-07-31
Filing date: 1993-07-30
Publication date: 1995-10-19
Also published as: ATE152180T1; DE69310179T2; DK0652973T3; EP0652973A1; CA2141450A1; US6030774A; DE69310179D1; ES2104160T3; EP0652973B1; US5679512A; US5683879A; WO1994003637A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ポリヌクレオチド類の３゜末端に特定配列を導入する方法本発明は、核酸ハイブリダイゼーンタンの使用に関する。

核酸ハイブリダイゼーションは、特定の核酸配列に関連する疾患状態の診断において大きな可能性を持っている。

本発明の一実施態様では、プライマー、および一本鎖鋳型ポリヌクレオチドから、２つまたはそれ以上の特定配列を有する一本鎮ボリヌクレオチドを形成する方法を記載している。その方法は；　（ａ）プロッカーボリヌクレオチドの配列Ｂ１を鋳型ポリヌクレオチド（“鋳型”）内の相補配列Ｔ３とハイブリダイズさせる、ここでＴ３の５゜末端は、配列Ｔ２の５゜末端の５゛側であり、Ｔ２およびＴ３は、鋳型の配列Ｔ１に対して５゜側にあり、鋳型の配列Ｔ１と隣接していない、（ｂ）第２の特定配列を含んでなるポリヌクレオチドプライマーの３゛末端をＴ１とハイブリダイズさせる、ここで工程（ｂ）は、工程（ａ）の前後または同時に実施される、そして（Ｃ）鋳型に沿って、さらにＴ２の少な《とも一部に沿ってプライマーを伸長させる、ことを含んで成る。その後、プライマーは、配列Ｓ１およびＳ２、ここでＳ１は、Ｓ２の３゜側にあり、Ｔ２と相同である、を有するポリヌクレオチドＱに沿って伸長する。伸長したプライマーは、その３゜末端にＳ２と相補である第１の特定核酸配列を有して得られる。ポリヌクレオチドＱは、プロッカーポリヌクレオチドの５゛末端に結合しているか、または別の領域として存在するかのいずれかである。

本発明の方法の別の実施態様では、互いに隣接せず、かつ相補である２つのセグメントを有する一本鎖ポリヌクレオチドが生産される。１つの組み合わせは、（ａ）３つの配列Ｔ１、Ｔ２およびＴ３、ここでＴ１は、Ｔ２およびＴ３と隣接せず、Ｔ２およびＴ３の３′側にあり、Ｔ３の３゜末端は、Ｔ２と隣接するか、またはＴ２内にある、を有する鋳型ポリヌクレオチド、（ｂ）その３゛末端がＴ１とハイブリダイズ可能であるブライマーポリヌクレオチド、（Ｃ）配列Ｔ３とハイブリダイズ可能な配列Ｂ１を有するプロッカーボリヌクレオチド、および（ｄ）配列Ｓ１およびＳ２を有するポリヌクレオチドＱを含むように形成される。ポリヌクレオチドＱは、ブロッカ−ポリヌクレオチドの５°末端（言い換えれば一部）に結合しているか、または別の領域として存在している。ｓｌは、Ｂ２の３ °側であり、Ｔ２と相同であって、Ｂ２は、少なくともブライマーポリヌクレオチドの３“末端と相同である配列である。プライマーは、鋳型ポリヌクレオチドに沿って、そして、Ｔ２の少なくとも一部に沿って、その後、ポリヌクレオチドＱに沿って伸長させる。この方法は、例えば、シングルプライマー増幅アッセイ（例えば、ヨーロッハ特許出願０３７９３６９号参照）に格別応用されるものである。

発明の別の実施態様は、標的ポリヌクレオチドの多量のコピーを生成する方法である。その方法は：　（ａ）媒質中（１）３つの配列Ｔｌ、Ｔ２およびＴ３、ここでＴ１は、Ｔ２およびＴ３と隣接せず、Ｔ２およびＴ３の３°側にあり、Ｔ３の３°末端は、Ｔ２と隣接するか、またはＴ２内にあり、標的配列がＴ１とＴ３の間に位置する、を有する鋳型ポリヌクレオチド、（２）その３°末端がＴ１とハイブリダイズできるプライマーポリヌクレオチド、（３）Ｔ３とハイブリダイズできる配列Ｂ１を有するブロッカ−ポリヌクレオチド、（４）配列ｓ１およびＢ２を有するポリヌクレオチドＱ１ここでＱは、ブロッカ−ポリヌクレオチドの５゛末端に結合しているか、または別の領域として存在しており、ｓｌは、Ｂ２の３°側で、Ｔ２と相同であり、Ｂ２は、少なくともブライマーポリヌクレオチドの３′末端と相同である、（５）ＤＮＡポリメラーゼおよび（６）デオキシヌクレオチドトリホスフェート類を：　（Ａ）ブロッカ−を鋳型ポリヌクレオチドの配列Ｔ３とハイブリダイズさせ、（Ｂ）プライマーを配列Ｔ１とハイブリダイズさせ、そして、鋳型ポリヌクレオチドの標的配列に沿って、モしてＴ２の少なくとも一部に沿って、その後は、ポリヌクレオチドＱに沿って伸長させて、二本鎖を形成し、（Ｃ）伸長したプライマーを二本鎖から解離し、（Ｄ）伸長したプライマーにプライマーをハイブリダイズさせ、それに沿って伸長させて、標的配列のコピーを含有する伸長したプライマーを含んで成る二本鎖を形成し、そして、段階（Ｃ）と（Ｄ）が繰り返される条件下で、合わせることを含んで成る。

別の実施態様では、ポリヌクレオチド分析物を含有して懸濁した媒質中の、鋳型配列を含んで成るポリヌクレオチド分析物の存在を検出する。鋳型配列は、３つの配列Ｔ１、Ｔ２およびＴ３、ここでＴ１は、Ｔ２およびＴ３と隣接せず、Ｔ２およびＴ３の３°側にあり、Ｔ３の５゛末端は、Ｔ２の５°末端の５゛側にある、を有する。媒質は、（１）その３°末端がＴ１とノゾブリダイズできるブライマーポリヌクレオチド、（２）Ｔ３とハイブリダイズできる配列Ｂ１を有するブロッカ−ポリヌクレオチド、（３）配列Ｓ１と８２を有するポリヌクレオチドＱ１ここでＱは、ブロッカ−ポリヌクレオチドの５°末端に結合しているが、または別の領域として存在しており、Ｓｌは、Ｂ２の３°側で、Ｔ２と相同であり、Ｂ２は、少な（ともブライマーポリヌクレオチドの３°末端と相同である、（４）ＤＮＡポリメラーゼおよび（５）デオキシヌクレオチドトリホスファターゼと合わせる。条件は＝　（Ａ）ブロッカ−を鋳型配列とハイブリダイズさせ、（Ｂ）プライマーをその鋳型配列とハイブリダイズさせ、そして、鋳型配列に沿って、モしてＴ２の少な（とも一部に沿って、その後は、ポリヌクレオチドＱに沿って伸長させて、二本鎖を形成し、（Ｃ）伸長したプライマーを二本鎖から解離し、そして（Ｄ）伸長したプライマーにプライマーをハイブリダイズさ也それに沿って伸長させて、伸長したプライマーを含んで成る二本鎖を形成し、段階（Ｃ）と（Ｄ）が繰り返される、ように選択する。その後、伸長したプライマーの存在について試験を行うが、その存在は、ポリヌクレオチド分析物の存在を確定するものである。また、上記実施態様では、Ｔ１は、Ｔ２およびＴ３と隣接せず、該Ｔ２およびＴ３の３°側にあり、該Ｔ３の３゛末端は、Ｔ２に隣接するが、またはＴ２内にある。

本発明の他の実施態様は、互いに隣接しておらず、相補である２つのセグメントを有する一重鎖ポリゾオキシヌクレオチドをプライマーポリヌクレオチドがら製造する方法に関する。その方法は：　（ａ）（１）３つの配列Ｔ１、Ｔ２およびＴ３、ここでＴ１は、Ｔ２およびＴ３と隣接せず、Ｔ２およびＴ３の３°側にあり、Ｔ３の３°末端は、Ｔ２と隣接しているか、またはＴ２内にあり、そして、Ｔ２は、ポリヌクレオチドＱの８１と相同な領域の５′末端に制限部位を含んで成る、を有する鋳型ポリヌクレオチド、（２）その３゛末端がＴ１とハイブリダイズできるポリヌクレオチドブライマー、（３）Ｔ３とハイブリダイズできる配列Ｂ１を有するブロッカ−ポリヌクレオチド、および（４）配列Ｓ１および配列Ｓ２を有するポリヌクレオチドＱ１ここでＱは、ブロッカ−ポリヌクレオチドの５゛末端に結合しているか、または別の領域として存在しており、Ｓｌは、Ｂ２の３°側で、Ｔ２と相同であり、Ｂ２は、少なくともプライマーポリヌクレオチドの３°末端と相同の配列である、の組み合わせを提供し、そして（ｂ）その組み合わせを、プライマーを鋳型ポリヌクレオチドに沿って、そして、Ｔ２の少なくとも一部に沿って伸長させ、鋳型ポリヌクレオチドを制限部位で切断し、部分的に伸長したプライマーを８１にハイブリダイズさせ、そして、そのプライマーをポリヌクレオチドＱに沿って伸長させる条件にかける、工程を含んで成る。

本発明の別の実施態様は、２つの異なる特定配列Ｐ１およびＰ’２を有する一重鎖ポリゾオキ／ヌクレオチドをポリヌクレオチドプライマーから製造する方法に関する。一実施態様において、−重鎖ポリデオキシヌクレオチドは、ポリメラーゼ連鎖反応法により増幅させることが出来る。該方法は：　（ａ）（１）３つの配列Ｔ１、Ｔ２およびＴ３、ここでＴ１は、Ｔ２およびＴ３と隣接せず、Ｔ２およびＴ３の３°側にあり、Ｔ３の３°末端は、Ｔ２と隣接しているか、またはＴ２内にある、を有する鋳型ポリヌクレオチド（鋳型）、（２）その３′末端がＴ１とハイブリダイズできるポリヌクレオチドブライマーＰ１、（３）Ｔ３とハイブリダイズできる配列Ｂ１を有するブロッカ−ポリヌクレオチド、および（４）配列Ｓ１およびＢ２を有するポリヌクレオチドＱ１ここでＱは、ブロッカ−ポリヌクレオチドの５゛末端に結合しているか、または別の領域として存在しており、Ｓｌは、Ｂ２の３゛側で、Ｔ２と相同であり、Ｂ２は、Ｂ２と相補である、の組み合わせを提供し、そして（ｂ）その組み合わせを、プライマーＰ１を鋳型に沿って、さらに、Ｔ２の少なくとも一部に沿って、その後、ポリヌクレオチドＱに沿って伸長させる条件にかける、工程を含んで成る。第２の一重鎖ポリデオキシヌクレオチドは、ポリデオキシヌクレオチドプライマーＰ２を、その二本鎖から解離させた伸長したプライマーの配列Ｐ’２とハイブリダイズさせ、最初の伸長したプライマーに沿ってＢ２を伸長させ、そして第２の伸長したプライマーをその二本鎖から解離させることにより、形成される。第２の伸長したプライマーは、配列Ｐ２の３°側にあって、プライマーＰ１とハイブリダイズできる配列Ｐ ’ｌを持つことを特徴とする。得られた２つの一本鎖ポリヌクレオチド（十分に伸長したプライマーＰ１およびＢ２）は、その後、ポリメラーゼ連鎖反応法により増幅させることが出来る。

本発明の別の態様は、配列Ｔ３および配列Ｔ２、ここでＴ３の３゛末端は、Ｔ２の５°末端と隣接している、を含むＤＮＡの一本鎖を含んで成る組成物に関する。その−重鎖は、Ｔ３と相補の配列Ｂ１、およびＢ１の５°側にあって、Ｔ２と相同である配列Ｓ１を含むブロッカ−ＤＮＡ配列に複合している。該組成物は、ＤＮＡの一本鎖において、その３゛末端で配列Ｔ１と複合された配列を有するプライマーポリヌクレオチドを含むことも出来る。

本発明は、更に、ハラケージ化した組み合わせ中に、（ａ）鋳型ポリヌクレオチドの最初の配列Ｔ１とその３°末端でハイブリダイズ可能な配列を有するプライマーポリヌクレオチド、（ｂ）配列Ｂ１を有するブロッカ−ポリヌクレオチド、ここで８１は、鋳型ポリヌクレオチドの配列Ｔ３とハイブリダイズ出来、Ｔ３は、Ｔ１の３°側にあり、Ｔ３の５′末端は、配列Ｔ２の５゛末端の５°側にある、および（Ｃ）配列Ｓ１およびＢ２を有するポリヌクレオチドＱ１ここでＳｌはＢ２の３°側にあって鋳型ポリヌクレオチドのＴ２と相同であり、Ｂ２は、少なくともそのプライマーの３゛末端部と相同な配列である、を含んで成るキットを含んでいる。

本発明は、更に、パンケージ化した組み合わせ中に、（ａ）鋳型ポリヌクレオチドの最初の配列Ｔ１とその３°末端でハイブリダイズ可能な配列を有するブライマーポリヌクレオチド、（ｂ）配列Ｂ１を有するブロッカ−ポリヌクレオチド、ここで８１は、鋳型ポリヌクレオチドの配列Ｔ３とハイブリダイズ出来、Ｔ３は、Ｔ１の３゛側であり、Ｔ３の５゛末端は、配列Ｔ２の５゛末端の５°側にあるもの、および（Ｃ）配列Ｓ１およびＢ２を有するポリヌクレオチドＱ１ここでＳｌはＢ２の３°側にあって鋳型ポリヌクレオチドのＴ２と相同であり、Ｂ２は、少なくとも第２のプライマーの３゛末端部と相同な配列である、を含んで成るキットを含んでいる。

図面の簡単な説明図１−７は、本発明に従う様々な実施態様の略図である。

図８−１６は、実施例の反応生成物を流したゲルを可視化したものである。

詳細な実施態様の記載本方法は、ポリデオキシヌクレオチドプライマーを一本鎖（Ｓ　Ｓ）鋳型ポリヌクレオチド配列に沿って、そしてその後、別のＳＳポリヌクレオチドに沿って伸長させ、２つまたはそれ以上の特定配列を有するＳＳ生成物ポリヌクレオチドを製造するものである。

上記ポリヌクレオチドの製造では、下記の工程を実施する　（ａ）ブロッカ−ポリヌクレオチドの配列Ｂ１を鋳型ポリヌクレオチド（鋳型）の相補配列Ｔ３にハイブリダイズさせるが、ここでＴ３の５′末端は、配列Ｔ２の５°末端の５°側にあり、Ｔ２およびＴ３は、配列Ｔ１の５゛側にあり、配列Ｔ１と隣接しない、（ｂ）第２の特定配列を含んで成るポリヌクレオチドブライマーの３°末端をＴ１にハイブリダイズさせる、ここで工程（ｂ）は、工程（ａ）の前後、または工程（ａ）と同時に行われる、および（Ｃ）プライマーを鋳型に沿って、モしてＴ２の少なくとも一部に沿って、好ましくはＴ２の少なくとも８塩基に沿って、より好ましくはブロッカ−ポリヌクレオチドまで、その後は、配列Ｓ１およびＳ２を有するポリヌクレオチドＱ、ここでＳ］はＳ２の３゛側にあって、Ｔ２と相同である、に沿って伸長させ、その３′末端に８２と相補である第１の特定核酸配列およびプライマーに相当する第２の特定配列を有する伸長したプライマーを得るが、ここでポリヌクレオチドＱは、ブロッカ−ポリヌクレオチドの５′末端（即ち一部分）に結合しているか、または別の領域に存在するかのいずれかである。

本発明の特徴の１つは、分子内塩基対を形成出来る構造を有する、即ち、互いに隣接しておらず、かつ相補であって、その他逆方向の繰り返しとして知られており、ステム・ループ構造を形成できる２つのセグメントを有する一重鎖ポリゾオキ／ヌクレオチドの製造を可能にすることである。その方法は、シングルプライマー増幅領域における特定の適用を有しており、試料中の標的ポリヌクレオチド配列が分子内塩基対形成可能な構造を有しており、かかる構造に変換され得る場合、そのような標的ポリヌクレオチド配列が増幅される。本方法は、必要な試薬および工程数を最小限にしながら、対象のポリヌクレオチド配列を塩基対形成可能な分子内構造を有する標的ポリヌクレオチド配列へと変換するための非常に便利な方法を提供するものである。

本発明の特定の実施態様の記載により更に説明を進める前に、多数の用語を定義したい。

ポリヌクレオチド分析物−−ポリマーヌクレオチドまたはポリマーヌクレオチドの一部である測定すべき化合物または組成物であって、無傷の自然状態では、約２０ないし５００．０００またはそれ以上のヌクレオチドを有することが出来、単離した状態では、約３０ないし５０，０００またはそれ以上のヌクレオチドを有することが出来、通常は、約１００ないし２０，０００ヌクレオチド、より頻繁に見られるのは５００ないし１０．０００ヌクレオチドである。従って、自然状態からの分析物の単離により、しばしばポリマーヌクレオチドの断片化が起こるのは明らかである。ポリヌクレオチド分析物は、任意の供給源由来の核酸を精製化または未精製化形態で念んでおり、ｔ−ＲＮＡ、ｍ−ＲＮＡ、ｒ−ＲＮＡｓ　ミトコンドリアＤＮＡおよびＲＮＡ、葉緑体ＤＮＡおよびＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド類、またはそれらの混合物、遺伝子、染色体、プラスミド、微生物、例えば、細菌類、酵母類、ウィルス類、ウィロイド類、糸状菌、真菌、植物、動物、ヒト、などの生物学的材料のゲノム、およびそれらの断片などを含むＤＮＡ（ｄｓＤＮＡおよび５ｓＤＮＡ）およびＲＮＡを包含している。ポリヌクレオチド分析物は、生物学的試料などの複合混合物の少量画分のみであってもよい。分析物は、当業者にはよ（知られた方法により様々な生物学的材料から得ることが出来る。

