JPH07509616A - 欠陥アデノウイルスおよび対応補足系 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 欠陥アデノウィルスおよび対応補足系 本発明は宿主真核細胞または生物への対象遺伝子の移入と発現とが可能な新規欠 陥アデノウィルスベクター、およびこれら組換えアデノウィルスのゲノムから欠 失された必須ウィルス機能をインドランス（ｉｎｔＩｎｓ）で補う新規補足系に 関する。本発明は、特にヒトにおける、遺伝子治療の展望上特別な関心がもたれ るものである。

アデノウィルスは広い宿主範囲を示すＤＮＡウィルスである。それらは多数の動 物種および多数の細胞で実証されている。ゲノム配列に関して特に異なる多数の 血清型が存在する。はとんどのヒトアデノウィルスはほんのわずかに病原性であ り、通常良性の症状を示すだけである。

アデノウィルスは特定レセプターを介して受容宿主細胞に入り、その後それはエ ンドソーム中に取り込まれる。

それらの酸性化が、ウィルスのコンホメーション変化と細胞質中へのその出現に 寄与している。複製サイクルの第一工程に必要とされるある種のウィルスタンパ ク質に関係するウィルスＤＮＡが、次いで感染細胞の核に入り、そこでその転写 が細胞酵素により開始される。アデノウィルスＤＮＡの複製は感染細胞の核で起 こり、細胞複製を必要としない。新たなピリオンのアセンブリーも核で起こる。

第一段階において、ウィルスタンパク質は二十面体構造の中空キャプシドを形成 するように集合化して、それからアデノウィルスＤＮＡが粗膜（ｃｎｃａｐｓｉ ｄａ＋ｅｄ）される。ウィルス粒子またはピリオンが感染細胞から放出され、他 の受容細胞に感染することができる。

アデノウィルスの感染サイクルは二つの工程、即ちニーアデノウィルスゲノムの 複製の開始の前であって、かつウィルスＤＮＡの複製および転写に関与する調節 タンパク質の生産が行なわれる前期、および−構造タンパク質の合成を導く後期 で生じる。

一般的には、アデノウィルスゲノムは、３０以上のタンパク質をコードする配列 を含んだ、長さ約３６ｋｂの二本直鎖ＤＮＡ分子からなる。その両末端には、Ｉ ＴＲ（逆方向末端反復）と呼ばれる、血清型に応じた１００〜１５０ヌクレオチ ドの短逆方向配列が存在している。ＩＴＲはアデノウィルスゲノムの複製に関与 する。

約３００ヌクレオチドの粗膜化領域は、ゲノムの５′末端において５−ＩＴＲの 直後に位置している。

初期遺伝子は、アデノウィルスゲノム中に分散した、Ｅ１〜Ｅ４（Ｅは“初期” を表す）と表示される４領域に分布している。初期領域はそれら自体のプロモー ターを有した少くとも６つの転写単位を含んでいる。初期遺伝子の発現はそれ自 体調節され、一部の遺伝子は他よりも前に発現される。３つの領域Ｅ１、Ｅ２お よびＥ４は各々ウィルス複製にとり必須である。このため、アデノウィルスがこ れら機能の１つに欠陥がある場合、即ちアデノウィルスがこれら領域の１つによ りコードされる少くとも１つのタンパク質を生産できない場合には、このタンパ ク質はインドランスでそれに供給されねばならない。

Ｅ１初期領域はアデノウィルスゲノムの５′末端に位置し、２つのウィルス転写 単位ＥＩＡおよびＥＩＢを各々含んでいる。この領域はウィルスサイクルに非常 に初期に関与するタンパク質をコードし、アデノウィルスのほぼすべての他の遺 伝子の発現にとり必須である。特に、ＥＩＡ転写単位は、他のウィルス遺伝子の 転写をトランス活性化するタンパク質をコードしており、ＥＩＢＳＥ２ＡＳＥ２ ＢおよびＥ４領域のプロモーターからの転写を誘導する。

２つの転写単位Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂをもまた含んだＥ２領域の産物は、ウィルス ＤＮＡの複製に直接関与している。この領域は、−重鎖ＤＮＡと強い親和性を示 す７２　ｋＤａタンパク質と、ＤＮＡポリメラーゼの合成とを特に支配している 。

Ｅ３領域はウィルスの複製にとり必須ではないがアデノウィルス感染の際に宿主 免疫反応の阻害に関与するらしい少くとも６つのタンパク質をコードしている。

特に、ｇ　ｌ）　１９　ｋＤｚ糖タンパク質は、宿主細胞毒性Ｔ細胞による感染 細胞の細胞溶解に関与するＣＴＬ応答を妨げると考えられる。

Ｅ４領域はアデノウィルスゲノムの３′末端に位置する。そして、それは後期遺 伝子の発現、後期メツセンジャーＲＮ　Ａ　（ｍ　ＲＮ　Ａ）の安定性、前期か ら後期への移行、そして更に細胞タンパク質合成の阻害に関与する多数のポリペ プチドをコードしている。

ウィルスＤＮＡの複製が開始されると、後期遺伝子の転写が始まる。これらはア デノウィルスゲノムの大部分を占め、初期遺伝子の転写単位と一部重複している 。しかし、それらは異なるプロモーターから別のスプライシング様式に従い転写 され、そのため同一配列が異なる目的に用いられる。後期遺伝子のほとんどは主 要後期プロモーター（ＭＬＰ）から転写される。このプロモーターは長鎖−次転 写産物の合成を行い、その後これは約２０のメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ ）の形で成熟化され、そこからピリオンのキャプシドタンパク質が生産される。

キャプシドを構成する構造タンパク質ＩＸをコードする遺伝子は、アデノウィル スゲノムの５″末端に位置し、その３′末端でＥＩＢ領域と重っている。タンパ ク質ＩＸ転写単位は、ＥＩＢ転写単位と同じ転写終結シグナルを利用している。

いくつかのアデノウィルスは現在遺伝的および生化学的にかなり特徴付けされて いる。ヒトアデノウィルスタイプ５（Ａｄ５）の場合、その配列は参照番号Ｍ７ ３２６０としてＧｅｎｅｂａｎｋデータバンクで開示されている。アデノウィル スゲノムで異なる遺伝子を正確に位置決めすることができた。そこでは５″から ３′にかけて１０３ｂｐ５＝ＩＴＲ，その後に約３００ｂｐ包膜化領域（Ｈｅａ 「ｉｎｇ　ｅｌａｌ、、　１９８７．１．　Ｖｉｔａｌ、、　６１．２５５５− ２５５８）　、次いでその位置が図１に示されている初期および後期領域と、最 後に３′ＩＴＲを含んでいる。

アデノウィルスが、対象遺伝子移入用の選択ベクターとしうる有利な特徴を備え ていることは、前記から明らかである。多数の組換えアデノウィルスが文献に記 載されている（Ｒｏｓｅｎｌｅｌｄ　ｅｌ　ａｌ、、　１９９１５ｃｉｅｎｃｅ 、　２５２．４３１−４３４　；Ｒｏｉｅｎｌｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、１９９２ ．Ｃｅ１１，６８．１４３−１５５）。一般的に言えば、それらはＡｄ５から誘 導され、環境および宿主生物でのそれらの伝播を避けうるように８１機能に欠陥 がある。加えて、非必須Ｅ３領域も欠失させることができる。外来配列か、Ｅｌ またはＥ３領域に代えて組み込まれる。

このため、これらの欠陥アデノウィルスは、ウィルス複製に必須である８１機能 をインドランスで補うセルラインでのみ増殖させることができる。現在、使用し うる唯一の補足系は胚腎臓系２９３　（Ｇ＋ａｈａｍ　ｅｔ　！＋、、１９７７ 、Ｊ。

Ｇｅｎ　、　Ｖｉｔａｌ、、３６．５９−７２）であって、これは特にウィルス ゲノムの５′末端を含んだＡｄ５ゲノムの断片の染色体への組込みにより得られ 、それによって系２９３は８１機能に欠陥があるアデノウィルスを補う。２９３ 細胞は欠陥組換えアデノウィルスにおいてまた見出される配列、例えば５−ＩＴ Ｒと、粗膜化領域と、初期タンパク質をコードする配列を含んだＥＩＢ領域の３ ′末端側の部分とを含んでいる。

アデノウィルスを用いた遺伝子移入の実施の可能性は現在確立されている。しか しながら、それらの安全性の問題はなお解決されていない。実際に、それらは培 養で一部の細胞系を形質転換することができ、少くとも一部の血清型において、 本質的にＥｌとおそら＜Ｅ４領域におけるアデノウィルスゲノムの発現産物の一 部のものとしての潜在的な発癌性がもたらされる。更に、従来の欠陥アデノウィ ルス（特に組換えアデノウィルス）と、天然もしくは野生型アデノウィルス（宿 主生物の偶発的汚染または日和見感染に起因する）または補足系２９３に組込ま れたアデノウィルスゲノム断片との間の遺伝子組換えの蓋然性は微々たるもので はない。実際に、１回の組換え現象は、８１機能を回復させ、環境に伝播しうる 非欠陥組換えアデノウィルスを生じるのに十分である。

欠陥アデノウィルスと同様の細胞に同時感染する野生型天然アデノウィルスが８ １機能に関して前者を補って、２ウイルスの同時伝播を起こすという状況も考え られるさらに、一部タイプの真核細胞はＥＩＡ様活性を示すタンパク質を生産し 、これはそれらに感染する欠陥アデノウィルスを部分的に補うこともできる。

このため、有効な治療方法がないｉｎマ１マＯの重度の遺伝子欠陥を修正して、 ある障害を治療するための遺伝子治療に用いるにあたり、最少の危険性を示し、 自由に扱える有用なアデノウィルスベクターが望まれている。ヒトに適用される 遺伝子治療の成否は、それを入手できるかどうかに依存している。

更に、系２９３の入手に関しては疑問が存在している。

その疑問により、それに由来するヒト用とされる産物の受容性が損なわれる傾向 にある。ヒト用の組換えアデノウィルス粒子を生産するためには、起源および由 来が正確に知られている、自由に扱える補足系があることが有用である。

今般、（１）アデノウィルスゲノムのある特定領域が欠失された、インビボでの 外来ヌクレオチド配列の移入により適した新規欠陥アデノウィルスベクター、お よび（２）薬学的観点から許容され、このためヒト用の産物の生産上要求される すべての安全性を示す、新規の特徴付けされた補足系が見出された。

これら新規ベクターの価値は、それらが１以上の太きな対象遺伝子の挿入が可能 な高いクローニング能力を示し、かつ使用上最大の安全性を示すことである。有 害変異は、対象遺伝子を移入および発現しうるそれらの能力を損うことなく、ア デノウィルスを自律複製および細胞形質転換できなくする。

このため、本発明の主題は、複製に欠陥があり、補足細胞中に色層することがで きて、５′から３′にかけて５−ＩＴＲ，包膜化領域、ＥＩＡ領域、ＥＩＢ領域 、Ｅ２領域、Ｅ３領域、Ｅ４領域、および３”ＩＴＲを含んだアデノウィルスの ゲノムから、 （ｉ）ＥＩＡ領域の全部または一部、および初期タンパク質をコードするＥＩＢ 領域の部分全体、または（ｉｉ）ＥＩＡ領域の全部または一部、およびＥ２およ びＥ４領域から選択される少くとも１つの領域の全部または一部、または （ｉｉｉ）　Ｅ　Ｉ　Ａ領域の全部または一部、および包膜化領域の部分 の欠失により誘導される、アデノウィルスベクターである。

本発明の目的において、“欠失“または“欠く”という用語は標的領域における 少くとも１つのヌクレオチドの除去に関し、欠失は当然ながら連続でもまたは不 連続でもよい。全部または一部とは、該当する領域の全体または部分のみの場合 を意味する。上記領域によりコードされる少くとも１つの発現産物の生産を妨げ る欠失が好ましい。このため、それらはコード領域または調節領域、例えばプロ モーター領域に存在してよく、遺伝子の読取枠を壊すかまたはプロモーター領域 を無機能化するように少くとも１つのヌクレオチドに影響を与えてもよい。

欠失には、上記領域の１以上の遺伝子の部分的欠失またはその領域の全体の部分 的欠失をも含む。

本発明によるアデノウィルスベクターは複製に欠陥がきる。宿主細胞にそのベク ターを送達しうる能力を有しているために、宿主細胞で自律複製できないにもか かわらず感染性であるアデノウィルス粒子（欠陥アデノウィルスとも呼ぶことと する）を生じるように、欠陥があるものに産物をインドランスでそれを提供する 。

第一の例によると、本発明によるアデノウィルスベクターは、ＥＩＡ領域の全部 または一部、および初期タンパク質をコードする配列の全体を含んだＥＩＢ領域 部分の欠失により、天然または野生型アデノウィルスのゲノムから誘導される。

好ましい態様によれば、欠失はＥＩＢ領域の発現産物（即ち初期タンパク質をコ ードする配列）とプロモーターとに影響を与え、後期タンパク質ＩＸをコードす る配列と重複する転写終結シグナルの全部または一部を含まない。ヒトアデノウ ィルスタイプ５から誘導される本発明によるアデノウィルスベクターに関して、 上記欠失にはアデノウィルスゲノムのヌクレオチド１６３４〜３５０９間にある 配列から少くともなり、その配列は参照番号Ｍ７３２６０としてＧｅｎｅｂａｎ ｋデータバンクで開示されている。この欠失の目的は、本発明によるアデノウィ ルスベクターと、補足系（例えば系２９３）に組み込まれるアデノウィルスゲノ ム断片とに共通した配列を減少または消失させることである。更に、少くともＥ ＩＡ領域の発現産物と一緒に、発現産物が潜在的に発癌性である配列を本発明に よるアデノウィルスベクターから除去することである。

しかも、本発明によるアデノウィルスベクターは、天然または野生型アデノウィ ルスのゲノムから、ニーＥ３領域の、および／または −Ｅ２領域の、および／または −Ｅ４領域の 全部または一部の欠失によって更に誘導される。

本発明によるアデノウィルスベクターが上記３欠失のうち１つ、またはいずれか の組合せでそれらのうち２つ、またはすべての欠失を含むことができることは自 明である。

特に有利な態様によると、Ｅ３領域の一部のみ、好ましくはｇ　ｐｌ　９　ｋＤ ａタンパク質、をコードする配列を含まない部分が、本発明によるアデノウィル スベクターから欠失される。本発明によるアデノウィルスベクターにｇ　ｐｌ　 ９　ｋＤｚタンパク質をコードする配列が存在することにより、感染細胞は宿主 の免疫監視（即ち治療プロトコールがいくつかの反復投与を要するときの重要な 基準）からのがれることができる。選択は、ｇｐ１９ｋＤｌをコードする配列を 、宿主細胞でそれらを発現させる適切な要素、即ちｍＲＮＡへの上記配列の転写 とタンパク質への後者の翻訳に必要な要素のコントロール下において行うことが 好ましい。これらの要素には特にプロモーターがある。このようなプロモーター は当業者に周知であり、遺伝子工学の慣用的技術で上記コード配列の上流に挿入 される。選択されるプロモーターはＥＲＡ領域の発現産物の１つにより活性化さ れない構成プロモーターであることが好ましい。例として、ＨＭＧ　（ヒドロキ シメチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ）遺伝子プロモーター、ＳＶ４０　（ シミアンウィルス４０）ウィルス初期プロモーター、Ｒ３Ｖ　（ラウス肉腫ウィ ルス）ＬＴＲ（長反復末端）または高等真核生物のＰＧＫ　（ホスホグリセリン 酸キナーゼ）遺伝子のプロモーターが挙げられる。

更に、プロモーター領域に相当するＥ３領域の部分は本発明によるアデノウィル スベクターから場合により欠失させることができ、そのプロモーター領域は上記 のような異種プロモーター領域に代えられる。

第二の例によると、本発明によるアデノウィルスベクターは、ＥＩＡ領域の全部 または一部と、少くともＥ２および／またはＥ４領域の全部または一部とにおけ る連続または不連続欠失により、天然または野生型アデノウィルスのゲノムから 誘導される。このような欠失により、対象遺伝子のクローニング可能性を増加さ せることができる。更に、Ｅ４領域の全部または一部の除去により、潜在的な発 癌性産物をコードする配列を減少または消失させることもできる。

上記のように、本発明によるアデノウィルスベクターは、特に上記のような態様 に従い、ＥＩＢおよび／またはＥ３領域の全部または一部を更に欠くことができ る（例えば、初期タンパク質をコードする配列の全体を含むＥＩＢ領域の部分、 およびｇｐ１９ｋＤ！タンパク質をコードしないＥ３領域の部分の欠失）。

最後に、第三の例によると、本発明によるアデノウィルスベクターは、ＥＩＡ領 域の全部または一部と、粗膜化領域の部分の欠失とにより、アデノウィルスのゲ ノムから誘導される。

粗膜化領域の部分的欠失により、本発明によるアデノウィルスベクターの無制御 の伝播の可能性を、野生型アデノウィルスの存在下にあるとき有意に減少させる ことができる。このような欠失は、野生型アデノウィルスによるベクターの欠陥 機能のインドランス相補によっても、競合野生型アデノウィルスのゲノムと比べ て効率的に粗膜できないように、その粗膜化機能に影響を与えることができる。

粗膜化領域からの欠失は、２つの基準、即ち粗膜される能力の減少と、同時に工 業的生産に適合する残りの効力とに基づいて選択される。換言すれば、本発明に よるアデノウィルスベクターの粗膜化機能は実質上、但しもっと低い程度に維持 される。弱毒化は、慣用的滴定技術により、適切な系を感染させて溶解プラーク の数を調べることにより判定できる。このような技術は当業者に知られている。

本発明において、粗膜化効力は、野生株包膜化領域を有するコントロールアデノ ウィルスと比較して、２〜５０分の１、有利には３〜２０分の１、好ましくは５ 〜１０分の１に減少している。

