JPH0870818A - 肉質改良剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 肉組織中のスジや腱などの硬質蛋白質を軟化
させ、食肉の食味を向上させる肉質改良剤を提供する。 【構成】 肉組織中の硬質蛋白質を特異的に加水分解す
るプロテアーゼを含有する肉質改良剤。使用できるプロ
テアーゼの例としてストレプトミセス・グリセオロアル
ブス ＳＮ−２２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３８３７）の生
産するプロテアーゼが挙げられる。 【効果】 スジや腱など硬質蛋白質を多く含む低品位の
肉に適用すると、肉質が軟化するばかりでなく食味的に
も優れた肉が得られ、その品位を向上することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、肉組織中のスジや腱な
どの硬質蛋白質を軟化させ、食肉の食味を向上させる肉
質改良剤に関する。さらに詳しくは、肉組織中の硬質蛋
白質を特異的に加水分解するプロテアーゼを含有する肉
質改良剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】食肉の軟化方法としては従来よりパパイ
ン、ブロメライン、メロン由来のプロテアーゼなど植物
由来のプロテアーゼを作用させることが知られている
（ＮｅｗＦｏｏｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，ｖｏｌ．３６，
Ｎｏ．２，ｐ５３〜５６（１９９４））。最近では、パ
パインなどのプロテアーゼ、ペプチダーゼ、アミラー
ゼ、コラゲナーゼの中から選ばれた１種類以上の酵素
と、アルカリ性バチルス属細菌の生産するエラスターゼ
を組合せ、肉を軟化する方法が提案されている（特開平
５−２７６８９９号）。

【０００３】食肉は、筋原線維蛋白質からなる筋細胞
と、スジや腱などの硬質蛋白質である結合組織からな
る。筋細胞は熟成中にエンドペプチダーゼ類の作用によ
り軟化する（化学と生物，ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．４，ｐ
２２９〜２３７（１９９４））が、硬蛋白質であるエラ
スチンやコラーゲンはこれらの酵素の作用を受けず、軟
化することはない。パパイン、ブロメラインなどを肉に
作用させると、確かに肉は軟化するが、その作用は特異
的ではなく筋細胞にも作用し、肉がボロボロとなったり
溶解してしまう。従って、筋細胞に作用せず、スジや腱
を特異的に軟化させる酵素の出現が期待されている。ア
ルカリ性バチルス属細菌の生産するエラスターゼ（Ｂｉ
ｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，ｖｏｌ．８８
３，ｐ４３９〜４４７（１９８６））はエラスチン分解
力が強く、一つの解答とは考えられるが、本酵素は基質
特異性が比較的広く、エラスチンのみならず肉質蛋白質
も分解するため、肉質の低下が問題であった。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、極めて基質
特異性が高く硬質蛋白質にのみ作用する酵素を使用する
ことにより、スジや腱などの多い食肉を軟化させ、筋細
胞蛋白質の分解を起こさず食肉の質を改良することが可
能となる肉質改良剤を提供するものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、種々のプ
ロテアーゼを用い、硬質蛋白質を多く含みスジや腱の多
い低品位の肉の軟化方法を鋭意検討していたが、驚くべ
きことにある種の放線菌が生産するプロテアーゼが硬質
蛋白質を特異的に分解し、他の筋原線維蛋白質などをほ
とんど分解しないことを見出し、本発明を完成した。

【０００６】すなわち本発明は、下記の性質を有するプ
ロテアーゼを含有する肉質改良剤であり、より具体的に
は放線菌ＳＮ−２２株が生産するプロテアーゼ、マシキ
ノリシン（Ｍａｓｉｋｉｎｏｌｙｓｉｎ）を含有するこ
とを特徴とする肉質改良剤である。 １）作用：Ｌ−バリンおよびＬ−アラニンのカルボキシ
ル基によるペプチド結合を加水分解する。 ２）基質特異性：還元アルキル化リゾチームを基質とし
た場合に、Ａｌａ１０−Ａｌａ１１、Ｖａｌ２９−Ｃｙ
ｓ３０、Ａｌａ３２−Ｃｙｓ３３、Ａｌａ４２−Ｔｈｒ
４３、Ａｌａ９０−Ｓｅｒ９１、Ｖａｌ１０９−Ａｌａ
１１０の間を切断する。 ３）作用ｐＨ範囲および至適ｐＨ：スクシニル−アラニ
ル−アラニル−アラニル−パラニトロアニリドを基質と
し、３７℃で測定した場合、作用ｐＨ範囲が６〜１１で
あり、至適ｐＨは９．０である。 ４）作用温度範囲および至適温度：スクシニル−アラニ
ル−アラニル−アラニル−パラニトロアニリドを基質と
し、ｐＨ１０．０のグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液
中で測定した場合、作用温度範囲が３０℃〜６０℃であ
り、至適温度は４５℃である。

【０００７】５）ｐＨ安定性：３７℃、４０分間保持し
た後の残存相対活性を測定した場合、安定ｐＨ範囲はｐ
Ｈ８〜１１である。 ６）温度安定性：ｐＨ９で１時間保持した後の残存酵素
活性を測定した場合、１０〜４０℃まで安定であり、６
０℃では失活する。 ７）阻害剤：ジイソプロピルホスホフルオリデートおよ
びフェニルメタンスルホニルフルオリドにより阻害を受
け、微生物アルカリプロテアーゼ阻害剤、エラスチナー
ル、パラクロロ水銀安息香酸、エチレンジアミン四酢酸
では阻害されない。８）等電点：等電点電気泳動法によ
る等電点（ｐＩ）は ６．４である。 ９）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法により測定した分子量は２６，０００ダルトンであ
る。