かかる生物学的材料のいくつかの例は、限定ではなく説明を目的として、下記表 ■に開示している。

表１対象となる微生物は：コリネバクテリア属コリネバクテリウム・ジフテリア肺炎法菌属ディプロコツカス・ニュウモニアエ連鎖球菌属ストレプトコンカス・ビロゲンスストレプトコンカス・サリバルススフフィロコンカス属スタフィロコッカス・アウレウススタフィロコッカス・アルプスナイセリ７ｇＲナイセリア・メニンシティディスアエロバクタ−・アエロバクタ　コリ型細菌りレブ／エラ・ニュウモニアエサルモ不う・ティホササルモ不う・コレラニスイス　サルモネラ類すルモ不う・チフィムリウムノゲラ・アラビノタルダンゲラ類／ゲラ・フレクスネリプロテウス・ブルガリスプロテウス・ミラビリス　プロテウス種プロテウス・モルガニツユ−トモナス・アエルギノサアルカリゲネス・ファエカリスヘモフィルス・インフルエンザ、　リゾーブス・アリヅア　藻菌類Ｈ，ダクリイヘモフィルス・ヘモフィルス　リゾーブス・ニグリカンスへモフィルス・二／プチクス　スポロトリカム・ンエンキへモフィルス・バラインフルエンザ　フロンセカエ・ベドロソイボルデテラ・ベルランス　フォンセカエ・コンパクトパスツレラ属　フォンセカエ・デルマチディスパスツレラ・ベスティス　クラドスポリウム・力′リオニパスソレラ・ツラレウンス　フィアロホラ・ベルコーサブルセラ属　アスペルギルス・ニドウランスプルセラ・メリテンンス　マドゥレラ・ミセトミブルセラ・アボルタス　マドゥレラ・グリセアプルセラ・スイス　アレンエリア・ポイディイ好気性胞子形成細菌　フィアロホラ・ジャンセルメイバノラス・アンスラシス　ミクロスポラム・ジブセウムバンラス・ズブチルス　トリコフィトン・メンタグロフィテスパフラス・メガテリウム　ケラチノマイセス・アジェロイハノラス・セレウス　ミクロスポラム・カニス嫌気性抱子形成細菌　トリコフィトン・ルブルムクロストリノウム・ポツリナム　ミクロスポラム・アドゥイニクロストリジウム・テタニ　ウィルス類りロストリンウム・ベルフリンゲンス　ウデノウイルス類クロストリジウム・ノヴイイ　ヘルペス・ウィルス類クロストリジウム・セブティカム　単純ヘルペス・シンプレックスクロストリジウム・ヒストリチカム　水痘（水ぼうそう）クロストリジウム・チルチウム　帯状ヘルペス（帯状庖疹）クロストリジウム・ビフェルメンタンス　Ｂウィルレスクロストリジウム・スポロゲネス　サイトメガウィルスミコバクテリア　ポックスウィルス類ミコバクテリウム・ツベルクロノス・本沁ス　痘癒（天然痘）ミコバクテリウム・ボビス　完全痘庖ミコバクテリウム・アビウム　ポックスウィルス・ボビスミコバクテリウム・レクラ　パラワク／ニアミコバクテリウム・パララベルクロシス　モルスカム・コンタジオスム放線菌ｒｉ４（真菌種菌）　ピコルナウィルス類アクチノマイセス・イスラエリ　ポリオウイルスアクチノマイセス・ボビス　コクサッキーウイルスアクチノマイセス・不スルンディ　ＥＣＨＯウイルスノカルジア・アステロイデス　ライノウイルストレポネマ・パリダム　バラインフルエンザ（１−４型）トレポネマ・ペルテヌ　おたふくかぜウイルストレポネマ・カラチウム　ニューキャッスル病ウィルスボレリア・レフレンチイス　麻疹ウィルスレプトスピラ・イクテロヘモラジアエ　牛疫ウィルスレプトスピラ・カニコラ　イヌジステンパーウィルススピリルム・ミナス　呼吸性シンチウムウィルスストレプトバチルス・モニリホルミス　風疹ウィルスマイクプラズマ属　アルボウィルス類マイコプラズマ・ニューモニア他の病原体　東部ウマ脳を髄炎症ウィルスリステリア・モノサイトゲネス　西部ウマ脳を髄炎症つイルスエリンペロスリクス・ルンオバチア　シンドビスウイルスストレブトバチルス・モニリホルミス　チクングニャウイルスドンバニア・グラヌロマテイス　セムリキフオレストウイルスバルトネラ・バシリホルミス　マヨラウイルスリケッチア属（細菌様寄生虫）　セントルイス脳炎ウィルスリケッチア・ブロワゼキ　カリフォルニア脳炎ウィルスリケッチア・モオセリ　コロラドマダニ熱ウィルスリケッチア・リケッチア　黄熱病ウィルスリケッチア・コノリ　デング熱ウィルスリケッチア・アウストラリス　レオウィルス属リケッチア・ンビリカス　レオウィルス１−３型リケツチア・アカリ　レトロウィルス類リケッチア・ツツガムノ　ヒト免疫不全ウィルスＩおよびＩＩ型（ＩＩＩＶ）リケッチア・プルネッティ　ヒトＴ細胞向性ウィルスＩおよびＩＩＩ（［１ＴＬＶ）／ウィルス性）　Ｂ型肝炎つィルスクラミジア剤（名称不祥）　Ｃ型肝炎ウィルス真菌　腫瘍ウィルス類クリプトコックス・ネオファルマンス　ローンヤー白血病ウィルスプラストマイセス・デルマチイブイス　グロスウィルスヒストプラズマ・カブスラタム　マロニー白血病ウイルスコクンジオイデス・イミティス　ヒト乳頭腫ウイルスパラコクンジオイデス・ブラジリエンシスカンジダ・アルビカンスアスペルギルス・フミガラスムコール・コリムビフエル（アブシディア・コリムビフェラ）を包含する。

適当なポリヌクレオチド分析物は、分析物を切断処理して、例えば、制限エンドヌクレアーゼまたは他の部位特異的化学切断法により、剪断または処理することにより、標的ポリヌクレオチド配列を含有する鋳型ポリヌクレオチドを得ることが出来る。しかしながら、本発明の利点は、ポリヌクレオチド分析物を更に切断することなく、その単離した状態で使用出来るという点である。

本発明の目的のために、ポリヌクレオチド分析物またはポリヌクレオチド分析物から得られた切断フラグメントは、通常少なくとも部分的に変性しているか、または−末鎖になっており、もしくは、変性または一本鎖になるように処理される。かかる処理は、当業者にはよく知られており、例えば、加熱またはアルカリ処理である。例えば、二本鎖ＤＮＡは、９０−１００℃で１０−２０秒間またはそれ以上加熱した場合、変性物質を生じる。

鋳型ポリヌクレオチド分析物通はポリヌクレオチド分析物内に存在するヌクレオチドの配列であって、その本体は、ポリヌクレオチドプライマー、プロ・ツカ− ポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチドＱの配列Ｓ１を調製できるのに十分な程度知られている。ポリヌクレオチドプライマーは、かかる鋳型ポリヌクレオチド内、普通は、その３°末端の少なくとも１０ヌクレオチドセグメント内、好ましくは少な（とも１５、しばしば２０ないし１００以上のヌクレオチドセグメント内で、配列Ｔ１とハイブリダイズする能力があるべきである。ブロッカ−ポリヌクレオチドの配列Ｂ１は、かかる鋳型ポリヌクレオチド内、普通は、その５ ′末端の少なくとも１０ヌクレオチドセグメント内、好ましくは少なくとも１５、しばしばその２０ないし１００以上のヌクレオチドセグメント内で、配列Ｔ３とハイブリダイズする能力があるべきである。鋳型ポリヌクレオチドは、３つのヌクレオチド配列Ｔ１、Ｔ２およびＴ３を有しており、Ｔ１は、Ｔ２およびＴ３と隣接せず、それらのＴ２およびＴ３の３′側にあって、ポリヌクレオチドプライマーにハイブリダイズする能力がある前述の部分である。配列Ｔ３の５°末端は、配列Ｔ２の５°末端の５゛側にあり、好ましくは配列Ｔ２の５°末端から少なくとも１０ないし１５塩基のところにあり、かつ好ましくは、その３°末端は、配列Ｔ２と隣接しているか、または配列Ｔ２内にある。Ｔ３の３゛末端が、配列Ｔ２と隣接していないか、または配列Ｔ２内に無い場合、Ｔ３は、Ｔ２の５° 側１０塩基以下のもの、しばしばＴ２の５′側５塩基以下にある。配列Ｔ２は、ポリヌクレオチドＱの配列Ｓ１と相同である。標的ポリヌクレオチド配列は、Ｔ１とＴ３の間に位置している。

鋳型ポリヌクレオチドは、通常、ポリヌクレオチド分析物の一部である。鋳型ポリヌクレオチドは、一般に、より大きい分子の断片であるが、実質的には、完全な分子である。鋳型ポリヌクレオチド中のヌクレオチド数は、Ｔ１、Ｔ３および標的ポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの総数から決定する。一般に、鋳型ポリヌクレオチドは、より小さいポリヌクレオチドをより大きいポリヌクレオチドから生成出来る何等かの操作、例えば、制限酵素または他の部位特異的化学切断薬剤による、より大きいポリヌクレオチドの消化、機械的剪断等によりポリヌクレオチド分析物から得られる。

ポリヌクレオチドＱの配列Ｓ１と相同である、鋳型ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列Ｔ２は、長さにして少なくとも４ヌクレオチド、好ましくは１０− ３０であって、３０−１００デオキシヌクレオチドであっても良い。一般にＴ２は、約１０ないし４０デオキシヌクレオチドである。

該Ｔ３の３゛末端の１５塩基の内生なくとも５塩基配列は、少なくとも８０％のＧおよびＣヌクレオチドから成ることがしばしばである。

標的ポリヌクレオチド配列−ｍ−同定すべきヌクレオチドの配列であって、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり、本発明で採用した鋳型ポリヌクレオチド内で、鋳型ポリヌクレオチドの配列Ｔ１およびＴ３の間に存在する。標的ポリヌクレオチド配列は、長さにして、少なくとも２０ヌクレオチド、普通は少なくとも５０、時に２００−４０００ヌクレオチドである。好ましくは、標的ポリヌクレオチド配列は、約２００ないし１２００デオキシヌクレオチドである。

試料中の標的ポリヌクレオチド配列の存在が、試料中のポリヌクレオチド分析物の存在を示す特異的指標であることを保証するために、標的ポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの最小数を選択する。非常に大まかには、標的ポリヌクレオチド配列の長さは、通常的１．５１ｏｇＬヌクレオチドより大きく、ここで、Ｌは、試料の生物源のゲノムにおける塩基対の数である。標的ポリヌクレオチド配列におけるヌクレオチドの最大数は、通常、ポリヌクレオチド分析物の長さ、およびそれが剪断または単離中の他の過程およびアッセイ用試料を調製するのに必要となる何等かの操作により破壊される傾向、および配列の検出および／または増幅効率により支配される。

一本鎖（ＳＳ）ポリデオキシヌクレオチド配列−一本発明の結果として形成されるデオキシヌクレオチドの配列である。通常、互いに隣接していない、少なくとも２つの特定セグメントまたはフランキング配列から成る。第１および第２の特定セグメントまたはフランキング配列は、ＳＳポリデオキシヌクレオチド配列の３°末端および５°末端にある。第１の特定配列は、第２の特定配列と相補であることもあり、および／またはそれら特定配列は、それらの相補配列に結合したとき、リプレフサー、制限酵素および同等物レセプターに対する特異的結合部位である１またはそれ以上の配列を含有していることもある。第１および第２の配列は、それぞれ、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５のデオキシヌクレオチドおよび／またはそれらの誘導体を含んで成る。

−重鎖ポリゾオキシヌクレオチド配列は、通常、４０から４０００デオキシヌクレオチド、好ましくは１００ないし２０００デオキシヌクレオチド、より好ましくは２５０ないし１２５０デオキシヌクレオチドを含有している。

ポリヌクレオチドプライマー−−その３゛末端に配列Ｔ１とハイブリダイズ出来、かつ好ましくは鋳型ポリヌクレオチド配列のＴ１と相補である配列を含有する一本鎖のポリヌクレオチドであって、通常は、合成ポリヌクレオチドである。

ポリヌクレオチドブライマーの３°末端のヌクレオチドは、通常デオキシヌクレオチドであるが、プライマーは、ホスホロチオエート類、メチル化塩基類、ホスホネート類および同等物などの修飾塩基を含んで成ることが出来、またリボヌクレオチドを含んで成ることもある。Ｔ１とハイブリダイズ出来るポリヌクレオチドプライマー配列のヌクレオチド数は、ポリヌクレオチドブライマーをＴ１にハイブリダイズするのに使用した条件が、過剰の無作為の非特異的ハイブリダイゼーン５ンを防ぐ程度にストリンジエンシーであるべきである。ポリヌクレオチドブライマーのヌクレオチド数は、少なくともＴ１と同程度の数である。ポリヌクレオチドブライマーは、その５゛末端に、ＴＩとハイブリダイズできる配列のヌクレオチド以外のヌクレオチドを含有出来る。これらの付加的なヌクレオチドは、伸長したプライマーの伸長および増幅後にリガンドとして働き得るもので、従って、例えば、核酸結合タンパク質に結合する配列を含むことができる。それらは、また伸長したプライマーの増幅を促進するように働き得る。例えば、それらは、その配列が８２と相同であって、従って、シングルプライマー増幅に用いるポリヌクレオチドブライマーにハイブリダイズ出来るように選択され得る。Ｔ１とハイブリダイズできる配列における、これら以外のヌクレオチドの数は、広範囲、通常は、０−２０００、しばしば０−３００、好ましくは０−５０の範囲内で変化する。プライマーは、リポータ−分子でｌ１１ｍすることも出来る。

部分的に伸長したプライマーーー通常、ポリヌクレオチドブライマーが鋳型ポリヌクレオチドに沿って、モしてＴ２の少なくとも一部に沿って伸長した結果として形成されるデオキシヌクレオチドの配列であって、それが鎖を移してポリヌクレオチドＱに沿って伸長するより以前の配列である。Ｔ３の３′末端がＴ２の５ °末端と共通の配列を有するとき、ブロッカ−ポリヌクレオチド配列Ｂ１の５′ 末端を伸長中にはずすことが出来る。そのとき、部分的に伸長したプライマーは、その３゛末端では、Ｔ３の３゛末端、Ｔ２の５°末端およびＳｌの５°末端と相補で、かつブロッカ−配列Ｂ１の５゛末端と相同な塩基から成る。ブロッカ− の５′末端が、ＤＮＡポリメラーゼによりはずされるかどうかは、反応が行われる温度、ブロッカ−ポリヌクレオチドの塩基組成および構造、および採用したＤＮＡポリメラーゼの種類に依存する。例えば、ヴエントＤＮＡポリメラーゼは、７２℃では、プライマーの３°末端を伸長させながら、特定の遭遇した（ａ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｎｃｏｕｎｔｅｒｅｄ）　ＤＮＡポリメラーゼの５゛末端をはずすことが出来るが、５５℃では出来ない。従って、５５℃でこのＤＮＡポリメラーゼを用いれば、プライマーのポリメライゼーノヨンまたは伸長は、ブロッカ−ポリヌクレオチドの５′末端で止まるであろう。一般に、プライマー伸長は、ブロッカ−配列Ｂ１が低温でＧ−Ｃ豊富であれば、より効率良くブロッカ−の５゛末端で止まるだろう。温度を制御することにより、伸長するプライマーをブロッカ−の５′末端またはその近くで止め、その後、更に伸長させる前に、鎖を鋳型からポリヌクレオチドＱに移すことが出来る。

デオキシヌクレオシドトリホスフェートー−５°−トリホスフェート置換基を有するデオキシヌクレオチド。デオキシヌクレオチドは、三次糖の１゛−炭素に共有結合しているプリンまたはピリミジン類のいずれかの窒素塩基の三次糖誘導体である。プリン塩基は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、イノシンおよびそれらの誘導体および類似体を含む。ピリミジン塩基は、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウランル（Ｕ）およびそれらの誘導体および類似体を含む。

誘導体および類似体は、ポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼの幾つかの基質を含んでおり、酵素などの触媒作用によりポリヌクレオチドに組み込まれ得るものである。誘導体および類似体は、非誘導化ヌクレオシドトリホスフェート類に対すると同様の方法で、酵素により認識されて重合化されるものによって例示される。かかる誘導体または類似体の例は、リポータ−基での修飾、ビオチニル化、アミン修飾、放射性標識、アルキル化等されるものであって、ホスホロチオエート、ホスファイト、環状原子修飾誘導体類、非天然塩基および同等物などを含むが、これらは、例示説明であって、限定ではない。リポータ−基は、フルオレセインなどの蛍光基、ルミノールなどの化学発光基、遅延蛍光など１こより検出可能なＮ（ヒドロキシエチル）エチレンジアミントリ酢酸などのテｌレビウムキレーターなどであり得る。

ポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼ−−ポリヌクレオチドブライマーを主にデオキシヌクレオチド類から成る核酸鋳型に沿って伸長させる触媒、通常１′！酵素。ポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼは、鋳型依存性ポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼであって、ポリヌクレオチドブライマーの３′末端の伸長のための基礎単位（ｂｕｉｌｄｉｎｇ　ｂｌｏｃｋｓ）としてデオキシヌクレオシドトリホスフェートを利用し、−末鎖ポリヌクレオチド配列に相補な配列を提供するものである。

通常は、触媒は、ＤＮＡポリメラーゼなど、例えば、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、フレノウフラグメント、逆転写酵素、ヴエント（Ｖｅｎｔ）ＤＮＡポリメラーゼおよびＶｅｎｔＲ（組換え）ＤＮＡポリメラーゼ（ヴエントＣＶｅｎｔ）は、二ニー・イングランドバイオラボラトリーズ、ピノ（シー、ＭＡの登録商標である）　、Ｐｆｕ　ＤＮＡポリメラーゼ等の、細胞、細菌、例えば、Ｅ、コ１ハ植物、動物、ウィルス、好熱性細菌、などの生物源に由来する酵素である。ポリヌクレオチドＱおよび／または標的ポリヌクレオチド配列が、ＲＮＡである場合、逆転写酵素を少なくともポリヌクレオチドポリメラーゼ類の１つとして使用し、ポリヌクレオチドＱおよび／または鋳型に沿ってプライマーの伸長を促進する。

−重鎖鋳型に沿って、そしてその後、別の一本鎖ポリヌクレオチドに沿ってプライマーを伸長させるのに本発明で使用したポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼは、もちろん、ブロッカ−ポリヌクレオチドの分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）を最小にするために、５°−３°エキソヌクレアーゼ活性を殆ど持たないか、または全（もつべきでない。ポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼの５−３゛エキソヌクレアーゼ活性は、ｐＨ１塩濃度、鋳型が二本鎖であるか、または−末鎖であるか等の様々な因子に依存しており、それらは全て当業者にはよく知られている。一般に、ポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼは、ブロッカ−ポリヌクレオチドまたはプライマーの実質的分解を生じるべきでない。

全体的にまたは部分的に連続してｍ一本発明で利用した試料および様々な薬剤を一緒に（同時に）でなく合わせる場合、１つまたはそれ以上を残りの薬剤の１つまたはそれ以上と合わせて、サブコンビネーションを形成することが出来る。

その後、各サブコンビネーションを本方法の１またはそれ以上の工程に力１けることが出来る。そうして、それぞれのサブコンビネーションを、所望の結果の１またはそれ以上を達成する条件下でインキュベート出来る。