当然ながら、本発明による弱毒化アデノウィルスベクターは上記欠失の少くとも １つまたは何らかの組合せも更に含むことができる。

本発明によるアデノウィルスベクターは、天然または野生型アデノウィルス、有 利にはイヌ、トリまたはヒトアデノウィルス、好ましくはヒトアデノウィルスタ イプ２．３．４．５または７、最も好ましくはヒトアデノウィルスタイプ５　（ Ａｄ５）のゲノムから誘導される。この後者の場合には、本発明によるアデノウ ィルスベクターの欠失は参照番号Ｍ７３２６０としてＧｅｎｅｂａｎｋデータバ ンクで特定されているＡｄ５ゲノムのヌクレオチドの位置を参照して示される。

ヒトアデノウィルスタイプ５のゲノムから、（ｉ）ＥＩＢ領域の初期タンパク質 をコードし、ヌクレオチド１６３４から始まり、ヌク・レオチド４ｏ４７で終わ る部分の全体、および／または （１１）ヌクレオチド３２８００〜３５８２６にわたるＥ４領域、および／また は （ｉ　ｉ　ｉ）ヌクレオチド２７８７１〜３０７４８にわたるＥ３領域の部分、 および／または （１ｖ）下記包膜化領域の部分ニ ーヌクレオチド２７０〜ヌクレオチド３４６の範囲、または 一ヌクレオチド１８４〜ヌクレオチド２７３の範囲、または −ヌクレオチド２８７〜ヌクレオチド３５８の範囲の欠失により誘導される本発 明によるアデノウィルスベクターが最も好ましい。

好ましくは、本発明によるアデノウィルスベクターは野生型または天然アデノウ ィルスのゲノムから、そのゲノムの少くとも１８％、少くとも２２％、少くとも ２５％、少くとも３０％、少くとも４０％、少くとも５０％、少くとも６０％、 少くとも７０％、少くとも８０％、少くとも９０％または少くとも９５％、特に ９８．５％の欠失により誘導される。

特に好ましい態様によると、本発明によるアデノウイルスベクターは、５′およ び：３”ｌＴＲと、粗膜化領域の全部または一部とを除いたアデノウィルスゲノ ムの全体の欠失により、アデノウィルスのゲノムから誘導される。この例による と、それは組換えのリスクおよび発癌性のリスクを制限して最大のクローニング 能力を有するような最少数のウィルス配列のみを含んでいる。このようなベクタ ーは“最小”アデノウィルスベクターと称され、３０ｋｂ以内の外来ヌクレオチ ド配列を挿入することが可能である。本発明による好ましいアデノウィルスベク ターは、ヌクレオチド４５９〜３５８３２にわたるウィルスゲノムの部分の欠失 により、ヒトアデノウィルスタイプ５から誘導される。

本発明に関して、本発明によるアデノウィルスベクターは、宿主細胞への外来ヌ クレオチド配列の移入と、そこでのその発現をその目的として有する。“外来ヌ クレオチド配列”は、コード配列とそのコード配列を発現させる調節配列を含ん だ、コード配列がアデノウィルスのゲノムに通常存在しない配列である核酸を意 味すると理解されている。調節配列はいかなる起源であってもよ０゜外来ヌクレ オチド配列は、粗膜化領域と３−ＩＴＲとの間に、遺伝子工学の標準技術で本発 明によるアデノウィルスベクター中に導入される。

外来ヌクレオチド配列は対象の、好ましくは治療対象の遺伝子１以上からなる。

本発明に関して、対象遺伝子はアンチセンスＲＮＡ、または対象タンパク質に翻 訳されるｍＲＮＡのいずれかをコードすることができる。対象遺伝子はゲノムタ イプ、相補性ＤＮＡ　（ＣＤＮＡ）タイプまたは混合タイプ（少くとも１つのイ ントロンが欠失されているミニ遺伝子）である。それは成熟タンパク質、成熟タ ンパク質の前駆体、特に分泌されてこのためシグナルペプチドを含む前駆体、別 間源の配列の融合によるキメラタンパク質、あるいは改善または改質された生物 学的性質を示す天然タンパク質の変異体をコードすることができる。このような 変異体は天然タンパク質をコードする遺伝子の１以上のヌクレオチドの変異、欠 失、置換および／または付加により得られる。

対象遺伝子は、宿主細胞でのその発現に適した要素のコントロール下においてよ い。′適切な要素”とは、ＲＮＡ　（アンチセンスＲＮＡまたはｍＲＮＡ）への その転写とタンパク質へのｍＲＮＡの翻訳とに必要な一連の要素を意味すると理 解されている。転写に必要な要素の中では、プロモーターが特に重要と思われる 。それは構成プロモーターまたは調節プロモーターであって、真核生物またはウ ィルス起源と更にはアデノウィルス起源の遺伝子から単離することができる。一 方、それは該当する対象遺伝子の天然プロモーターであってもよい。一般的に言 えば、本発明で用いられるプロモーターは調節配列を含むように修飾してもよい 。例として、本発明で使用の対象遺伝子は、リンパ球宿主細胞へのその移入を目 標にすることが望まれるときに、免疫グロブリン遺伝子のプロモーターのコント ロール下におかれる。多数の細胞タイプで発現を行う、ＴＫ−ＨＳＶ−１（ヘル ペスウィルス、タイプ１チミジンキナーゼ）遺伝子プロモーター、または一方で 特にヒトアデノウィルスタイプ２のアデノウィルスＭＬＰプロモーターも挙げら れる。

本発明に関して使用しつる対象遺伝子の中では、以下が挙げられる： 一すイト力イン、例えばインターフェロンα、インターフェロンγ、インターロ イキンをコードする遺伝子、−膜レセプター、例えば病原生物（ウィルス、細菌 または寄生虫）、好ましくはＨＩＶウィルス（ヒト免疫不全ウィルス）により認 識されるレセプターをコードする遺伝子、 一凝固因子、例えば因子Ｖｌ１１および因子１ｘをコードする遺伝子、 一シストロフィンをコードする遺伝子、−インスリンをコードする遺伝子、 −細胞イオンチャンネルに直接または間接的審こ関与するタンパク質、例えばＣ ＦＴＲ（嚢胞性繊維症経膜伝達レギュレーター）タンパク質をコードする遺伝子 、−病原生物のゲノムに存在する病原遺伝子による力Ａまた（よ発現が調節解除 される細胞遺伝子、例えば癌遺伝子（こより生産されるタンパク質の活性を阻害 できるアンチセンスＲＮＡまたはタンパク質をコードする遺伝子、−酵素活性を 阻害するタンパク質、例えばα１−アンチトリプシンまたはウィルスプロテアー ゼ阻害物質をコードする遺伝子、 一生物学的機能を損うように変異された病原タンパク質の変異体、例えば標的配 列に結合する上で天然タンパク質と競合して、それによりＨＩ■の活性化を妨げ うる、例えばＨＩＶウィルスのＴＡＴタンパク質のトランス優性変異体をコード する遺伝子、 一宿主細胞免疫を増加させるために抗原性エピトープをコードする遺伝子、 一主要組織適合性複合体りラスＩおよび１１タンパク質をコードする遺伝子と、 これら遺伝子のインデューサーであるタンパク質をコードする遺伝子、−細胞酵 素または病原生物により生産されるものをコードする遺伝子、および 一自殺遺伝子。ＴＫ−ＨＳＶ−１自殺遺伝子が特に挙げられる。ウィルスＴＫ酵 素は、あるヌクレオシドアナログ（例えば、アシクロビアまたはガンシクロビア ）に対して細胞ＴＫ酵素と比べ著しく大きな親和性を示す。

それはそれらを−リン酸分子に変換するが、これは毒性であるヌクレオチド前駆 体にそれ自体が細胞酵素により変換されつる。これらのヌクレオチドアナログは 合成中のＤＮＡ分子、ひいては主に複製状態にある細胞のＤＮＡ中に組み込むこ とができる。この組込みにより分裂細胞、例えば癌細胞を特に破壊することがで きる。

上記リストは限定的なものではなく、他の対象遺伝子も本発明に関して用いてよ い。

更に、本発明のもう１つの態様によると、本発明によるアデノウィルスベクター は、非アデノウィルス転写をトランス活性化するタンパク質をコードする非治療 遺伝子を更に含むことができる。当然ながら、トランス活性化タンパク質をコー ドするＥＩＡ領域の遺伝子、その発現はアデノウィルスを非欠陥にするリスクを 生じる、は避けられる。５ｘｅｃｈａ＋ｏｍ７ｃｅｓ　ｃｅ＋ｅｙｉｓｉａｃ　 Ｇ！＋４タンパク質をコードする遺伝子が選択されることが好ましい。その発現 により、ベクターを補足系、例えば下記で増殖させることができる。このような 系はより洗練させて、アデノウィルス補足性タンパク質の連続生産による起こり うる毒性の問題を軽減することができる。転写をトランス活性化するタンパク質 をコードする遺伝子は、必要であれば、その発現に適した要素、例えば対象遺伝 子を発現させる要素のコントロール下においてもよい。

本発明は、アデノウィルス粒子に加えて、本発明によるアデノウィルスベクター を含んだ真核宿主細胞にも関する。上記細胞は有利には哺乳動物細胞、好ましく はヒト細胞であり、ゲノム中に組込み形で、または好ましくは非組込み（エピゾ ーム）形で上記ベクターを含むことができる。

本発明によるアデノウィルス粒子は、本発明によるアデノウィルスベクターに欠 陥がある機能をインドランスで付与するいずれかの補足系、例えば従来の系２９ ３、で継代により生産してもよい。これらの生産技術は当業者に知られている（ Ｇ＋ａｈａｍ　ａｎｄ　Ｐ＋ｃｖｅｃ、１９９１．Ｍｓｔｈｏｄｓ　１ｎＬｌｅ ｃｕｌａ＋　ＢｉａｌＢ２．ｖｏｌ、７．　ｌＮ−１２８，Ｅｄ：Ｂ、Ｉ、Ｍｕ ｔｔ７．ＴｈｅＨｕｍａｎ　Ｐｒｅ＋ｓ　Ｉｎｃ、）　。場合により、本発明に よるアデノウィルス粒子は、下記のような本発明による補足系で作製してもよい 。

よって、本発明は、特に！ＭＩＴＲを除くアデノウィルスのゲノムのＥ１領域の 部分を含む補足要素を含んだ補足系にも関し、上記補足要素は欠陥アデノウィル スベクターをインドランスで補い、上記補足系のゲノムに組込むかまたは発現ベ クター中に挿入することができる。

本発明に関して、“補足系”という用語は、アデノウィルスベクターに欠陥があ る機能をインドランスで付与しうる真核細胞に関する。換言すれば、それは上記 アデノウィルスベクターの複製および粗膜に必要なタンパク質、それ自ら生産で きないウィルス粒子を作る上で要求される初期および／または後期タンパク質を 生産することができる。当然ながら、上記部分はヌクレオチドの変異、欠失およ び／または付加により修飾してもよいが、但しこれらの修飾は補足性に関してそ の能力を損ってはならない。このため、８１機能に欠陥があるアデノウィルスベ クターは（ベクターが生産できないＥ１領域によりコードされるタンパク質また は一連のタンパク質をインドランスで供給できる）Ｅｌ用の補足系で増殖されな ければならず、Ｅｌおよび８４機能に欠陥があるベクターは（ＥｌおよびＥ４領 域によりコードされる必要タンパク質を供給する）ＥｌおよびＥ４用の補足系で 増殖され、最後にＥｌ、Ｅ２および８４機能に欠陥があるベクターはその３機能 用の補足系で増殖される。冒頭に挙げられたＥ３領域は非必須であり、特に補足 される必要はない。

本発明による補足系は、無制限に分裂しつる不死化細胞系または一次系から誘導 される。本発明により追求される目的によると、本発明による補足系はいずれか の欠陥アデノウィルスベクター、特に本発明による欠陥アデノウィルスベクター の粗膜に有用である。このため、“欠陥アデノウィルスベクター”という用語が 以下で用いられるとき、それは従来または本発明いずれかの欠陥ベクターに関す ると理解されるべきである。

“補足要素”は、本発明に関して使用上アデノウィルスゲノムの部分を少くとも 含んだ核酸を意味すると理解される。それは例えばプラスミドまたはウィルスタ イプのベクター、例えばレトロウィルスまたはアデノウィルスベクター、あるい はポックスウィルスに由来するものに挿入することができる。それでも、それが 本発明による補足系のゲノムに組込まれている場合が好ましい。ベクターまたは 核酸を細胞系中に導入して、できればそれを細胞のゲノムに組込む方法は、この ような目的に使用できるベクターのように、当業者に周知の慣用的技術である。

補足要素は本発明による補足系中に予めまたは欠陥アデノウィルスベクターに伴 い導入することができる。

特別の態様によると、本発明による補足系は８１機能に関して欠陥アデノウィル スベクターをインドランスで補うように考えられている。このような系は組換え のリスクを減少させるという利点を有しているが、その理由は従来の系２９３と 異なりベクター中に存在する５”ＩＴＲを欠いているからである。

本発明に関して、本発明による補足系はアデノウィルスのゲノムのＥＩＡ領域の 全部または一部と、（ｉ）　Ｅ　Ｉ　Ｂ、　Ｅ２およびＥ４領域から選択される アデノウィルスのゲノムのうち少くとも１領域の全部または一部、または （１１）上記ゲノムのＥＩＢ、Ｅ２およびＥ４領域のうち少くとも２領域の全部 または一部、または（ｉ　ｉ　ｉ）上記ゲノムのＥＩＢ、Ｅ２およびＥ４領域の 全部または一部 を含むことができる。

本発明に関して、上記領域はそれらを発現させる適切な要素のコントロール下に 必要であればおいてもよいが、ＥＩＡ領域によりコードされる転写をトランス活 性化するタンパク質により誘導しうるそれら自体のプロモーターのコントロール 下にそれらをおくことが好ましい。

指針として、ＥＩＡ、ＥＩＢおよびＥ４領域を含んだ例（ＩＩ）による補足系は 、ＥｌおよびＥ４領域に欠陥があって対応領域の全部または一部が欠失されたア デノウィルスの生産に向けられる。

有利な態様によると、本発明による補足系は、特にＥＩＡ領域の全部または一部 と、ＥＩＢ領域の初期タンパク質をコードする配列の全体を含んでいる。

更に、この態様の例によると、本発明による補足系はＥＩＡ領域のプロモーター 領域を更に欠くことができる。

この場合に、上記ＥＩＡ領域の初期タンパク質をコードするアデノウィルスのゲ ノムの部分は、上記補足系で機能する適切な異種プロモーターのコントロール下 におかれる。それはいずれの真核またはウィルス遺伝子からも単離することがで きる。しかしながら、初期領域のアデノウィルスプロモーターの使用は避けつる 。該当するプロモーターは構成プロモーターである。例として、５ｖ４０ウイル ス、ＴＫ−Ｈ３Ｖ−１遺伝子およびネズミＰＧＫ遺伝子プロモーターも挙げられ る。

一方、選択されるプロモーターは、非アデノウィルス転写をトランス活性化する タンパク質により調節および有利には誘導しつる。それは天然誘導性遺伝子から 単離されたプロモーターであっても、あるいは上記トランス活性化タンパク質に 応答する活性化配列（または上流活性化配列を表すＵＡＳ）の付加により修飾さ れたいずれのプロモーターであってもよい。更に具体的には、Ｓａｃｃｈａｕｍ ７ｃｅｓ　ｃｅ＋ｅｙｉｓｉｘｅ　Ｇ！＋４タンパク質により誘導されうるプロ モーター、好ましくは何らがの種類の遺伝子（例えば、ＴＫ−Ｈ３Ｖ−１遺伝子 またはＡｄ２ＭＬＰ）の転写開始配列（ＴＡＴＡボックスおよび開始部位）のみ を含むいわゆる“最小”プロモーターからなるハイブリッドプロモーターを用い ることが好ましく、その上流にはＳａｃｃｈａｒｏｍ７ｃｅｓ　ｃｅ＋ｅｖｉｓ ｉｘｅ　Ｇ！１１０遺伝子の少くとも１つの活性化配列が挿入される（Ｗｅｈｓ ｔｅｒ　ｅｊａｔ、、　１９８８．　Ｃｅ１ｌ、　５２．１６９−１７８）　、 後者の配列は化学的に合成しても、または遺伝子工学の標準技術に従いＧａ１ｌ Ｇ遺伝子から単離してもよい。こうしてハイブリッドプロモーターは活性化され 、Ｇａ１４タンパク質の存在下のみで、そのコントロール下におがれたＥＩＡ領 域によりコードされる遺伝子の発現を誘導する。次いでＥＩＡ領域の発現産物は 、本発明による補足系に場合により含まれる他のＥＩＢＳＥ２および／またはＥ ４初期領域の発現を誘導することができるようになる。本発明のこの具体的態様 は、補足性に必要なアデノウィルスタンパク質の構成的生産（おそらく毒性）を 回避する。このため、誘導はＧａ１４タンパク質を発現する本発明による欠陥ア デノウィルスベクターの存在下で誘発される。しかしながら、このような系はイ ンドランスでＧａ１４タンパク質を供給する条件でいずれかの欠陥アデノウィル スベクターを生産するために用いてもよい。インドランスでタンパク質を供給す る手段は当業者に知られている。

一般的に、補足系は動物アデノウィルスから有利に誘導されるアデノウィルス、 例えばイヌまたはトリアデノウィルス、あるいは好ましくはヒトアデノウィルス 、最も好ましくはタイプ２または５のゲノムの部分を含んでなる。

本発明による補足系は、 （１）参照番号Ｍ７３２６０としてＧｅｎｅｂｘｎｋデータバンクで開示されて いる配列のヌクレオチド１００〜ヌクレオチド５２９７、または （１１）ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド４０３４、または （ｉｉｉ）ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド４０３４にわたるヒトアデノウィ ルスタイプ５のゲノムの部分を特に含んでいる。