【０００８】本発明の肉質改良剤に含まれるプロテアー
ゼ、マシキノリシンを生産する放線菌ＳＮ−２２株の菌
学的性質を以下に記す。 １．形態的特徴 寒天培地上に生育した基底菌糸より気中菌糸を生じ、こ
れはよく伸張し直鎖状の菌糸先端に胞子鎖を生じる。胞
子表面は平滑であり、大きさは、直径０．５〜０．７μ
ｍ、長さ１．０〜１．５μｍである。

【０００９】２．各種培地上での生育状態 （１）トリプトン・酵母エキス寒天培地（ＩＳＰ−１）
での生育は中程度で白色の気菌糸を少量着生する。基底
菌糸は白色でメラノイド色素および可溶性色素の生成は
ない。 （２）麦芽エキス・酵母エキス寒天（ＩＳＰ−２）での
生育は旺盛で白色の気菌糸を着生し、その先端に赤味を
帯びた胞子を着生することがある。基底菌糸の色は淡い
褐色であり、メラノイド色素および可溶性色素の生成は
ない。 （３）オートミール寒天培地（ＩＳＰ−３）での生育は
ＩＳＰ−２の場合と似ているが紫色の可溶性色素を生成
する。 （４）澱粉・塩類寒天培地（ＩＳＰ−４）での生育はＩ
ＳＰ−２の場合と類似するが僅かに黄色可溶性色素を生
成する。 （５）グリセロール・アスパラギン寒天培地（ＩＳＰ−
５）での生育はＩＳＰ−２の場合と類似するが胞子は白
色であり基底菌糸は無色で褐色の可溶性色素を生成す
る。チロシン添加培地でメラニン色素は生成しない

【００１０】３．生育温度範囲 生育温度範囲は１５〜３５℃であり至適生育温度は２６
〜３０℃である。 ４．各種炭素源の利用性 プリードハム・ゴットリーブの培地を用いて調べた結
果、Ｄ−キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトー
ス、シュークロース、イノシトール、Ｌ−ラムノース、
Ｄ−マンニトールを利用し、ラフィノースは利用しな
い。

【００１１】５．細胞壁成分 細胞壁成分を全菌体の分解物を用いて調べた結果、ＬＬ
−ジアミノピメリン酸を含みガラクトース、マンノー
ス、リボース、ラムノースおよび少量のグルコースを含
んだ。これらの結果からルシェバリエ（インターナショ
ナル・ジャーナル・オブ・システマティック・バクテリ
オロジー（Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃｔ．）ｖｏ
ｌ．２０，ｐ４３５〜４４３（１９７０））のタイプＩ
細胞壁に属した。

【００１２】以上の菌学的性質からＩｎｔ．Ｊ．Ｓｙ
ｓ．Ｂａｃｔ．，ｖｏｌ．１８，ｐ６９〜１８９，ｐ２
７９〜３９２（１９６８）、同ｖｏｌ．１９，ｐ３９１
〜５１２（１９６９）、同ｖｏｌ．２２，ｐ２６５〜３
９４（１９７２）を参考に検索し本菌株をストレプトミ
セス・グリセオロアルブス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｇｒｉｓｅｏｌｏａｌｂｕｓ）ＳＮ−２２と同定した。
本菌株は、工業技術院生命工学工業技術研究所に菌寄第
１３８３７号（ＦＥＲＭ Ｐ−１３８３７）として寄託
している。

【００１３】本発明の肉質改良剤に含まれるプロテアー
ゼ、マシキノリシンは上記菌株を栄養培地に接種し、好
気的に培養することにより製造される。上記菌株の培養
方法は、原則的には一般微生物の培養方法に準ずるが、
通常は液体培養による振とう培養、通気攪拌培養などの
好気的条件下で行うのが好適である。

【００１４】培養に用いられる培地としては、ストレプ
トミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属に属する微生
物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各
種の合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも用い
ることができる。培地組成としては炭素源としてのグル
コース、シュークロース、フルクトース、グリセリン、
デキストリン、澱粉、糖蜜などを単独又は組合わせて用
いることができる。窒素源としてはファーマメディア、
ペプトン、肉エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、酵
母エキス、麦芽エキス、尿素などの有機窒素源、硝酸ナ
トリウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素源を単独又
は組合わせて用いることができる。その他、塩化ナトリ
ウム、塩化カリウム、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウ
ム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化コバルト
などの塩類、重金属類塩、ビタミンＢ、ビオチンなどの
ビタミン類も必要に応じて添加することができる。な
お、培養中発泡が著しいときは公知の各種消泡剤を適宜
培地中に添加することもできる。

【００１５】培養条件は、上記菌株が良好に生育してマ
シキノリシンを生産し得る範囲内で適宜選択すればよ
い。例えば、培地のpHは、５〜９程度、通常中性付近と
することが好ましい。培養温度は、微生物が良好に生育
する温度、通常２６〜３０℃に保つのがよく、培養時間
は、３〜５日間程度でよい。

【００１６】マシキノリシンは、菌体外酵素であるの
で、培養終了後、ろ過または遠心分離により菌体を除き
その上澄液を粗酵素液として用いる。粗酵素液はそのま
ま肉質改良剤として使用することもできるが、硫酸アン
モニウムによる塩析沈澱物あるいはエタノール、アセト
ンなどによる沈澱物を得、乾燥粉末として用いることも
できる。また、さらに公知の酵素精製手段、例えばイオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィ
ーなどによって、より活性純度を高めてから使用するこ
ともできる。

【００１７】例えば、次のとおり精製することができ
る。まず培養液よりろ過または遠心分離により菌体を除
去し上澄液を得る。これに硫酸アンモニウムを添加し沈
澱を生成させる。沈澱を水に溶解し透析後ＤＥＡＥセル
ロースカラムクロマトグラフィー、次いでブチルトヨパ
ール６５０Ｓカラムクロマトグラフィー、セファデック
スＧ−７５ゲルろ過により、ディスクゲル電気泳動およ
びゲルろ過クロマトグラフィーで単一バンドとなるまで
精製することができる。