ハイブリダイゼーション（／％イブリダイズする）および結合−一不明細側二１ま、ヌクレオチド配列の前後にこの用語が互換的に用いられている。２つのポリヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズする能力は、大部分、２つのポリヌクレオチド配列の相補性の程度に基づいており、次ぎにこれは適合した相補ヌクレオチド対の両分に基づいている。与えられた配列中に別の配列と相補なヌクレオチドがより多くなると、ハイブリダイゼーションに対する条件は、ますますストリンジェントであることが出来、２つの配列の結合は、ますます特異的になるであろう。考慮すべき別の要因は、２つの鎖において相対するヌクレオチド対の性質である。あるヌクレオチド対、例えばＧとＣは、他の対に比べ、互いに対してより大きい結合親和性をもっている。高いストリンジエンシーは、温度を上げること、共溶媒の比率を増やすこと、塩濃度を下げることなどにより、達成される。

相同または実質的に同−一一一般に、同一であるが、または少なくとも同じポリヌクレオチド配列とそれぞれハイブリダイズできる２つのポリヌクレオチド配列は、相同である。２つの配列は、各配列が、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）を同じとみなした上で同じまたは類似の塩基配列を少な（とも９０％、好ましくは１００％有する場合、相同または実質的に同一である。従って、リボヌクレオチドＡＳＵ、ＣおよびＧは、それぞれ、デオキシヌクレオチドｄＡ、ｄＴ、ｄＣおよびｄＧに対する類似体と見なす。相同配列は、両方ＤＮＡであるが、または一方がＤＮＡで他がＲＮＡであることが出来る。

相補−−２つの配列は、１つの配列が、逆平行センスで、即ち、各配列の３゛末端がもう一方の配列の５°末端に結合し、そして、例えば、天然塩基の中で、一方の配列のＡ、Ｔ（Ｕ）、ＧおよびＣそれぞれがもう一方の配列のＴ（Ｕ）、ＡｌＣおよびＧとそれぞれ整列する状態で、もう一方の配列と結合出来るとき、相補である。

プロッカーポリヌクレオチドーー鋳型ポリヌクレオチドの配列Ｔ３とハイブリダイズ出来、かつ好ましくは相補である配列Ｂ１を含有するポリヌクレオチドであって、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり、通常は一本鎖の合成ポリヌクレオチドである。ブロッカ−ポリヌクレオチドのハイブリダイズ可能な配列Ｂ１のヌクレオチドの数および組成は、ブロッカ−ポリヌクレオチドをハイブリダイズするのに使用される条件が過剰の無作為非特異的ハイブリダイゼーションを防ぐ程度にストリンジエンシーであるべきである。ブロッカ−ポリヌクレオチドのヌクレオチド数は、鋳型ポリヌクレオチド配列の配列Ｔ３と少なくとも同程度である。付加的なヌクレオチドを、ハイブリダイズ可能な配列Ｂ１の末端に結合させることが出来、その数は、主に費用および実用性を考慮して決められる。従って、０−１０００またはそれ以上のヌクレオチドを末端に結合させても良く、または、ブロッカ−ポリヌクレオチドを、例えば、Ｂ１をプラスミドまたはファージＤＮＡに組み込むことにより、環状にしても良い。

実際問題として、ブロッカ−ポリヌクレオチドが合成オリゴマーである場合は、短い配列、好ましくは１００以下、好ましくは５０以下、より好ましくは１〇− ４０ヌクレオチドを使用するのが望ましい。ハイブリダイズ可能な配列Ｂ１のヌクレオチド、特に、Ｂ１の５゛末端のものまたはＴ２の５°末端近くに結合するものは、相対する配列Ｔ３のヌクレオチドと強力に結合することが重要である。

このことは、様々な方法で達成出来る。好ましくは、ブロッカ−は、特に、Ｔ２の５゛末端近（にそれが結合する領域では、ＧＣ豊富であろう。例えば、配列Ｓｌ内に、少なくとも４つ、および好ましくは５つのＧおよびＣヌクレオチドを含有する５塩基配列を少なくとも１つ有するのが好ましい。それとは別に、Ｂ１配列全体またはＢ１内の１またはそれ以上のヌクレオチドが、リボヌクレオチドであるか、または非天然であっても良（、そして、置換ヌクレオチドまたはヌクレオチド模擬物（ヌクレオチドが二本鎖配列とともに組み込まれる場合、インターカレーションさせる方法で結合させたインターカレーション基、例えば、エチジウムを有するヌクレオチドなど）または脱リン酸したヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドを含んでいても良い。上記に関する重要な考察課題は、Ｂ１配列が十分に、選択的に、配列Ｔ３に結合し、それが、プライマーまたは標的ポリヌクレオチド配列に沿った、またはポリヌクレオチドＱに沿ったプライマーの結合または鎖伸長を妨げず、かつＴ２と共通部分を持たないＴ３の少な（とも部分に沿った鎖伸長を遮断または妨害しないことである。Ｔ２がＴ３と隣接していることもしばしばある。

ブロッカ−ポリヌクレオチドの３°末端は、Ｂ１の３°末端と同じであることができ、または付加的なヌクレオチドまたは置換物を含んでいて、例えば、ポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼにより触媒される鎖伸長を妨げることも出来る。

ポリヌクレオチドＱ−−ブロッカーポリヌクレオチドの５′末端に結合しているか、または別の領域として存在するかのいずれかの一本鎖ポリヌクレオチドであって、通常は合成オリゴヌクレオチド。ポリヌクレオチドＱは、ＤＮＡまたはＲＮＡ、好ましくはＤＮＡであり得、２つのヌクレオチド配列を含んで成る。かかる配列の１つ（Ｓｌ）は、もう一方の配列（Ｂ２）の３゛末端にあり、配列Ｔ２と相同である。Ｓｌの５゛末端は、Ｔ２の５゛末端が、Ｔ３の３°末端と部分的に重複するとき、配列Ｂ１の５°末端と相補である。Ｓｌを選択する主たる基準は、配列が確かである、即ち、Ｔ２と十分に相同であるということであり、それは、少なくともポリヌクレオチドＱに沿ってＤＮＡ配列をポリヌクレオチドポリメラーゼ触媒化伸長させるのに十分な程度、Ｔ２と相補な配列を含んで成るＤＮＡ配列の３゛末端に特異的に結合するだろう。配列Ｓ１のヌクレオチド数は、鋳型ポリヌクレオチド配列のＴ２配列におけるヌクレオチド数に等しい。Ｔ２配列、例えば４−１２ヌクレオチドを選択する場合、ポリヌクレオチドＱにおいて前後−列に並んだＳｌの多数のコピー、通常は２−６コピーを含んでいることが望ましい場合もある。Ｓｌのコピーが多数存在することは、必須ではないが、ある場合には２つの特定配列を持つ一本鎖ポリヌクレオチドの収率を増大出来る。Ｓｌは、長さにして５−５０ヌクレオチドであることがしばしばである。Ｓｌの５ ″末端を含んで成る配列が、１の５°末端を含んで成る配列に対して相補であることも多い。別の場合では、これらの配列は相補でない。

Ｂ２で示される、ポリヌクレオチドＱの第２のポリヌクレオチド配列は、Ｓｌの５°側にあり、かつＳｌと隣接してもまた隣接しなくても良いヌクレオチドの配列である。Ｂ２は、伸長したプライマーの３′末端に導入すべき第１の特定配列に相補であり、それにより、第１の特定配列を定めている。Ｂ２は、少なくともポリヌクレオチドブライマーの３°末端と実質的に同一または相同である配列を含有でき、および／またはそれらの相補配列に結合する場合、レセプター、例えばりプレッサー、制限酵素などに対する特異的結合部位である１またはそれ以上の配列を含有出来る。Ｂ２は、長さにして、少なくとも１０ヌクレオチド、通常は、少な（とも１５、好ましくは２０−５０デオキシヌクレオチドである。一般に、Ｂ２は、所望の第１の特定配列によって変わり、約１０ないし２０００またはそれ以上のデオキシヌクレオチドであるだろう。

ポリヌクレオチドＱが別の領域として存在する状態では、伸長したポリヌクレオチドブライマーに沿ったポリヌクレオチドＱの３゛末端の伸長を妨げることが望ましいこともある。このことは、Ｔ２の３゛末端と隣接する標的ポリヌクレオチド配列のヌクレオチドに相補でない１またはそれ以上のヌクレオチドを８１の３ °末端に付けることにより、避けることが出来る。更に、または別法として、３ °末端は、リン酸化、ジデオキシヌクレオチドまたは塩基性リポホスフェートの導入、ポリマーまたは表面への結合または鎖伸長を阻害する他の方法により、修飾できる。上記のような修飾操作は全て、該技術分野ではよく知られている。

更に、他の修飾操作も、当業者に提案されるであろう。

ポリヌクレオチドＱがブロッカ−ポリヌクレオチドの５°末端に結合している状態では、配列Ｓ１は、配列Ｂ１に隣接していてもよく、または、適宜の数の、通常は、０−１００、好ましくは０−４０、より好ましくは０−２０の適宜の数のヌクレオチドにより隔てられている。

ポリヌクレオチドＱは、更にＳｌとＢ２の間またはＢ２の末端に位！するスペーサー配列または池の配列を含有出来る。

隣接しない−−２つの配列間に少なくとも１、通常は少な（とも１０のヌクレオチドがある、隣接しない配列。

隣接するｍ−２つの配列間にヌクレオチドがない場合、隣接すると見なされる配列。

コピーーーー重鎖ポリヌクレオチドの配列に相補であるか、またはハイブリダイズできる配列とは区別されるものとして、−重鎖ポリヌクレオチド配列と同一または相同である配列。発明の背景の部で前記したシングルプライマー増幅において、−重鎖ポリデオキシヌクレオチド配列の相補配列は、ポリヌクレオチドブライマーの伸長の結果として、初期に生産され、そして、−重鎖デオキシポリヌクレオチド配列と同一かまたは相同である配列は、前記した相補配列に沿ったポリヌクレオチドブライマーの更なる伸長により連続して得られる。

プライマー伸長手段−一部なくともプライマーの３°末端または両方にハイブリダイズできる、ポリヌクレオチドポリメラーゼまたはその３°末端以外に配列を有する一重鎖鋳型ポリヌクレオチド。プライマー伸長手段は、また、酵素または他の物質に対する基質として作用できるヌクレオシドトリホスフェート類またはその類似体および、酵素活性に必要な条件、例えば、二価金属イオン（通常はマグネシウム）、ｐＨ、イオン強度、有機溶媒（ホルムアミド）等、を含んでいる。

特異的結合対のメンバー（“ｓｂｐメンバー”）−一２種の異なる分子のうち、表面上または空洞内に、一方の分子の特定の空間的かつ極性組織に特異的に結合する領域を有し、それ故に、それと相補であると定義されるもう一方の分子。特異的結合対のメンバーは、リガンドとレセプター（抗リガンド）のように表される。

これらは、抗原−抗体などの免疫学的対のメンバーであり得るか、または、オペレーター−レセプター、ヌクレアーゼ−ヌクレオチド、ビオチン−アビジン、ホルモン−ホルモンレセプター、核酸二本鎖分子、■ｇＧ−プロティンＡ、ＤＮＡ −ＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡなどであり得る。

リガンドーーそれに対するレセプターが天然に存在するか、または製造できる、い（つかの化合物。

レセプター（”抗リガンド”）−一分子の特定の空間的かつ極性の構造、例えば、エピトープまたは決定基部位、を認識できるい（っかの化合物または組成物。

例となるレセプターは、天然に生成するレセプター、例えば、チロキシン結合グロブリン、抗体類、酵素類、Ｆａｂフラグメント類、レクチン類、核酸類、リプレッサー類、防御酵素類（ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｅｎｚｙｍｅ）　、プロティンＡ１補体成分Ｃ１ｑ、ＤＮＡ結合タンパク質またはリガンド類等を含む。

小さい有機分子−一分子量１５００以下、このましくは１ｏｏないし１ｏｏｏ。

より好ましくは３００ないし６００の化合物であって、例えば、ビオチン、フルオレセイン、ロダミンおよび他の染料、テトラサイクリンおよび他のタンパク質結合分子、およびハプテン等である。小さい有機分子は、標識または支持体へのヌクレオチド配列の結合法を提供できる。

支持体または表面−一多孔性または非多孔性の水不溶性物質。支持体は、親水性であるか、または親水性となし得るものであり、無機粉末、例えば、シリカ、硫酸マグネシウムおよびアルミナ：天然ポリマー物質、特にセルロース性物質およびセルロースから誘導される物質、例えば、濾紙、クロマトグラフィー用紙等の繊維含有紙など；合成の、または修飾した天然生成ポリマー、例えば、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリ（塩化ビニル）、ポリアクリルアミド、架橋化デキストラン、アガロース、ポリアクリレートポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ（４−メチルブテン）、ポリスチレン、ポリメタクリレート、ポリ（エチレンテレフタレート）、ナイロン、ポリ（ビニルブチレート）等；それ単独で、または他の物質と共に使用されるいずれかのもの：バイオガラス、セラミック類、金属類および同種物のように利用可能なガラスを含む。天然または合成のアセンブリー、例えば、リポソーム類、リン脂質小胞類、および細胞類もまた採用出来る。

支持体または表面へのｓｂｐメンバーの結合は、通常、文献により入手出来るよく知られた技術により達成され得る。例えば、“インモビライズド・エンザイムス”、イチロー・チバタ、ハルステッド・プレス、ニューヨーク（１９７８年）およびクアトレカサス、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２４５巻、３０５９頁（１９７０年）参照。その表面は、多くの形、例えば、ストリップ状、ロッド状、ビーズおよび同種物を含む粒子状のうちのいずれか１つを有している。

標識またはリポータ−基もしくはリポータ−分子−一シグナル生成系の１メンバー。通常は、標識またはリポータ−基もしくは分子は、ポリヌクレオチドプローブまたはポリヌクレオチドブライマーにコンジュゲートまたは結合させるものであって、特異的結合反応によって検出可能な物質に結合させることにより、直接または間接的に検出され得る。間接的に検出され得る標識類は、相補なポリヌクレオチドに対するリガンドとして作用できるか、または増幅またはライゲーション用の鋳型を提供できるポリヌクレオチドブライマーまたは特定のポリヌクレオチド配列などのポリヌクレオチドを含んでいるか、または例えば、リプレッサータンパク貢、ハプテン類；抗体類：アビジンなどのレセプター類；ビオチンおよび同種物などのリガンド類に対するリガンドとして作用する。直接検出できる標識類は、同位元素性または非同位元素性、通常は、非同位元素性であって、触媒、例えば、酵素、リポザイム、ＱＢレプリカーゼなどのレプリカーゼに対する基質、プロモーター、染料、蛍光分子、化学発光体、補酵素、酵素基質、放射活性基、粒子、例えば、ラテックスまたは炭素粒子、金属ゾル、クリスタライト、リポソーム、細胞等であり得る。さらに染料、触媒または他の検出可能基および同種物で標識されてもまたはされな（でも良い。標識は、シグナル生成系の１メンバーであって、単独か、またはシグナル生成系の他のメンバーと一緒にかのいずれかで、検出可能なシグナルを産生できる。該標識は、ヌクレオチド配列に直接結合できるか、またはヌクレオチド配列に結合するｓｂｐメンバーに相補なｓｂｐメンバーに結合させることにより、それらに結合できるようになる。

／グナル生成系−−シグナル生成系は、１またはそれ以上の成分を有することができ、少な（とも１つの成分は、標識またはリポータ−基である。シグナル生成系は、試料中の標的ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド分析物の存在または量に関連するシグナルを産生ずるものである。シグナル生成系は、測定可能な／グナルを生成するに必要な全ての試薬を包含している。標識をヌクレオチド配列にコンツユゲートさせない場合、その標識は、通常、ヌクレオチド配列に、またはその部分に結合するｓｂｐメンバーの１つに相補なｓｂｐメンバーに結合させる。／グナル生成系の他の成分は、展開溶液中に含まれていることもあり、かつ、基質類、エンハンサ−類、活性化剤類、化学発光化合物類、コファクター類、阻害剤類、スカベンジャー類、金属イオン類、シグナル産生物質の結合に必要となる特異的結合物質、および同様物を含むことが出来る。シグナル生成系の他の成分は、補酵素類、酵素生成物と反応する基質類、他の酵素類および触媒類および同種物であり得る。シグナル生成系は、外部操作、例えば、電磁放射の検出、望ましくは、目視検査により検出可能なシグナルを提供するものである。

シグナル生成系は、１９９０年７月１９日に出願された米国特許出願第０７１５５５゜３２３号、これと同等の開示内容が本明細書に参照として組み込まれている、および対応するＥＰ出願０４６９７５５号に記載されている。

補助物質−一様々な補助物質を本発明の方法では頻繁に採用するであろう。例えば、緩衝液は、通常、媒質の安定剤および反応成分と同じく、媒質中に存在するであろう。しばしば、これらの添加物に加えて、アルブミンなどのタンパク質類、ホルムアミドなどの有機溶媒類、第４級アンモニウム塩類、硫酸デキストランなどのポリカチオン類、界面活性剤類、特に、非イオン性界面活性剤類、結合エンハンサ−類、例えば、ポリアルキレングリコール類または同種物が含まれ得る。

該方法の実施態様の１つは、図１に略図で記載している。配列ｓ３を含んでなるポリヌクレオチドブライマーＰは、鋳型ポリヌクレオチドＡのＴ１とハイブリダイズする。ブロッカ−ポリヌクレオチドＢの５°末端に位置する配列Ｂ１は、配列Ｔ１、Ｔ２およびＴ３を有する鋳型ポリヌクレオチドＡのＴ３とハイブリダイズする。Ｔ３の３°末端は、Ｔ２内にある。Ｔ２は、ポリヌクレオチドＱの配列Ｓ１と相同である。ポリヌクレオチドＱは、ブロッカ−ポリヌクレオチドの５゛末端に結合しており、即ち、ブロッカ−ポリヌクレオチドの５゛末端に続くヌクレオチド配列であり、配列Ｓ１およびＢ２を含有している。ｓｌの５°末端は、Ｂ１の５°末端に相補である。この例での８２は、Ｂ３と相同である。デオキシヌクレオノドトリホスフェート類およびＤＮＡポリメラーゼの存在下、かつ適切な反応条件下で、プライマーを鋳型に沿って、モしてＴ２の一部に沿ってプライマーを伸長させる。この反応条件下では、伸長したプライマーの少なくとも３゛末端は、Ｔ２の位置で鋳型から解離して、ｓｌとハイブリダイズし、そしてポリヌクレオチドＱに沿って伸長して、伸長化プライマーＤを生じる。伸長したプライマーは、配列Ｓ’２、これは、Ｂ２および、この例ではＢ３と相補である、を含有している。その二本鎖分子から解離後、ＳＳポリデオキシヌクレオチドＤが得られ、この生成物は、互いにハイブリダイズできる第１の特定配列Ｓ’２および第２の特定配列Ｓ３を含有している。

上記実施態様の変法は、図２に記載している。この場合は、デオキシヌクレオシドトリホスフェート類およびＤＮＡポリメラーゼの存在下、かつ適切な反応条件下で、プライマーを鋳型に沿って、モしてＴ２に沿って伸長させる。この反応条件下では、ポリメラーゼが、部分的にブロッカ−の５゛末端をはずし、そして、プライマーがＴ２の全長に沿って伸長する。Ｓｌの５゛末端は、Ｂｌの５°末端に相補である。部分的に伸長したプライマーは、次に、鎖を移して、Ｓｌにノゾブリダイズし、ポリヌクレオチドＱに２８って伸長して、配列Ｓ’２、これは、Ｂ２および、この例では、Ｂ３と相補である、を含有する伸長化プライマーＥを生じる。この時、Ｅは、互いにハイブリダイズできるＢ３およびＳ’２を含有している。

