JPH0767650A - アルツハイマー病用のモデルとしての遺伝子交換性ハツカネズミ中の表示用組み換え型ａｐｐ小遺伝子 - Google Patents

アルツハイマー病用のモデルとしての遺伝子交換性ハツカネズミ中の表示用組み換え型ａｐｐ小遺伝子

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JPH0767650A
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【目的】アルツハイマー病用のモデルとしての遺伝子交
換性ハツカネズミ中の表示用組み換え型ＡＰＰ小遺伝子
の提供。 【構成】組み換え型遺伝子構成体、小遺伝子（ｍｉｎｉ
ｇｅｎｅ）構成体、およびアルツハイマー様病理学の表
現型表示用の遺伝子交換性ハツカネズミに関する。さら
に、アルツハイマー病用の遺伝子交換性動物モデルにも
関する。特にアミロイド先駆体蛋白質のコード付け配列
の全てまたは一部を含んで、小遺伝子構成体を有する遺
伝子交換性ハツカネズミ中で特異的な方法で細胞および
組織中で表示可能な種々の小遺伝子構成体。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】本発明は、組み換え型遺伝子構成体、小
遺伝子(minigene)構成体、およびアルツハイマー様病理
学の表現型表示用の遺伝子交換性ハツカネズミに関する
ものである。本発明はさらに、アルツハイマー病用の遺
伝子交換性動物モデルにも関するものである。特に、本
発明はアミロイド先駆体蛋白質のコード付け配列の全て
または一部を含んでおりそして小遺伝子構成体を有する
遺伝子交換性ハツカネズミ中で特異的な方法で細胞およ
び組織中で表示可能な種々の小遺伝子構成体を提供する
ものである。
【０００２】アルツハイマー病（ＡＤ）は人生後半にお
ける痴呆の最も一般的な単一原因である。ＡＤ患者は、
進行性の記憶障害、言語および視覚空間的能力の損失、
並びに行動欠損により特徴づけられている（マッカーン
(McKhann)他、１９８６、Neurology、３４：９３９−９
４４）。ＡＤ患者の認識損失は、脳皮質、海馬、基底前
脳および他の脳部分に配置されている神経単位の変性の
結果である（例えばケンパー(Kemper)、Clin. Neurol.
Aging、Ｍ.Ｌ.アルバート(Albert)編集、９−５２頁、
オックスフォード大学出版、ニューヨーク、１９８４；
プライス(Price)、１９８６、Annu. Rev. Neurosci.、
９：４８９−５１２）。剖検で得られたＡＤ脳の組織学
的分析は、変性神経単位の核周囲部および軸索、細胞外
神経炎性（老人性）プラーク、影響を受けた脳部のある
種の血管の内部および周辺のアミロイドプラーク中での
神経原線維の線維濃縮体の存在を示している（アルツハ
イマー(Alzheimer)、１９０７、Allg. Z. Psychiat. u.