【００１８】粗酵素液から沈澱、各種クロマトグラフィ
ーにより精製されたマシキノリシンの酵素学的性質は以
下のとおりである。 １）作用：Ｌ−バリンおよびＬ−アラニンのカルボキシ
ル基によるペプチド結合を加水分解する。スクシニル−
アラニル−アラニル−アラニル−パラニトロアニリドを
基質として作用させた場合にアラニル−パラニトロアニ
リドのＣＯＮＨ結合を加水分解する。 ２）基質特異性： 還元アルキル化リゾチームを基質と
した場合に、Ａｌａ１０−Ａｌａ１１、Ｖａｌ２９−Ｃ
ｙｓ３０、Ａｌａ３２−Ｃｙｓ３３、Ａｌａ４２−Ｔｈ
ｒ４３、Ａｌａ９０−Ｓｅｒ９１、Ｖａｌ１０９−Ａｌ
ａ１１０の間を切断する。酸化インシュリンＢ鎖を基質
とした場合に、Ｂ鎖のＶａｌ１２−Ｇｌｕ１３の間を強
く切断しＧｌｙ２３−Ｐｈｅ２４間を弱く切断する

【００１９】３）作用ｐＨ範囲および至適ｐＨ：スクシ
ニル−アラニル−アラニル−アラニル−パラニトロアニ
リドを基質とし、クエン酸緩衝液（ｐＨ３．５〜５）、
リン酸緩衝液（ｐＨ５〜７）、トリス・塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７〜９）、グリシン・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
９〜１１）、炭酸水素ナトリウム・水酸化ナトリウム緩
衝液（ｐＨ１０〜１２）中で３７℃、２０分間反応した
ときの相対活性は図１に示すとおりであり、作用ｐＨ範
囲が６〜１１であり、至適ｐＨは９．０である。 ４）作用温度範囲および至適温度：スクシニル−アラニ
ル−アラニル−アラニル−パラニトロアニリドを基質と
し、ｐＨ１０．０のグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液
中で測定した場合、図２に示すように作用温度範囲は３
０℃〜６０℃であり、至適温度は４５℃である。

【００２０】５）ｐＨ安定性：スクシニル−アラニル−
アラニル−アラニル−パラニトロアニリドを基質とし、
クエン酸緩衝液（ｐＨ３〜５）、リン酸緩衝液（ｐＨ５
〜７）、トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ７〜９）、グリシン
・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ９〜１１）、炭酸水素
ナトリウム・水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ１０〜１
２）中に３７℃、４０分間保持した後の残存相対活性を
測定した場合、図３に示すように安定ｐＨ範囲はｐＨ８
〜１１である。 ６）温度安定性：スクシニル−アラニル−アラニル−ア
ラニル−パラニトロアニリドを基質とし、ｐＨ９で１時
間保持した後の残存酵素活性を測定した場合、図４に示
すように１０〜４０℃まで安定であり、６０℃では失活
する。

【００２１】７）阻害剤：ジイソプロピルホスホフルオ
リデートおよびフェニルメタンスルホニルフルオリドに
より阻害を受け、微生物アルカリプロテアーゼ阻害剤、
エラスチナール、パラクロロ水銀安息香酸、エチレンジ
アミン四酢酸、キモスタチン、Ｎ−トシル−Ｌ−リシル
クロロメチルケトン、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニ
ルクロロメチルケトン、オボムコイド、アンチパイン、
タロペプチンでは阻害されない。添加した阻害剤の濃度
および残存活性を表１に示す。

【００２２】

【表１】

【００２３】８）等電点：等電点電気泳動法による等電
点（ｐＩ）は ６．４である。 ９）分子量：ディスクゲル電気泳動およびセファデック
スＧ−７５カラムによるゲルろ過において１バンドであ
り、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により
測定した分子量は２６，０００ダルトンである。従って
本酵素は分子量２６，０００ダルトンの単量体である。

【００２４】本発明の肉質改良剤中の酵素含有量は特に
限定されないが、肉に作用させ有意に肉質を軟化できる
量が好ましい。酵素の含有量は当該酵素の精製度により
大きく異なるが、通常１ｇの肉質改良組成物中０．００
００１〜０．５ｇ程度、好適には０．０００１〜０．１
ｇ程度が推奨される。また肉質改良剤には酵素活性安定
剤、あるいは増量剤として血清アルブミン、グリセロー
ル、塩化カルシウム、シクロデキストリン、デキストリ
ン、乳糖、クエン酸ナトリウム、重曹などを単独または
組み合わせて使用することができる。本発明の肉質改良
剤の形態は粉末状でも良いが、緩衝液や水に溶解した液
状でも良い。

【００２５】本発明の肉質改良剤の肉に対する使用方法
は、肉が屠殺直後から調理されるまでの間に酵素が肉に
対し有効に作用する方法であれば、特にその方法は限定
されない。すなわち、肉を液状の肉質改良剤に漬け込
む、液状の肉質改良剤を肉に注入する、粉末または液状
の肉質改良剤を肉に振りかける方法などいずれの方法で
も良い。本発明の肉質改良剤はその本質が酵素であるの
で、酵素反応が充分に進行するよう一定時間保持する必
要がある。通常は、肉を本発明品にて処理後、１晩程度
冷蔵庫に保存すれば良い。酵素反応は通常温度が高い
程、速く進行するので、本発明品にて肉を処理後、３０
〜４０℃に３０〜６０分間保持後、数時間冷蔵庫に保存
することも行われる。