上記実施態様の別の変法は、図３に略図で記載している。この場合は、ポリヌクレオチドＱは、別の領域として存在する。ブロッカ−中の配列Ｂ１とポリヌクレオチドＱ中のＳｌは、相補な５°末端を持たない。ブロッカ−中の配列Ｂ１は、配列Ｔ１、Ｔ２およびＴ３を有する鋳型ポリヌクレオチドＡのＴ３に相補である。

Ｔ３の３°末端は、Ｔ２と隣接しており、その両方がＴ１の５°側にあって、Ｔ１と隣接していない。デオキシヌクレオシドトリホスフェート類およびＤＮＡポリメラーゼの存在下、および適切な反応条件下で、プライマーはＴ１と／ゾブリダイズし、鋳型に沿って、そしてＴ２の少な（とも一部に沿って伸長する。この反応条件下では、部分的に伸長したプライマーは、鎖を移して、Ｓｌにハイブリダイズし、そして、ポリヌクレオチドＱに沿って伸長して、Ｂ２と相補である配列Ｓ’２を含有する伸長化プライマーＦを生じる。Ｂ２が８３と相同であるように設計されているとき、Ｓ’２は、Ｂ３とも相補である。このとき、Ｆは、互いにハイブリダイズできる特定配列Ｓ３およびＳ’２を含有している。上記方法の変法では、ポリヌクレオチドＱは、ブロッカ−ポリヌクレオチドＢを含んでなるより大きいポリヌクレオチドの５゛部である。伸長しているプライマーは、図１で示したように、鎖を移す前に、Ｔ２の少な（とも一部に沿って伸長する。　本発明の別の実施態様は、図４に記載している。この実施態様では、鋳型ポリヌクレオチドＡの配列Ｔ２は、配列Ｔ３に隣接していない。また、ポリヌクレオチドＱにおいて配列Ｓ１とＢ１の５°末端は、相補でない。適切な反応条件下では、プライマーは、鎖を移して３１とハイブリダイズし、ポリヌクレオチドＱに沿って伸長して伸長化プライマーＧを生成する前に、鋳型に沿って、そして、Ｔ２の少な（とも一部に沿って伸長する。上記手法の変法では、ポリヌクレオチドＱは、ブロッカ−ポリヌクレオチドとは結合していない、別の領域として存在出来る。

本発明の別の実施態様は、図５に記載している。この実施態様では、Ｔ２は、ポリヌクレオチドＱの８１と相同であり、Ｔ３の５°末端は、Ｔ２の５°末端の５ °側にあり、Ｔ３の３°末端はＴ２内にある。この実施態様では、ｓ１配列全体が、Ｂ１の５゛末端と相補である。プライマーは、鋳型にそって、モしてＴ３の３°末端を含んで成るＴ２の少なくとも一部に沿って伸長する。適切な反応条件下では、伸長しているプライマーは鎖を移して、Ｓｌにハイブリダイズし、ポリヌクレオチドＱに沿って伸長して、伸長化プライマーＨを生成する。ポリヌクレオチドＱは、本発明の別法の実施態様では、ブロッカ−ポリヌクレオチドとは別の領域として存在できる。

本発明の別の実施態様は、図６に示している。ポリヌクレオチドＱは、ブロッカ −ポリヌクレオチドＢとは別の領域として存在している。配列Ｔ３の５°末端は、配列Ｔ２の５°末端の５′側にある。配列Ｓ１は、Ｔ２と相同であり、Ｂ１はＴ３と相補である。適切な反応条件下では、プライマーは、Ｔ１に結合し、Ｔ２の少なくとも一部に沿って伸長する。その後、伸長したプライマーは、鎖を移して、Ｓｌとハイブリダイズし、ポリヌクレオチドＱに沿って伸長して、伸長化プライマーＪを生成する。

本発明の方法は、特定配列を含有する一重鎖ポリヌクレオチドが所望されるいかなる状況にも適用される。そのような状況は、例えば、フランキング配列をポリヌクレオチドに付けてクローニングベクターへの挿入を援助したい場合、特に、適切な制限酵素を見付けるのが困難であるような長い鎖を採用する場合である。

特定配列の導入は、突然変異誘発研究やＰＣＲおよびシングルプライマー増幅などのポリメラーゼ依存性増幅法に有用である。

本方法は、鋳型ポリヌクレオチドの配列Ｔ１および１２間に位置した標的ポリヌクレオチド配列の１またはそれ以上のコピーを形成する、上記のノングルプライマー増幅における特定の使用を見い出すものである。シングルプライマー増幅における本方法の使用は、図７に記載している。ポリデオキシヌクレオチドプライマーＰは、その３“末端に、上記図１−６のようにして生成した伸長化プライマーのＳ’２とハイブリダイズする配列（Ｂ３）を有する。Ｓ’２は、ポリヌクレオチドＱの８２と相補である。好ましくは、Ｂ３は、Ｂ２と同一の配列である。

Ｐは、標識またはリポータ−分子Ｗを含んで成ることも出来る。Ｐを、伸長化プライマーＤ（図１）、Ｅ（図２）、Ｆ（図３）、Ｇ（図４）、Ｈ（図５）またはＪ（図６）とハイブリダイズさせ、そしてそれに沿って伸長させ、その後、その二本鎖から解離して、配列Ｓ３およびＳ’２、ここで８３はＳ’２に相補である、を含んで成る伸長化プライマーＫを生成する。伸長化プライマーＫを、その二本鎖から解離し、Ｐが、Ｓ’２とハイブリダイズして、その伸長化プライマーやＤ、Ｅ、ＦＳＧＳＨまたはＪに沿って伸長し、それぞれＫｌおよびＫが得られる。ＫｌはＫに相補である。二本鎖を解離し、Ｐをに１およびＫとハイブリダイズさせ、それに沿って伸長させるとに１およびに２が得られる。更にこれを繰り返すと、Ｋ１およびに２の多数のコピーを生じ、これらは、標識Ｗを持っているので検出できる。

本方法を標的ポリヌクレオチド配列の複製に適用するときは、上記実施態様の１つを利用し、そして下記段階を少なくとも１回繰り返す：　（ａ）ポリヌクレオチドブライマーを伸長したプライマーとハイブリダイズさせ、そのプライマーに沿って伸長させて、伸長したプライマーを含んでなる第２の二本鎖を形成する、そして（ｂ）伸長したプライマーを第２の二本鎖から解離する。通常ならば、この工程を、少なくとも３回繰り返すであろう。好ましくは、ポリヌクレオチドプライマーは、Ｂ２と相補な配列とハイブリダイズできる、少な（とも１５デオキシヌクレオチドの配列Ｓ３を含有している。好ましくは、Ｔ１およびＢ２は、それぞれ、１０から１００ヌクレオチドを含有している。

この方法は、標的ポリヌクレオチド配列がＤＮＡまたはＲＮＡである場合に適用される。−態様では、ポリヌクレオチドプライマーをリポータ−分子で標識する。リポータ−分子は、検出可能基または結合剤、例えば、ビオチンまたはＢ２と相補な配列とハイブリダイズする配列以外のヌクレオチド配列などであり得る。

伸長したプライマーは、プローブと共有結合したリポータ−分子により検出できる。プローブは、普通、Ｔ１とＴ２の間の標的ヌクレオチド配列の一部に相同または相補なヌクレオチド配列を有するであろう。

本発明の他の実施態様は、ポリヌクレオチド分析物を含有する懸濁媒質中、鋳型配列を含んで成るポリヌクレオチド分析物の存在を検出する方法に関する。鋳型配列は、３つの配列Ｔ１、Ｔ２およびＴ３、ここで、Ｔ１はＴ２およびＴ３と隣接しておらず、Ｔ２およびＴ３の３゛側にあり、Ｔ３の５°末端は、Ｔ２の５゛末端の５゛側にある、を有する。媒質を、その３°末端がＴ１とハイブリダイズできるポリヌクレオチドプライマーと合わせる。Ｔ３とハイブリダイズできる配列Ｂ１を有するブロッカ−ポリヌクレオチドも含まれている。配列Ｓ１およびＢ２を有するポリヌクレオチドＱは、ブロッカ−ポリヌクレオチドの５′末端に結合しているか、または別の領域として存在している。Ｓｌは、Ｂ２の３′末端にあり、Ｔ２と相同である。Ｂ２は、少なくともブライマーポリヌクレオチドの３゜末端に相同である。デオキシヌクレオシドトリホスフェート類および１またはそれ以上のポリデオキシヌクレオチドボリメラーゼを採用する。条件は、（Ａ）ブロッカ−を鋳型配列にハイブリダイズさせ、（Ｂ）プライマーを鋳型配列にハイブリダイズさせ、それに沿って、モしてＴ２の少なくとも一部に沿って、その後、ポリヌクレオチドＱに沿って伸長させて、二本鎖を形成させ、（Ｃ）その伸長したプライマーを二本鎖から解離し、そして（Ｄ）プライマーを伸長したプライマーにハイブリダイズさせて、それに沿って伸長させ、伸長したプライマーを含んで成る二本鎖を形成し、そして工程（Ｃ）および（Ｄ）が繰り返されるように、選択する。その後、ポリヌクレオチド分析物の存在を指示するものである、伸長したプライマーの存在について、試験を行う。工程（Ｃ）および（Ｄ）は、少なくとも１回、好ましくは少なくとも１０回繰り返すが；通常は、繰り返す回数が６０回以下であるのが好ましい。一般に、工程（Ｃ）および（Ｄ）は、ポリヌクレオチド分析物の正確な検出を提供するに充分な回数繰り返す。ポリヌクレオチド分析物が、ＲＮＡである場合は、まずプライマーと逆転写酵素、または少な（とも工程Ｂで使用した逆転写酵素になり得るポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼにより、ＤＮＡに転換できる。

適切な反応条件が、プライマーを用いる一重鎖ポリデオキシヌクレオチド形成法および、所望ならば増幅法を実行するために選択される。下記の説明は、そのような適切な条件を記載したものであり、当業者により、任意の特定適用のために選択される特定の試薬およびその他の分子に応じて修飾を受けるものである。

一般に、水性媒質が採用される。池の極性共存溶媒類を媒質中に採用することもでき、普通は、１−６の炭素原子、より普通には１−４の炭素原子の酸素化有機溶媒であり、アルコール類、エーテル類および同種物を含む。普通、これらの共存溶媒類は、約７０重量パーセント以下、多くの場合約３０重量パーセント以下で存在している。

媒質のｐＨは、普通、約５．５ないし１０の範囲、より普通には、約６．５−９゜５の範囲、好ましくは、約７−９の範囲である。ｐＨと温度は、場合により、選択および変えて、内部でハイブリダイズした幾つかの配列の解離、鋳型ポリヌクレオチドおよびプライマーが伸長すれば、その伸長したプライマーとプライマーとのハイブリダイゼーション、配列Ｔ２の部分または全部を含むがＴ２を越えない鋳型に沿ったプライマーの伸長、部分的に伸長したプライマーの鋳型ポリヌクレオチドからの解離と部分的に伸長したプライマーのポリヌクレオチドＱへのハイブリダイゼーシヨン、および伸長したプライマーのその二本鎖からの解離を、同時にか、または全体的または部分的に連続するかのいずれかで起こるようにする。ある場合には、上記工程を全体的にまたは部分的に連続して、または同時に実施することを所望するかどうかによって、これらの工程の速度、効率および特異性を最大にするようなんらかの処理がなされるであろう。様々な緩衝液を使用して、所望のｐＨを達成し、測定中そのｐＨを維持することができる。その例となる緩衝液は、ボレート、ホスフェート、カーボネート、トリス、バルビツールおよび同等物を含む。採用した特定の緩衝液が、本発明に不可欠というわけではないが、個々の方法においては、１つの緩衝液が他のものよりも好ましいことがある。

この方法を実施する場合、通常は、穏やかな温度を採用する。上記のように、適切な反応条件を選択して、配列Ｔ２上での鋳型に沿ったプライマーの伸長を達成する一方で、伸長しているプライマーが鋳型Ｔ２の５°側領域内へ伸長するのを最小限にし、その後、鋳型からポリヌクレオチドＱへと伸長しているプライマーの鎖を移す。これらの反応条件は、例えば、塩濃度および媒質のｐＨ，使用した媒質の溶媒組成、標的ポリヌクレオチド配列の長さ、および配列ｓ１およびＢ１の長さおよびヌクレオチド組成、およびプライマーの長さおよびヌクレオチド組成などの多（の考慮課題によって、変わるものである。プライマー伸長の温度は、ポリメラーゼの活性に依存しており、５℃から９０℃、通常は、２５℃ないし８０℃、多くは４０℃ないし７０℃の範囲で変化できる。鎖の移し換え（ｓｔｒａｎｄ　ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）は、伸長したプライマーが鋳型ポリヌクレオチドからはずれる融解工程、それが５１にハイブリダイズするハイブリダイゼーション工程を含んでなることができる。融解工程温度は、通常４５℃ないし１００℃ であり、多くの場合は、７０℃ないし９８℃である。ハイブリダイゼーション工程温度は、通常２５℃ないし８０℃であり、多くの場合は、３５℃ないし７０℃ である。鎖の移し換えは、鎖の移し換えの温度が通常３５℃ないし９０”Ｃ１このましくは４５℃ないし８０℃、多（は５ｏ℃ないし７５℃であれば、融解工程なしでも起こり得る。

通常には、本発明の方法を増幅を兼ねて実施する場合、媒質を２つまたは３つの温度間で循環させる。増幅を兼ねた本方法の温度は、一般に、約１０℃から１０５℃、多くの場合は約４０℃から９９℃、好ましくは５０℃ないし９８℃の範囲である。本発明自体の方法の場合では、利用する温度は、塩濃度、ｐＨ，使用した溶媒、標的ポリヌクレオチド配列の長さおよび配列Ｓ１およびＢ２の長さ、標的および／または鋳型ポリヌクレオチド配列のヌクレオチド組成およびプライマーのヌクレオチド組成によって変化し得る。伸長工程には、約３０℃から６５℃ の比較的低温を採用でき、一方、変性およびハイブリダイゼーションは、約５０ ℃から１０５℃の温度で実施できる。

ある状況では、鋳型ポリヌクレオチドの変性が完了した後のみに、ハイブリダイゼーシヨンおよび伸長を引き起こさせるのが望ましい。これは、複製の正確さくｆｉｄｅｌｉｔｙ）を増大するという利点を持っており、鋳型を、通常は予め加熱されているポリメラーゼおよび／またはヌクレオチドトリホスフェート類と合わせる前に、予め少なくとも８０℃、好ましくは９０℃−１００℃に加熱してお（ことにより、達成できる。

本方法を１またはそれ以上のプライマーを使用するポリヌクレオチド配列の増幅に利用する場合は、この方法を伸長したプライマーまたはそれらと相補な配列の所望数のコピーを得るのに充分な時間行う。これもまた、増幅を実施する目的、例えば、ポリヌクレオチド分析物のアッセイ等、に依存する。一般に、この方法の実施期間は、１サイクル当たり約２０秒から１０分であり、１回から多（て２００回またはそれ以上の数回のサイクルを使用でき、通常は、５ないし８０回、多くの場合１０−６０回である。便宜上、通常は、各サイクルの期間および回数を最小にすることが望ましい。一般に、所定程度に増幅させるための期間は、例えば、ポリヌクレオチドポリメラーゼを飽和するに充分なヌクレオシドトリホスフェート類の濃度を選択すること、およびポリヌクレオチドポリメラーゼおよびポリヌクレオチドプライマーの濃度を増加することにより短縮できる。一般に、本方法の実施期間は、約５から２００分である。便宜上、通常は、期間を最小にするのが望ましい。上記条件は、前記のポリヌクレオチド分析物から鋳型ポリヌクレオチド配列を形成するために選択することもできる。

鋳型ポリヌクレオチドの量は、試料中１または２分子程度の低さであるが、一般に、試料容量、１マイクロリツトル以下、通常は１−１０００μｌ、多くの場合は５−２５０μｍ中約１０２から１０１４分子、多くの場合は、１０３から１０＠分子の間で変えることができる。ポリヌクレオチドブライマーの量は、少なくとも所望のコピー数と同程度に多くあるべきであり、通常は、少なくとも１０− ’Ｍ、好ましくは１０”Ｍ、より好ましくは少なくとも約１０−６Ｍで存在する。好ましくは、ポリヌクレオチドプライマー濃度は、−重鎖ポリヌクレオチド濃度よりも実質的に過剰であり、好ましくは少な（とも１００倍である。

媒質中のデオキシヌクレオシドトリホスフェート類濃度は、広範囲に変えることができ、好ましくは、これらの試薬は、過剰量で存在する。デオキシヌクレオノドトリホスフェート類は、通常、１０−’ないし１０”Ｍ、好ましくは１０″６ないし１０−’Ｍで存在する。

ブロッカ−ポリヌクレオチドの濃度は、通常、少なくとも鋳型ポリヌクレオチドと同程度に高いが、好ましくは少なくとも１０−＠Ｍ、通常は、１ｏ−７ないし１０−”Ｍである。ポリヌクレオチドＱは、ブロッカ−に結合させない場合、好ましくは少なくとも１０−’Ｍ、通常は、少なくとも１０−’Ｍ、最も好ましくは少なくとも１０−’Ｍである。

鋳型依存性ポリヌクレオチドポリメラーゼ類の濃度は、通常、経験的に決められる。好ましくは、濃度を増大しても増幅時間を５倍以上、好ましくは２倍以上低減させない程度に充分な濃度を使用する。主要な限定要因は、試薬の費用である。

試薬の組み合わせを作るための様々な試薬を合わせる順序は、変えることができる。一般に、鋳型ポリヌクレオチドは、有機体または細胞由来の、または分子生物学技術により製造される人口構築物由来の遺伝物質、ＤＮＡまたはＲＮＡがら得られる。一般に、鋳型ポリヌクレオチド、プライマー、ポリヌクレオチドＱおよびブロッカ−ポリヌクレオチドを、予め調製したデオキシヌクレオノドトリホスフェート類および鋳型依存性ポリデオキシヌクレオチドポリメラーゼの組み合わせと合わせる。しかしながら、これら全てを同時に添加しても良いし、また別にステップ−ワイズまたは逐次添加を採用することもできる。

試薬の濃度および添加順序と実施条件は、一般に、特定配列を有するどのような一重鎖ポリデオキシヌクレオチドをポリヌクレオチドブライマーおよび鋳型ボリヌクレオチドから創製したいかによって左右される。本方法を１またはそれ以上のプライマーを用いるポリヌクレオチド配列の増幅と併せて使用する場合、考慮すべき１つの問題は、伸長したプライマーのコピー数およびそのコピーを形成する速度および複製の正確さを最大にすることである。一般に、伸長したプライマーのコピー数を少なくとも１０２倍、好ましくは１０４倍、より好ましくは１０６倍またはそれ以上まで増大するのが好ましい。