有利には、（１１）によるゲノムの部分は転写終結シグナル、例えばＳＶ４０　 （シミアンウィルス４０）またはウサギβ−グロビン遺伝子のポリアデニル化シ グナルの上流に挿入される。一方、ＥＩＡ領域のプロモーター配列もＥＩＢ領域 の転写終結シグナルも含まない（ｉｉｉ）の部分は、適切なプロモーター、特に Ｇａ１４タンパク質により誘導しうるプロモーターと、転写終結シグナル、例え ばウサギβ−グロビン遺伝子とのコントロール下におかれる。このような補足系 は特に安全であると考えられ、その理由はそれが欠陥アデノウィルスと共通した 配列の大部分を欠いているからである。

更に、本発明による補足系は、参照番号Ｍ７３２６０としてＧｅｎｅｂａｎｋデ ータバンクで開示されている配列のヌクレオチド３２８００から始まりヌクレオ チド３５８２６で終わるヒトアデノウィルスタイプ５のＥ４領域の部分を含むこ とができる。

更に、本発明による補足系は、粗膜化領域と、５′および３”ＩＴＲと、そして 最も好ましくは参照番号Ｍ７３２６０としてＧｅｎｅｂａｎｋデータバンクで開 示されている配列のヌクレオチド５０５から始まりヌクレオチド３５８２６で終 わるヒトアデノウィルスタイプ５のゲノムの部分とを除いて、天然アデノウィル スのゲノムの全体を含むことができる。本発明の目的から、この部分は適切なプ ロモーターのコントロール下におかれる。５ｘｃｃｈａ＋ａｍ７ｃｅ＋ｃｅｒｅ ｖロｉａｅ　Ｇａ１４タンパク質により誘導されうるプロモーターを用いるのが 好ましい。このような系によれば、Ｅｌ、Ｅ２および８４機能に欠陥があるアデ ノウイルスベクター、特に本発明による最小アデノウィルスベクターの複製およ び粗膜化に必須な機能のすべてをインドランスで補うことができる。

好ましい態様によると、本発明による補足系は、それを含有した細胞を検出およ び単離できる選択マーカーをコードする遺伝子を更に含んだ補足要素を含有する ことができる。本発明に関して、これは選択マーカーをコードするいずれの遺伝 子であってもよく、このような遺伝子、有利には抗生物質耐性に関する遺伝子、 好ましくはプロマイシン耐性を付与するプロマイシンアセチルトランスフェラー ゼ（ｐａｃ遺伝子）をコードする遺伝子は通常当業者に知られている。

本発明に関して、選択マーカーをコードする遺伝子は、その発現を行う適切な要 素のコントロール下においてもよい。これらには構成プロモーター、例えばＳＶ ４０ウィルス初期プロモーターがある。しかしながら、ＥＩＡ領域によりコード されるトランス活性化タンパク質で誘導されうるプロモーター、特にＥ２Ａアデ ノウィルスプロモーターが好ましい。このような組合せは、本発明による補足系 でＥＩＡ領域の遺伝子の発現を維持するための選択の圧力を誘導する。本発明の 目的から、選択されるプロモーターはヌクレオチドの欠失、変異、置換および／ または付加により修飾されていてもよい。

最も好ましい態様によると、本発明による補足系は薬学的観点から許容される細 胞系から誘導される。“薬学的観点から許容される細胞系”は、特徴付けられて （その起源および由来が知られている）および／またはヒト用の産物の大規模生 産（高度臨床試験用バッチまたは販売用バッチのアセンブリー）に既に用いられ た細胞系を意味すると理解されている。このような系はＡＴＣＣのような組織か ら入手できる。この点においては、Ｖｅｔｏアフリカミドリザル腎臓、ＢＨＫゴ ールデンまたは５７ｒｉｘｎハムスター腎臓系、肺癌腫に由来するＡ３４９ヒト 系と、ＭＲＣ５ヒト肺、Ｗ１３８ヒト肺およびＣＨＯチャーニーズハムスター卵 巣系が挙げられる。

一方、本発明による補足系は一次細胞、特にヒト胚から採取される網膜細胞から 誘導することができる。

本発明は本発明によるアデノウィルス粒子の生産方法にも関し、それによれば 一本発明によるアデノウィルスベクターが、トランスフェクトされた補足系を得 るために、上記ベクターをインドランスで補える補足系中に導入され、−上記補 足系が上記アデノウィルス粒子の生産を行うために適した条件に従い培養され、 および−上記粒子が細胞培養で回収される。

当然ながら、アデノウィルス粒子は培養上澄から、但し慣用的プロトコールによ り細胞からも回収される。

好ましくは、本発明による方法では本発明による補足系を用いる。

本発明の主題は、本発明によるアデノウィルスベクター、アデノウィルス粒子、 真核宿主細胞または補足系の治療または予防のための使用にも関する。

最後に、本発明は、薬学的観点から許容されるビヒクルとともに、本発明による アデノウィルスベクター、アデノウィルス粒子、真核細胞または相補細胞を治療 または予防剤として含んでなる、医薬組成物に関する。

本発明による組成物は、疾患、例えば −遺伝障害、例えば血友病、嚢胞性繊維症またはデュシエーヌおよびベラカータ イプ筋障害、−癌、例えば癌遺伝子またはウィルスにより誘導される癌、 −レトロウイルス疾患、例えばエイズ（ＨＩ　Ｖ感染に起因する後天性免疫不全 症候群）、および−再発ウィルス疾患、例えばヘルペスウィルス誘導感染の予防 または治療用として特に考えられている。

本発明による医薬組成物は常法で製造される。特に、治療有効量の治療または予 防剤が、ビヒクル、例えば希釈剤と組み合わされる。本発明による組成物はエア ゾールにより、あるいは当業界で使用上慣用的ないずれかの経路、特に経口、皮 下、筋肉内、静脈内、腹腔内、肺内または気管内経路により投与される。投与は １回分の用量で、またはある時間間隔後に１回以上繰返される用量で行う。適切 な投与経路および投与量は様々なパラメーター、例えば治療される個体または治 療される障害、あるいは移入される対象遺伝子に応じて変わる。一般的に言えば 、本発明による医薬組成物は１０〜１ｏ１４、有利には１０〜１０　、好ましく は１０〜１ｏ１１の本発明によるアデノウィルスの投与量を含む。医薬組成物、 特に予防目的に用いられるものは、薬学的観点から許容されるアジュバントを更 に含むことができる。

本発明は、本発明によるアデノウィルスベクター、アデノウィルス粒子、真核細 胞または補足系の治療有効量がこのような治療を要する患者に投与される治療方 法も包含している。

本発明は下記図面を参照して下記例により詳細に記載されている。

図１は、異なる遺伝子の位置を示した、ヒトアデノウィルスタイプ５のゲノムの （０〜１００の任意単位で表される）略図である。

図２はベクターｐＴＧ６５４６の略図である。

図３はベクターｐＴＧ６５８１の略図である。

図４はベクターｐＴＧ６３０３の略図である。

図５はベクターｐＴＧ１６６０およびｐＴＧ１６６１の略図である。

図６はベクターｐＴＧ１６５３、ｐＴＧ１６５４およびｐＴＧ１６５５の略図で ある。

図７はベクターｐＴＧ５９１３の略図テある。

図８はベクターｐＴＧ８５１２の略図である。

図９はベクターｐＴＧ８５１３の略図である。

図１０はベクターｐＴＧ８５１４の略図である。

図１１はベクターｐＴＧ８５１５の略図である。

撚 下記例は本発明の一態様のみを示している。

下記構築は、Ｍｘｎｉａ山ｅｔ　ａｌ、　（１９８９，Ｌｘｂｏｒａｊｏｒ７Ｍ ！ｎｕｘｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ＋ｂｏ＋、Ｌｘｂｏｒａ）ｏｒ７　 Ｐｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ）で詳述された遺伝子 工学および分子クローニングの一般的技術に従い行う。細菌プラスミドを用いる クローニングの選択工程はε５ｃｈｅ＋１ｃｈｉｘ　ｃｏ［ｉ（Ｅ、ｃｏｌｉ） 株５ＫまたはＢＪで継代により行なわれ、一方ファージＭ１３から誘導されたベ クターを用いる場合はＥ、ｃｏｌｉ　ＮＭ５２２で継代により行なわれる。ＰＣ Ｒ増幅の工程に関しては、ＰＣＲＰ＋ｏｔｏｃｏｌ＋　−Ａ　ｇｕｉｄｅ　ｔ。

ｍｅｌｈｏｄｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｆｉａｎｓ（１！１９（１，ｅｄＨ！ ｄ　ｂ７１ｎｎｉｓ。

Ｇｅ１ｆｘｎｄ、５ｎｉｎｓｋ７　ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ ｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、）で記載されたプロトコールが適用される。

更に、細胞は当業者に周知の標準技術に従いトランスフェクトする。リン酸カル シウム技術（Ｍｘｎｉｕ口ｅｊ　ｔｌ。

、　ｔｅｒａ）　も挙げられる。しがしながら、核酸を細胞内に導入させつる他 のプロトコール、例えばＤＥＡＥデキストラン技術、エレクトロポレーション、 浸透圧ショックに基づく方法、選択細胞のマイクロインジェクションまたはリポ ソームの使用に基づく方法も用いてよい。

下記の異なる構築体に挿入された断片は、−参照番号Ｍ７３２６０（！：　Ｌ　 テＧｅｎｅｂａｎｋチー　９　バンクｔ’開示されているＡｄ５ゲノム、 一参照番号１０１９４９としてＧｅｎｅｂａｎげ一タバンクで開示されているア デノウィルスタイプ２（Ａｄ２）ゲノム、−参照番号ＪＯ２４００としてＧｃｎ ｅｂｘｎｋデータバンクで開示されているＳＶ４０ウィルスゲノム のヌクレオチド配列でそれらの位置に従い正確に示されている。

ＮＩ：ａｌ［ｆ［呈旦４幻りＣ＊Ｇａ／ｕ亙二！！　１１１　（［Ｓ　”　７７ ’７３の欠失を含んだ“弱毒化”ベクターの組立て以下を含んだベクターニ ーＡｄ５ゲノムの５１ＴＲ（ヌクレオチド１〜ヌクレオチド１０３）、 −ヌクレオチド１８４〜ヌクレオチド２７３にわたる部分が欠失されて、１７６ 位のチミン（Ｔ）がＡａｔｌｌ制限部位を作るためにシトシン（ｃ）に変えられ た、ヌクレオチド１０４〜４５８にあるＡｄ５包膜化膜化領域５′から３′にか けてＡｄ２　ＭＬＰ　（ヌクレオチド５７７９〜６０３８）　、ＫｐｎＩ−Ｘｂ ａｌ−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限部位、ＣＦＴＲタンパク質を コードするヒトｃ　ＤＮＡ　（Ｒｉｏ＋ｄａｎ　ｅｌｌｌ、　、　１９８９．５ ｃｉｅｎｃｅ、　２４５．１０６６−１０７３　で公表された配列に相当するア ミノ酸組成；但し４７０位はメチオニンの代わりにバリン）、ＰｓｔＩ、Ｘｈｏ ｌおよび５ａｌＩ部位と、最後にＳＶ４０ウイルス転写終結シグナル（ヌクレオ チド２６６５〜２５３８）を含んでなる、対象遺伝子の発現用カセット、および −ヌクレオチド３３２９〜ヌクレオチド６２４１にわたるＡｄ５ゲノムの断片 を組み立てる。

第一段階では、ｐＭＬＰｌｌから単離されたＥｃｏＲｌ　−Ｓｍａ　Ｉ断片をベ クターＭｌ　３ＴＧ１３１　（Ｋｉｅｎ７Ｎ　ｘｉ、　、　１９８３．　Ｇｅｎ ｅ、　２６．９ｌ−９９）　のＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ部位間に組み込んで クローニングする。この組立てはｐ　Ｍ　Ｌ　Ｐ　１０　（Ｌｅｖｒｅ＋ｏ　ｅ ｔ　ａｌ、、　１９９１．Ｇｅｎｅ、　１０１゜１９５−２０２）から始めるが 、Ｈｉｎｄｌ１１部位におけるＳｍａ　Ｉ部位の導入により親ベクターとは異な る。ベクターＭ１３ＴＧ６５０１を得る。後者は、粗膜化領域のヌクレオチド１ ８４〜２７３間にある配列を欠失させるために、特定部位変異誘発に付す。特定 部位変異誘発では供給業者の勧めに従い市販キット（Ａｍｅｒｓｈｘｍ）を用い て行い、配列確認Ｎα１（配列番号１）で示されたオリゴヌクレオチド○ＴＧ４ １７４を用いる。変異ベクターをＭｌ　３７Ｇ６５０２と命名した。こうして欠 失された粗膜化領域はＥｃｏＲＩおよびＳｍａ　Ｉで切断されたベクター９ＭＬ Ｐ１１中にＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌｌ断片の形で再導入するが、そのＢｇｌ１１部 位はフレノウＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑化されている。

得られたベクターｐＴＧ６５００をＰｓｔＩで部分的に切断し、ファージＴ４　 ＤＮＡポリメラーゼで処理し、その後Ｐｖｕ　Ｉで切断する。（ｐＭＬＰｌｌか ら誘導された）ｐＴＧ５９５５から単離されたＰｖｕＩ−ＨｐａＩ断片をこのベ クター中に挿入する。この断片はＳＶ４０ウィルス転写終結シグナルとヌクレオ チド３３２９〜ヌクレオチド６２４１にわたるＡｄ５ゲノムの部分を含んでいる 。こうして形成されたベクターｐＴＧ６５０５を５ｐｈＩで部分的に切断し、フ ァージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで処理し、再結合させるが、この目的はポリリ ンカーの５′末端に位置するｓｐｈ　Ｉ部位を壊すことである。これによりｐＴ Ｇ６５１１を得て、その中に、ＢａｍＨＩ切断およびフレノウＤＮＡポリメラー ゼ処理後に、ヒトＣＦＴＲｃＤＮＡ＠ＸｈｏＩ−ＡｖａＩ切断およびフレノウＤ ＮＡポリメラーゼ処理により形成された平滑末端化断片の形で組み込んでクロー ニングする。

ｐＴＧ６５２５を得る。指針として、ＣＦＴＲｃＤＮＡは従来のプラスミド、例 えばｐＴＧ５９６０（Ｄａｌｅｍａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９９１．Ｎａｔｕｒ ｅ、３５４．５２６−５２８）から単離する。

４６の欠失を含んだ“弱毒化”ベクターの組立てベクターＭｌ　３ＴＧ６５０１ を、オリゴヌクレオチド０ＴＧ４１７３（配列番号２）を用いる特定部位変異誘 発に付す。次いで変異断片を前記のようにｐＭＬＰ１１中に再導入して、ベクタ ーｐＴＧ６５０１を得る。後者をｓｐｈ　Ｉで切断し、ファージＴ４　ＤＮＡポ リメラーゼ、その後Ｐｖｕ　Ｉで処理する。ｐＴＧ６５４６　（図２）は、ｐＴ Ｇ６５２５から単離されたＰｖｕ　Ｉ　−Ｋｐｎ　Ｉ断片（ＫｐｎＩ部位は平滑 化されている）をクローニングして、ヒトＣＦＴＲｃＤＮＡを含有させることに ょ３５８の欠失を含んだ“弱毒化”ベクターの組立てベクターＭ１３ＴＧ６５０ １を、粗膜化領域のヌクレオチド２８７〜３５８間にある配列を欠失させるため に特定部位変異誘発に付し、Ｎｃｏ１部位を導入するために２７５および２７６ 位のチミンをグアニンに変えて、Ｎｃｏ１部位を導入する。変異誘発はオリゴヌ クレオチド０ＴＧ４１９１　（配列番号３）を用いて行い、Ｍ１３ＴＧ６５０７ を得る。後者をＢｇｌｌ＋で開裂させ、フレノウＤＮＡポリメラーゼで処理し、 その後ＥｃｏＲＩで切断し、対応変異断片を精製し、ＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩ で切断されたｐＭＬＰ１１中に導入する。

ｐＴＧ６５０４を得て、それから５ｐｈＩ　（ファージＴ４　ＤＮＡポリメラー ゼ処理で平滑化された部位）−Ｐｖｕ　Ｉ断片を単離し、ｐＴＧ６５１１のＫｐ ｎＩ部位（Ｔ４ポリメラーゼ処理で平滑化）とＰｖｕ　１部位との間に挿入する 。ｐＴＧ６５１３を得て、これをＢａｍＨＩおよびフレノウＤＮＡポリメラーゼ で処理してから、ｐＴＧ５９６０のＡｖａＩおよびＸｈｏＩ断片を挿入して、ｐ ＴＧ６５２６を得る。

４、欠陥および弱毒化組換えアデノウィルスの作製欠陥組換えアデノウィルスは 、相同的組換えで組換えウィルスを得るために、Ｃ１ａＩおよびＡｄ−ｄ１３２ ４ゲノムＤ　Ｎ　Ａ　（Ｔｈｉｍｍａｐｐａ７ｘ　ｅｌ　ａｌ、、　１９８２． 　Ｃｅ１１．３１．５４３−５５１）で直鎖化されて更にＣ１ａＩで切断された ｐＴＧ６５２５、ｐＴＧ６５２６またはｐＴＧ６５４６の２９３細胞中へのコト ランスフェクションにより作製する。８〜１０日後、個々のプラークを単離し、 ２９３細胞で増幅させ、制限地図作製により分析する。ウィルスストック（Ａｄ ＴＧ６５２５、ＡｄＴＧ６５２６およびＡｄＴＧ６５４６）を集め、それらの力 価を慣用的技術に従い調べる。