【００２６】本発明における肉質改良剤の使用量は、処
理する肉の種類や肉に含まれる結合組織の量、目的とす
る肉の軟化程度、あるいはその処理温度、処理時間、処
理方法などにより異なるため、普遍的な使用量を示すこ
とはできないが、酵素活性量として肉１．０ｇ当り０．
０１〜１０ユニット程度の量であれば良い。

【００２７】なお、酵素活性は、以下の方法で測定した
ときにパラニトロアニリンを１μｍｏｌ／ｍｉｎ／ｍｌ
生成する酵素量を１ユニット（ｕ）と定義した。酵素サ
ンプル溶液１００μｌ、ｐＨ１０の５０ｍＭグリシン・
水酸化ナトリウム緩衝液１ｍｌを混合し３７℃、１０分
間保持後、２ｍＭスクシニル−アラニル−アラニル−ア
ラニル−パラニトロアニリド（５０％メタノール溶液）
１００μｌを加え３７℃で２０分間反応する。その後、
１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）を２００μｌ加え４１０
ｎｍの吸光度を測定する。

【００２８】以下に実施例を示し本発明の効果をさらに
具体的に説明するが、本発明はこれらにより何ら限定さ
れるものではない。なお、下記の説明中特に記載がない
限り表示濃度は重量％である。

【００２９】

【実施例】

実施例１ グルコース１％、脱脂大豆粉 ０．５％、酵母エキス
０．３％、麦芽エキス０．３％を含む培地（ｐＨ７．
０）７０ｍｌを肩付振とうフラスコ（坂口フラスコ）に
入れ１２０℃、１５分間蒸気加圧滅菌しストレプトミセ
ス・グリセオロアルブス・ＳＮ−２２株を接種し３０℃
にて８４時間振とう培養した。この培養液を遠心分離し
菌体を除去し上澄み液を得た。この液の酵素活性は２．
５ｕ／ｍｌであり、これを粗酵素液として以下の精製を
実施した。

【００３０】上記粗酵素液１０ｌに硫酸アンモニウムを
４０％飽和になるように添加し、４℃で１時間放置後生
じた沈澱を遠心分離で集めた。沈澱物を１ｌの水に溶解
し、純水に対して低温下で２４時間透析後、ＤＥＡＥカ
ラムクラマトグラフィーに供した。吸着した酵素蛋白質
を０〜１Ｍの食塩水で溶出し、活性画分を集め再び４０
％飽和硫酸アンモニウムで塩析沈澱化を行い、続いてセ
ファデックスＧ−７５カラムクロマトグラフィーでゲル
ろ過を行い活性画分を集めた。これを凍結乾燥し酵素蛋
白質２００ｍｇを得た。この比活性は１３ｕ／ｍｇであ
り、ろ液からの収率は１０．３％、純度は９１倍以上に
上昇していた。

【００３１】実施例２ 実施例１で得られた精製マシキノリシン１００μｌ（１
０ｕ）およびｐＨ１０の５０ｍＭグリシン・水酸化ナト
リウム緩衝液１ｍｌを２ｍＭスクシニル−アラニル−ア
ラニル−アラニル−パラニトロアニリド溶液１００μｌ
に加え、３７℃、２０分間反応し、反応液をメルク社製
シリカゲル薄層クロマトグラフィープレート（Ａｒｔ５
７１５）に１０μｌスポットし、ブタノール：酢酸：水
（４：１：２）で展開し、ニンヒドリン発色により酵素
反応物を調べ、パラニトロアニリンの生成を確認した。

【００３２】実施例３ 実施例１で得られた精製マシキノリシン２０５μｇをガ
ラスチューブに入れ６Ｎ塩酸を２００μｌ加え封管し、
１００℃、４８時間加水分解を行ないアミノ酸組成を分
析した。その結果を表２に示す。Ａｓｘ、Ｇｌｙ、Ｖａ
ｌが多く含まれることが特徴である。なお、Ａｓｘはア
スパラギン酸またはアスパラギンを表わし、Ｇｌｘはグ
ルタミン酸またはグルタミンを表わす。

【００３３】

【表２】

【００３４】実施例４ 実施例１で得られたマシキノリシンを用いて酸化インシ
ュリンＢ鎖に対する加水分解部位を決定した。５０ｍＭ
トリス・塩酸緩衝液（ｐＨ９）に溶解した酸化インシュ
リンＢ鎖（シグマ社製）１ｍｇ／ｍｌの溶液２５０μｌ
に酵素標品２．４μｇを加え、３７℃で反応し、１５、
３０、６０、２４０分毎にサンプリングを行ない、最終
濃度０．１Ｎになるように塩酸を加えて（６Ｎ塩酸を５
μｌ添加）反応を停止した後、その９μｌを用いて高速
液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分解、分取
した。

【００３５】ＨＰＬＣの条件 カラム：Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ５Ｃ１８、４×１５０ｍ
ｍ 展開溶媒：Ａ＝０．０５％トリフルオロ酢酸 Ｂ＝８０％アセトニトリル＋０．０５％トリフルオロ酢
酸 グラジエント Ａ１００％→５０％、４５分 検出：２１０ｎｍ 流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ カラム温度：４０℃

【００３６】分取した４ピークについてアミノ酸配列の
決定を行ない加水分解部位を決定した。本酵素は酸化イ
ンシュリンＢ鎖のＶａｌ１２−Ｇｌｕ１３の間を強く切
断しＧｌｙ２３−Ｐｈｅ２４間を弱く切断することが分
かった。種々のプロテアーゼによる加水分解の状態を図
５に示す。

【００３７】実施例５ 還元アルキル化リゾチーム（和光純薬製）に対する加水
分解部位を調べた。５０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ
９）に溶解した還元アルキル化リゾチームに実施例１で
得られた酵素標品を還元アルキル化リゾチーム：酵素＝
１００：１（ｗ：ｗ）の割合で混合し３０℃で反応し、
１５、３０、６０、１２０分毎にサンプリングを行ない
塩酸により反応を停止後ＨＰＬＣにより分析を行なっ
た。