ポリヌクレオチド分析物の検出への応用として、本発明方法を実施するに当たり、媒質、ｐＨ，温度および時間に関する考慮すべき問題は、上記のとおりである。様々な試薬の濃度は、一般に、対象のポリヌクレオチド分析物の濃度範囲によって決定されるが、一方、各試薬の最終濃度は、通常、対象の範囲よりもアッセイ感度を最大にするために経験的に決定される。アッセイにおける他の試薬類の濃度は、一般に、上記増幅方法と同じ原則にしたがって決められる。考慮すべき重要な問題は、伸長したプライマーのコピーが容易に検出でき、もし存在するならば、ポリヌクレオチド分析物の正確な測定を提供できるために、伸長したプライマーの十分なコピー数がポリヌクレオチド分析物に関して生産されることである。

伸長したプライマーのコピーは、非常に多くの方法で検出できる。例えば、本方法では、ポリヌクレオチドブライマーの分子をリガンド、小さい有機分子、ポリヌクレオチド配列、ポリペプチド、支持体、オペレーターまたは同種物などのリポータ−分子で標識できる。特定の標識またはリポータ−分子の例、およびそれらの検出は、１９９０年７月１９日に出願された米国特許出願第０７１５５５゜３２３号、これと同等の開示を参照として本明細書に組み込んである、および対応するヨーロッパ特許出願０４６９７５５号に見ることができる。別のアッセイ形式および検出形式は、１９８９年１月１９日および１９８９年８月２９日に出願された米国特許出願第０７／２９９．２８２号および０７／３９９．７９５号それぞれ、これらは本明細書に参照して組み込んである、および対応するヨーロッパ特許出願０３７９３６９号に開示されている。核酸配列を特異的に決定するいくつかの標準方法を用いてもよい。

核酸を検出する１つの方法は、核酸プローブを採用することである。かかるプローブを利用する方法の１つは、米国特許第４，８６８，１０４号に記載されており、この開示は、本明細書に参照して組み込んである。

ノブナルの検出は、利用したシグナル生成系の性質に依存している。標識またはリポータ−基が酵素である場合、シグナル生成系の追加メンバーは、酵素基賀および同等物を含むであろう。酵素反応の生成物は、好ましくは、発光生成物、または蛍光または非蛍光染料で、それらの幾つかは、分光光度計により検出でき、または他の分光測定または電気測定手段により検出できる生成物である。標識が、発光分子である場合、媒質を照射し、発光体を測定することができる。標識が、放射性基である場合、媒質をカウントし、放射能カウントを測定する。

様々な技術を採用して、本発明で利用されるポリヌクレオチドブライマー、ブロッカ−ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドＱまたは他のポリヌクレオチド配列をの調製できる。かかる配列は、生合成または化学合成により得ることができる。短い配列（約１００ヌクレオチドまで）の場合、しばしば、化学合成の方が、生合成と比べて経済的である。経済性以外にも、化学合成は、合成工程中に低分子量化合物および／または修飾ヌクレオチドまたは塩基を組み込む便利な方法を提供する。更に、化学合成は、標的ポリヌクレオチド結合配列の長さおよび領域の選択において、非常に融通がきく。ポリヌクレオチドブライマー、ブロッカ− ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドＱおよび他のポリヌクレオチド類は、市販の自動核酸合成機を使用する等の標準手段により合成できる。適切に修飾されたガラスまたは樹脂でのＤＮＡまたはＲＮＡの化学合成の結果、その表面に共有結合したＤＮＡまたはＲＮＡを得ることができる。このことは、洗浄および試料取り扱いにおいて、有利である。より長い配列の場合、Ｊ、メツンング、メソツズ・オブ・エンザイモロジ−（１９８３年）１０１巻　２０−７８頁に記載の一本鎖ＤＮＡに対するＭ１３の使用等、分子生物学において採用される標準複製法を使用できる。

標準クローニング技術に加えて、ポリメラーゼ触媒反応などのイン・ビトロ酵素法を使用することもできる。ＲＮＡを調製する場合、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼと適切なりＮＡ鋳型を使用できる。ＤＮＡの場合、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびノングルプライマー増幅が便利である。

ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド合成の他の化学的手段には、ホスホトリエステルおよびホスホジエステル法（ナラング等、メソツズ・オブ・エンザイモロジー（１９７９年）６８巻、９０頁）および支持体上の合成（ビューケイジ等、テトラヘドロン（１９８１年）レター、２２巻：１８５９−１８６２頁）、並びにホスホルアミデート技術、カルチル、Ｍ、Ｈ，等、“メソソズ・イン・エンザイモロノー”　１５４巻、２８７−３１４頁（１９８８年）および“ンンセンス・アンド・アブリケーンヨン・オブ・ＤＮＡ・アンド・ＲＮＡ”、Ｓ、Ａ、ナラング、出版、アカデミツク・プレス、ニューヨーク、１９８７年および本明細書に含まれている文献に記載の他の方法がある。

ブロッカ−ポリヌクレオチドの設計および製造は、本発明の実施に際し重要である。Ｂ１配列がグアニン（Ｇ）およびンチジン（Ｃ）に富んでいることが好ましい。比較的ＡおよびＴによって妨害されずにＧとＣが連続していることが、特に有用であり、なぜならば、それらの密な結合は、プライマー伸長中の解離と鎖の移し換えを阻害するからである。従って、ブロッカ−ポリヌクレオチドは、好ましくは少な（とも５０％のＧＣ組成、好ましくは少なくとも６０にのＧＣ組成を含有すべきである。解離を阻害するための他の技術、例えば、ポリヌクレオチドブロッカ−に、Ｔ３とハイブリダイズしたＢ１を含んで成る二本鎖にインターカレートできる、または別に結合できる１またはそれ以上の共有結合化低分子を与える等、を使用できる。非常に様々な低分子結合剤、例えば、エチジウム、アクリノウム、およびツェナジニウムイオン類、ソラリン、ダウノマイシン、マイトマイノンおよび同等物などが入手可能である。ソラリンなどの光活性低分子を使用するような場合では、照射後ブロッカ−を鋳型とハイブリダイゼーンヨンすると、低分子により吸収される光を媒質に照射することにより、さらに結合を増強できる。これらの各調製物において、低分子を塩基の適当な原子、例えば、Ｇまたはへの８位またはＣの４−アミノ基、またはＴの５−メチル基に結合させることができ、または、基をリボース炭素またはホスフェートに、例えばホスホロチオエートのアルキル化により結合させることができる。別法として、ブロッカ− をホスフェート結合の代わりに代替原子を用いて合成できる。特に、使用され得る非荷電リンカ−類は、ホスフェート類、ホスファイト類、アミド類、メチレンジオキシ基および同種物である。これらの型のオリゴヌクレオチド類似体の合成は、当該技術分野では知られている。

少なくとも１つのホスホロチオエートジエステルを含有するブロッカ−ポリヌクレオチドは、知られている技術に従って製造できる。オリゴヌクレオチド合成は、ホスホロチオエートジエステルの導入が望まれる程度に上記のとおり実行され得る。ホスホロチオエートジエステルは、例えば、商業的に入手できるジアシルジスルフィド、またはテトラエチルチウラムジスルフィドなどのチオール化剤を利用する酸化などの多（の方法で導入できる。その後、残りのヌクレオチドを導入する。ポリヌクレオチド類を含有するホスホロチオエートの別の製造方法は、ＷＯ９００８８３８、ＷＯ３９１１４８６、米国特許第４，９１０，３００、ヨーロッパ特許３１８２４５に記載されており、これらと同等の開示を本明細書に参照して組み込んである。ポリヌクレオチドを含有するホスホロチオエートの他の製造方法は、（ａ）ヤウ等、テトラヘドロン・レター（１９９０）３１　（１４）、１９５３−１９５６頁、（ｂ）プリル等、上記（１９８９）３０　（４８）、６６２１−６６２４頁、（Ｃ）カルチル等、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　５ｙａｐ、　Ｓｅｒ、　（１９８９）２１．１１９−１２０頁；　（ｄ）カルチル等、ヌクレオチド・ヌクレオチド（１９８８）８　（５−６）、１０１１−１０１４頁：　（ｅ）プリル等、ジャーナル・オブ・ノ・アメリカン・ケミカル・ソサエティー（１９８９）１１１　（６）、２３２１−２３２２頁に記載されている。

上記のように、ある場合には、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼとの反応を妨げ、または結合配列を追加するために、ポリヌクレオチドの３°末端を修飾する。通常は、３′末端上のＤＮＡテールが必要な全てのものである。しかしながら、３゜末端は、例えば、固相合成またはジデオキシヌクレオチドまたはりボヌクレオチドの導入中に非塩基性（ａｂａｓｉｃ）リボホスフェートまたは他の非天然基を３゛末端に導入し、その後、リボースを過ヨウ素酸塩で酸化し、その後、生じたジアルデヒドをホウ化水素およびアミノデキストランなどの巨大アミンで還元アミン化することにより、修飾できる。上記修飾実施の詳細は、当技術分野ではよ（知られており、ここに繰り返すまでもない。

本発明の別の実施態様は、ポリヌクレオチドブライマーから、２つの異なる特定配列、例えば、ＰｌおよびＰ’２を有する一重鎖ポリゾオキシヌクレオチドを製造する方法に関する。鋳型ポリヌクレオチド（鋳型）は、３つの配列Ｔ１、Ｔ２およびＴ３を有するものを採用する。Ｔ１は、Ｔ２およびＴ３と隣接せず、Ｔ２およびＴ３の３′側にある。Ｔ３の３°末端１ま、Ｔ２と隣接しているか、またはＴ２外にある。この方法は、その３°末端がＴ１とｔｚ４ブリダイズするポリヌクレオチドプライマーＰ１を利用する。ブロッカ−ポリヌクレオチドも採用し、これは、Ｔ３とハイブリダイズできる配列Ｂ１を有している。ポリヌクレオチドＱは、配列Ｓ１およびＳｌを有しており、ブロッカ−ポリヌクレオチドの５′ 末端に結合しているか、または別の領域として存在するかのいずれかである。５ｉｆｔ、Ｓｌの３゛側にあり、Ｔ２と相同である。Ｓｌは、第２のポリデオキシヌクレオチドプライマーＰ２と相補である配列Ｐ’２のような、Ｐｌとは異なる配列と相補な配列である。この組み合わせを、プライマーＰ１を鋳型に沿って、モしてＴ２の少なくとも一部に沿って、その後ポリヌクレオチドＱに沿って伸長させ、部分的に伸長したプライマーＰ１をその各自の二本鎖から解離し、部分的に伸長したプライマーＰ１をポリヌクレオチドＱに／Ｓ＜ブリダイズさせる条件にかける。

伸長したプライマーＭを、その二本鎖から解離させる。第２の一重鎖ポリデオキシヌクレオチドＮは、ポリデオキシヌクレオチドブライマーＰ２を伸長したプライマーＭの配列Ｐ’２とハイブリダイズさせ、Ｐ２をＭに沿って伸長させ、そして第２の伸長したプライマーＮをその二本鎖から解離させることにより、形成される。第２の伸長したプライマーＮは、配列Ｐ２の３°側にあり、かつプライマーＰＬにハイブリダイズできる配列Ｐ’ｌを有することを特徴とする。その後、得られた２つの一重鎖ポリヌクレオチドＭおよびＮ（完全に伸長したプライマーＰ１およびＰ２）をポリメラーゼ連鎖反応、例えば、米国特許第５．００８．１８２号、第４．９６５．１８８号、４．８００．１５９号、４，６８３，１９５号、４゜６８３．２０２号に記載されており、それらと同等の開示を本明細書に参照して組み込んである、により増幅できる。ＰＣＲ増幅を含む本発明のこの態様を達成するための条件および試薬は、上記の本発明に従うプライマーの伸長の場合と同様である。プライマーＰ２をＭのＰ’２にハイブリダイズし、Ｍに沿って伸長させ、プライマーＰ１をＮのＰ’ｌにハイブリダイズし、Ｎに沿って伸長させる。

伸長したプライマーは、それら各自の二本鎖から解離し、それぞれがＰＣＲ増幅における他のプライマーに対する鋳型として働くことを特徴とする。

便利なことに、本発明に使用される所定量の試薬は、組み合わせてパッケージ化したキットの形で提供することができる。本発明の、特定配列を有する一重鎖ポリヌクレオチド形成方法に使用する場合、キットは、ポリヌクレオチドブライマー、ブロッカ−ポリヌクレオチドおよびブロッカ−ポリヌクレオチドに結合できるか、または結合しないポリヌクレオチドＱを含んで成る。これらの構成成分は、別々の試薬として提供しても良いし、また組み合わせてもよいが、好ましくは組み合わせる。試料中のポリヌクレオチド分析物をアッセイする場合、本方法に有用なキットは、他の試薬類と組み合わせてパッケージ化される中に、（ａ）ポリヌクレオチド分析物から、配列Ｔ１、Ｔ２およびＴ３、ここでＴ１は、Ｔ２およびＴ３の３゛側にあり、Ｔ３は、Ｔ２の少なくとも一部を含んで成る、を有する鋳型ポリヌクレオチド配列を得るための試薬、ここでそのような試薬は、例えば、制限酵素である場合もある、（ｂ）その３°末端に鋳型ポリヌクレオチド配列中の第１配列Ｔ１とハイブリダイズできる配列を有する、少なくとも１つの標識化または非標識化プライマー、（Ｃ）＃を型ポリヌクレオチド中の配列Ｔ３とハイブリダイズできる配列Ｂ１を有するブロッカ−ポリヌクレオチド、および（ｄ）配列Ｓ１およびＳｌ、ここでＳｌはＳｌの３′側にあり、かつ鋳型ポリヌクレオチド中のＴ２と相同であって、Ｓｌは、少なくともプライマーの３°末端部と相同である、を有するポリヌクレオチドＱ１ここで、ポリヌクレオチドＱは、ブロッカ−ポリヌクレオチドの５゛末端に結合しているか、または別の領域として存在するかのいずれかである、を含んで成る。

キットは、更に、鋳型ポリヌクレオチド配列または本発明方法において製造される伸長したプライマーに結合できる標識化または非標識化ポリヌクレオチドプローブを含む。上記キットは、更に、組み合わせてノ（・ソケージ化される２喜こ、例えば、デオキシアノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）　、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）　、デオキシシチジントリホスフエート（ｄＣＴＰ）およびデオキシチミンントリホスフエート（ｄＴＴＰ）または上記の誘導体または類似体などのデオキ／ヌクレオ／ドトリホスフエート類（ｄＮＴＰｓ）を含むことができる。キットは、更にポリデオキソヌクレオチドポリメラーゼおよびシグナル生成系のメンバー、また様々な緩衝媒質を含むこともでき、それらの幾つかは、上記試薬類の１またはそれ以上を含有することもある。

本発明の別の実施態様では、ポリヌクレオチドＱは、配列Ｓ１およびＳｌ、ここでＳｌは、Ｓｌの３゛側にあり、かつ鋳型ポリヌクレオチド中のＴ２と相同であって、Ｓｌは、第２のプライマーの少なくとも３°末端部に相同である。この後者のキットは、例えば、ＰＣＲ増幅に使用される。

本方法中に生じる必要があり、かつ更に本方法を使用する全てのアツセイの感度を実質的に最大にする必要のある、反応を最適化する試薬の濃度をｔｉｔｌにするために、キット中の様々な試薬類の相対量を広範に変えること力（できる。適切な環境下、キット中の１つまたはそれ以上の試薬は、賦形剤を含む乾燥粉末状、通常は凍結乾燥したもの、として提供することができ、それ（ま溶解すると、本発明暑こ従う方法またはアッセイを実施するのに適切な１度を有する試薬溶液を提供するであろう。各試薬は、別々の容器中に〕々ソケージ化でき、また交差反応性および貯蔵寿命が許せば、いくつかの試薬を合わせて１つの容器１こ入れることもできる。

実施例本発明を、更に下記の例示説明の実施例により示す。温度は、セ氏度（”Ｃ）であり、部およびパーセントは、特記しないかぎり、重量によるものである。

実施例１ステム・ループ構造を有する一重鎖ボリヌクレオチドの合成Ｌ−１貯が！粘生仁１五址Ｖ」リヱと：」灯山に伸長プライマーおよび３２Ｐ伸長プライマー）；Ｌコ１町亙り對」飢旦虹三誌二辻射丸匹且在ヱとおよび３２Ｐ−ＧＣブロッカ−）：オリゴマー２（４０量体）！！　’　４ＣＧ４ｅ−Ｃ１ｆｆｉＣ−ＴＴＣ−Ｇｅｒ−＆？Ｔ−Ａｃｅ−ＣＣＡａ−ＧＧＣ４Ｍ−ｍ＋ｃａｏ＋＾−３９（配列番号２）Ｌコ鼻町亙６．　Ｕ尖旦五眩三ユニ代挺丸己互在」ヒおよび３２Ｐ−ＡＢブロッカ−）鋳型ポリヌクレオチド・ＢａｍＨＩ消化したＭ１３ｍｐ７またはファージＤＮＡ（ベサスダ・１ノサーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ）　、ゲイゼアノく−グ、ＭＤ）　、ここでＭ１３ｍｐ７１ｉ、製造元のプロトコールに従い、ファルマンア社のＭ１３＋ａｐ１９　ＲＦ力１らＢａｍＨＩ　（ＢＲＬ）で消化した。

池の試薬類・１０×ヴエント緩衝液（１００ｍＭ　ＫＣＬ、２００ｍＭト’ノスーＨＣＩ、２５℃でｐＨ８，８，１００ｍＭ　［ＮＨ４コ、ＳＯ２，２０ｍＭＭｇ　Ｓ　Ｏａ、１％ト１ノトンＸ−１００）、ヴエントポリメラーゼにューイングランド・ノくイオラボラト１Ｊ−ズ、ビバリー、ＭＡ）；デオキシアデノシントリホスフェート（ｄＡＴＰ）　、デオキシグアノシントリホスフェート（ｄＧＴＰ）　、デオキシシチジントリホスフェート（ｄＣＴＰ）およびデオキシチミジントリホスフェート（ｄＴＴＰ）（本明細書ではｄＮＴＰｓと表す）；Ｈ，Ｏ０方法：オリゴマ−１，２および３をバイオリサーチＤＮＡ合成機（ミリボア・コーポレイション、ベットホード、ＭＡ）を用いて、製造元のプロトコールに従うホスホルアミダイト法により合成し、標準操作に従うポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。濃度は、吸光度２６０ｎ−で測定した。オリゴマー類は、５゜末端をガンマ−５ｚｐ−アデニントリホスフェート（ＡＴＰ）を用いてポリヌクレオチドキナーゼにより標識した。典型的には、オリゴマーの５ピコモルをガンマ−３”Ｐ−ＡＴＰの５０ピコモルおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ５単位と共に３７℃で１時間インキュベートした。未反応のトリホスフェートは、反応混合物をブツシュカラム（ストラタジーン・インコーホレイテッド、ＮｕｃＴｒａｐの登録商標で販売されている）に通して、除去した。