ＡｄＴＧ６５４６ウイルスは、野生型粗膜化領域を含むＡ　ｄ　−ＣＦ　ＴＲ（ Ｒｏｓｅｎｌｅｌｄ　ｅｌ　ａｌ、、１９９２．Ｃｅ１ｌ、６８，１４３−１５ ５１　との同時感染により、競合状況下におく。２９３細胞を細胞当たり５ｐｌ ｕ（、、’リーダ形成単位）のＡｄ−ＣＦＴＲおよび５　ｐｌｕのＡｄＴＧ６５ ４６で感染させる。

並行して、全ウィルスＤＮＡをＨｉＮ’ｉ法（Ｇｌｕｘｍａｎ　ａｎｄＶａｎ　 Ｄｏｚｅｎ、　１９８３．１．　Ｖｉ＋ｏ１．、４５９ｌ−１０３）　により単 離し、粗膜化ウィルスＤＮＡを０．　％デオキシコール酸とその後１０μｇ／ｍ 　ｌのデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮアーゼ）■で細胞を処理した後に単離し て、ピリオンで保護されていないＤＮＡを除去すＺ０全Ａｄ−ＣＦＴＲおよびＡ ｄＴＧ６５４６　ＤＮＡの量は同一であるが、粗膜化ＡｄＴＧ６５４６　ＤＮＡ の約３倍の粗膜化Ａｄ−ＣＦＴＲＤＮＡがある。

ＡｄＴＧ６５４６感染２９３細胞の細胞抽出物中におけるＣＦＴＲタンパク質の 発現のレベルを測定する。分析はＤａｌｅｍａｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　（１９９１ ，Ｎａｔｕｒｅ、５ｕｐｒａ）に記載された技術に従いウェスタンブロッティン グによりモノクローナル抗体ＭＡＴＧ１０３１を用いて行う。しかしながら、Ｃ ＦＴＲタンパク質の抗原性エピトープを認識するいずれの他の抗体も用いてよい 。約１７０　ｋＤａの予想分子量の産物を検出する。指針として、生産のレベル は未刊毒化Ａｄ−ＣＦＴＲウィルスで感染された細胞抽出物で得られる場合にお およそ等しい。

例２：ＥＩＡ領域とＥＩＢ領域の初期タンパク質をコードする配列の全体が欠失 された欠陥アデノウィルスの作このようなアデノウィルスは、５′から３′にか けて−Ａｄ５　５−ＩＴＲ（ヌクレオチド１〜１ｏ３）、−Ａｄ５包膜化膜化領 域クレオチド１０４〜４５８）、−下記要素を含んだ発現カセットを含む外来ヌ クレオチド。

・Ａｄ２　ＭＬＰ　（ヌクレオチド５７７９〜６０３８）、その後Ａｄ２の３つ の三部分リーダー（ヌクレオチド６０３９〜６０７９　；ヌクレオチド７１０１ 〜７１７５；ヌクレオチド９６３７〜９７１２）；これらのリーダーは下流に挿 入された配列の翻訳の効率を増加させるために含まれる、 ・対象遺伝子のクローニングに使用しうるＸｂａＩ、Ｈｉ　ｎｄｌｌｌ　、Ｂａ ｍＨＩＳＥｃｏＲＶ、Ｈｐａ　ＩおよびＮｏｔＩ制限部位を５′から３′にかけ て含んだポリリンカー、 ・対象遺伝子、例えばＣＦＴＲタンパク質をコードする遺伝子、 ・ＳＶ４０ウイルスから単離された転写終結シグナル（ヌクレオチド２５４３〜 ２６１８）、−ヌクレオチド４０４７〜６２４１にわたるＡｄ５アデノウィルス ゲノムの部分 を含んだプラスミドベクターｐＴＧ６５８１から作製する。

ヌクレオチド４０４７〜ヌクレオチド４６１４にわたるＡｄ５ゲノムの断片をＡ ｄ５ゲノムＤＮＡからＰＣＲにより増幅させる。ＰＣＲ反応では、後のクローニ ング工程を容易にするためにＢａｍＨ１部位を５′末端に含むセンスプライマー ０ＴＧ５０２１　（配列番号４）とアンチセンスプライマー０ＴＧ５１５７　（ 配列番号５）を用いる。こうして形成された断片をフレノウＤＮＡポリメラーゼ で処理してから、Ｍ　１３　ｍ　ｌ）　１８　（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）のＳｍａ 　Ｉ部位中に組み込んでクローニングして、Ｍ１３ＴＧ６５１７を得る。ＰＣＲ で形成された断片の配列は、標準酵素方法（Ｓａｎｇｅ【ｅｌ　ａｌ、、１９７ ７、Ｐ＋ｏｃ、ＮａＮ、Ａｃ１ｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７４．５４６３）に従い確認する。

別に、Ｐｖｕ　Ｉ　−Ｓｍａ　Ｉ断片をｐＭＬＰｌｌから単離する。それをｐＴ Ｇ６５１１　（例１．１）のＰｖｕ　Ｉと〜ｐｎ１部位間に組み込んでクローニ ングするが、ＫｐｎＩ部位は標準方法に従いファージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼ 処理で平滑化されている。ベクターｐＴＧ６５４７はこうして形成する。

後者を酵素５ａｌｌおよびＢｓ　ｔＸＩで切断し、２つの断片に結合させるが、 一方はＭ１３ＴＧ６５１７の精製ＢａｍＨＩ　−Ｂｓ　ｔＸＩ断片で、他方はｐ ＴＧ６１８５のＸｈｏ　Ｉ　−Ｂｇ　ＩＩＩ断片である。後者はＸｈｏＩおよび Ｂ　ｇ　ｌ　ｌ！制限部位に隣接するＳＶ４０ウィルス転写終結シグナルを特に 含んでいる。しかしながら、同様の終結配列と適切な制限部位を含んだいずれか 他のプラスミドも使用できる。ベクターｐＴＧ６５５５を得るが、その中に、２ つの制限部位形成平滑末端ＥｃｏＲＶおよびＨｐａＩを含むアダプターを唯一の ＢａｍＨＩ部位に挿入する。このアダプターはオリゴヌクレオチド０ＴＧ５５６ ４および０ＴＧ５５６５　（配列番号：６および７）の組換えから形成する。ｐ ＴＧ６５８０を得る。最後に、末端が平滑化されてヒトｃＦＴＲｃＤＮＡを含む ｐＴＧ６５２５の５ａｃｌ−Ｐｓｔｌ断片を、ｐＴＧ６５８０のＥｃｏＲＶ部位 中に組み込んでクローニングする。ｐＴＧ６５８１　（図３）を得る。

対応組換えアデノウィルスＡｄＴＧ６５８１は、標準プロトコールに従い、Ｅ１ 機能用の補足系、例えば系２９３または例６の系中への、双方ともＣ１ａＩで開 裂されたｐＴＧ６５８１およびＡｄ　ｄ１３２４のコトランスフエクションによ り得る。

２、ＩＦＮ−７発現用の組換えアデノウィルスの生産ベクターｐＴＧ６３０３　 （図４）を、Ｍ１３ＴＧ２４３７のＨｐａｌ−５ｍａＩ断片をｐＴＧ６５８０の ＨｐａＩ部位中に組み込んでクローニングすることにより得る。上記断片は、配 列がＧｒｉ７　ｅｔ１＋、　（１９８２，Ｎｘｔｕｒｅ。

２９５、５０３−５０８）で特定されているインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ） をコードする遺伝子をベクターＭ　ｌ　３　Ｔ　Ｇ　１３０　（ＫｉｅＢ　ｃｌ 　ｓｌ、、１９８３，５ｕｐｒｚ）　に組み込んでクローニングすることにより 得る。組換えアデノウィルスＡｄＴＧ６３０３は、標準技術に従い、Ｅ１機能に 関する補足系中へのＣ１ａＩで直鎖化されたｐＴＧ６３０３およびＡｄ　ｄ１３ ２４のコトランスフエクションに基づく相同的組換えにより得る。

３、Ｅ１領域が欠失されてＥ３領域が構成プロモーターのコントロール下におか れているアデノウィルスの作製ベクターｐＴＧ１６７０は、ベクターｐポリＩＩ （Ｌａｔｈｅｃｌ　１１．、１９８７．　Ｇｅｎｅ、　５７．１９３−２０１） のＡａｔｌｌ−ＢａｍＨ■部位間にＲ３Ｖウィルス（ラウス肉腫ウィルス）３′ ＬＴＲ（、長末端反復）を含むＰＣＲ断片をクローニングすることにより得る。

ＰＣＲ反応では、鋳型としてベクターｐ　ＲＳ　Ｖ／　Ｌ　（Ｄｅ　Ｗｅｔ　ｅ ｔ　！１．．１９８７．Ｍｏ１．ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ。

７、７２５−７３７）と、プライマー○ＴＧ５８９２および○ＴＧ５８９３　（ 配列番号８および９）を用いる。

別に、Ｅ３領域の５′部分（ヌクレオチド２７５８８〜２８６０７）は、ベクタ ーｐＴＧ１６５９からプライマー０ＴＧ５９２０および０ＴＧ５８９１　（配列 番号１０および１１）を用いたＰＣＲにより増幅させる。後者のベクターは数工 程で組み立てる。ＢａｍＨＩ−Ａｖｒｌｌ断片（ヌクレオチド２１５６２〜２８ ７５２）をＡｄ５ゲノムＤＮＡから得て、その後ｐＴＧ７４５７の同部位間に組 み込んでクローニングして、ｐＴＧ１６４９を得る。

ベクターｐＴＧ７４５７は、特にＡｖｒ１１部位を含むようにポリリンカー中で 修飾されたｐ　Ｕ　Ｃ１９（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）である。次いでＭ１３７Ｇ１ ６４６　（例８）のＥｃｏＲＩ　（フレノウ）−Ａｖｒｌｌ断片をＡｖｒｌｌＮ ｄｅＩ（フレノウ）で開裂されたｐＴＧ１６４９中に導入して、ベクターｐＴＧ １６５１を得る。最後に、ｐＴＧ１６５９を、Ａｖｒｌｌで直鎖化されたｐＴＧ １６５１中にＡｄ５ゲノムＤＮＡの精製Ａｖｒｌｌ断片（ヌクレオチド２８７５ ２〜３５４６３）を挿入することにより得る。ＰＣＲ断片をｐポリ１１のＸｂａ Ｉ〜ＢａｍＨＩ部位間に組み込んで、ｐＴＧ１６７１を得る。次いでｐＴＧ１６ ７０から得られたＥｃｏＲＶ−Ａａｔｌｌ断片をｐＴＧ１６７１のＡａｔ１１部 位に挿入して、ｐＴＧ１６７６を得る。

ヌクレオチド２７３３１〜３００４９に相当するＡｄ５のＥｃｏＲＩ断片をゲノ ムＤＮＡ調製物から単離し、ＥｃｏＲＩで既に開裂されたｐ　ＢＩｕｅｔｃ＋ｉ ｐｊ　−Ｓ　ｋ　＋（Ｓ＋ｒａ１ｇｏｎｅ）中に組み込んでサブクローニングす る。

ｐＴＧ１６６９を得る。後者は２７８６７位（変異原性オリゴヌクレオチド０Ｔ Ｇ６０７９；配列番号１２）または２８２４９位（変異原性オリゴヌクレオチド ＯＴＧ６０８０；配列番号１３）でＢａｍＨ１部位を導入することにより変異さ せる（Ａｍｅ＋ｓｈａｍ　ｋＮ）。ｐＴＧ１６７２およびｐＴＧ１６７３３を各 々得る。Ｒ３Ｖ　３−ＬＴＲＩ、：続いてＥ３領域の５′部分を含むＢａｍＨＩ −ＢｓｉＷＩ断片をベクターｐＴＧ１６７６から単離し、先の工程で得られたベ クターのＢａｍＨＩ部位（２７３３１または３００４９位）とＢｓｌＷ部位（２ ８３９０位）との間に挿入して、ｐＴＧ１９７７およびｐＴＧ１９７８を得る。

次いでこれら２つのベクターの各々から得られたＥｃｏＲＩ断片を野生型Ｅｃｏ ＲＩ断片の代わりとしてｐＴＧ１６７９に組込む。ｐＴＧ１６７９−Ｅ３　を得 る。参考のため、ベクターｐＴＧ１６７９はｐＴＧ６５８４（例３．１）のＢｓ ｔＥＩ１部位とＢａｍＨ１部位（クレノウボリメラーゼ処理により平滑化された 部位）との間に組み込まれたｐＴＧ６５９０　（例３．１）のＢｓｔＥＩＩ−Ｋ ｐｎｌ断片（Ｔ４ポリメラーゼ処理によ　゛り平滑化された部位）のクローニン グから得る。

アデノウィルス粒子は、ｐＴＧ１６７９−Ｅ３＋のＡａｔｌｌ断片とアデノウィ ルスベクター、例えばＡｄｄ１３２４またはＡｄ−Ｒ３Ｖβ−ｇａｌとの間でＥ １機能用の補足系における相同的組換えにより作製する。後者はＥ１領域の代わ りにβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を含んている（Ｓｔ＋ａｌｌｏ＋ｄ−Ｐｅ＋＋ １ｃａｕｄｅｔ　ｅ＋　！＋、、１９９２゜］、　Ｃｌ１ｎ、　１ｎｖｅｕ、、 　９０．６２６−６３０）。

例３　ＥｌおよびＥ３領域の部分的欠失による改善されたクローニング能力を有 した組換えアデノウィルスベタヌクレオチド２フ３２５〜２フ８フ１間にあるＡ ｄ５ゲノムの部分を有した断片を、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物からプライマー〇 ＴＧ６０６４およびプライマー０ＴＧ６０６５　（配列番号１４および１５）を 用イたＰｃＲにより増幅させる。０ＴＧ６０６５はその５′末端にＢｓｍＩ部位 を含むが、これはＥ３領域でも（３０７５０位に）存在している。

増幅された断片をＭｌ　３ｍｐ　１８のＳｍａ　１部位に組み込んでクローニン グし、Ｍ１３７Ｇ６５２３を得る。

ＥｃｏＲＩ−ＢｓｍＩ断片を後者から単離し、同酵素で開裂されたベクターｐＴ Ｇ６５９０中に導入する。ｐＴＧ６５９０Δ３が得られ、これはアデノウィルス ゲノムの３″部分（ヌクレオチド２７０８２〜３５９３５）を含んでいるが、そ の部分からはヌクレオチド２７８７２〜３０７４０間にあるＥ３領域が欠失され 、一方Ｅ３領域のもっと小さな部分（２８５９２〜３０４７０位）はｐＴＧ６５ ９０から欠失されていた。ベクターｐＴＧ６５９０は下記のようにして得る。ヌ クレオチド３５２２８〜３５９３５にわたる断片（３−ＩＴＲを含む）をＡｄ５ ゲノム調製物からプライマー０ＴＧ５４８１および０ＴＧ５４８２　（配列番号 １６および１７）ニよるＰＣＲで形成する。次いでこの断片をＭｌ　３ｍｐ　１ ８のＳｍａ■部位に組み込んでクローニングし、Ｍ１３７Ｇ６５１９を得る。別 に、ベクターｐＴＧ６５８４をＸｂａＩで切断し、その後Ｅ３領域の対応断片を 除去するために再結合させる。ｐＴＧ６５８９を得て、これをＢａｍＨＩで開裂 させ、フレノウで処理し、その後ＢｓｔＥＩｌで切断する。Ｍ　１３　Ｔ　Ｇ　 ６５１９の精製ＥｃｏＲＩ　（フレノウ）−ＢｓｔＥＩＩ断片をこうして処理さ れたベクター中に導入して、ｐＴＧ６５９０を得る。

参考のため、ベクターｐＴＧ６５８４は唯一の５ｐｅｌ部位（２７０８２位）〜 Ｅ４領域のプロモーター領域の開始部（３５８２６位）にわたるＡｄ５配列を含 んだｐｌＪｃ１９ベクター（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ）である。それはｐＴＧ１６５ ９　（例２．３）を５ａｌｌおよび５ｐｅｌで切断し、フレノウＤＮＡポリメラ ーゼで処理し、その後再結合させることにより得る。

ｇ　＋）　１９　ｋＤａをコードするＡｄ５のＥ３領域の部分（ヌクレオチド２ ８７３１〜２９２１７）を、Ａｄ５ゲノムＤＮＡｆｉ製物からプライマー０ＴＧ ５４５５および０ＴＧ５４５６　（配列番号１８および１９）を用いたＰ　Ｃ’ Ｒにより得る。形成された断片をＭｌ　３ｍｐ　１８のＳｍａ１部位中に導入し て、Ｍ１３７Ｇ６５２０を得る。後者のＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片を単、離して 、ｐＴＧ１６７０（例２．３）のＡａｔ１１部位に組み込んでクローニングする が、その部位はフレノウＤＮＡポリンラーゼ処理で平滑化されている。次いで先 の工程のベクターの精製Ｘｂａｌ断片をベクターｐＴＧ６５９０ΔＥ３（例３゜ １）のＸｂａ１部位中に挿入する。

３、アデノウィルス粒子の生産 組換えウィルス粒子を、ＡｄＴＧ６３０３またはＡｄＴＧ６５８１ゲノムＤＮＡ から単離された５ｐｅｌ断片と例３．１および３．２のベクターのどれかとの結 合により得る。次いで結合混合物を８１機能に関する補足系中にトランスフェク トする。

ヌクレオチド３１８０３〜３２７９９および３５８２７〜３５９３５にわたるア デノウィルスゲノムの部分を、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物からプライマーＯＴＧ 　５７２８および０ＴＧ５７２９　（配列番号２０および２１）と０ＴＧ５７３ ０および０ＴＧ５７８１　（配列番号２２および１６）を各々用いて増幅させる 。約１０回の増幅サイクル後に、反応はオリゴヌクレオチド０ＴＧ５７２８およ び○ＴＧ５７８１を用いて２反応混合物の一部に基づき続ける。増幅断片はヌク レオチド３１８０３〜３５９３５にわたり、Ｅ４領域の全部（３２８００〜３５ ８２６位）が欠失している。ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌ切断後に、それを Ｍｌ　３ｍｐ　１８の同部位間に組み込んでクローニングし、Ｍ１３ＴＧ６５２ １を得る。