【００３８】ＨＰＬＣの条件 カラム：Ｗａｋｏｓｉｌ ５Ｃ４、２．６×１５０ｍｍ 溶媒：Ａ＝０．０５％トリフルオロ酢酸 Ｂ＝８０％アセトニトリル＋０．０５％トリフルオロ酢
酸 グラジエント Ａ１００％→Ｂ１００％、４５分 流速：０．３ｍｌ／ｍｉｎ 検出：２１０ｎｍ

【００３９】得られた９個のピークの分取を行ないアミ
ノ酸配列の分析を行ない加水分解部位を次に示すように
決定した。マシキノリシンは、還元アルキル化リゾチー
ムのＡｌａ１０−Ａｌａ１１、Ｖａｌ２９−Ｃｙｓ３
０、Ａｌａ３２−Ｃｙｓ３３、Ａｌａ４２−Ｔｈｒ４
３、Ａｌａ９０−Ｓｅｒ９１およびＶａｌ１０９−Ａｌ
ａ１１０の間を切断した。図６にこれらの加水分解部位
を示す。以上の結果から本酵素はＬ−バリン並びにＬ−
アラニンのカルボキシル末端を切断する特異なプロテア
ーゼであることがわかる。

【００４０】実施例６ 市販の牛スジおよび鶏腿肉から採取したスジを用い、実
施例１にて得られた本発明のマシキノリシンの動物のス
ジに対する効果を調べた。比較のため、豚膵臓由来エラ
スターゼ（和光純薬工業株式会社製）、Ｃｌｏｓｔｒｉ
ｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由来コラゲナーゼ
（コラゲナーゼ・アマノ、天野製薬株式会社製）、パパ
イヤ由来パパイン（パパインＷ−４０、天野製薬株式会
社製）、パイナップル由来ブロメライン（天野製薬株式
会社製）についても同時に試験を行った。尚、酵素類の
作用を確認するため、使用酵素濃度は大過剰量とした。

【００４１】牛のスジは２ｍｍ×２ｃｍ、鶏のスジは取
得した紐状のものを長さ２ｃｍに切り、容量約１ｍｌの
豆試験管に入れ、マシキノリシンは４０ｍＭトリス・塩
酸緩衝液（ｐＨ９．０）に濃度６ｍｇ／ｍｌ、豚膵臓由
来エラスターゼは４０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ
８．８）に濃度２．２４ｍｇ／ｍｌ、コラゲナーゼは４
０ｍＭ ＭｃＩｌｖａｉｎｅ氏緩衝液（ｐＨ７．０）に
濃度２．１５ｍｇ／ｍｌ、パパインは４０ｍＭ ＭｃＩ
ｌｖａｉｎｅ氏緩衝液（ｐＨ７．０）に濃度１０．２ｍ
ｇ、ブロメラインは４０ｍＭ ＭｃＩｌｖａｉｎｅ氏緩
衝液（ｐＨ７．０）に濃度９．８ｍｇ／ｍｌの酵素溶液
をそれぞれ０．５ｍｌ添加し、３０℃にて１６時間反応
を行った。酵素反応後のスジを取り出し、実態顕微鏡下
で拡大倍率６０倍にて、処理後のスジの状態を観察し
た。

【００４２】その結果、パパイン、ブロメライン処理で
は両スジ共に酵素により全く変化を受けず、酵素処理前
と同じ状態であった。パパイン、ブロメラインはスジに
対し、酵素作用を示さないことが明らかとなった。コラ
ゲナーゼ処理では鶏スジは完全に溶解し、牛スジは表面
が溶解しドロドロの状態となった。一方、マシキノリシ
ンとエラスターゼはスジに対し、ほとんど同様の作用を
示した。すなわち、両酵素処理では両スジ共にスジの原
形は留めていたが、表面が透明に変化し、明確にスジに
対する作用が確認された。以上より、マシキノリシンは
コラゲナーゼほど強力ではないが、結合組織であるスジ
に対し、豚膵臓由来のエラスターゼと同様の作用を示す
ことが明らかとなった。

【００４３】実施例７ マシキノリシンおよび実施例６で用いた種々のプロテア
ーゼの筋原線維蛋白質に対する作用を調べた。市販の牛
腿肉５．１２ｇをＲ．Ｙａｎｇらの方法（Ａｇｒｉｃ．
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．３６，Ｎｏ．１２，ｐ
２０８７〜２０９５（１９７２））にて処理し、粗筋原
線維蛋白質６．４ｇ（湿重量、ローリー法による蛋白質
含量１２．６％）を得た。

【００４４】得られた筋原線維蛋白質１０ｍｇ（粗筋原
線維１２２ｍｇ）に２ｍｌの緩衝液（処理酵素毎に、実
施例６と同じ緩衝液を使用）を加え均一に攪拌後、各酵
素液０．２ｍｌを添加し、３７℃で１時間反応を行っ
た。各酵素の酵素濃度はそれぞれ、マシキノリシン２４
２μｇ／ｍｌ、豚膵臓エラスターゼ２５８μｇ／ｍｌ、
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ由
来コラゲナーゼ２４８μｇ／ｍｌ、パパイン２５６μｇ
／ｍｌ、ブロメライン２７８μｇ／ｍｌであった。

【００４５】酵素反応液についてＳＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動を行い、各種酵素による筋原線維蛋
白質の挙動を調べた。図７にＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動の電気泳動図を示す。図７に示したよう
に、パパイン、ブロメラインは分子量２０万付近の筋原
線維蛋白質のミオシン重鎖（図中のＭＨＣ）を良好に分
解し、蛋白質バンドが消失した。筋原線維蛋白質を分解
しないと思われた、豚膵エラスターゼもミオシン重鎖を
完全に分解した。