酵素を除く試薬類を、表１に示したように、番号１−１１で印をつけたエツペンドルフチューブに加えた（μｍ）。

表Ｉ上記反応混合物を７２℃で２分間加熱し、その後、室温まで冷ます。表Ｉに従い、酵素をチューブに加えた後、反応混合物を６５℃で１５分間インキュベートした。０．５Ｍエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）溶液２μｌを加えて反応を止め、各チューブからの反応混合物２ａｌをホルムアミド染料混合物１（９０％ホルムアミド、０．２％ブロモフェノールブルー（ＢＢ）、０．２％キシレンシアツール（Ｘ　Ｃ））　４　ｇｌと混合して、９０℃で２分間加熱し、その後、氷で冷ます。

ホルムアミド染料混合物６ミクロライトを０．５×トリス−ボレート−ＥＤＴＡ（４５ｍＭトリス−ボレート（トリス−ＨＣｌとホウ酸から製造）／２ｍＭＥＤＴＡ）（ＴＢＥ）緩衝液中１０％ポリアクリルアミド、８Ｍウレアゲル上に流し、Ｘ線フィルムにさらして可視化することにより、反応生成物を評価し、図８にその写真複写物を示し、詳細は下記に記載する。生成物の収率は、バンドを切り取り、生成物毎にカウントを定量することにより、測定した。

結果と考察：上記反応は、隣接しないで、互いにハイブリダイズ可能である、即ちステム・ループ構造に相当する、２つの配列を有する一重鎖ポリヌクレオチドを形成する本発明の方法を示すために行った。この方法は、ステム・ループ構造を有するポリヌクレオチドを形成するため、ブロッカ−の存在下で、伸長しているプライマーが鋳型ポリヌクレオチドからポリヌクレオチドＱへ鎖を移すことを含んでいた。

従って、ポリヌクレオチドＱは、伸長しているプライマーと相同である配列Ｓ２を有していた。

上記反応を２つのブロッカ−ポリヌクレオチド・塩基６３５１ないし６３９１で鋳型Ｍ１３ｍｐ７にハイブリダイズさせたＧＣブロッカ−（オリゴマー２）および（１）その３°末端にＧＣブロッカ−中の配列と同一であり、同じ位置でＭ１３ｍｐ７に結合できる４０塩基またはヌクレオチドの配列［−５・ａ−ＧＧＣ− ＣＴＣ−ＴＴＣ−ＧＣＴ−Ａ買−ＡＣＧ−Ｃ（Ｊ弓ＣＴ（ＣへＡＡ−ＡＧＧ−ＧＧＧ−Ａ−３’　（配列番号４）］を有し、かつ（２）その５°末端に結合したポリヌクレオチドＱ［Ｓ・−−一−−２；λ１に≦ＣＣ−ｃＧＣ−＾ＣＣ−ＧＡ丁−ｃｃｃ−ｃ−コ°（配列番号５）］を有するＡＢブロッカ−（オリゴマー３）のうちの１つで、別々に行った。ポリヌクレオチドＱ内で、５゛末端の２５塩基（下線部）は、配列Ｓ２を示しており、伸長プライマー（オリゴマー１）の５ ′末端の２５塩基と同一であった。残りの１５塩基は、配列Ｓ１を示しテイタ。

Ｓ　１（７）３’末端の１０塩基［−ｘｃｃ−ａｉｔ−ｃｏｃ−ｃ−（配列番号６）］は、配列Ｔ２の３°末端と相同であり、これは、配列Ｔ３の３゛末端と隣接していた。

５Ｌ（７）５’末端の５塩基［−ｃｃ−ｃｃｃ−（配列番号７）］は、Ｔ３の３ ′末端の５塩基と相同であり、ＡＢブロッカ−の５°末端の５塩基と相補であった。

この反応条件下で、伸長プライマーは、鋳型の塩基６４４１−６４６５にハイブリダイズし、鋳型ポリヌクレオチドに沿って伸長した。上記のとおり、上記反応から得られた生成物をポリアクリルアミドゲルのＸ線フィルムで可視化し、その写真複写物を図８に示す。図８に示したレーン番号は、レーン番号１１−１２に対応するチューブ番号１０−１１以外は上記反応のチューブ番号に対応し、マーカーＤＮＡのサイズをレーン１０に示している。ブロッカ−不在の、レーン番号７では、得られた生成物は、鋳型（２２６塩基）の末端に対する伸長プライマーの伸長に相当する。ＧＣブロッカ−の存在下（レーン番号１１）では、得られた生成物の約４０％が、長さにして約１００塩基であり（伸長プライマーがブロッカ−の５゛末端近くで止まったことから生じる）、得られた生成物の別の４０％は、長さにして９８−１２８塩基の間であり（ブロッカ−がハイブリダイズした鋳型の一部に沿って、伸長プライマーが伸長したことから生じる）、そして、得られた生成物の残りは、長さにして約２２５塩基であった（ブロッカ−が鋳型から完全にはずれ、鋳型の全長にわたって伸長プライマーが伸長したことから生じる）。ＡＢブロッカ−の存在下（レーン番号１２）では、長さにして１００塩基であるような生成物は、何等得られず、他の反応では見られなかった顕著なバンドがあり、これは、長さにして１３７塩基である生成物に相当した（この反応番号１２で得られた総生成物の約６３％について計算）。この反応番号１２の生成物は、本発明に従い得られるステム・ループ構造を持つ、予定のポリヌクレオチドに相当した。

上記１３７塩基生成物が本当に本発明の方法に従って得られることを判断ず名ために、生成物をシングルプライマー増幅条件に付し、下記のとおり配列決定しパートＢ。

１３７−塩基生成物の増幅オリゴマー４（２５量体）オリゴマー５（２５量体）Ｖ−ＴＧＴ−ＴＵＴ−ＩＣＣ−ＱＴＴ−ＭＴ−ＴＣＤ−ｍ４ｋＴ４−３’　（配列番号９）伸長プライマ一番号３７６配列（５６量体）Ｓ’−Ｔ’ＱＴ−π丁− ＴＣＣ−ＱＴ？−λＧ丁−テＣｏ−ＴＴＴ−Ｔ　入Ｔ−〒Ｏｋ−ＡＡＣ−ｈｃｃ −ＭＡｋ−ｋｃｔｌ−１ｄ２Ｔ−＾f〒−＾＾＾− 買シ引に−ｆｆ−３°　（配列番号１０）オリゴマー１（上記パートＡ）他の試薬類・１０×ヴエント緩衝液、パートへの反応生成物番号１ｏおよび１１：ヴエントボリメラーゼ；　ｄ　ＮＴ　Ｐ　ｓ　：　Ｈ２Ｏ０方法オリゴマー４および５を上記の通り、ホスホノげミグイト法により合成し、標準操作のポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。試薬類を、表ＩＩに示したように、番号１−８で印をつけたエッペンドルフチューブ中に加えた（μｍ）。

表ＩＩチューブ番号５−７は、負の対照であって、上記パートＡの反応番号１０を敷部含有していた。これらは、ソングルプライマー増幅により増幅可能なりＮＡを有していないと予想していた。チューブ番号４は、プライマーを含有していないので負の対照であった。チューブ番号８は、正の対照であって、ＨｚＯ（８３ｊｌ）、１０×ヴエント緩衝液（１０１１１）、伸長プライマ一番号３７６　Ｌｏｊｎ（ｂ＋１）、ンングルプライマー２（オリゴマー５Ｘ１ｇｌＸ１００μｌＭ）、１０ｍＭｄＮＴＰ’ｓ（２μｍ）　、Ｍｌ　３＋ａｐｌ　９鋳型（１ｊ１、約６Ｘ１０’モル含有している）およびヴエントＤＮＡポリメラーゼ（２ｎｌ）を含有していた。酵素を加える前に、チューブ番号８中の反応混合物を９５℃まで５分間加熱し、２０分間室温で冷ました。その後、９０℃で３０秒間、５５℃で６０秒間そして７２℃で９０秒間の温度循環を、プログラム可能な熱循環器（ツインブロックＥＺサイクラ−、エリコンブ・インコーホレイテッド、サン・ディエゴ、ＣＡ）を用いて、３種の温度により、計６０サイクル行った。試料１０μ ｌを、０サイクル（ヴエントＤＮＡポリメラーゼ添加前）、３０サイクルおよび６０サイクルで幾つかの反応混合物から抜き取り、２μｌの６×ホルムアミド染料混合物２（水中１５％ＦＩＣＯＬＬ４００．０２５％ＢＢ、０．２５％ＸＣ染料）と共に混合した。そうして、例えば、チューブ番号１を図９のレーン１．２および３に対応する０、３０そして６０サイクルにそれぞれ付した。

反応生成物は、上記試料合計１２ミクロリツトルを、１％アガロース、３％ヌノーヴ（ＦＭＣバイオプロダクツ、ロックフォード、ＭＥ）アガロースゲル上で１ｘＴＢＥｖ＆ｌｉ液（９０１Ｍホウ素化トリス、ｐＨ８，３，４ｍＭＥＤＴＡ）中バイオマーカー（バイオパンチャーズ・インコーホレイテッド、マーフリースポロ、ＴＮ）５μｌの側に沿って流し、そしてゲルを０５μｇ／＋ｍｌのエチジウムブロマイド溶液で染色することにより可視化して、評価した。

結果と考察上記ゲルの写真複写物（図９）に見られるように、反応番号１（レーン番号１− ３、ただしレーン１は０サイクルを表す）により、３０サイクル（レーン番号２）後、長さ１３０−１４０塩基の生成物（シングルプライマー増幅生成物として表される）を得、６０サイクル（レーン番号３）後ではかなりの量で存在していた。レーン番号１０−１２．１４−１６．１７−１９および２０−２２にそれぞれ対応する反応番号４−７では、それぞれレーン番号４−７に見られるように、増幅された生成物を何等得られず、レーン番号２３−２５に対応する反応番号８ては、予セどおり、またレーン番号８に見られるように、長さ約１８３塩基の増幅された生成物を得た。レーン番号１３および２６は、分子量マーカーである。

レーン番号４−６（チューブ番号２）および７−９（チューブ番号３）は、結果として明らかにＳＰＡ阻害を示した。長さ１３０−１４０塩基の生成物の７ングルプライマーによる増幅は、この生成物が、内部塩基対構造またはステム・ループ構造を有しており、本発明に従う場合にのみ形成され得ることを示していた。

次に、上記／ングルプライマー増幅生成物を精製し、下記のとおり配列決定した。

上記のシングルプライマー増幅反応混合物６０μｍを上記６×ホルムアミド染料混合物２の５ａｌと混合し、この試料５５ｐ１をロードし、４０■Ｍトリスーアセテート（トリス−ＨＣＬ！：酢酸から作成）　、２ｍＭＥＤＴＡＳｐＨ８，Ｏ（ＴＡＥ）緩衝液中の３％ＮｕＳｉｅｖｅ　ＧＴＧアガロースゲル（ＦＭＣバイオプロダクツ）上で流し、エチジウムブロマイドでの染色により可視化した。適切なバンドを削り取り、２つの１．５１１エツペンドルフチユーブに入れて、アガロースゲル由来の低分子量またはオリゴマーＤＮＡを除去するためにマーメイドキット（バイオ１ｏ１）を用い、製造元の使用説明書に従って精製した。精製したＤＮＡを１４μＩＨ，Ｏに墾濁した。

精製ＤＮＡの配列決定・　オリゴヌクレオチドプライマ一番号１０　：　ｌ’− ｏｏＣ−費Ｃ−爬い冗Ｃ−（９）−ＡＪＩＡ−ＣＣＡ−０６Ｃ−Ａ−３°（配列番号１１）を“シーケナーゼキット（ユナイテソド・スティッ・バイオケミカル・コーポレイション）と共に使用して、上記の精製した生成物の一部を配列決定した。配列決定により、Ｍ１３＋ｏｐ７標的ポリヌクレオチドの予想した領域に由来する増幅化ＤＮＡとしての生成物の同一性を証明した。

オリゴマー６（２５量体）ｓ’−ａｃｅ−ｃｃ丁−丁Ｇ＾−丁入入−丁Ｃ＾−Ｇ＾＾−人＾ａ−ｃｃｃ−ｃ −３１（配列番号１２）ポリヌクレオチドＱ（下線部）が結合したブロッカ−ポリヌクレオチド（複合ブロッカ−）：１０×ヴエント緩衝液（１００マイクロリツトル、２０ｍＭトリスＨＣＩ、ｐＨ８，８，１００ｍＭＫＣｌ、１１００Ｉ　（ＮＨ４）ｘｓＯ４，２０醜ＭＭｇＳＯ４および１％トリトンＸ−１００を含有する）２０ｓＭｄＮＴＰ　（１０フイクロリツトル）、１０−４Ｍプライマー（１０マイクロリツトル）、１０”Ｍブロッカ−（１０マイクロリツトル）およびＨ２Ｏ（６７０マイクロリツトル）を合わせて計８００マイクロリットルにすることにより、調製された。

鋳型ポリヌクレオチド直鎖状の一本鎖（ｓ、ｓ）　Ｍｌ　３ｍｐ７および二本鎖（ｄ、ｓ）　Ｍｌ　３＋ｐ１９方法：オリゴマ−６および７を上記参照のホスホルアミダイト法により合成し、標準操作に従う変性ポリアクリルアミドゲルで精製した。ポリヌクレオチドＱは、オリゴマー７の５′末端の４０塩基［５・−−−−−−−−ＣＣ−Ｗ−ｋＣＣ４＾Ｔ４Ｘ：＜−（配列番号１４）］であって、オリゴマー７の３゛末端の４０塩基［（４弱−ｃｅｒ−ご−国Ｃ−丁為τ−τ＾Ｃ−ＧＣＣ−廠−π針国＾−店噛→＾ −３１（配列番号１５）］である］ブロッカーポリヌクレオチの５°末端に結合させた。

ポリヌクレオチドＱの中で、５゛末端の２５塩基（下線部）を配列Ｓ２とし、ただしこれは、ポリデオキシヌクレオチドブライマーオリゴマー６と同一であって、そしてポリヌクレオチドＱの３°末端の残り１５塩基を配列Ｓ１とし、ここで、Ｓｌの５°末端は、ブロッカ−ポリヌクレオチドの５゛末端の５塩基と相補な５塩基［−ｃｃ−ｃｃｃ−（配列番号１６）コから成り、Ｓｌの３°末端は、鋳型ポリヌクレオチドの塩基６３９１−６４００と相同である１０塩基［−＾ｃｃ −ｅｘｔ−ｃｏｃ−ｃ−（配列番号１７）コから成る。複合ブロッカ−（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　Ｂｌｏｃｋｅｒ）は、塩基６３５１−６３９０でＭ１３ｍｐ７にハイブリダイズできた。本発明に従うポリヌクレオチドブライマーの伸長により、分子内塩基対構造またはステム・ループ構造を有する増幅可能なポリヌクレオチド配列を創製した。ポリヌクレオチドプライマーは、塩基６８０６−６８３０でＭ１３ｍｐ７とハイブリダイズした。

このようなステム・ループ分子の形成および増幅を、一本鎖Ｍ１３■ｐ７およびＭ１３＋＋ｐ１９（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ社の二本鎖複製形、７２５０塩基対）を用いて実施した。いずれも、製造元の使用説明書に従いＢａｍＨＩで消化して、直鎖状にし、鋳型ポリヌクレオチドを得、そしてＭ１３■ｐ１９を更に沸騰水中で１０分間加熱することにより変性させ、次の工程を実施する前に、すぐさま氷水中に入れた。マスターミックス８０マイクロリツトルを、異なる量の鋳型ポリヌクレオチドを含有する番号１−９で印をつけたエツペンドルフチューブ（表ＩＩＩ）に加え、上記反応混合物を９４℃で４分間加熱し、１０分間室温まで冷ました。これにより、プライマーおよび伸長したブロッカ−を鋳型ポリヌクレオチドに対しアニーリングすることができた。堕ポリメラーゼ（ストラタンーン・インコーホレイテッド）を加えた（５ユニツト）。プログラム可能な熱循環器（エリコンブ・インコーホレイテッド）を用いて９０℃で３０秒、５５℃で６０秒および７２℃で９０秒の温度サイクルを３種の温度で計６０サイクル実施した。増幅の生成物は、反応媒質１５マイクロリツトルを鉤５ＸＴＢＥ緩衝液中１．２％アガロースゲル上で横側の適切な対照に沿って流し、ゲルをエチジウムブロマイドで染色して可視化することにより評価した；そのゲルの写真複写物は図１０に示している。レーン番号１−９は、チューブ番号１−９に対応しており、レーン番号１０は、正の対照としての一本鎖Ｍ１３■ｐ７であり、レーン番号１１は、正の対照としての二本鎖Ｍ１３＋ｐ１９であり、レーン番号１２は、負の対照であり、レーン番号１３は、分子量マーカーを表している。

訓１１０２一本ＭＭ１３■ｐ７２１０４一本鎖Ｍ１３叩７３１０６一本鎖Ｍ１３ｍｐ７４１０８一本鎖Ｍ１３１Ｎ１）７５　１０”二本鎖Ｍ１３ｍｐ１９６１ｏ４二本鎖Ｍ１３ｍｐ１９７１０６二本鎖Ｍ１３ｍｐ１９８１ｏ８二本鎖Ｍ１３Ｑ１９９　１ｏ二本鎖Ｍ１３ｍｐ１９パートＢ。

上記実験を、様々な濃度で鋳型ポリヌクレオチドとしての環状二本鎖（ｄ、　ｓ）Ｍ１３ｍｐ１９を用いて繰り返した。増幅生成物は、各反応混合物の１５マイクロリツトルを０．５ｘＴＢＥ緩衝液中１．２％アガロースゲル上で横側の適切な対照に沿って流し、ゲルをエチジウムブロマイドで染色して可視化することにより評価した（図１１参照、詳細は下記に記載。ここでレーン番号１および９は、分子量マーカーに対応しており、レーン番号２−５は、チューブ番号１−４に対応している。レーン６−８には、何もロードせず、レーン７は、標的を持たない負の対昭である。）。

１０００二本鎖Ｍ１３ｍｐ１９図１０および１１に示したとおり、長さ４５０塩基のポリヌクレオチド生成物の形成および増幅は、ポリヌクレオチドプライマー（オリゴマー６）が鎖を移す前に、鋳型ポリヌクレオチドに沿って複合ブロッカ−の位置まで伸長し、そして、ポリヌクレオチドＱに沿って伸長して、内部塩基対構造またはステム・ループ構造を有する伸長化プライマーを生じたことを示唆している。その後、後者の分子を既に記載したシングルプライマー増幅により増幅した。