Ｍ１３ＴＧ６５２１をＥｃｏＲＩで切断し、フレノウＤＮＡポリメラーゼで処理 し、その後Ｂｓ　ｔＸＩで開裂する。３−　ＬＴＲを含んだ０．４６ｋｈ断片を フレノウＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑化されたＢａｍＨ１部位とｐＴＧ６５８ ４　（例３，１）のＢｓｔＸＩ部位との間に挿入する。ｐＴＧ６５８７を得て、 これをＸｂａｌで切断し、その後それ自体と再結合させ、ｐＴＧ６５８８（Ｅ３ の欠失）を得る。

オリゴヌクレオチド０ＴＧ６０６０．０ＴＧ６０６１．０ＴＧ６０６２および０ ＴＧ６０６３　（発刊番号２３〜２６）の組換えから得た合成りＮＡ断片をｐＴ Ｇ６５８８のＰａｃＩ部位中に導入する。これによりｐＴＧ８５００を得て、そ の中におけるＬ５後期遺伝子の転写終結シグナルを改善する。

Ｅ４領域の全部（ヌクレオチド３２８００〜３５８２６）とＥ３領域のＸｂａＩ 断片（ヌクレオチド２８５９２〜３０４７０）が欠失されたゲノムを有するアデ ノウィルス粒子（ＡｄΔＥ４）を、ｐＴＧ８５００またはｐＴＧ６５８８とＡｄ ５から単離された５ｐｅＩ断片の結合により形成する。結合混合物を８４機能に 関する相補細胞系、例えば系Ｗ　１６２　（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ　ａｎｄ　Ｋｅｌ ｎｅｒ、　１９８３゜Ｐ＋ｏｃ、　Ｎａｐ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、 　８０．５３８３−５３８６）中にトランスフェクトする。Ｅｌおよび８４機能 に欠陥があるアデノウィルス（ΔＥ１、ΔＥ４）は、Ａｄ　ｄ１３２４ゲノムと Ｓｐｅ　Ｉで直鎖化されたプラスミドｐＴＧ８５００またはｐＴＧ６５８８との 結合混合物のＥｌおよびＥ４に関する補足系（例えば、例８の系）中へのトラン スフェクションにより得る。

更に、下記のように行うことも可能である。ｐＴＧ１６５９（例２，３）から単 離された５ｐｅＩ−３ｃａＩ断片をこれら同酵素で開裂されたベクターｐＴＧ６ ５８８中に組み込んでクローニングし、ｐＴＧ６５９１を得る。後者はヌクレオ チド２１０６２〜３５９３５のＡｄ５配列を含んでいるが、そこからは上記のよ うにＥ４領域の全部とＥ３領域のＸｂａＩ断片が欠失されている。

上記の合成りＮＡ断片をＰａｃＩで切断されたベクターｐＴＧ６５９１中に導入 して、ｐＴＧ６５９７を形成する。アデノウィルス粒子は、５ｐｅＩで開裂され たＡｄｄ１３２４ゲノムＤＮＡとＢａｍＨＩで開裂されたプラスミドｐＴＧ６５ ９１またはＩ）ＴＧ６５９７との相同的組換えにより得てもよい。

例５：　“最小”ウィルスの作製 いわゆる“最小”アデノウィルスベクターは、プラスミド中に下記要素。

−Ａｄ５　５−ＩＴＲ（ヌクレオチド１〜１０３）、−Ａｄ５包膜化膜化領域ク レオチド１０４〜４５８）、−下記を含む外来ヌクレオチド配列： ・自然調節にできるだけ近い発現の調節を得るために、好ましくは自己のプロモ ーターの存在下におかれた、治療対象の第一遺伝子、 ・ＴＫ−Ｈ３Ｖ−１遺伝子からなる対象の第二遺伝子、・場合により、粗膜化さ れるゲノムの全サイズが３０〜３６ｋｂであるような粗膜化または複製の効率の 理由から加えられる、何らかの種類のヌクレオチド配列、・高等真核細胞で機能 的なプロモーターのコントロール下におかれた５ｘｃｃｈａ＋ｏｍｙｃｅ＋　ｃ ｅ＋ｅｖｉｓｉａｅ　Ｇａ１４タンパク質（Ｌａｕｇｈｏｎ　ａｎｄ　Ｇｅ５ｌ ｅｌａｎｄ、　１９８４．　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　４゜２６０ −２６７）をコードする配列、および−Ａｄ５　３−ＩＴＲ（ヌクレオチド３５ ８３３〜３５を組み込んでクローニングすることにより形成する。

これらの異なる要素のアセンブリーは分子生物学の標準技術に従い行う。このよ うなベクターを含んだ感染性ピリオンの生産は例７の補足系で上記のように行う 。

例６・８１機能をインドランスで補える相補細胞の形成この細胞は以下を含んで いる； 一遺伝子が５Ｖ４Ｑウィルス初期プロモーター（ヌクレオチド５１７１〜５２４ ３）のコントロール下におかレテ、３′末端にＳＶ４０転写終結シグナル（ヌク レオチド２５４３〜２６１８）を含んだ、ｐａｃ遺伝子の発現用カセット。用い られたｐａｃ遺伝子は、Ｌｘｃｘｌｌｅ　ｅｊａｌ、　（１９８９，Ｇｅｎｅ、 　７９．３７５−３８０）に開示された配列のヌクレオチド２５２〜ヌクレオチ ド９０５にわたり、公表配列と比べて４つの変更点（３０５位でＣの代わりにＡ ；３６７位でＣの代わりにＴ　；　８０４位でＧの挿入；８２０位でＧの欠失） を含んだ断片に相当する。

−ヌクレオチド１００〜５２９７にわたるＡｄ５ゲノムの断片。この断片は、自 己のプロモーターおよび転写終結シグナルをもったＥＩＡおよびＥＩＢ領域と、 Ｅ２領域のフラクションを含んでおり、このためタンパク質１ｘをコードする配 列と重複している。指針として、系２９３は機能性タンパク質ＩＸを生産するこ とができないらしい。

組立ては以下で詳述されたいくつかの工程で行う。ベクターｐポリｌ１ｌ−Ｉ　 （Ｌａｔｈｅ　ｅ＋　ａｌ、、ｌ９８７ｔＧｅｎｅ、５７゜１９３−２０１）を 酵素ＡｃｃｌおよびＥｃｏＲＩによる切断に付す。プラスミドｐＴＧ６１６４か ら単離されたＥｃ。

ＲＩ−Ｃ１ａＩ断片をこうして処理されたベクター中に組み込んでクローニング する。ベクターｐＴＧ６５２８を得る。

プラスミドｐＴＧ６１６４はｐ　Ｌ　Ｘ　Ｓ　Ｎ　（Ｍｉｌｌｃ＋　Ｄ。

１９８９、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ＋、　７．９８０）から誘導し、ＳＶ ４０ウィルス初期プロモーターのコントロール下におかれたｐａｃ遺伝子を含ん でいる。簡単に言えば、ｐＬＸＳＮのＨｉ　ｎ　ｄｌｌｌ−Ｋｐ　ｎ　Ｉ断片を Ｍ１３ＴＧ１３１中に導入して、Ｍ１３ＴＧ４１９４を得る。ｐＭＰＳＶ　Ｈ２ Ｋ　Ｉ　Ｌ　２　Ｒ（Ｔａｋｅｄａ　ｅｌ　ａｌ、、１９８８．Ｇｒｏｗｔｈ　 Ｆｘｃｔｏｒ＋。

１、５９−６６）　のＮｈｅＩ−ＫｐｎＩ断片を後者に挿入し、ＮｈｅＩおよび Ｋｐｎｌで切断して、Ｍｌ　３７Ｇ４１９６を得る。後者をＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ ＬＫ　ｐ　ｎ　Ｉで切断し、Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ切断および部分的Ｋｐｎｌ切 断から得たｐＬＸＳＨの精製断片をクローニングする。ｐＴＧ５１９２を得る。

後者をＨｉｎｄｌｌｌ　と部分的にＮｈｅＩで切断し、ｐ　Ｂａｂｃ　Ｐｕ＋ｏ （Ｌａｎｄ　ｅｌ　ａｌ、、　１９９０．Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｄ、 　、　１８．３５８７）のＨｉｎｄｌｌｌ−ＮｈｅＩ断片を導入して、ｐＴＧ６ １６４を得る。

ベクターｐＴＧ６５２８をＰｓ　ｔ　Ｉテ切断し、ＳＶ４０転写終結シグナルを 含んだｐＴＧ６１８５　（例２．１）から単離されたＰｓｔＩ断片をこの部位に 導入する。

ｐＴＧ６５２９を得る。後者をＥｃｏＲＩ−Ｈｐａｌ切断に付し、２断片と結合 させるが、一方はＡｄ５ゲノムＤＮＡの精製ＢｓｐＥＩ−Ｂｃｇｌ断片（８２６ 〜５２９７位）で、他方はＥｃｏＲＩおよびＢｓｐＥＩ末端でＰＣＲにより形成 された断片であって、ｐＴＧ６５３１を得る。ＰＣＲ断片はＡｄ５ゲノムＤＮＡ とプライマー０ＴＧ４５６４および０ＴＧ４５６５　（ＳＥＱ　１０　Ｎｏ：２ ７および２８で記載）からの遺伝子増幅により得る。増幅断片を酵素ＥｃｏＲＩ およびＢｓｐＥＩで切断し、先の段落で記載されたように結合させる。

ベクターｐＴＧ６５３１は同方向に２つの転写単位（Ｅｌ領域の単位とｐａｃ遺 伝子の単位）を含んでいる。

転写で干渉を避けるためには、それらはｐＴＧ６５３１をＢａｍＨｌで処理して 再結合させることにより頭−尾（互いに逆）方向におく。ベクターｐＴＧ６５３ ３は２単位の逆方向を示すクローンに相当する。

ベクターｐＴＧ６５３３をリン酸カルシウム技術により哺乳動物細胞系、例えば Ｖｅｒｔｒ　（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ８１）またはＡｓ２９　（ＡＴＣＣ，ＣＣＬ１ ８５）系中にトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を供給業者の 勧めに従い培養し、プロマイシン（濃度６μｇ／ｍｌ）含有選択培地にトランス フェクション後２４時間おく。耐性クローンを選択し、そこではＥ１領域の遺伝 子の発現について最も生産的なりローンを調べるために評価するが、これは８１ 機能に欠陥があるアデノウィルス、例えば例２で詳述されたものの生産用の補足 系として用いてよい。

Ｅ１領域の初期タンパク質をコードする配列の発現は、アイソトープ３２Ｐで標 識された適切なプローブを用いて、ノーザンブロツティングにより分析する。

ＥＩＡ領域でコードされたタンパク質の生産は、細胞をアイソトープ３５Ｓで標 識した後に市販抗体（Ｏｎ　ＣＯｇ　ｔ　ｎ　ｅＳｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ、、ｒ ｅｆｅｒｅｎｃｅ　ＤＰＩＩ）を用いた免疫沈降により検出する。

（Ｅ　Ｉ　Ｂ　ｍＲＮＡのノーザンプロット分析により）ＥＩＢ領域のプロモー ターを活性化するか、または（Ｅ２プロモーターのコントロール下におかれたＣ ＡＴ（クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）を含む“リポータ− ”プラスミドの一時トランスフエクション後に酵素活性を調べることにより）Ｅ ２領域のプロモーターを活性化する、ＥＩＡ領域の発現産物の能力を確認するこ ともできる。

最後に、これらの細胞をＡｄ−Ｒ３Ｖ−βｇａｌ（ＳＨａｔｌｏ＋ｄ−Ｐ＋＋＋ １ｃａｕｄｅｔ　＋ｔ　ａｌ、、ｌ９９２．ｓｕｐ＋ａ）で感染させて、細胞変 性効果が観察されるとすぐに寒天技術でウィルスを滴定することができる。一般 的に、操作は下記のとおりである。細胞を１０のｍｏｉ（感染多重度）で感染さ せる。感染の約４８時間後、細胞変性効果がみられたときに、細胞を溶解させて 、β−ガラクトシダーゼ活性を慣用的プロトコールに従い調べる（例えば、Ｍａ ｎｉａ１口ｅ＋　ａｌ、、１９８９．ｓａｐ＋ａ参照）。陽性クローンをもっと 低いｍｏｉで再感染させる。感染の約４８時間後に、上澄および細胞を標準技術 に従い集める。ウィルス力価は２９３細胞を用いて寒天積層法により決める。得 られた力価対初期力価の比率が増幅ファクターになる。

ベクターｐＴＧ６５５７、ｐＴＧ６５５８およびｐ’ｒＧ６５５９は以下を含ん でいる： （１）以下のコントロール下にあるｐａｃ遺伝子（前記のようなヌクレオチド２ ５２〜９０５）の発現用カセットニーＡｄ２　Ｅ２Ａプロモーター（ヌクレオチ ド２７３４１〜２７０３０）（ｐＴＧ６５５８の場合）−ヌクレオチド２フ１６ ３〜２フ１８２間にある配列が欠失されたＡｄ２　Ｅ２Ａプロモーター（ｐＴＧ ６５５７の場合）。このような変異から、ＥＩＡでコードされたトランス活性化 タンパク質による誘導能に影響を与えることなく、Ｅ２Ａプロモーターの基準レ ベルを減少させることができる。または −ｐＴＧ６５５９の場合ＳＶ４０初期プロモーター上記３つの場合において、そ れは３−末端にＳＶ４０ウィルス転写終結シグナル（ヌクレオチド２５４３〜２ ６１８）も含んでいる；および （１１）ヌクレオチド５０５〜４０３４にわたるＡｄ５Ｅ１領域の部分を含んだ 発現カセット。アデノウィルスゲノムのこの部分は、ＥＩＡ領域の初期タンパク 質をコードする配列の全部、ＥＩＡ単位の転写終結シグナル、ＥＩＢプロモータ ー（ＥＩＡでコードされるトランス活性化タンパク質により誘導しうる）と、Ｅ ＩＢ領域のコード配列の全部を含んでいる。それはタンパク質１ｘをコードする 配列も含んでおり、ＥＩＢ領域と重複している。

しかしながら、それはＥＩＡ領域のプロモーターとＥＩＢおよびＩＸ転写単位の 転写終結シグナルを欠く。Ｅ１領域の配列を発現させるためには、ネズミＰＧＫ 遺伝子プロモーターをアデノウィルス断片の５′末端に導入し、ウサギβ−グロ ビン遺伝子の転写終結シグナル（Ｇｅｎｃｂｓｎｋデータバンクで参照番号ＫＯ ３２５６として開示されている配列のヌクレオチド１５４２〜２０６４）を３′ 末端に導入する。

場合により、何らかの種類の、例えばｐＢＲ３２２（ＢｏｌｉｖａＩｅ＋　ａｌ 、、ｌ９７７、Ｇｅｎｅ、２．９５−１１３）から単離されたヌクレオチド配列 も、転写で生じうる干渉を避けるために、ｐａＣ遺伝子とＥ１領域との発現用カ セット間に導入してよい。

これらベクターの組立ては下記のいくつかの工程で行う。

最初に、ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド８２６にわたるＡｄ５ゲノムの部分 は、ゲノム調製物から、後のクローニング工程に有用なＰｓｔ１部位を５′末端 に含むプライマー０ＴＧ５０１３　（配列番号２９）とＢｓｐＥＩ部位と重複す る０ＴＧ４５６５　（配列番号２８）を用いたＰＣＲにより増幅させる。ＰＣＲ により形成された断片をフレノウＤＮＡポリメラーゼで処理し、その後Ｍｌ　３ ｍｐ　１８のＳｍａ　Ｉ部位中に挿入して、Ｍ１３７Ｇ６５１２を得る。ＰＣＲ 断片の配列を確認する。

ベクターｐＴＧ６５３３　（例６，１）を酵素ＥｃｏＲＩおよびＢｓｐＥＩで切 断する。こうして処理されたベクターを、一方ではＭ１３７Ｇ６５１２から単離 されたＰｓｔ　Ｉ−ＢｓｐＥＩ断片、他方ではｐＫＪ　−１から単離されたＥｃ ｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉ断片と結合させる。後者の断片はヌクレオチド−５２４〜 −１９間にあるネズミＰＧＫ遺伝子プロモーターの部分を含んでいるが、その配 列はＡｄ＋ａ　ｅｔ　ａｔ、　（１９８７，Ｇｃｎｅ、６０．６５−７４）で報 告されている。この工程ではｐＴＧ６５５２を生じ、ヌクレオチド５０５で始ま るＡｄ５のＥ１領域の上流にネズミＰＧＫ遺伝子プロモーターを挿入することが できる。

別に、Ｘｈｏ　Ｉで形成された末端がフレノウＤＮＡポリメラーゼ処理後に平滑 化されているＸｈｏ　Ｉ　−Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ断片を、ｐ　Ｂ　ＣＭ　Ｇ　Ｎ　 ｅ　ｏ　（ＫａｒａｓＢａｍｘ　ｅｌａ　１．　、１９８９．１．　Ｅｘｐ、　 Ｍｅｄ、　、　１６９．１３−２５）から精製する。ウサギβ−グロビン遺伝子 の転写終結シグナルを含んだこの断片を、ベクターｐポリＩｆ−５ｆｉ／Ｎｏｔ −１４’　（Ｌａｔｈｅ　ｅｔ！＋、、　１９８７．　Ｇｅｎｅ、　５７．１９ ３−２０１）のＳｍａ　ＩおよびＢａｍ８１部位間に導入する。得られたベクタ ーｐＴＧ６５５１は、ヌクレオチド３６６５〜ヌクレオチド４０３４にわたるＡ ｄ５ゲノムの断片をその中に挿入するために、酵素ｓｐｈ　ＩおよびＥｃｏＲＶ でその一部について切断する。この断片は標準プロトコールに従いＰＣＲで形成 する。用いられた操作では、鋳型としてＡｄ５ゲノムＤＮＡ調製物と、３６６５ 位で内部Ｓｐｈ　ｉ部位と重複するプライマー０ＴＧ５０１５（配列番号３０） および５′末端にＢｇ１１１部位を含む０ＴＧ５０１４　（配列番号３１）を用 いる。