【００４６】一方、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｈｉｓｔ
ｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のコラゲナーゼは本条件では、ミ
オシン重鎖蛋白質には全く作用しなかった。本発明のマ
シキノリシンは、図よりミオシン重鎖に僅かに作用して
いるように観察されるが、豚膵エラスターゼとは異な
り、ミオシン重鎖のバンドをほとんど残していた。以上
の観察より、マシキノリシンは筋原線維蛋白質に及ぼす
影響は少なく、硬蛋白質に作用することから、肉質を軟
化し、且つ、肉質を過剰に分解する懸念のないことが判
明した。

【００４７】実施例８ 市販の牛内腿肉２ｋｇを購入し、厚さ２ｃｍ、１切れ５
０ｇに切断し、肉重量の３％容量のマシキノリシン酵素
溶液あるいは緩衝液を、注射器（注射針：２５Ｇ）で４
ｍｍ間隔で肉の上下に肉厚の１／３付近に注入し、５℃
にて一晩冷蔵庫に放置後、３ｌのイオン交換水中で９５
℃、１５分間蒸煮後、レオメーター（ＣＲ−２００Ｄ、
株式会社サン科学製）にて、直径４ｍｍ円柱型のプラン
ジャーを使用し、侵入速度５０ｍｍ／ｍｉｎ、圧縮距離
５ｍｍの条件にて、肉の固さをその最大荷重として求め
た。

【００４８】各試験区の処理条件は以下のとおりであ
る。 １）無処理 ２）２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８）を注入した
もの ３）肉１ｇ当り０．２ｕのマシキノリシン（使用酵素量
１０ｕ、精製酵素０．７７ｍｇ相当）を２）の緩衝液に
溶解した酵素液を注入したもの ４）肉１ｇ当り０．５ｕのマシキノリシン（使用酵素量
２５ｕ、精製酵素１．９２ｍｇ相当）を２）の緩衝液に
溶解した酵素液を注入したもの ５）肉１ｇ当り１．０ｕのマシキノリシン（使用酵素量
５０ｕ、精製酵素３．８５ｍｇ相当）を２の緩衝液に溶
解した酵素液を注入したもの各試験区の処理肉の結果を
剪断最大荷重として表３に示す。

【００４９】

【表３】

【００５０】表３に示したとおり、本発明のマシキノリ
シンを含有する肉質改良剤は肉に対して顕著な軟化効果
を示すことが判明した。また、使用酵素量は肉１ｇに対
し、０．２ｕ以上で有意に肉を軟化できることが判明し
た。

【００５１】実施例９ 本発明は酵素の作用に関するものであるので、肉に対す
る作用温度を３０℃程度に上げれば肉の軟化作用が増大
すると考えられたので、酵素液を肉に注入後、冷蔵庫に
一晩保存する前に、３０℃、３０分間保温した。試験
区、試験条件は３０℃、３０分間プレインキュベート以
外は実施例８と同じである。各試験区の処理肉の結果を
剪断最大荷重として表４に示す。

【００５２】

【表４】

【００５３】表４に示したとおり、反応条件として肉に
酵素液を注入後、３０℃、３０分間プレインキュベート
しても、特に肉の軟化に顕著な効果は認められなかっ
た。プレインキュベートにより、緩衝液処理区では肉が
やや固くなったが、マシキノリシン注入区では実施例８
と同様、肉１ｇに対し、酵素量０．２ｕ以上の使用で、
肉の有意な軟化効果が認められた。

【００５４】比較例１ 本発明の効果を他の酵素と比較するために、パパイン
（パパイヤ由来、４００ｕ／ｍｇ、天野製薬株式会社
製）の肉の軟化効果を調べた。実験条件は実施例８と同
様とした。但し、予備試験より使用酵素量を決定した。
すなわち、市販の牛内腿肉２ｋｇを購入し、厚さ２ｃ
ｍ、１切れ５０ｇに切断し、肉重量の３％容量のパパイ
ン酵素溶液あるいは緩衝液を、注射器（注射針：２５
Ｇ）で４ｍｍ間隔で肉の上下に肉厚の１／３付近に注入
し、５℃にて一晩冷蔵庫に放置後、３ｌのイオン交換水
中で９５℃、１５分間蒸煮後、レオメーター（ＣＲ−２
００Ｄ、株式会社サン科学製）にて、直径４ｍｍ円柱型
のプランジャーを使用し、侵入速度５０ｍｍ／ｍｉｎ、
圧縮距離５ｍｍの条件にて、肉の固さをその最大荷重と
して求めた。

【００５５】各試験区の処理条件は以下のとおりであ
る。 １）無処理 ２）２０ｍＭトリスー塩酸緩衝液（ｐＨ８）を注入した
もの ３）肉１ｇ当り５ｕのパパインを２）の緩衝液に溶解し
た酵素液を注入したもの ４）肉１ｇ当り１０ｕのパパインを２）の緩衝液に溶解
した酵素液を注入したもの ５）肉１ｇ当り１５ｕのパパインを２）の緩衝液に溶解
した酵素液を注入したもの各試験区の処理肉の結果を剪
断最大荷重として表５に示す。

【００５６】

【表５】

【００５７】表５に示したとおり、パパインは肉１ｇ当
りの酵素量１０ｕ以上の使用で、緩衝液注入区に対し５
％の危険率で有意に肉を軟化した。パパイン処理の場合
は酵素量の上昇に伴う肉の軟化度がマシキノリシンのよ
うには顕著ではなかった。また、酵素液注入部位が溶解
すると共に、注射針の痕跡を伝って肉の表面に多くのひ
び割れが生じた。これはパパインが筋原線維を消化して
しまうためと考えられ、パパインは肉の処理には適して
いないことが判明した。