Psych. Gerichtl Med.、６４：１４６−１４８）。神
経原線維は、螺旋方式で対になっている異常な繊維含有
フィラメント状構造（直径が約１０ｎｍ）であるため、
対になった螺旋フィラメントとも称されている（キッド
(Kidd)、Nature、１９７：１９２−１９３、ウィスニー
フスキー(Wisniewski)他、１９７６、J. Neurol. Sc
i.、２７：１７３−１８１、セルコー(Selkoe)、１９８
２、Science、２１５：１２４３−１２４５、ブリオン
(Brion)他、１９８５、J. Submicrosc. Cytol.、１７：
８９−９６、グルンドケ−イクバル(Grundke-Iqbal)
他、１９８６、J. Biol. Chem.、２６１：６０８４−６
０８９、ウッド(Wood)他、１９８６、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA、８３：４０４０−４０４３、コシク(Kosi
k)、１９８６、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８３：４
０４４−４０４８、ゲデルト(Goedert)、１９８８、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA、８５：４０５１−４０５
５、ウィシク(Wischik)、１９８８ａ、 Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA、８５：４８８４−４８８８、ウィシク(W
ischik)、１９８８ｂ、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、
８５：４５０６−４５１０）。神経炎性プラークは変性
神経末端に位置しており（軸索状および樹枝状）、そし
てアミロイド蛋白質繊維からなる芯を含有している（マ
スタース(Masters)他、１９８５ａ、EMPO J.、４：２７
５７−２７６３、マスタース他、１９８５ｂ、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA、８２：４２４５−４２４９）。脳
血管アミロイド蛋白質物質は、髄膜および脳皮質中の血
管内で見いだされている（グレナー(Glenner)およびオ
ン(Wong)、１９８４ａ、Biochem. Biophys. Res. Commu
n.、１２０：８８５−８９０；グレナー(Glenner)およ
びオン(Wong)、１９８４ｂ、Biochem. Biophys. Res. C
ommun.、１２２：１１３１−１１３５、オン(Wong)他、
１９８５、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８２：８７
２９−８７３２）。
【０００３】過去数年間に、ＡＤに関連する主要な病理
学的標識が同定されている。３種類のアルツハイマー脳
の病変部の生化学的分析（再調査に関しては、ケンパ
ー、上記引用文献；ウルツマン(Wurtman)、１９８５、S
ci. Amer.、２５２：６２−７４；カッツマン(Katzma
n)、１９８６、N. Engl. J. Med.、３１４：９６４−９
７３；プライス、１９８６、上記引用文献；セルコー(S
elkoe)、１９８９、Ann.Rev. Neurosci.、１２：４６３
−４９０；ミュラー−ヒル(Muller-Hill)およびベイロ
イサー(Beyreuther)、１９８９、Ann. Rev. Biochem.、
５８：２８７−３０７を参照のこと）、すなわち線維濃
縮体、神経炎性プラーク、および脳血管プラークの生化
学的分析、が蛋白質配列情報を示しており、そして対応
する遺伝子の一部のその後のｃＤＮＡクローニングおよ
び染色体地図作成を容易にしている。免疫学的研究によ
り、微小管−関連性蛋白質２（ＭＡＰ−２）、タウ、ウ
ビキチンおよびアミロイド蛋白質（Ａ４）などの対にな
っている螺旋状フィラメント（ＰＨＦ）の蛋白質成分類
に関するいくつかの候補が同定された。変性神経細胞は
例えばＡ６８の如き特異的抗原であるａ６８ｋＤａ蛋白
質を表示する。この異常抗原はモノクローン性抗体ＡＬ
Ｚ−５０を用いて検出できる（ウォロジン(Wolozin)
他、１９８６、Science、２３２：６４８−６５０；ウ
ォロジン他、１９８７、 Ann. Neurol.、２２：５２１
−５２６；ウォロジン他、１９８８、Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA、８５：６２０２−６２０６）。
【０００４】ＡＤ病理学の中心的特徴はプラーク内のア
ミロイド蛋白質の沈着である。Ａ４とも称されている４
ｋＤａアミロイド蛋白質（ＡＰＣ、β−］およびまたは
ＢＡＰ）は、染色体２１上に局在された遺伝子によりコ