ＰＣＲ断片をフレノウＤＮＡポリメラーゼで処理してから、Ｍ　１３　ｍ　ｐ　 １８のＳｍａ　１部位中に組み込んでクローニングし、Ｍ１３ＴＧ６５１６を得 る。その配列の確認後に、ＰＣＲ断片をＢｇｌ１１切断、フレノウＤＮＡポリメ ラーゼ処理およびｓｐｈ　Ｉ切断により抽出する。

それをｐＴＧ６５５１のＳｐｈ　ＩおよびＥ　ｃ　ｏ　ＲＶ　部位間に挿入する 。これによりｐＴＧ６５５４を得る。

別に、ベクターｐＴＧ６５２９　（例６．１）を酵素ＨｐａｌおよびＨｉｎｄｌ ｌｌ切断に付す。ｐａＣ遺伝子とその後にＳＶ４０ウィルス転写終結シグナルを 含んだ２．９ｋｂ断片を精製する。この断片を、Ａｄ２　Ｅ２Ａプロモーターを 有するｐ　Ｅ　２　Ｌ　ａ　ｃ　（Ｂｏｅｕｌ　ｅｔ　１１．。

＋９９０．　Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、　５．６９１−６９９）から単離されたＳｍａ 　Ｉ　−Ｈｉ　ｎ　ｄ　ＩＩＩ断片に結合させる。ベクターｐＴＧ６５５６を得 る。一方、それはＡｄ２の変異Ｅ２Ａプロモーターを有するｐＥ２　Ｌａｃ　Ｄ ９１７０（２ａｉｃｈｏｖｓｋｉ　ｅｔａｌ、　、　１９８５．　ＥＭＢＯ，１ ，、４，１２９３−１３００）から単離されたＳｍａ　Ｉ　−Ｈｉ　ｎｄｌｌｌ 断片に結合させてもよい。この場合には、ベクターｐＴＧ６５５０を得る。

ｐＴＧ６５５６を酵素ＥｃｏＲ１およびＢａｍＨＩで切断する。ｐＴＧ６５５２ から単離されたＥｃｏＲＩ　−３ａ　ｃ　Ｉｆ断片とｐＴＧ６５５４から単離さ れたＳ　ａ　ｃ　ＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をこれらの部位間に挿入する。ベクター ｐＴＧ６５５８を得る。ｐＴＧ６５５０およびｐＴＧ１６４３　（例７．１）で 行う同様の工程では、各々ｐＴＧ６５５７およびｐＴＧ６５５９を得る。

ｐＴＧ６５５７およびｐＴＧ６５５８をＥｃｏＲＶで切断するが、唯一の部位は ２つの発現カセット（ｐａｃ遺伝子およびＥ１領域）間に位置している。ｐＢＲ ３２２（Ｂｏｌｉｖａ＋　ｅｔ　ａｌ、、＋ｕｐ＋ａ）から単離された１、８８ ｋｂＥｃｏＲ■−Ｐｖｕｌｌ断片は、２プロモ一ター間の距離をあけるために、 この部位中に組み込んでクローニングする。ｐＴＧ６５６４およびｐＴＧ６５６ ５を各々得る。

ベクターｐＴＧ６５５７、ｐＴＧ６５５８、ｐＴＧ６５５９、ｐＴＧ６５６４お よびｐＴＧ６５６５を細胞系Ａ３４９中にトランスフェクトする。前記のように 、プロマイシン耐性クローンを選択し、Ｅ１領域の発現を確認する。Ｅ１発現ク ローンは、Ｅ１機能に欠陥があるアデノウィルスを増幅および増殖させるために ある。Ｅ１発現産物の生産には細胞毒性効果を伴うが、サザン分析ではベクター 再配列を実証できない。Ａｄ−Ｒ３Ｖ−βｇａｌ感染後、いくつかのクローンは ウィルスを１００倍以上増幅させることができる。

これらのベクターは、前記のように、ヌクレオチド５０５〜４０３４にわたるＡ ｄ５　Ｅｌ領域の部分を含んでいる。しかしながら、ＥＩＡ領域の配列の発現は 、一方ではＡｄ２　ＭＬＰ最小プロモーター（ＴＡＴＡボックスおよび転写開始 シグナル；ヌクレオチド−３４〜＋３３）と他方ではＧａ１４タンパク質により 活性化できるＧａ１ｌＯ遺伝子の活性化配列からなる誘導性プロモーターのコン トロール下におかれている。Ｇａ１４結合部位に相当する１７ヌクレオチド（１ ７ＭＸ）の共通活性化配列はＷｅｂ＋ｔｅ＋　ｅｔ　ａｌ、　（１９８８，Ｃｅ １１．５２，１６９）で特定されている。ウサギβ−グロビン遺伝子の転写終結 シグナルをＥＩＢ転写単位の３′末端におく。

１７ＭＸ配列のダイマー（配列番号３２および３３）とその後にＡｄ２　ＭＬＰ 最小プロモーターを含み、その５′末端に５ａｌＩ部位およびその３′末端にＢ ａｍＨＩ部位を含んだ第−ＤＮＡ断片を合成する。５ａｌＩ部位をフレノウＤＮ Ａポリメラーゼ処理により平滑化する。別に、配列のペンタマーとその後に同様 のプロモーターを含み、その５′および３′末端にＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ部 位を含んだ第二ＤＮＡ断片を合成する。

Ｘｂａｌ切断後に、その末端をクレノウボリメラーゼ処理で平滑化する。

これら断片の各々をｐポリＩＩのＢｇｌ１１部位中に導入して、ｐＴＧ１６５６ およびｐＴＧ１６５７を各々得る。

次いで下記２断片、即ちｐＴＧ６５５２　（例６．２）から単離されたＰｓｔｌ −Ｘｂａｌ断片とｐＴＧ６５５９（例６．２）から単離されたＸｂａＩ−Ｂａｍ ＨＩ断片をＰｓ　ｔ　Ｉ　−ＢａｍＨＩで既に切断されたベクターの各々の中に 導入する。ｐＴＧ１６６０およびｐＴＧ１６６１を各々得る（図５）。

Ａ３４９細胞をｐＴＧ１６４３　（ｐａＣ遺伝子発現用のベクター）とｐＴＧ１ ６６０またはｐＴＧ１６６１でコトランスフエクトする。クローンをそれらのプ ロマイシン耐性について選択し、上記のように試験する。Ａ３４９−１６６０お よびＡ３４９−１６６１の約５０％はＥ１領域の発現産物を生産する。しかしな がら、生産には細胞毒性効果を伴い、細胞の形態的外観を変える。

細胞ゲノムにおけるプラスミドの組込みおよび非再配列をサザン分析により確認 する。組込みプラスミド（ｐＴＧ１６４３、ｐＴＧ１６６０およびｐＴＧ１６６ １）の実質的変化は、分析された生産クローンで実証できない。Ｇａ１４の存在 下でＥＩＡ領域によりコードされた配列の発現の誘導能も（Ｇａ１４タンパク質 の構成的発現を行うプラスミドでの形質転換により）確認することができる。

約２のｍｏｉでＡｄ−Ｒ３Ｖ−βｇａｌによるいくつかの生産クローンの感染後 に、２つのＡ３４９−１６６０クローンはウィルスストックを１００倍以上増幅 させることができる。

例７：アデノウイルスの複製に必須な機能のすべてに関ｔａ補足系の形成 ５″ＩＴＲ，３”ｌＴＲおよび化膜化領域を除いてＡｄ５アデノウィルスゲノム の全部を含んだベクターを組み立てる。

ベクターｐＴＧ６５２８　（例６，１）を酵素ＰｓｔＩおよびＢｇｌｌｌで切断 するが、その間にはＯＴＧ　５０３９および０ＴＧ５０４０　（配列番号３４お よび３５）のオリゴヌクレオチドからなる標準プロトコールに従い化学的に合成 されたＤＮＡ断片が挿入されている。オリゴヌクレオチド配列はＰｓｔＩクロー ニング部位を再形成せずにＥｃｏＲＶ部位を導入できるようにデザインされてい る。ｐＴＧ１６３９を得て、これをＥｃｏＲＶ切断で直鎖化し、末端がフレノウ ＤＮＡポリメラーゼ処理で平滑化さｈたＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片に結合させる 。この断片はＳＶ４０ウィルス転写終結シグナルを有している。

適切な制限部位で囲まれたシグナルを含むいずれのプラスミドもこの工程で用い てよい。

こうして形成されたベクターｐＴＧ１６４０をＢａｍＨＩおよびＢ　ｇ　ｌ　Ｉ Ｉで切断し、ｐａｃ遺伝子発現用のカセットを有する断片をベクターｐポリｌｔ −３ｌｉ／Ｎｏｔ孝 −１４のＢ　ｇ　ｌ　１１部位中に導入する。ｐＴＧ１６４１を得る。後者をＮ ｏｔｌで直鎖化し、フレノウＤＮＡポリメラーゼで処理する。ｐ　Ｂ　Ｒ３２２ （Ｂｏｌｉｙｘｒ　ｔｔ　Ｉｌ、。

＋ｏｐ＋ａ）から単離されて更にフレノウＤＮＡポリメラーゼで処理された０、 ２７６ｋｂＢａｍＨＩ−３ａｉｌ断片を導入する。これによりｐＴＧ１６４３を 得る。

ｐＴＧ１６４３をＸｈｏＩで直鎖化し、１７１Ｘダイマーとその後にＴＫ−Ｈ８ Ｖ−１遺伝子最小プロモーター（Ｇｅｎｅｂａｎｋデータバンクで参照番号ＶＯ Ｏ４６７として開示された配列のヌクレオチド３０３〜４５０，３−末端におい てＸｈｏＩ部位で補充されている）を含んだＸｈｏＩハイブリッド断片をこの部 位中に挿入する。ｐＴＧ１６４７を得るが、そコテは２ｘ１７ＭＸ−ＴＫ−Ｈ３ Ｖ−１ハイブリツドプロモーターがｐａｃ遺伝子発現用のカセットと同方向に挿 入されている。

この組立体ｐＴＧ１６４７は、ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド３５８２６に わたるＡｄ５ゲノムの断片をＰｓｔＩおよびＢａｍＨ１部位間に導入するための 親ベクターとして用いる。第一段階では、ｐＴＧ１６４７をＰｓｔｌおよびＢａ ｍＨＩで切断し、その後一方ではヌクレオチド５０５〜９１８のＡｄ５ゲノムの 部分を含んだｐＴＧ６５５２　（例６．２）のＰｓｔＩ−Ｃ１ａＩ断片と、他方 ではＡｄ５ゲノムＤＮＡから調製されたＣ１ａＩ−ＢａｍＨＩ断片（９１８〜２ １５６２位）とに結合させる。それにより得られたベクターは、５′ＩＴＲおよ び化膜化領域を除いたＡｄ５の５′部分を含んでいる。

別に、Ａｄ５ゲノムの３′部分をベクターｐポリ１ｌ−３ｌｉ／Ｎｏ＋−１４で アセンブリー化する。後者をＢａｍＨＩで直鎖化し、Ａｄ５ゲノムのＢａｍＨＩ −Ａｖｒｌｌ断片（ヌクレオチド２１５６２〜２８７５２）とＡｄ５のヌクレオ チド３５４６３〜３５８２６に相当するＰＣＲ断片を導入する。後者の断片はＡ ｄ５ゲノムＤＮＡからプライマー０ＴＧ５０２４　（配列番号３６）および０Ｔ Ｇ５０２５　（配列番号３７）を用いて形成し、５′末端にＢａｍ８１部位を含 んでいる。得られたベクターをＡｖｒｌｌで切断し、Ａｄ５ゲノムＤＮＡから単 離された２　８７５３〜３５４６２位にわたるＡｖｒｌｌ断片を挿入する。

アデノウィルス配列を含んだＢａｍＨＩ断片を、５′ＩＴＲおよび化膜化領域を 欠くアデノウィルスゲノムの５′部分を含んだ先の工程のベクターのＢａｍＨＩ 部位中に導入する。

欠陥アデノウィルスの機能のすべてを補える補足系は、前例で記載されたプロト コールに従い、細胞系、例えばＡ３４９中へのトランスフェクションにより形成 する。

アデノウィルスゲノムの事実上全体を含む下記４つのベクターを組み立てること により行うことも可能であり、これは最終工程において単一ベクターでリアセン ブリ−化させる。

−ｐＴＧ１６６５は、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物から単離されたＢｓｐＥＩ断片 （ヌクレオチド８２６〜７２６９）をｐポリｌ　Ｉ−Ｓ　Ｉ　ｉ／Ｎｏ　ｔ−１ ４のＸｍａ１部位中に組込むクローニングに相当する； −ｐＴＧ１６６４は、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物から単離されたＮｏｔＩ断片（ ヌクレオチド６５０３〜１５０４）を同ベクターのＮｏｔＩ部位中に挿入するこ とにより形成する； −ｐＴＧ１６６２は、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物から単離されたＡ　ａ、ｔ　Ｉ Ｉ断片（ヌクレオチド１０７５４〜２３９７０）をｐポリＩＩのＡａｔｌ１部位 中に導入することにより得る； −Ａｄ５ゲノムの３′部分を含むｐＴＧ１６５９　（例２．３） 次いで誘導発現系、例えばＧａ１４により誘導しうる例６．３または７で記載さ れたプロモーター、あるいは従来のプロモーター、例えばメタロチオネインまた はテトラサイクリンプロモーターを含んだ断片を導入する。

このような断片はＡａｔｌｌおよびＣ１ａＩで切断されたベクターｐＴＧ１６６ ５においてＡｄ５の５′配列（ヌクレオチド５０５〜９１８）の上流に位置させ る。最後に、ｐＴＧ１６６４のＮｏｔｌ断片、ｐｒＧ１６６２のＡａｔｌｌ断片 と、最後にｐＴＧ１６５９のＢａｍＨＩ断片を上記ベクター中に対応部位で連続 的に組み込んでクローニングする。

補足系を上記ベクターおよび１）ＴＧ１６４３のコトランスフエクションにより 形成し、プロマイシン耐性クローンを単離する。この系は、更に詳しく言うと、 Ｅｌ、Ｅ２および８４機能と後期機能に欠陥がある例５のアデノウイルスヘクタ ーを増幅および化膜化するためにある。

ＢａｍＨＩで切断し、下記３つの断片ニーヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド１ ３３９のＡｄ５配列を有するｐＴＧ６５５２　（例６．２）のＰｓ　ｔ　Ｉ−Ｘ ｂａ　Ｉ断片、 一ヌクレオチド１３４０〜ヌクレオチド３６６５のＡｄ５配列を有するｐＴＧ６ ５５２のＸｂａ　Ｉ　−Ｓｐｈ■断片、および 一ヌクレオチド３６６５〜ヌクレオチド４０３４のＡｄ５配列と転写終結シグナ ルを有するｐＴＧ６５５４（例６．２）のＳｐｈ　１−　ＢａｍＨＩ断片をこう して処理されたベクター中に導入する。

それにより得られたベクターをＢａｍＨＩで切断し、下記３つの断片ニ −３２８００〜３３１０４位間に位置するＡｄ５配列に相当する、ＰＣＲにより 形成される、ＢａｍＨＩ−Ａｆｌｌ＋で切断された断片。用いられる操作では、 鋳型としてＡｄ５ゲノムＤＮＡとプライマー０ＴＧ５０７８（配列番号３８）お よび○ＴＧ５０７９　（配列番号３９）を用いる。

−Ａｄ５ゲノムＤＮＡから単離されたＡｆｌｌｌＡｖｒｌｌ断片（ヌクレオチド ３３１０５〜３５４６３）、−プライマー０ＴＧ５０２４および０ＴＧ５０２５ （例７参照）を用いるＰＣＲにより形成されたＡｖｒｌｌ−ＢａｍＨＩ断片 をこの部位中に導入する。

これにより形成されたベクターを上記プロトコールに従い細胞系中に導入して、 Ｅｌおよび８４機能に関する補足系を形成する。

しかも、このような系は下記プロトコールに従い得てもよい： Ａｄ５ゲノムのＥ４領域（ヌクレオチド３２８００〜３５８２６）をいくつかの 工程で再形成させる。ヌクレオチド３３１１６〜３２８００にわたる部分をＡｄ ５ゲノムＤＮＡからプライマ一対０ＴＧ５０７８および０ＴＧ５０７９　（配列 番号３８および３９）でＰＣＨにより合成し、その後Ｍ１３ＴＧ１３０のＥｃｏ ＲＶ部位中に挿入して、Ｍ１３ＴＧ１６４５を得る。

後者のＢａｍＨＩ−Ａｆｌｌｌ断片をＡｄ５のＡｆｌｌｌ−Ａｖｒｌｌ断片（ヌ クレオチド３３１０４〜３５４６３）との結合反応に付し、ベクターｐＴＧ７４ ５７をＢａｍＨＩおよびＡｖｒｌｌで切断する。ｐＴＧ１６５０を得る。

次いでＥ４領域を、Ａｄ５ゲノムＤＮＡ調製物からプライマー０ＴＧ５０２４お よび０ＴＧ５０２５　（配列番号３６および３７）を用いるＰＣＲでヌクレオチ ド３５８２６〜３５４５７に相当する断片を得ることにより完成させる。この断 片をＭ　１３　ｍ　ｐ　１８のＳｍａＩ部位に挿入して、Ｍ１３ＴＧ１６４６を 得る。ＡｖｒｌｌＥｃｏＲＩ断片を後者から単離し、ｐＴＧ１６５０のＡｖｒｌ ｌおよびＥｃｏＲＩ部位間に組み込んでクローニングする。ｐＴＧ１６５２を得 る。