【００５８】比較例２ 本発明の効果を他の酵素と比較するために、エラスター
ゼ（豚膵臓由来、２５１ｕ／ｍｇ、和光純薬工業株式会
社製）の肉の軟化効果を調べた。実験条件は実施例４と
同様とした。但し、予備試験より使用酵素量を決定し
た。すなわち、市販の牛内腿肉２ｋｇを購入し、厚さ２
ｃｍ、１切れ５０ｇに切断し、肉重量の３％容量のエラ
スターゼ酵素溶液あるいは緩衝液を、注射器（注射針：
２５Ｇ）で４ｍｍ間隔で肉の上下に肉厚の１／３付近に
注入し、５℃にて一晩冷蔵庫に放置後、３ｌのイオン交
換水中で９５℃、１５分間蒸煮後、レオメーター（ＣＲ
−２００Ｄ、株式会社サン科学製）にて、直径４ｍｍ円
柱型のプランジャーを使用し、侵入速度５０ｍｍ／ｍｉ
ｎ、圧縮距離５ｍｍの条件にて、肉の固さをその最大荷
重として求めた。

【００５９】各試験区の処理条件は以下のとおりであ
る。 １）無処理 ２）２０ｍＭトリス・塩酸緩衝液（ｐＨ８）を注入した
もの ３）肉１ｇ当り５ｕのエラスターゼを２）の緩衝液に溶
解した酵素液を注入したもの ４）肉１ｇ当り１０ｕのエラスターゼを２）の緩衝液に
溶解した酵素液を注入したもの ５）肉１ｇ当り１５ｕのエラスターゼを２）の緩衝液に
溶解した酵素液を注入したもの各試験区の処理肉の結果
を剪断最大荷重として表６に示す。

【００６０】

【表６】

【００６１】表６に示したとおり、エラスターゼは肉１
ｇ当りの酵素量１４ｕの使用で、無処理区に対し５％の
危険率で有意に肉を軟化した。エラスターゼ処理の場合
は肉の軟化が顕著ではなく、また、エラスターゼが豚膵
臓由来であることを考えると、食品工業で使用するには
価格的にも問題があり、実用的ではないことが指摘され
た。

【００６２】実施例１０ 各酵素で軟化処理した肉について、その食味をパネラー
１５名にて官能検査により評価した。使用した肉は実施
例８に於ける無処理区、マシキノリシン処理肉は実施例
８の肉１ｇ当り０．５ｕ処理区、パパイン処理肉は比較
例１の肉１ｇ当りパパイン１０ｕ処理区、エラスターゼ
処理肉は比較例２の肉１ｇ当り１４ｕ処理区の肉を使用
した。評価は無処理を比較対照とする２点比較法によ
り、１点を極めて不味い、５点を最高に美味しいとする
５点法にて行った。結果を表５に示す。

【００６３】

【表７】

【００６４】表７に示したとおり、無処理区に対し有意
に食味が向上したのは本発明のマシキノリシン処理のみ
であった。エラスターゼは肉の軟化効果が不充分であ
り、パパイン処理は筋原線維も消化されているためか、
食味の評価は高くなかった。以上より本発明の効果は明
白である。

【００６５】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ストレプトミセス・グリセオロアルブスＳＮ
−２２株の生産するプロテアーゼ、マシキノリシンの作
用ｐＨと活性の関係を示す図である。

【図２】 ストレプトミセス・グリセオロアルブスＳＮ
−２２株の生産するプロテアーゼ、マシキノリシンの安
定ｐＨ域を示す図である。

【図３】 ストレプトミセス・グリセオロアルブスＳＮ
−２２株の生産するプロテアーゼ、マシキノリシンの作
用温度と活性の関係を示す図である。

【図４】 ストレプトミセス・グリセオロアルブスＳＮ
−２２株の生産するプロテアーゼ、マシキノリシンの作
用温度安定性を示す図である。

【図５】 ストレプトミセス・グリセオロアルブスＳＮ
−２２株の生産するプロテアーゼ、マシキノリシンおよ
び数種のプロテアーゼによる酸化インシュリンＢ鎖の加
水分解部位を示す図である。

【図６】 ストレプトミセス・グリセオロアルブスＳＮ
−２２株の生産するプロテアーゼ、マシキノリシンによ
る還元アルキル化リゾチームの加水分解を示す図であ
る。

【図７】 ストレプトミセス・グリセオロアルブスＳＮ
−２２株の生産するプロテアーゼ、マシキノリシンおよ
び各種のプロテアーゼによる筋原線維蛋白質の加水分解
を示す、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の図
である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡村 和彦 神奈川県藤沢市城南４−９−１メルシャン 株式会社中央研究所内 (72)発明者 刀根 弘 神奈川県藤沢市城南４−９−１メルシャン 株式会社中央研究所内 (72)発明者 村尾 澤夫 大阪府堺市堀上緑町２−17−31