実施例３ステム・ループ構造を有する一本鎖ポリヌクレオチドの形成における温度の影３２ｐ標識のある、またはないポリヌクレオチドプライマー（それぞれ、プライマーおよびトレーサーブライマー）・オリゴマー８（２５量体）ｓ　ｌ−Ｃ＋：Ｃ−０１２７−ＭＡ４ＡＡ−ＴＣＡ−ＯＡＡＣ−０ｌ２７−羽− Ｃ−３１（配列番号１８）３２ｐ標識のある、またはない伸長化ブロッカ−（ポリヌクレオチドＱを有する）ＢａｍＨＩ消化したＭ１３ｍｐ７−重鎖ファージＤＮＡオリゴマー８および９を上記ホスホルアミダイト法により合成し、標準操作に従うポリアクリルアミドゲル電気泳動により精製した。伸長化ブロッカ−（オリゴマー９）は、塩基６３５１−６３９０でＭ１３＋ｐ７にハイブリダイズ可能であった。ポリヌクレオチドプライマー（オリゴマー８）は、分子内塩基対またはステム・ループ構造を有する増幅可能なポリヌクレオチド配列を創製するように作用し、そして塩基６８０６−６８３０でＭ１３ｍｐ７にハイブリダイズした。酵素を除（試薬類を全て、表■に示したように番号１−６で印をつけたエツペンドルフチューブに加えた（μｍ）。

上記反応混合物を９４℃で４分間加熱し、その後、室温まで放冷した。表Ｖに従いチューブに酵素を加えた後、反応混合物を指定の温度で１５分間インキユベートシた。各チューブからの反応混合物２μｍを上記ホルムアミド染料混合物２の４μｍと混合し、９０℃で４分間加熱し、その後水中で冷ました。

反応生成物は、ホルムアミド染料ａ＝物を敷部加えたもの６マイクロリツトルを０．５ｘＴＢＥ緩衝液中、６％アクリルアミド、８Ｍ尿素ゲル上に流し、Ｘ線フィルムにさらして可視化すること、その写真複写物は図１２に示している、により評価したが、更に詳細には下記に記載している。

結果と考察ステム・ループ構造を持つポリヌクレオチドを形成する場合の鎖の移し換え（ストランド・スウィッチング）に対する温度の影響を測定するために、上記反応を実施した。反応は、伸長化ブロッカ−を用いて為された。伸長化ブロッカ−は、３°末端に鋳型とハイブリダイズできる３°末端に４０塩基を有した。伸長化ブロッカ−の５′末端の４０塩基は、ポリヌクレオチドＱを含んでいた。ポリヌクレオチドＱ内では、その５゛末端の２５塩基がプライマーと同じであった。

伸長化ブロッカ−を用いた様々な温度での上記反応から得られた生成物を、ゲルのＸ線フィルムの写真複写物（図１２）に示している。レーン２−７は、反応番号１−６に相当し、レーン１は、マーカーＤＮＡのサイズを示している。ブロッカ−反応番号１を欠く場合（レーン２）、その生成物は、鋳型の末端（５６６塩基）に対するプライマーの伸長に該当した。しかしながら、温度を上げた場合（レーン３−６）　、予想していた長さ約４８０塩基の鎖を移した生成物の量が増加した（図１２参照）。７５℃でポリメラーゼが効果的にブロッカ−オリゴマー８をはずしている場合（レーン７）、この予想した生成物の量は減少した。

オリゴマー１０（２５量体）Ｓ　−”　ＣＡＡ−ＡＡＣ−ＡＧＣ−４ＯＡ−ＡＧ＾−ａｃｏ−ｍｈ−ＡＡｔ− ｃ−ｘｌ（配列番号２０）（１００フイクロリツトル）　１０ＸＰｆｕ緩衝液ナンバー２（２００ｗｋｌｈリスーＣｔ、ｐＨｓ、８　（２５℃）　、１００ｍＭＫＣｌ、６０ｍＭ　（ＮＨ４）ｔｓｏ＜、１５ＩＩＭＭｇＣＩ、、１％トリトンＸ−１００を含有する）　、２０＋＋ＭｄＮＴＰ’ｓ　ｌｖイクロリノトル、２Ｘ１０−’Ｍオリゴマー１０の０．５マイクロリツトル、２Ｘ１０−’Ｍオリゴマー１１の０．５マイクロリツトル、２．５単位／マイクロリットル堕ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン・インコーホレイテッド）２マイクロリツトル、１０マイクロリツトルのＩＸＰｆｕ緩衝液ナンバー２中旦二１竺ゲノムＤＮＡ標的および水を合わせて最終容量１００マイクロリツトルにすることにより、調製された。

方法各１００マイクロリツトルの反応物１５種を増幅収量について試験した。反応物の２成分を変えた。Ｅ、ｌ　ゲノムＤＮＡ標的濃度は、５つの反応物の数群では、試験管あたりそれぞれ１０６．１０４．１０！、１０および０標的であった。

この５つの反応物の群を、４組（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）同じものを作成し、得られた５反応物の４組それぞれを異なる温度循環プロトコールで処理した。全ての反応物を室温で集め、その後、９６℃で５分間、６５℃で１０分間および７２℃で４分間−回循環させた。その後、５反応物の第１組を９３℃で１分間、６３℃で１分間、および７２℃で１．５分間６０回循環させた。次の３組の反応物では、最低アニーリング温度を、例えば、５反応物の第２組では６５℃、第３組では６７℃、そして第４組では６９°Ｃというように、各組毎に２℃づつ上げた。これらの温度での伸長時間は、１分を維持した。これらの実験の目的は、細菌ゲノム標的におけるＳＰＡの最適プロトコールを研究することであった。

図１３は、上記した１９のシングルプライマー増幅反応物の一部のアガロースゲル電気泳動写真複写物である。レーン１−５は、６０サイクル中最低アニ一リング温度が６３℃であった場合、１０６．１０４．１０２．１０および０標的でのノングルプライマー増幅反応物である。レーン６−１０．１１−１５および１６ −１９は、前記と同じ一連の標的数での５つの反応物の残り３組を表しているが、アニーリング温度は、それぞれ６５８Ｃ５６７℃および６９℃である。第４組の０標的反応は、示していない。サイズマーカーはレーン２０である。

結果と考察ニシングルプライマー増幅したＤＮＡ生成物の予想サイズは、図１３に示している。この図は、生成物の制限酵素消化および適切なプローブに対するハイブリダイゼーション（データは示さず）により変えられた。図１３は、最低アニーリング温度を６５℃以上に上げた場合、この一連のシングルプライマー増幅反応の感度が減少し始めたことを示している。この標的に対する最適温度は、上記プライマーとブロッカ−を組み合わせ、かつ上記の緩衝条件下では、９３℃で１分、６５ ℃で１分、そして７２℃で１．５分であると思われる。１０の標的ＤＮＡ由来の増幅を表している増幅化ＤＮＡは、レーン９にはっきりと見ることができる。

このゲル上の負の標的対照全て、即ちレーン５．１０および１５は、予想通り、何等増幅された標的を示していない。レーン２０は、サイズマーカー（リサーチ・ジェネティソクス社由来の５Ｏ−１０００ｂｐ）である。

実施例５オリゴマー１２（２５−量体）ｐＨ８，８（２５℃）　、５００ｍ１ｌＫＣ１，１５ｆｆ１ＭＭｇＣ１□、１％トリトンＸ−１００を含有する）、７５ｍＭジチオトレイトール、１０ｍＭｄＮＴＰ’ｓ　２フイクロリツトル、１１００ｕオリゴマー１２１マイクロリツトル、５ｕＭオリゴマー１３１マイクロリツトル、２．５単位／マイクロリタトルのクローン化Ｐｆｕポリメラーゼ（ストラダジーン・インコーホレイテッド）２マイクロリツトル、様々な量のＭ。

ラベルクロシスゲノムＤＮＡおよび様々な量のヒト胎盤ゲノムＤＮＡ　（シグマ）全体、および水を合わせて容量計１００マイクロリツトルにすることにより、調製された。

方吠二１５の個別の増幅反応物を、５つのチューブそれぞれにつきＭ、ラベルクロシスゲノムＤＮＡをそれぞれ約１０４．１０３．１０２．１０およびＯモル有する５つの組合せが３組あるように調製した。第１の組には、ヒトゲノムＤＮＡを加えず、第２の組には、ヒトゲノムＤＮＡを１０ｎｇ加え、第３の組には、ヒトゲノムＤＮＡを１１００ｎ加えた。反応物を室温（約２２℃）で集め、その後、９５ ℃で３分間変性させ、そして、３種の温度：９４℃で１分間、６６℃で１分間および７２℃で１分間から成る、４５サイクルを用いて温度循環させた。

図１４は、上記の１５の温度循環させた反応物１００マイクロリツトルの内１２マイクロリットルを流し、エチジウムブロマイド染色した１、２％アガロースゲルの写真である。予想したサイズのアンブリコン（４５０塩基対）は、ヒトゲノムＤＤＮＡ１００ｎの存在下約１０標的を含有する反応物を除き、Ｍ、ラベルクロシスゲノムの標的ＤＮＡを含有する全ての反応において検出可能である（図１４のレーン１５）。

ミスブライミノグを抑制し、それによって、Ｍ、ツベルクロンス標的ＤＮＡのより特異的かつ感度の高い増幅を達成するために、温度循環を始める前に、上記と同様の反応物を７２℃で集めた。詳細には、全て１×緩衝液中４００ｕｌｌｄＮＴＰ’ｓ、２ｕＭプライマーオリゴマー１２．１００１Ｍブロッカ−オリゴマー１４および水から成る５０マイクロリツトルを７２℃で加熱した。それとは別に、１×緩衝液中、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ５単位、ヒト胎盤ゲノムＤＮＡ１マイクログラム、様々な濃度のＭ、ラベルクロシスゲノムＤＮＡおよび水から成る５０マイクロリツトル容量を７２℃で加熱した。これら２つの容量を迅速に混合して、６６℃以上の温度を保つ完全な反応物１００マイクロリツトルを生成させた。反応を９５℃で３分間変性させ、その後、９４℃で１分間、６６℃で１分間、および７２℃で１分間の３種の温度を通して温度循環させた。

上記反応物１２マイクロリツトルづつを、一部を４５．５０．５５および６０温度サイクルで止めた以外は上記のように、アガロースゲルで試験した。上記反応物の第１組とは異なり、高温で反応を開始するように編成し、かつヒトゲノムＤＮＡ１マイクログラムを含有するこれらの反応物の組は、約１０モルのＭ。

ツベルクロノスゲノムＤＮＡ標的の検出をまさに可能にするものである（図１５のレーン５．１０．１５および２０参照）。予想した４５０塩基対のアンブリコンバンドは、１０の標的、６０サイクルレーンにおいて明白である。負の対照（０標的）のゲルに見られるバンドは、非特異的増幅である（レーン６．１１．１６および２１）。この解釈は、増幅されたＤＮＡの制限消化マツピングにより支持されている（図１６）。４５０ｂｐアンブリコン由来の予想制限フラグメントは、０標的対照を除く全ての増幅物の消化物中に存在する。

Ｍ　ツベルクロンスの同じ標的ゲノムＤＮＡを用いて実施した、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）とシングルプライマー増幅とを比較すると、感度は等しいが、ＰＣＲでは、ＳＰＡ反応では見られなかった、しばしば“プライマー二量体”と呼ばれる強度に染まるバンドがあることが示された。

結果と考察・大過剰の非標的ＤＮＡ分子の存在にもかかわらず、少数の標的分子を増幅できるＤＮＡ増幅技術が望まれている。対象のＤＮＡ標的を含有する臨床試料が、多量の非標的ＤＮＡを含有していることも多いであろうし、また、増幅は、標的のみを検出し、非標的ＤＮＡをほとんどまたは全く増幅しない程度に充分特異的でなければならない。この実施例に使用したＳＰＡプライマーおよびブロッカ−は、ミコバクテリア（１）の様々な種に通有であると知られているゲノムＤＮＡの領域に関係していた。この実施例１転大過剰のヒトＤＮＡの存在下で、少数のミコバクテリアゲノムＤＮＡを増幅するシングルプライマー増幅の能力を示すものである。（１）ジャーナル・オブ・クリニカル・ミクロバイオロジー（１９９３年）、３１巻、２号、１７５−１７８頁。“ラピッド・アイデンテイフイケーノヨン・オブ・ミコバクテリア・トウ・ザ・スペーシイーズ・レベル・／くイ・ポリメラーゼ・チェイン・リアクンコン・アンド・リストリクジョン・エンザイム・アナリシス゛。

図１４ヒトゲノムＤＮＡを加えた非“加熱出発”ＳＰＡ反応レーし１および１７は、１２３塩基対（ｂ　ｐ）のＤＮＡサイズラダー（ｌａｄｄｅｒ）標準（ＢＲＬインコーポレイテッド）を含有する。レーン２−６．７−１１および１２−１６は、本明細書に記載したＳＰＡ反応物中に存在するＭ、ツベルクロノス（Ｍ、　ｔｂ、）を１０４．１０３．１０２．１０および０モル含有する反応物の一部である。反応物２−６の群は、ヒトゲノムＤＮＡを加えていない。反応物７−１１は、ヒトゲノムＤＮＡ１０ナノグラムを含有しており、反応物１２−１６は、ゲノムＤＮＡ　１００ナノグラムを含有している。レーン１５に由来するＳＰＡの予想した４５０塩基対アンブリコンバンドは、この一連の反応中に失われており、おそらく、拮抗するヒトゲノムＤＮＡが、Ｍ２功ゲノムＤＮＡの１０の標的のみのこの非“加熱出発゛反応物中に存在する場合の、感度の損失が原因と暦われる。

図１５ヒトゲノム１）ＮＡ１マイクログラムを加えた“加熱出発”ＳＰＡ反応レーン１および２２は、１２３ｂｐ標準ＤＮＡラダー（ｌａｄｄｅｒ）を含有している。

レーン２−６．７−１１．１２−１６および１７−２１は、と−功ゲツムＤＮＡの１０４．１０３．１０２．１０および０標的を含有する反応物の一部を表している。レーン２−６は、４５温度サイクル後の反応物を表しており、レーン７− １１は、５０サイクル後、レーン１２−１６は、５５温度サイクル後、およびレーン１７−２１は、６０温度サイクル後を表している。５つの反応初盆ては、ヒト胎盤ゲノムＤＮＡ１マイクログラムを含有した。１０の標的リゲノム程度に少ない場合でさえ、オリジナルの写真は、４５サイクル程度に少なし）場合（レーン５）に予想した４５０ｂｐアンブリコンの検出を示している。このアガロースゲルでは、０標的の負の対照（レーン６．１１．１６および２１）において、４５０ｂｐバンドは、検出されていない。

図１６選択したＳＰＡおよびＰＣＲ反応アンブリコン生成物の制限酵素分析レーン１および１２は、サイズマーカーである：レーン１は、ｐＢＲ３２２のＭｓｐｌ消化であり、レーン１２は、１２３ｂｐラダー（ＢＲＬインコーポレイテッド）である。このゲルでの生成物は全て、５ＰＡ（図１５）またはＰＣＲ反応に由来するものである。レーン２および３は、６０サイクルの増幅後、Ｍ、　ｔｂＤＮＡの１００の標的に由来するＳＰＡアンブリコンのＢｓｔＥ　ＩＩ制限消化の前後を表している。予想した２４５．１２５および８０塩基対の制限フラグメントは、レーン３で検出でき、レーン２の４５０ｂｐアンブリコンの同一性を証明するものである。レーン４および５は、１０の標的を用いるＳＰＡ由来の４５０ｂｐアンブリコンの消化を表している。レーン５は、更に、微かであるが、検出可能な予想ＢｓｔＥ　ＩＩ制限パターン、並びに、ＢｓｔＥ　ＩＩの基質でない非特異的増幅生成物を示している。レーン６および７は、Ｙ２功標的なしで行った同様の研究であり、検出可能な４５０ｂｐアンブリコンも、このアンブリコンからの制限生成物も無い。

レーン８および９は、６０サイクル後、１００の標的を用いるＰＣＲ反応由来の４４０ｂｐアンブリコンを表している。ＢｓｔＥ　ＩＩ制限酵素処理により、予想した２３５．１２５および８０ｂｐフラグメントを得る。レーン１０および１１は、ＰＣＲを１０の標的で開始した以外は、８および９と同じである。予想したアンブリコンおよび制限フラグメントが存在する。

配列表（１）一般的情報：（］）特許出願人：（Ａ）名称、ノンテンクス（ニー・ニス・エイ）・インコーホレイテッド（Ｂ）通り　ヒルビュー・アベニュー３４０１番（Ｃ）市　パロ・アルド（Ｄ）州　カリフォルニア（Ｅ）国　アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号（ＺＩＰ）：カリフォルニア９４３０３（ｉｉ）発明の名称：ポリヌクレオチド類の３°末端に特定配列を導入する方法（ｉｉｉ）配列の数・２３（ｉｖ）コンピューター解読書式（Ａ）媒体型、フロッピー・ディスク（Ｂ）コンピューター　ｌｌ３ＭＰｃコンパティプル（Ｃ）オペレーティング・システム：　ＰＣ−ＤＯ８／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェア：　ＰａｔｅｎｔＩｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃　１．０１Ｖｅｒｓｉｏｎ　＃　１　、２５　（ＥＰＯ）（２）配列番号１の情報。

（１）配列の特徴・（Ａ）長さ、５０塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数、一本鎖（Ｄ）トポロジー二直線状（］ｌ）配列の種類　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル　Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス６ＮＯ（Ｖ）フラグメント型　中間部（ｖｌ）起源（Ａ）生物名０合成、物（ｘｉ）配列：配列番号１：ＭＣＣＡ’！’０ｆｆｒ　ｃｏａＡＡＣＡＣＣ’ｒ　Ａ’！’ＧＣ？ｅ　（！？ＧＧ６　ＡＭｅＣＡＩＳＯａ　％Ｑ（２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長さ、４０塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数、一本鎖（Ｄ）トポロジー、直線状（ｉｉ）配列の種類＝　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル＝Ｎ。

（１ｖ）アンチセンス＝Ｎ。

（ｖ）フラグメント型、中間部（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名　合成物（ｘｌ）配列・配列番号２：ＣαＸＣσ■ゴ劉スＸゴ＾費ＡＣ仇ｘａｃｃπ叱にＧ黒ωＸに４＾　４０（２）配列番号３の情報：（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長さ：８０塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー・直線状（１１）配列の種類：　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル＝Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス　Ｎ。

（Ｖ）フラグメント型　中間部（ｖｉ）起源・（Ａ）生物名：合成物（ｘｌ）配列　配列番号３（２）配列番号４の情報。

（］）配列の特徴。

（Ａ）長さ：４０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー　直線状（ｉｉ）配列の種類・　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル　Ｎ。

（１ｖ）アンチセンス　Ｎ。

（Ｖ）フラグメント型・中間部（ｖｌ）起源。

（Ａ）生物名　合成物（ｘｉ）配列　配列番号４ＧＣｌＡＧＣＣｒＣＴ　カニｋＴＴ＾ｅ　！　ＧＡＡＡＧＧＧｃｃ＾　４゜（２）配列番号５の情報。

（］）配列の特徴（Ａ）長さ　４０塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数　一本鎖（Ｄ）トポロジー　直線状（１１）配列の種類　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティカル、Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス＝Ｎ。