Ａｄ５のＥ４領域を含んだＢａｍＨＩ断片をｐＴＧ１６５２から単離し、ｐＴＧ １６４３およびｐＴＧ６５５９（例６．２）のＢａｍＨ１部位またはｐＴＧ６５ ６４（例６．２）の５ｓｐ１部位中に、その部位が平滑化された後に組み込んで クローニングし、ｐＴＧ１６５３、ｐＴＧ１６５４およびｐＴＧ１６５５　（図 ６）を各々得る。

Ｅｌおよび６４機能をインドランスで補える相補細胞は、慣用的技術で： （１）細胞系２９３へのｐＴＧ１６５３の形質転換、または （２）細胞系Ａ３４９へのｐＴＧ１６５４またはｐ’ｒｃ１６５５の形質転換 により作製する。

一般的に言えば、ＥｌおよびＥ４領域の産物の発現には細胞毒性効果を伴う。い くつかの２９３−１６５３クローンは、Ｅｌが欠失されたアデノウィルスとＥ４ が欠失されたアデノウィルスの双方を補うことができる。

別法では下記のように行う。

ベクターＭ１３ＴＧ１６４６を、Ｅ４領域のプロモーターを欠失させてＨｐａＩ 部位を挿入する目的から、変異原性オリゴヌクレオチド０ＴＧ５９９１　（配列 番号４０）で特定部位変異誘発に付す。変異ベクターはＭ１３ＴＧ６５２２と命 名する。それをＰｓｔｌで切断し、ファージＴ４　ＤＮＡポリメラーゼとその後 Ａｖｒｌｌで処理し、ｐＴＧ１６５２　（例８）の精製ＥｃｏＲＩ　（フレノウ ）−Ａｖｒｌｌ断片と結合させて、ｐＴＧ６５９５を得る。

後者をＨｐａｌで開裂し、ＢｇｌｌｌおよびＢａｍＨＩ切断とフレノウ処理後に ｐＴＧ５９１３　（ｌｆｆ１７）から得られた０、８ｋｂ断片を導入する。ｐＴ Ｇ６５９６を得るが、そこではＥ４領域（３２８００〜３５８２６位）はＴＫプ ロモーターのコントロール下にある。参考のため、ｐＴＧ５９１３はＴＫ−Ｈ３ Ｖ−１遺伝子を有し、Ｂｇｌｌｌ−ＢａｍＨＩ断片はこの遺伝子のプロモーター に相当する（Ｗｘｇｎｅ＋　Ｎ　ａｌ、、１９８１．Ｐｒｏｃ、Ｎｘｊｌ、Ａｃ １ｄ、Ｓｃｉ、。

ＵＳＡ、　７８．１４４１−１４４５）。

並行して、ベクターｐＴＧ１６４３およびｐＴＧ６５５９（例６）をＢａｍＨＩ で直鎖化し、オリゴヌクレオチド０ＴＧ６１４１および０ＴＧ６１４２　（配列 番号４１および４２）の組換えから得た合成断片を挿入して、ｐＴＧ８５０８お よびｐＴＧ８５０７を各々得る。

これらの後者をＢ　ａｍＨＩで開裂してから、Ｅ４発現用のカセットを含んだｐ ＴＧ６５９６の精製ＢａｍＨＩ断片を導入する。ベクターｐＴＧ８．５１２（図 ８）およびｐＴＧ８５１３　（例９）を得る。

更に、同酵素で直鎖化されたベクターｐＴＧ８５０８またはｐＴＧ８５０７中へ のｐＴＧｌ、６５２のＢａｍＨＩ断片の導入から、ｐＴＧ８５１４およびｐＴＧ ８５１５を各々得る（図１０および１１）。

ｐＴＧ８５１２またはｐＴＧ８５１５でトランスフェクトされた細胞系は６４機 能に欠陥があるアデノウィルスを補うことができ、一方ｐＴＧ８５１３またはｐ ＴＧ８５１４トランスフェクションによるものはＥｌおよび６４機能に欠陥があ るアデノウィルスを増幅および増殖させるためにある。同様に、２９３細胞中へ のｐＴＧ８５１２またはｐＴＧ８５１５のトランスフェクションでは、Ｅｌおよ びＥ４に欠陥があるアデノウィルスを補うことができる。

配列表 配列番号Ｉ Ｈ）配列の特徴 ＦＡ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー二直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｂｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイボセテ ィカル二Ｎ０ （ｉｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （１マ）起源 （Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ４１７４） （！１）　配列・配列番号Ｉ ＧＴＧＡＣＧＴＣＴＴ　ＴＧＧＴＧＴＴＴＴＣＧＣＧＧＧＡＡＡＡＣ３０配列番 号２ （１）配列の特徴 （Ａ）長さ　３０塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖の数・−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセテ ィカル：Ｎ。

（ｉｉｉ）アンチセンス：Ｎｏ （ｉマ）　起源 （Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ４１７３） （ｘｌ）　配列：配列番号　２ ＡＣＣＧＡＧＴＡＡＧＡＴＴＴＧＴＣＴＡＧ　ＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧ　３０配列 番号３ （ｉ）配列の特徴 （＾）長さ＝３３塩基対 （Ｂｊ型　核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖 （１１）配列の種類　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポ セティカル：Ｎ０（ｉ　ｉ　ｉ）アンチセンス、Ｎｏ （１ｖ）　起源 （Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ４１９１） （ｘｉ　配列：配列番号３ ＧＧＣＣＡＴＧＧＴＣＧＣＧＧＧＡＡＡＧＧ　ＧＡＣＴＴＴＧＡＣＣＧＴＴ　３ ３配列番号４ （１）配列の特徴 （人）長さ＝３１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃｌ鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイ ポセティカル、Ｎ。

（ｉｉｉ）アンチセンス：Ｎ。

（１ｖ）　起源 （局生物名；合成オリゴヌクレオチド （ＯＴＧ５０２１） （ｘｌ）　配列：配列番号４ ＧＡＡＣＧＧＡＴＣＣＣＣＡＧＡＣＴＣＴＧ　ＴＴＴＧＧＡＴＴＴに　Ｇ　３１ 配列番号５ （：）　配列の特徴 （Ａ）・長ざ　３０塩基対 （３）型　核酸 ｊ（）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロン−１直鎖 （１１）配列の種類　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｈｎｏｍｉｃ　）！Ｉｔ：ｊ　ハイポセテ ィカル　Ｎ。

、’１ｌｉ）アンチセンス　Ｙｅｓ （ｉ　ｖ）　起源 （Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５１５７） （！１）　配列：配列番号５ ＣＣＡＧＡＡＡＴＡＴ　ＣττＣＧＣＣＣｋＧ　ＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣ３０配列 番号６ （１）配列の特徴 （Ａ）長さ＝２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｂｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポ セティカル：Ｎ０（ｉ　ｉ　ｉ）アンチセンス二Ｎ０ （１ｖ）　起源 （Ａ）生物名　合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５５６４） （ｘｌ）　配列：配列番号６ ＧＡＴＣＣＧＡＴＡＴ　ＣＣＣＧＴＴＡＡＣＣ２０配列番号７ い）配列の特徴 ＩＡ）長さ　２０塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ＩＩ）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセ ティカル：Ｎ。

（ｉｉｉ）　アンチセンス：Ｙｅｓ （１マ）　起源 （Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（○ＴＧ５５６５） （ｘｉ）　配列：配列番号７ ＧＡＴＣＧＧＴＴＡＡ　ＣＧＧＧＡＴＡＴＣＧ　２０配列番号８ （ｉ）配列の特徴 ＦＡ）長さ・４７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数・一本鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖 （１１）配列の種類　１）　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイボセ ティカル：Ｎ。

（ｉｉｉｊ　アンチセンス二Ｎ。

（１ｖ）　起源 （Ａ）生物名　合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５８９２） （ｘｉ）　配列：配列番号８ ＧＴＣＧＴＡＧＧＡＴ　ＣＣＡＧＣＴＧＣＴＣＣＣＴＧＣＴＴＧＴＧ　ＴＧＴＴ ＧＧＡＧＧＴ　ＣＧＣＴＧＡＧ　４７配列番号９ （１）配列の特徴 （Ａ）長さ＝４７塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉ　ｉ）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハ イボセティカル二Ｎ０（ｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ （１ｖ）　起源 （Ａ）生物８二合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５８９３） （ｘｌ）　配列：配列番号９ ＧＴＡＧＣＴＧＡＣＧ　ＴＣＣＣＡＧＧＴＧＣＡＣＡＣＣＡＡＴＧＴ　ＧＧＴＧ ＭＴＧＧＴ　ＣＡＡＡＴＧＧ　４７配列番号１０ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：４６塩基対 ＦＢ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ＩＩ）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセ ティカル：Ｎ。

（ｉｉｉ）アンチセンス・Ｎｏ （１マ）起源 （Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５９２０９） （！１）　配列：配列番号１０ ＡＣＧＧＴＡＧＧＡＴ　ＣＣＧＡＣＧＴＣＧＧ　ＴＧＡＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴＴ ＧＧＴＣＴＣＣＧＴＣＣＧ　４６配列番号１１ （１）配列の特徴 （Ａ）長さ：２４塩基対 ＣＢ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数・一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　ＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ’、ハイポセ ティカル：Ｎ。

ｆｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ （ｌ　Ｖ）起源 （八）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５８９１） （１１）　配列　配列番号１１ ＣＡＡＣＣＣＣＧＡＴ　ＴＣＴＡＧＡＧＡＡＡ　ＣＣＴＧ　２４配列番号１２ （１）配列の特徴 （Ａｌ長さ：３５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイ ボセティカル：Ｎ。

（夏１１）アンチセンス：Ｙｅｓ （ｉ　ｖｌ　起源 （＾）生物８二合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６０７９） （ｘｉ）　配列：配列番号１２ ＧＣＧＣＡＧＴτＧＣＴＣＴＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＴＭＣＡＴ　ＴＣＡＧＴ　 ３５配列番号１３ （ｉ）配列の特徴 ＦＡ＋長さ、３８塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃｌ　鎖の数、一本鎖 （Ｄ）トポロン−・直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｓｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセ ティカル　ＮＯ ｆ＋ｉｉ）　アンチセンス：Ｙｅｓ （ｉｉ）　起源 （＾）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６０８０） （ｗｉ）　配列：配列番号１３ ＴＡＡＡＡＧＴＡＣＣＡＧＧＴＭＧＧＡＴ　ＣＣＣＣＴＴＧＧＴｒ　ＴＧＣＴＴ ＧＧＧ　３８配列番号１４ （１）配列の特徴 （Ａｌ長さ＝２１塩基対 （８）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｅ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイ ポセティカル：Ｎ０（ｉ　ｉ　ｉ）　アンチセンス：Ｎｏ （１ｖ）　起源 （Ａ）生物名　合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６０６４） ｆｘｉ）　配列：配列番号１４ ＧＡＡＡＣＣＧＡＡＴ　ＴＣＴＣＴＴＧＧＡＡ　Ｃ２１配列番号１５ （１）配列の特徴 （Ａ）長さ、３２塩基対 （Ｋ１）　配列：配列番号１６ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ｉｉ）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイボセ ティカル＝ＮＯ （ｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅ　ｓ （１マ）　起源 （Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６０６５） （Ｘｌ）　配列：配列番号１５ ＡＣＧＡＡＴＧＣＡＧ　ＣＴＣＴＣＣＡＣＴＴ　ＡＡＣＡＴＴＣＡＧＴ　ＣＧ　 ３２配列番号１６ （１）配列の特徴 （Ａ）長さ、２７塩基対 （Ｂｊ型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉｉ　ハイポ セティカル　Ｎｏ （ｉ　ｉ　ｉｌ　アンチセンス：Ｙｅ　５（（Ｖ）起源 （＾）生物名　合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５４８１） （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）ＣＡＧＴＧＡＡＴＴ ＣＡＴＣＡＴＣＡＡＴＡ　ＡＴＡＴＡＣＣ”（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ０ （ｉｉｉ）アンチセンス＝Ｎ０ 配列番号２０ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：１８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイボセ ティカル＝ＮＯ （ｉｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （１ｖ）　起源 （Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５７２８） （１１）　配列：配列番号２０ ＴＧＴＡＧＣＡＧＧＡ　ＧＧＡＣＴＭＧ　１８配列番号２１ （１）配列の特徴 （＾）長さ　３９塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ＩＩ）配列の種類　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセテ ィカル、Ｎ０ （ｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ （ｉ　ｖ）　起源 （Ａ）生物名０合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ　５７２９） （！１）　配列：配列番号２１ ＣＣＧＣＡＴＴＡＡＴ　ＴＡＡＣＣＧＣＧＡＣＡＡＡＣＧＡＴＴＣＴ　ＴＴＡＴ ＴＣＴＴＧ　３９配列番号２２ （ｉｌ配列の特徴 （八）長さ：３６塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖の数−一本鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖 （１１）配列の種類、ＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセティカル 、Ｎ０ （ｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ （１ｖ）　起源 （Ａ）生物名　合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５７３０） （ｘｌ）　配列：配列番号２２ ＣＧＣＧＧＴＴＡＡＴ　ＴＭＴＧＣＧＧＴＡＡＡＡＣＣＴＡＣＧＴ　ＣＡＣＣＣ Ｇ　３１１ｉ配列番号２３ （１）配列の特徴 （Ａ）長さ　３０塩基対 （８）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセテイ カル二Ｎ。

（ｉｉｉ）アンチセンス＝ＮＯ （１マ）　起源 （Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６０６０） （！１）　配列：配列番号２３ ＡＡＴＡＡＡＡＧＡＴ　ＣＡττＡＴＴＴＴＣＡＴＴＡＧＡＡＣＴＧ　３０配列 番号２４ （１）配列の特徴 （、〜）長さ：２４塩基対 （３）型、核酸 （ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（！、ｌ）ハイポセ ティカル　Ｎｏ （ｉｉｉｊ　アンチセンス、Ｎｏ （１７）　起源 ：へ）生物名　合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６０６１） （ｘｌ）　配列：配列番号２４ 丁ＧＴＧＴＴＧＧＴ丁　ＴＴＴＴＧＴＧＴＧＴ　ＴＭＴ　２４配列番号２５ （１）配列の特徴 （Ａ）長さ：３０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセ ティカル＝ＮＯ （ｉｉｉ）　アンチセンス：Ｙｅｓ （１ｖ）　起源 （Ａ）生物名工合成オリゴヌクレオチド（○ＴＧ６０６２） （１１）　配列：配列番号２５ ＴＭＣＡＣＡＣＡＡ　ＭＡＡＣＣＡＡＣＡ　ＣＡＣＡＧＴＴＣＴＡ　３０配列番 号２６ （１）配列の特徴・ （Ａｌ　長さ：２４塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（目■）ハイボセテ ィカル：Ｎ。

（ｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ （１マ）起源 （Ａｌ生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６０６３） （ｘｉ）　配列、配列番号２６ 配列番号２７ （１）配列の特徴 （杓長さ＝３２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ１鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー　直鎖 ｌｉ　ｉ）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉｊ　ハイ ポセティカルコＮ。

（ｉｉｉ）アンチセンス・Ｎｏ （１ｖ）起源 （、へ）生物８二合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ４５６４） （１１）　配列　配列番号２７ ＴＣＣＧＴＧＡＡＴＴ　ＣＴＡＧＴＡＧＴＧＴ　ＧＧＣＧＧＡＡＧＴＧ　ＴＧ　 ３２配列番号２８ （ｉｌ　配列の特徴 （Ａ）長さ：２３塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ１鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類：　ＤＮＡ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉｌ　ハイボ セティカル：Ｎ。

（ｉ　ｉ　ｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ （１マ）起源 （Ａｌ生物名名二成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ４５６５） （ｘｉ）　配列：配列番号２８ ＴＣＣＡＧＴＣＣＧＧ　ＡＧＡＡＣＣＧＧＧＣＧＣＣ２３配列番号２９ （１）配列の特徴 （Ａ）長さ　２８塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖 （１１）配列の種類　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉｌ　ハイボセ ティカル：Ｎ。

（ｉｉｉ）アンチセンス二Ｎ０ （１ｖ）　起源 （Ａ）生物名二合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ　５０１３） （Ｘｌ）　配列：配列番号２９ τｋｋＣＣＴＧＣｋＧ　ＧＡＧＴＧＣＣＡＧＣＧＡＧτ八ＧＡへ　２Ｂ配列番号 ３０ （１）配列の特徴 （Ａ）長さ＝２１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイ ボセティカル：Ｎ。

（ｉ　ｉ　ｉ）アンチセンス、Ｎｏ （１ｖ）　起源 ＦＡ）生物名９合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５０１５） （ｘｌ：　配列、配列番号３０ ＣＡＡＣＧＣＧＣＡＴ　ＧＣＣＣＣＣＡＴＧＧ　Ｇ　”配列番号３１ １：１）配列の特徴 （八）長さ、３１塩基対 （３）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー；直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイボセ ティヵル二Ｎ０ （ｉ　ｉ　ｉ）　アンチセンス：Ｙｅｓ（！Ｖ）起源 （Ａ）生物名二合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５０１４） （Ｘり　配列：配列番号３１ ＴＡＧＧＡＧＡＴＣＴ　ＧＴＴＴＴＡＭＣＣＧＣＡＴＴＧＧＧＡＧ　Ｇ　３１配 列番号３２ （１）配列の特徴 （Ａ’長さ：３４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖 （ＩＩ；配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇ！ｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセ ティヵル：Ｎ０ （ｉｉｉｊ　アンチセンス二Ｎ。