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の性質を有するプロテアーゼを含有
   することを特徴とする肉質改良剤。 １）作用：Ｌ−バリンおよびＬ−アラニンのカルボキシ
   ル基によるペプチド結合を加水分解する。 ２）基質特異性：還元アルキル化リゾチームを基質とし
   た場合に、Ａｌａ１０−Ａｌａ１１、Ｖａｌ２９−Ｃｙ
   ｓ３０、Ａｌａ３２−Ｃｙｓ３３、Ａｌａ４２−Ｔｈｒ
   ４３、Ａｌａ９０−Ｓｅｒ９１、Ｖａｌ１０９−Ａｌａ
   １１０の間を切断する。 ３）作用ｐＨ範囲および至適ｐＨ：スクシニル−アラニ
   ル−アラニル−アラニル−パラニトロアニリドを基質と
   し、３７℃で測定した場合、作用ｐＨ範囲が６〜１１で
   あり、至適ｐＨは９．０である。 ４）作用温度範囲および至適温度：スクシニル−アラニ
   ル−アラニル−アラニル−パラニトロアニリドを基質と
   し、ｐＨ１０．０のグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液
   中で測定した場合、作用温度範囲が３０℃〜６０℃であ
   り、至適温度は４５℃である。 ５）ｐＨ安定性：３７℃、４０分間保持した後の残存相
   対活性を測定した場合、安定ｐＨ範囲はｐＨ８〜１１で
   ある。 ６）温度安定性：ｐＨ９で１時間保持した後の残存酵素
   活性を測定した場合、１０〜４０℃まで安定であり、６
   ０℃では失活する。 ７）阻害剤：ジイソプロピルホスホフルオリデートおよ
   びフェニルメタンスルホニルフルオリドにより阻害を受
   け、微生物アルカリプロテアーゼ阻害剤、エラスチナー
   ル、パラクロロ水銀安息香酸、エチレンジアミン四酢酸
   では阻害されない。８）等電点：等電点電気泳動法によ
   る等電点（ｐＩ）は ６．４である。 ９）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
   法により測定した分子量は２６，０００ダルトンであ
   る。
2. 【請求項２】 ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
   ｃｅｓ）属に属する微生物が生産し、下記の性質を有す
   るプロテアーゼを含有することを特徴とする肉質改良
   剤。 １）作用：Ｌ−バリンおよびＬ−アラニンのカルボキシ
   ル基によるペプチド結合を加水分解する。 ２）基質特異性： 還元アルキル化リゾチームを基質と
   した場合に、Ａｌａ１０−Ａｌａ１１、Ｖａｌ２９−Ｃ
   ｙｓ３０、Ａｌａ３２−Ｃｙｓ３３、Ａｌａ４２−Ｔｈ
   ｒ４３、Ａｌａ９０−Ｓｅｒ９１、Ｖａｌ１０９−Ａｌ
   ａ１１０の間を切断する。 ３）作用ｐＨ範囲および至適ｐＨ：スクシニル−アラニ
   ル−アラニル−アラニル−パラニトロアニリドを基質と
   し、３７℃で測定した場合、作用ｐＨ範囲が６〜１１で
   あり、至適ｐＨは９．０である。 ４）作用温度範囲および至適温度：スクシニル−アラニ
   ル−アラニル−アラニル−パラニトロアニリドを基質と
   し、ｐＨ１０．０のグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液
   中で測定した場合、作用温度範囲が３０℃〜６０℃であ
   り、至適温度は４５℃である。 ５）ｐＨ安定性：３７℃、４０分間保持した後の残存相
   対活性を測定した場合、安定ｐＨ範囲はｐＨ８〜１１で
   ある。 ６）温度安定性：ｐＨ９で１時間保持した後の残存酵素
   活性を測定した場合、１０〜４０℃まで安定であり、６
   ０℃では失活する。 ７）阻害剤：ジイソプロピルホスホフルオリデートおよ
   びフェニルメタンスルホニルフルオリドにより阻害を受
   け、微生物アルカリプロテアーゼ阻害剤、エラスチナー
   ル、パラクロロ水銀安息香酸、エチレンジアミン四酢酸
   では阻害されない。８）等電点：等電点電気泳動法によ
   る等電点（ｐＩ）は ６．４である。 ９）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
   法により測定した分子量は２６，０００ダルトンであ
   る。
3. 【請求項３】 ストレプトミセス・グリセオロアルブス
   （Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｌｏａｌｂ
   ｕｓ）ＳＮ−２２株（ＦＥＲＭ Ｐ−１３８３７）が生
   産し、下記の性質を有するプロテアーゼを含有すること
   を特徴とする肉質改良剤。 １）作用：Ｌ−バリンおよびＬ−アラニンのカルボキシ
   ル基によるペプチド結合を加水分解する。 ２）基質特異性： 還元アルキル化リゾチームを基質と
   した場合に、Ａｌａ１０−Ａｌａ１１、Ｖａｌ２９−Ｃ
   ｙｓ３０、Ａｌａ３２−Ｃｙｓ３３、Ａｌａ４２−Ｔｈ
   ｒ４３、Ａｌａ９０−Ｓｅｒ９１、Ｖａｌ１０９−Ａｌ
   ａ１１０の間を切断する。 ３）作用ｐＨ範囲および至適ｐＨ：スクシニル−アラニ
   ル−アラニル−アラニル−パラニトロアニリドを基質と
   し、３７℃で測定した場合、作用ｐＨ範囲が６〜１１で
   あり、至適ｐＨは９．０である。 ４）作用温度範囲および至適温度：スクシニル−アラニ
   ル−アラニル−アラニル−パラニトロアニリドを基質と
   し、ｐＨ１０．０のグリシン・水酸化ナトリウム緩衝液
   中で測定した場合、作用温度範囲が３０℃〜６０℃であ
   り、至適温度は４５℃である。 ５）ｐＨ安定性：３７℃、４０分間保持した後の残存相
   対活性を測定した場合、安定ｐＨ範囲はｐＨ８〜１１で
   ある。 ６）温度安定性：ｐＨ９で１時間保持した後の残存酵素
   活性を測定した場合、１０〜４０℃まで安定であり、６
   ０℃では失活する。 ７）阻害剤：ジイソプロピルホスホフルオリデートおよ
   びフェニルメタンスルホニルフルオリドにより阻害を受
   け、微生物アルカリプロテアーゼ阻害剤、エラスチナー
   ル、パラクロロ水銀安息香酸、エチレンジアミン四酢酸
   では阻害されない。８）等電点：等電点電気泳動法によ
   る等電点（ｐＩ）は ６．４である。 ９）分子量：ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
   法により測定した分子量は２６，０００ダルトンであ
   る。