（Ｖ）フラグメント型：中間部（ｖｌ）起源。

（Ａ）生物名：合成物（ｘｌ）配列・配列番号５゜＾ｃｃｃａ冗ｍ（３）赫儲吋＾宮ＣＣＭＣ＾（３）＾冨ｃ４０（２）配列番号６の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｉ）配列の種類：　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス、Ｎ。

（Ｖ）フラグメント型・中間部（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名９合成物（ｘｉ）配列：配列番号６（２）配列番号７の情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長さ　５塩基対（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー；ｌｌ！線状（ｉｆ）配列の種類：　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティヵル二Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（ｖ）フラグメント型；中間部（ｖｉ）起源；（Ａ）生物名：合成物（ｘｉ）配列：配列番号７：ｅＱ２Ｃ（２）配列番号８の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２５塩基対（Ｂ）型・ｔｌＡ酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖ＣＤ）トポロジー；直線状（ｉｉ）配列の種類：　（ゲノム）ＤＮＡ（山）ハイポセティヵル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（ｖ）フラグメント型：中間部（ｖｉ）起源・（Ａ）生物名：合成物（ｘｉ）配列：配列番号８：＾０ＣＣＪｋ冗’ｒＴＴ　ＣＧＧＡＡ（ＪＣＣＴ　ｋＴＧＣＴ　２ｓ（２）配列番号９の情報：（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長さ：２５塩基対（Ｂ）型二核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ｉｉ）配列の種類；　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティヵル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（ｖ）フラグメント型：中間部（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：合成物（ｘｌ）配列：配列番号９二 π世費Ｃ国費騙豐国費費入費（２）配列番号１０の情報；（１）配列の特徴：（Ａ）長さ＋５６＃ｉ基対（Ｂン型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー・直線状（ｉｆ）配列の種類：　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（Ｖ）フラグメント型：中間部（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：合成物（ｘｉ）配列　配列番号１０：（２）配列番号１１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ　２５塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数・−末鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（１１）配列の種類＝　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｆｆ）ハイポセティカル二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ（Ｖ）フラグメント型：中間部（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名０合成物（ｘｉ）配列：配列番号１１・ＣＧＣＴＴＣＴＯａＴ　ＧＣαＸＬｋ＾＾ＣＯＮＸ！ＩＪ　２１（２）配列番号１２の情報：（１）配列の特徴：（Ａ）長さ：２５塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）Ｍの数・−末鎖（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｉ）配列の種類＝　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティカル、Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス：Ｎｏ（Ｖ）フラグメント型、中間部（ｖｌ）起源（Ａ）生物名；合成物（ｘｌ）配列・配列番号１２：ｅ（Ｃ（、ＧＴ？Ｇ＾丁　＾＾ＴＣ＾Ｇ＾＾＾＾　ｅｃｃｅｃ　２５（２）配列番号１３の情報；（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：８０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）　Ｉの数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：ｒ１１線状（ｉｉ）配列の種類＝　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティヵル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス；Ｎ。

（ｖ）フラグメント型：中間部（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：合成物（ｘｉ）配列、配列番号１３：（２）配列番号１４の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ　４０塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｉ）配列の種類：　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティヵル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（ｖ）フラグメント型　中間部（ｖｉ）起源。

（Ａ）生物名；合成物（ｘｉ）配列、配列番号１４：ｃｃｃｃａｍ＾テ　＾＾ＴＣ＾Ｇ＾＾＾＆　！　ＪｋＣＣＯ＾丁口ＧＯＣ４６（２）配列番号１５の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ・４０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ｉｉ）配列の種類：　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル＝Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（Ｖ）フラグメント型：中間部（ｖｌ）起源：（Ａ）生物名：合成物（ｘｉ）配列　配列番号１５゜ＧＣＸＡＧＣＣＴＣＴ　ＴｅＡ？ｒＡＣ（ＩｃｔｘＸＣＴＧＧＣＧＪＩＡ＾Ｍ＾　４０（２）配列番号１６の情報：（］）配列の特徴：（Ａ）長さ・５塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数・−末鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（１１）配列の種類　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス　Ｎ。

（ｖ）フラグメント型：中間部（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名工合成物（ｘｉ）配列；配列番号１６：ＣＣ国Ｃ５（２）配列番号１７の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ｉｉ）配列の種類：　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス；Ｎ。

（ｖ）フラグメント型：中間部（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：合成物（ｘｉ）配列：配列番号１７：ＡｄＡＴｃｏｃｃｌＧ（２）配列番号１８の情報二（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２５塩基対（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数−一本鎖（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｉ）配列の種Ｒ：　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）　／ゾポセティヵル＝Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス、Ｎ。

（ｖ）フラグメント型：中間部（ｖｉ）起源・（Ａ）生物名：合成物（ｘｉ）配列：配列番号１８：（２）配列番号１９の情報：（１）配列の特徴：（Ａ）長さ二８０塩基対（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：１ｉ［線状（ｉｉ）配列の種類　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティヵル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス：Ｎ。

（Ｖ）フラグメント型・中間部（ｖｉ）起源。

（Ａ）生物名０合成物（ｘｌ）配列　配列番号１９゜（２）配列番号２０の情報（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長さ・２５塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ｉｆ）配列の種類：　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ（ｖ）フラグメント型：中間部（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：合成物（ｘｉ）配列：配列番号２０：ＣＪＪＪａＣＡＱＣＯＧｋｋ（ａｋＧＣＧＴＧ　ＡＡ＾↑Ｃ２Ｂ（２）配列番号２１の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ二８０塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ｉｉ）配列の種類：　（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイポセティカル；Ｎ。

（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ。

（Ｖ）フラグメント型、中間部（ｖｉ）起源・（Ａ）生物名−合成物（ｘｉ）配列：配列番号２１：（２）配列番号２２の情報：（】）配列の特徴：（Ａ）長さ：２５塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二直線状（ｉｉ）配列の種類−（ゲノム’）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティカル二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ（Ｖ）フラグメント型：中間部（ｘｉ）配列：配列番号２２：ＴＡＧＣＣＣＴＴＯＴ　ＣＧＡＡＣＣＧＣＡＴ　ＡＣＣＣ？　２５（２）配列番号２３の情報：（ｉ）配列の特徴：（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直線状（ｉｉ）配列の種類、（ゲノム）ＤＮＡ（ｉｉｉ）ハイボセティカル二Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ（Ｖ）フラグメント型：中間部（ｘｉ）配列：配列番号２３゜

Claims

【特許請求の範囲】１．２つまたはそれ以上の特定核酸配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドの製法であって：（ａ）ブロッカーポリヌクレオチドの配列Ｂ１を鋳型ポリヌクレオチド（鋳型）内の相補配列Ｔ３とハイブリダイズさせ、ここで該鋳型は、配列Ｔ１および配列Ｔ２を含んで成るもので、該Ｔ３の５′末端は、該Ｔ２の５′末端の５′側にあり、該Ｔ２およびＴ３は、該配列Ｔ１の５′側にあって該配列Ｔ１と隣接していないものであり、（ｂ）第２の特定配列を含んで成るポリヌクレオチドプライマーの３′末端を該Ｔ１とハイブリダイズさせ、ここで、工程（ｂ）は、工程（ａ）の前、後、またはと同時に行われるものであり、さらに（ｃ）該プライマーを該鋳型に沿って、そして該Ｔ２の少なくとも一部に沿って、その後は、配列Ｓ１およびＳ２、ここでＳ１がＳ２の３′側にあって該Ｔ２と相同である、を有するポリヌクレオチドＱに沿って伸長させ、第１の特定核酸配列をＳ２と相補であるその３′末端に有する伸長したプライマーを得る、ここで、ポリヌクレオチドＱは、該ブロッカーポリヌクレオチドの５′末端と結合しているか、または別の領域に存在しているかのどちらかである、各工程を含んで成る製法。２．互いに隣接しておらず、相補である２つのセグメントを有する一本鎖ポリヌクレオチドのプライマーポリヌクレオチドからの製法であって：（ａ）（ａ）３つの配列Ｔ１、Ｔ２およびＴ３、ここでＴ１は、該Ｔ２およびＴ３と隣接せず、Ｔ２およびＴ３の３′側にあり、Ｔ３の３′末端は、Ｔ２と隣接しているか、またはＴ２内にある、を有する鋳型ポリヌクレオチド、（ｂ）その３′末端が該Ｔ１とハイブリダイズできるプライマーポリヌクレオチド、（ｃ）該Ｔ３とハイブリダイズできる該配列Ｂ１を伴うブロッカーポリヌクレオチド、および（ｄ）配列Ｓ１および配列Ｓ２を有するポリヌクレオチドＱ、ここで該Ｑは、ブロッカーポリヌクレオチドの５′末端に結合しているか、または別の領域として存在しており、Ｓ１は、該Ｓ２の３′側で、該Ｔ２と相同であり、該Ｓ２は、少なくとも核プライマーポリヌクレオチドの３′末端と相同である、を組み合わせで供給し、さらに（ｂ）該組み合わせを、該プライマーが該鋳型ポリヌクレオチドに沿って、そして該Ｔ２の少なくとも一部に沿って、そしてその後、該ポリヌクレオチドＱに沿って伸長する条件に付す、各工程を含んで成る、請求の範囲第１項記載の製法。３．標的ポリヌクレオチド配列の少なくとも１つのコピーの製法であって：（１）３つの配列Ｔ１、Ｔ２およびＴ３、ここでＴ１は、該Ｔ２およびＴ３と隣接せず、Ｔ２およびＴ３の３′側にあり、該Ｔ３の３′末端は、該Ｔ２と隣接しているか、またはＴ２内にあり、そして該標的ポリヌクレオチド配列が該Ｔ１とＴ３の間に位置している、を有する鋳型ポリヌクレオチド、（２）その３′末端が該Ｔ１とハイブリダイズできるプライマーポリヌクレオチド、（３）該Ｔ３とハイブリダイズできる該配列Ｂ１を伴うブロッカーポリヌクレオチド、（４）配列Ｓ１および配列Ｓ２を有するポリヌクレオチドＱ、ここで該Ｑは、ブロッカーポリヌクレオチドの５′末端に結合しているか、または別の領域として存在しており、Ｓ１は、Ｓ２の３′側で、該Ｔ２と相同であり、該Ｓ２は、少なくとも該プライマーポリヌクレオチドの３′末端と相同である、（５）ＤＮＡポリメラーゼ、および（６）デオキシヌクレオシドトリホスフェート類、を組み合わせ、（Ａ）該ブロッカーを該鋳型にハイブリダイズさせ、（Ｂ）それに該プライマーをハイブリダイズさせて、該鋳型ポリヌクレオチドの該標的ポリヌクレオチド配列に沿って、そして、該Ｔ２の少なくとも一部に沿って、そしてその後、該ポリヌクレオチドＱに沿って伸長させて二本鎖を形成し、（Ｃ）該伸長したプライマーを該二本鎖から解離させ、そして（Ｄ）該プライマーを該伸長したプライマーにハイブリダイスさせ、それに沿って伸長させて、該標的配列のコピーを含有する伸長したプライマーを含んで成る二本鎖を形成する条件下で、一緒に、または全体的もしくは部分的に連続して供給する、工程を含んで成る製法。４．該Ｂ１の少なくとも１つの５塩基配列が、ＧおよびＣヌクレオチドを少なくとも８０％含んで成るものである、請求の範囲第３項記載の製法。５．該Ｔ２が該Ｔ３と隣接しているものである、請求の範囲第３項または４項記載の製法。６．該ポリヌクレオチドＱが、該ブロッカーポリヌクレオチドの５′末端に結合している、請求の範囲第３項、第４項、または第５項記載の製法。７．標的ポリヌクレオチド配列の複数のコピーを形成する方法であって：（ａ）（１）３つの配列Ｔ１、Ｔ２およびＴ３、ここでＴ１は、該Ｔ２およびＴ３と隣接せず、Ｔ２およびＴ３の３′側にあり、該Ｔ３の３′末端は、該Ｔ２と隣接しているか、またはＴ２内にあり、そして該標的ポリヌクレオチド配列が該Ｔ１とＴ３の間に位置している、を有する鋳型ポリヌクレオチド、（２）その３′末端が該Ｔ１とハイブリダイズできるプライマーポリヌクレオチド、（３）該Ｔ３とハイブリダイズできる該配列Ｂ１を伴うブロッカーポリヌクレオチド、（４）配列Ｓ１および配列Ｓ２を有するポリヌクレオチドＱ、ここで該Ｑは、ブロッカーポリヌクレオチドの５′末端に結合しているか、または別の領域として存在しており、Ｓ１は、Ｓ２の３′側で、該Ｔ２と相同であり、該Ｓ２は、少なくとも該プライマーポリヌクレオチドの３′末端と相同である、（５）ＤＮＡポリメラーゼ、および（６）デオキシヌクレオシドトリホスフェート類、の組み合わせを、（Ａ）該ブロッカーを該鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズさせ、（Ｂ）それに該プライマーをハイブリダイズさせて、該鋳型ポリヌクレオチドの該標的ポリヌクレオチド配列に沿って、そして、該Ｔ２の少なくとも一部に沿って、そしてその後、該ポリヌクレオチドＱに沿って伸長させて二本鎖を形成し、（Ｃ）該伸長したプライマーを該二本鎖から解離させ、そして（Ｄ）該プライマーを該伸長したプライマーにハイブリダイスさせ、それに沿って伸長させて、該標的配列のコピーを含有する伸長したプライマーを含んで成る二本鎖を形成する条件下で、一緒に、または全体的にもしくは部分的に連続して供給し、さらに（ｂ）工程（Ｃ）および（Ｄ）を繰り返す、各工程を含んで成る、請求の範囲第３項記載の製法。８．ポリヌクレオチド分析物を含有する疑いのある媒質中のポリヌクレオチド分析物の存在の検出法であって、該分析物は、３つの配列Ｔ１、Ｔ２およびＴ３を有する鋳型配列、ここでＴ１は該Ｔ２およびＴ３に隣接せず、Ｔ２およびＴ３の３′側にあり、Ｔ３の５′末端は該Ｔ２の５′末端の５′側にある、を含んで成るものであり：（ａ）該媒質を、（１）その３′末端が該Ｔ１とハイブリダイズできるプライマーポリヌクレオチド、（２）該Ｔ３とハイブリダイズできる該配列Ｂ１を伴うブロッカーポリヌクレオチド、（３）配列Ｓ１およびＳ２を有するポリヌクレオチドＱ、ここでＱは、ブロッカーポリヌクレオチドの５′末端に結合しているか、または別の領域として存在しており、Ｓ１は、該Ｓ２の３′側で、該Ｔ２と相同であり、該Ｓ２は、少なくとも該プライマーポリヌクレオチドの３′末端と相同である、（４）ＤＮＡポリメラーゼ、および（５）デオキシヌクレオシドトリホスフェート類を、（Ａ）該ブロッカーを該鋳型にハイブリダイズさせ、（Ｂ）それに該プライマーをハイブリダイズさせて、該鋳型に沿って、そして、該Ｔ２の少なくとも一部に沿って、そしてその後、該ポリヌクレオチドＱに沿って伸長させて二本鎖を形成し、（Ｃ）その伸長したプライマーを該二本鎖から解離させ、そして（Ｄ）該伸長したプライマーに該プライマーをハイブリダイスさせて、それに沿って伸長させて、伸長したプライマーを含んで成る二本鎖を形成し、さらに工程（Ｃ）および（Ｄ）が繰り返される条件下で、組み合わせ、（ｂ）該伸長したプライマーの存在について試験する各工程を含んで成る検出法。９．（ａ）その３′末端に、標的ポリヌクレオチドの第１の配列Ｔ１とハイブリダイズ出来る配列を有するプライマーポリヌクレオチド、（ｂ）該標的ポリヌクレオチド中の配列Ｔ３、ここで該Ｔ３は該Ｔ１の３′側にあり、該Ｔ３の５′末端は、配列Ｔ２の５２′末端の５′側にある、とハイブリダイズできる配列Ｂ１を有するブロツカーポリヌクレオチド、および（ｃ）Ｓ１が、該Ｓ２の３′側で、該鋳型ポリヌクレオチド中の該Ｔ２と相同であり、該Ｓ２が、少なくとも該プライマーの３′末端と相同である、配列Ｓ１およびＳ２を有するポリヌクレオチドＱ、をパッケージ化した組み合わせで含んで成るキット。１０．ポリヌクレオチドプライマーから２つの異なる特定配列Ｐ１およびＰ′２を有する一本鎖ポリヌクレオチドを製造する方法であって：（ａ）（１）３つの配列Ｔ１、Ｔ２およびＴ３を有する鋳型ポリヌクレオチド（鋳型）、こニでＴ１は、該Ｔ２およびＴ３と隣接せず、Ｔ２およびＴ３の３′側にあり、該Ｔ３の３ ′末端は、該Ｔ２と隣接しているか、またはＴ２内にある、（２）その３′末端が該Ｔ１とハイブリダイズできるポリヌクレオチドプライマー（プライマー）Ｐ１、（３）該Ｔ３とハイブリダイズできる該配列Ｂ１を伴うブロッカーポリヌクレオチド、および（４）配列Ｓ１および配列Ｓ２を有するポリヌクレオチドＱ、こニで該Ｑは、ブロッカーポリヌクレオチドの５′末端に結合しているか、または別の領域として存在しており、Ｓ１は、Ｓ２の３′側で、該Ｔ２と相同であり、該Ｓ２は、該Ｐ′２と相補である、の組み合わせを供給し、（ｂ）該組み合わせを該プライマーＰ１を鋳型に沿って、そして該Ｔ２の少なくとも一部に沿って、そしてその後、該ポリヌクレオチドＱに沿って伸長させる条件に付す、各工程を含んで成る、請求の範囲第１項記載の製法。１１．配列Ｔ３および配列Ｔ２を含んで成るＤＮＡの一本鎖であって、該Ｔ３の３′末端はＴ２の５′末端と隣接しており、該一本鎖は、該Ｔ３と相補の配列Ｂ１から成るブロッカーＤＮＡ配列と複合しており、さらにＢ１の５′側にあり該Ｔ２と相同である配列Ｓ１を含んで成る組成物。１２．（ａ）その３′末端に標的ポリヌクレオチドの第１の配列Ｔ１とハイブリダイズ出来る配列を有するプライマーポリヌクレオチド、（ｂ）標的ポリヌクレオチド中の配列Ｔ３、ここでＴ３は該Ｔ１の３′側にあり、該Ｔ３の５′末端は、配列Ｔ２の５′末端の５′側にある、とハイブリダイズできる配列Ｂ１を有するブロッカーポリヌクレオチド、および（ｃ）配列Ｓ１およびＳ２、ここでＳ１は、該Ｓ２の３′側にあって、該鋳型ポリヌクレオチド中の該Ｔ２と相同であり、該Ｓ２は、第２のポリヌクレオチドプライマーの少なくとも３′末端部と相同な配列である、を有するポリヌクレオチドＱ、をパッケージ化した組み合わせで含んで成るキット。