（１ｖ）　起源 （Ａ）生物名　合成オリゴヌクレオチド（ｘｌ）　配列・配列番号３２ ＣＧＧＡＧＴＡＣＴＧ　ＴＣＣＴＣＣＧＣＧＧ　ＡＧＴＡＣＴＧＴＣＣＴＣＣＧ 　３４配列番号３３ （ｉ）配列の特徴 （入）長さ、３４塩基対 （Ｂｊ型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイボセ テイカル：Ｎ０ （１目）アンチセンス：Ｙｅｓ （１ｖ）起源 （入）生物名・合成オリゴヌクレオチド（！１）　配列、配列番号３３ ＣＧＧＡＧＧＡＣＭ；　ＴＡＣＴＣＣＧＣＧＧ　ＡＧＧＡＣＡＧＴＡＣＴＣＣＧ 　３４配列番号３４ （１）配列の特徴 （入）長さ　１６塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロン−直鎖 （１１）配列の種類　［）　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイ ボセティカル　Ｎ。

（ｉ　ｉ　ｉ）アンチセンス、ＮＯ いマ）　起源 （Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５０３９） （ｘｉ）　配列：配列番号３４ ＴＧＣＴＧＧＡＴＡＴ　ＣＡＧＴＣＡ 配列番号３５ い）配列の特徴 （Ａ）長さ＝２４塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （０）トポロジー；直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇ！ｎｏｍｉｃ　）（口Ｉ）ハイボセテ イカル、Ｎ。

（ｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ （巨）　起源 （Ａ）生物名８合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５０４０） （１１）　配列・配列番号３５ ＧＡＴＣＴＧＡＣＴＧ　ＡＴＡＴＣＣＡＧＣＡ　ＴＧＣＡ　”配列番号３６ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型、核酸 （Ｃ）鎖の数、−重鎖 （Ｄ）トポロジー・直鎖 （目）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｃｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポ セティカル＝ＮＯ（ｉ　ｉ　Ｉ　アンチセンス＋Ｎ。

（ｉｖ）　起源 （＾）生物名・合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ　５０２４） （！Ｉ）　配列、配列番号３６ ＣＴＣＣＴＧＣＣＴＡ　ＧＧＣＡＡＡＡＴＡＧ　２０配列番号３７ い）配列の特徴 （島長さ　３２塩基対 ｆＢｊ型　核酸 （Ｃ）鎖の数　−重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ロ）配列の種類　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｂｎｏｍｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポセテ イカル、Ｎ０（ｉｉｉ）アンチセンス　Ｙｅｓ （口・）　起源 （入）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５０２５） （１１）　配列：配列番号３７　・ 配列番号３８ （ｉ）配列の特徴 （杓長さ＝３１塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ’ｌ　鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏａ＋ｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハ イポセテイカル：ＮＯ（日Ｉ）アンチセンス−ＮＯ （ｉ　ｖｌ　起源 （入）生物名：合成オリゴヌクレオチド（○ＴＧ５０７８） （日）　配列；配列番号３８ ＧＴＣＧＣＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＴＧＴＴＴ　ＣＡＡＣＧＴＧＴＴＴ八　３１配 列番号３９ （１）配列の特徴 （八）長さ・２０塩基対 （Ｂ）型　核酸 （Ｃ）鎖の数−一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｅｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイボセ ティカル：Ｎ０ （ｉｉｉ）アンチセンス：Ｙｅｓ （−Ｖ）起源 （Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ５０７９） （日）　配列：配列番号３つ ＡＣＡＴＧＭＣＴＴ　ＡＡＧＣＧＡＧＣＴＧ　”配列番号４０ （１）配列の特徴 （Ａｌ長さ、３８塩基対 （Ｂ）型、核酸 ｔｃ）鎖の数、一本鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｈｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｌ　ハイボセテ イカル：Ｎ０ （ｉｉｉ）　アンチセンス、ＮＯ ［ｉ　ｙｌ　起源 （Ａ）生物名−合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ　５９９１） （Ｘｌ）　配列：配列番号４０ ＣＡＣＧＧＣＡＣＣＡ　ＧＣＴＣＭＧＴＴＡ　ＡＣＧＧ入τＣＣＡＴ　ｃｒａｃ ａｃｃｉｒ　３Ｂ配列番号４１ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）長さ：２７塩基対 （Ｉｌｌ型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （肖）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（Ｂｎｏａ＋ｉｃ　）（ｉ　ｉ　ｉ）ハイポ セティカル：Ｎ０（ｉｉｉ）アンチセンス：ＮＯ いマ）　起源 （Ａ’ｌ生物名二名二オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６１４１） （！１）　配列：配列番号４１ Ｇ入ＴＣＣＴＧＴＧＴ　ＧＴＴＧＧＴＴＴＴＴ　ＴＧＴＧＴＧＣ２７配列番号４ ２ （１）配列の特徴 （Ａ）長さ、２７塩基対 （Ｂ）型・核酸 （Ｃ）鎖の数、一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （１１）配列の種類：　Ｄ　Ｎ　Ａ　（ｇｔｎｏｍｉｃ　）（ｉｉｉ）ハイポセ ティカル＝Ｎ。

（目１）アンチセンス：Ｙｅｓ （１マ）起源 （Ａ）生物名：合成オリゴヌクレオチド（ＯＴＧ６１４２） （ｘｉ）　配列：配列番号４２ ＧＡＴＣＧＣＡＣＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣＡＡ　ＣＡＣＡＣＡＧ　２７Ｆ工ＧＵＲ Ｅ　１゜ ｐＴＧ６５４６ Ｆ工ＧＵＲＥ　２ ｐＴＧ６５８１ Ｆ工ＧＵＲＥ　３ ｐＴＧ６３０３ Ｆ工ＧＵＲＥ　４ Ｆ工ＧＵＲＥ　５ Ｆ工ＧＵＲＥ　６ ｐＴＧ５９１３ Ｆ工ＧＵＲＥ　７ ｐＴＧ８５１２ Ｆ工ＧＵＲＥ　８ ｐＴＧ８５１３ Ｆ工ＧＵＲＥ　９ ｐＴＧ８５１４ Ｆ工ＧＵＲＥ　１−０ ｐＴＧ８５１５ Ｆ工ＧＵＲＥ　１１゜ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　７１０４　８ ９３１−４Ｂ Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．複製に欠陥があり、補足細胞中において包膜することができ、５′から３′ にかけて５′ＩＴＲ、包膜化領域、Ｅ１Ａ領域、Ｅ１Ｂ領域、Ｅ２領域、Ｅ３領 域、Ｅ４領域および３′ＩＴＲを含んだアデノウイルスのゲノムから、 （ｉ）Ｅ１Ａ領域の全部または一部、および初期タンパク質をコードするＥ１Ｂ 領域の部分の全体、または（ｉｉ）Ｅ１Ａ領域の全部または一部、およびＥ２お よびＥ４領域から選択される少くとも１つの領域の全部または一部、または （ｉｉｉ）Ｅ１Ａ領域の全部または一部、および包膜化領域の部分 の欠失により誘導されてなる、アデノウイルスベクター。 ２．Ｅ１Ａ領域の全部または一部、および初期タンパク質をコードするＥ１Ｂ領 域の部分の全体の欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求 項１に記載のアデノウイルスベクター。 ３．Ｅ３領域の全部または一部の更なる欠失によりアデノウイルスのゲノムから 誘導されてなる、請求項２に記載のアデノウイルスベクター。 ４．Ｅ２領域の全部または一部の更なる欠失によりアデノウイルスのゲノムから 誘導されてなる、請求項２または３に記載のアデノウイルスベクター。 ５．Ｅ４領域の全部または一部のさらなる欠失によりアデノウイルスのゲノムか ら誘導されてなる、請求項２〜４のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクタ ー。 ６．Ｅ１Ａ領域の全部または一部、およびＥ２領域の全部または一部の欠失によ りアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項１に記載のアデノウイル スベクター。 ７．Ｅ１Ａ領域の全部または一部、およびＥ４領域の全部または一部の欠失によ りアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項１に記載のアデノウイル スベクター。 ８．Ｅ１Ｂ領域の全部または一部の更なる欠失によりアデノウイルスのゲノムか ら誘導されてなる、請求項６または７に記載のアデノウイルスベクター。 ９．Ｅ３領域の全部または一部の更なる欠失によりアデノウイルスのゲノムから 誘導されてなる、請求項６〜８のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター 。 １０．Ｅ４領域の全部または一部の更なる欠失によりアデノウイルスのゲノムか ら誘導されてなる、請求項６、８または９に記載のアデノウイルスベクター。 １１．ｇｐ１９ｋＤａタンパク質をコードするＥ３領域の部分を保持し、ゲノム のＥ３領域の部分的欠失により、アデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、 請求項３〜５、９または１０のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。 １２，ｇｐ１９ｋＤａタンパク質をコードするＥ３領域の部分が、宿主細胞にお いて上記タンパク質の発現に適した要素のコントロール下におかれてなる、請求 項１１に記載のアデノウイルスベクター。 １３．Ｅ１Ａ領域の全部または一部、および包膜化領域の部分の欠失によりアデ ノウイルスのゲノムから誘導されてなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載 のアデノウイルスベクター。 １４．（ｉ）ヌクレオチド２７０〜ヌクレオチド３４６、 （ｉｉ）ヌクレオチド１８４〜ヌクレオチド２７３、または （ｉｉｉ）ヌクレオチド２８７〜ヌクレオチド３５８にわたる包膜化領域の部分 の欠失によりヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムから誘導されてなる、請求項 １３に記載のアデノウイルスベクター。 １５．イヌ、トリおよびヒトアデノウイルスから選択されたアデノウイルスのゲ ノムから誘導されてなる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のアデノウイル スベクター。 １６．ヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムから誘導されてなる、請求項１５に 記載のアデノウイルスベクター。 １７．少くともヌクレオチド１６３４〜ヌクレオチド４０４７にわたるＥ１Ｂ領 域の部分の欠失によりヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムから誘導されてなる 、請求項１６に記載のアデノウイルスベクター。 １８．特にヌクレオチド２７８７１〜ヌクレオチド３０７４８にわたるＥ３領域 の部分の欠失によりヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムから誘導されてなる、 請求項１６または１７に記載のアデノウイルスベクター。 １９．ヌクレオチド３２８００〜ヌクレオチド３５８２６にわたるＥ４領域の部 分の欠失によりヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムから誘導されてなる、請求 項１６〜１８のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター。 ２０．ウイルスのゲノムの少くとも１８％の欠失によりアデノウイルスのゲノム から誘導されてなる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベ クター。 ２１．ウイルスのゲノムの少くとも２２％の欠失によりアデノウイルスのゲノム から誘導されてなる、請求項２０に記載のアデノウイルスベクター。 ２２．ウイルスのゲノムの少くとも４０％の欠失によりアデノウイルスのゲノム から誘導されてなる、請求項２１に記載のアデノウイルスベクター。 ２３．ウイルスのゲノムの少くとも９５％の欠失によりアデノウイルスのゲノム から誘導されてなる、請求項２２に記載のアデノウイルスベクター。 ２４．５′および３′ＩＴＲと包膜化領域の全部または一部とを除くアデノウイ ルスのゲノムの全体の欠失によりアデノウイルスのゲノムから誘導されてなる、 請求項２３に記載のアデノウイルスベクター。 ２５．ヌクレオチド４５９〜３５８３２にわたるウイルスゲノムの部分の欠失に よりヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムから誘導されてなる、請求項２４に記 載のアデノウイルスベクター。 ２６．外来ヌクレオチド配列を更に含んでなる、請求項１〜２５のいずれか一項 に記載のアデノウイルスベクター。 ２７．発現に必要な要素のコントロール下におかれた対象遺伝子を更に含んでな る、請求項２６に記載のアデノウイルスベクター。 ２８．非アデノウイルス転写をトランス活性化するタンパク質をコードする遺伝 子を更に含んでなり、その遺伝子が宿主細胞で上記タンパク質の発現に必要な要 素のコントロール下におかれてなる、請求項２６または２７に記載のアデノウイ ルスベクター。 ２９．転写をトランス活性化するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉ ａｅＧａｌ４タンパク質をコードする遺伝子を含んでなる、請求項２８に記載の アデノウイルスベクター。 ３０．請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターを含んで なる、アデノウイルス粒子。 ３１．請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターまたは請 求項３０に記載のアデノウイルス粒子を含んでなる、真核宿主細胞。 ３２．特に５′ＩＴＲ以外のアデノウイルスのゲノムのＥ１領域の部分を含んだ 補足要素を含んでなる補足系であって、 上記補足要素が欠陥アデノウイルスベクターをイントランスで補うことができ、 上記補足系のゲノムに組込まれているかまたは発現ベクター中に挿入されてなる 、補足系。 ３３．特に： （ｉ）アデノウイルスのゲノムのＥ１Ａ領域の全部または一部、および （ｉｉ）Ｅ１Ｂ、Ｅ２およびＥ４領域から選択される上記ゲノムの少くとも１つ の領域の全部または一部を含んでなる、請求項３２に記載の補足系。 ３４．特に： （ｉ）アデノウイルスのゲノムのＥ１Ａ領域の全部または一部、および （ｉｉ）上記ゲノムのＥ１Ｂ、Ｅ２およびＥ４領域のうち少くとも２つの全部ま たは一部 を含んでなる、請求項３２に記載の補足系。 ３５．特に： （ｉ）アデノウイルスのゲノムのＥ１Ａ領域の全部または一部、および （ｉｉ）上記ゲノムのＥ１Ｂ、Ｅ２およびＥ４領域の全部または一部 を含んでなる、請求項３２に記載の補足系。 ３６．特に、Ｅ１Ａ領域の全部または一部、および初期タンパク質をコードする アデノウイルスのゲノムのＥ１Ｂ領域の全体を含んでなる、請求項３３〜３５の いずれか一項に記載の補足系。 ３７．特に、イヌ、トリおよびヒトアデノウイルスから選択されるアデノウイル スのゲノムの部分を含んでなる、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載の補足 系。 ３８．特に、ヒトアデノウイルスタイプ５のゲノムの部分を含んでなる、請求項 ３７に記載の補足系。 ３９．特に、 （ｉ）ヌクレオチド１００〜ヌクレオチド５２９７、（ｉｉ）ヌクレオチド１０ ０〜ヌクレオチド４０３４、または （ｉｉｉ）ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド４０３４にわたるヒトアデノウイ ルスタイプ５のゲノムの部分を含んでなる、請求項３８に記載の補足系。 ４０．特に、ヌクレオチド３２８００〜ヌクレオチド３５８２６にわたるヒトア デノウイルスタイプ５のゲノムのＥ４領域の部分を含んでなる、請求項３８また は３９に記載の補足系。 ４１．特に、ヌクレオチド５０５〜ヌクレオチド３５８２６にわたるヒトアデノ ウイルスタイプ５のゲノムの部分を含んでなる、請求項３８に記載の補足系。 ４２．天然プロモーターを欠くアデノウイルスのゲノムのＥ１Ａ領域の部分を含 み、その部分が適切なプロモーターのコントロール下におかれてなる、請求項３ ２〜４１のいずれか一項に記載の補足系。 ４３．Ｅ１Ａ領域の部分が、非アデノウイルス転写をトランス活性化するタンパ ク質により誘導しうるプロモーターのコントロール下におかれてなる、請求項４ ２に記載の補足系。 ４４．Ｅ１Ａ領域の部分が、請求項２８または２９に記載のアデノウイルスベク ターによりコードされる転写をトランス活性化するタンパク質により誘導しうる プロモーターのコントロール下におかれてなる、請求項４３に記載の補足系。 ４５．Ｅ１Ａ領域の部分が、転写をトランス活性化するＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃ ｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＧａｌ４タンパク質により誘導しうるプロモーターの コントロール下におかれてなる、請求項４３または４４に記載の補足系。 ４６．選択マーカーをコードする遺伝子を更に含んでなる、請求項３２〜４５の いずれか一項に記載の補足系。 ４７．選択遺伝子がプロマイシンアセチルトランスフェラーゼをコードするもの である、請求項４６に記載の補足系。 ４８．選択遺伝子が、野生型アデノウイルスのゲノムのＥ１Ａ領域によりコード される転写をトランス活性化するタンパク質により誘導されうるプロモーターの コントロール下、特に上記ゲノムのＥ２領域のプロモーターのコントロール下に おかれてなる、請求項４６または４７に記載の補足系。 ４９．薬学的観点から許容される細胞系に由来する、請求項３２〜４８のいずれ か一項に記載の補足系。 ５０．Ｖｅｒｏ、ＢＨＫ、Ａ５４９、ＭＲＣ５、Ｗ１３８およびＣＨＯ系から選 択される細胞系に由来する、請求項４９に記載の補足系。 ５１．ヒト胚網膜細胞に由来する、請求項３２〜４８のいずれか一項に記載の補 足系。 ５２．（ｉ）請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクターが 、トランスフェクトされた補足系を得るために、上記アデノウイルスベクターを イントランスで補える補足系中に導入され、（ｉｉ）上記トランスフェクトされ た補足系がアデノウイルス粒子の生産を行うために適した条件下で培養され、（ ｉｉｉ）上記アデノウイルス粒子が細胞培養物中で回収される、 請求項３０に記載のアデノウイルス粒子の生産方法。 ５３．請求項３２〜５１のいずれか一項に記載の補足系が用いられる、請求項５ ２に記載の方法。 ５４．請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター、請求項 ３０に記載されたまたは請求項５２または５３に記載の方法を用いて得られたア デノウイルス粒子、請求項３１に記載の真核宿主細胞、または請求項３２〜５１ のいずれか一項に記載の補足系の治療または予防における使用。 ５５．請求項１〜２９のいずれか一項に記載のアデノウイルスベクター、請求項 ３０に記載されたあるいは請求項５２または５３に記載の方法を用いて得られた アデノウイルス粒子、請求項３１に記載の真核細胞、または請求項３２〜５１の いずれか一項に記載の補足系を治療または予防剤として、薬学的観点から許容さ れるビヒクルとともに含んでなる、医薬組成物。