ード付けされている切断形の比較的大きいアミロイド先
駆体蛋白質（ＡＰＰ）である（ゴールドガーバー(Goldg
aber)他、１９８７、Science、２３５：８７７−８８
０；カング(Kang)他、１９８７、３２５：７３３−７３
６；ジェンキンス(Jenkins)他、１９８８、Biochem. Bi
ophys. Res. Commun.、１５１：１−８；タンジ(Tanzi)
他、１９８７、Science、２３５：８８０−８８５）。
制限フラグメント長多形性を検出するＤＮＡ探針を使用
する遺伝子結合分析（ＲＦＬＰ，ボツステイン(Botstei
n)他、１９８０、Am. J. Hum. Genet.、３２：３１４−
３３１）は、高頻度のＡＤを有する家族の人間染色体２
１上での候補遺伝子（ＦＡＤ、家族性ＡＤ）の局在化を
生じた（セント・ジョージ−ヒスロップ(St. George-Hy
slop)他、１９８７ａ、Science、２３５：８８５−８９
０）。しかしながら、ＦＡＤ座は正確に局在化されてお
らず、そしてそれの機能に関してはほとんど知られてい
ない。染色体２１の一部または全部のトリソミー(triso
my)により引き起こされるダウン症候群（ＤＳ）患者の
初期の研究は、これらの患者が人生の２０代を越えると
アルツハイマー様病変を起こすことを示した。しかしな
がら、多数のアルツハイマー系統の分析からＡＰＰ遺伝
子は家族性ＡＤでは雑種分離しないことが示された（ヴ
ァン・ブレークホーヴェン(Van Broeckhoven)他、１９
８７、Nature、３２８：１５３−１５５；タンジ他、１
９８７、Nature、３２９：１５６−１５７）。さらに、
新しい家族を用いる最近の二研究では、家族性ＡＤに対
する染色体２１標識剤の結合が存在していないことが示
されている（シェレンベルグ(Schellenberg)他、１９８
８、Science、２４１：１５０７−１５１０；ローゼス
(Roses)他、１９８８、Neurology、３８：１７３）。
【０００５】年令、遺伝子因子、および多分環境因子が
ＡＤの細胞病理学に寄与するようである。ＡＤの病理学
における基本的であるが未解決の問題は、神経単位の異
常とアミロイドの沈着との間の関係である。特に、血液
−脳遮蔽体（脳血管アミロイド）のある区域と隣接して
おりそして特定の脳部中の神経末端（神経炎性プラー
ク）近くにあるアミロイド並びにプラーク芯中の細胞外
アミロイドの沈着をもたらす病理学的事象の細胞起源は
知られていない。グレナーおよびオンは、ＡＤ（グレナ
ーおよびオン、１９８４ａ、上記引用文献）またはＤＳ
（グレナーおよびオン、１９８４ｂ、上記引用文献）の
両方の患者の脳からの小遺伝子性アミロイドの精製およ
び同定法を記載しており、そしてＮ−末端ペプチド配列
を測定した。分析された２４個の残基の中で、２個のア
ミロイドペプチドが唯一の差異、すなわち分析された２
４個の残基の中でアミノ酸位置１１だけにおける差異
（ＡＤアミロイド中のグルタミン対ＤＳアミロイド中の
グルタミン酸）、を示した。アルツハイマー脳のプラー
ク芯のその後の研究により、報告されているＤＳ脳血管
アミロイドデータと同一であるアミノ酸配列が示された
（マスターズ(Masters)他、１９８５ｂ、Proc. Natl. A
cad. Sci. USA、８２：４２４５−４２４９）。正常組
織およびアルツハイマー脳物質の両者からのＡＰＰ転写
体のコピー−ＤＮＡ分析によると、この位置におけるグ
ルタミン酸用のコドンの存在が示された（カン他、１９
８７、上記引用文献；ゴールドガバー他、１９８７、上
記引用文献；ロバキス(Robakis)他、１９８７、Lancet:
３８４−３８５；タンジ他、１９８７、Science、２３
５：８８０−８８４、ザイン(Zain)他、１９８８、Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA、８５：９２９−９３３；ビ
テック(Vitek)他、Mol. Brain Res.、４：１２１−１３
１）。
【０００６】アルツハイマー脳中のアミロイド蛋白質か
らの蛋白質配列情報の利用により、推定メッセンジャー
ＲＮＡ転写体と相補性のある合成オリゴヌクレオチド類
の設計が可能となった。４つのグループが独立して、ア
ミロイド蛋白質配列部を含むｃＤＮＡの連続的クローニ
ングを報告した（ゴールドガバー他、１９８７、上記引
用文献；カン他、１９８７、上記引用文献；ロバキス
他、上記引用文献；タンジ他、１９８７、上記引用文
献）。１つのグループ（カン他）は人間胎児脳ｃＤＮＡ
ライブラリーからのＡＰＰ用の明白な全長転写体（約
３.４ｋｂ）をクローニングした。６９５−残基アミロ
イド先駆体蛋白質（ＡＰＰ−６９５）は、グリコシル化
された細胞−表面膜交換蛋白質の典型的特徴を示した。
先駆体の推定膜交換部および２８Ｎ−末端残基中のＡ４
％残基のＣ−末端１２−１４スクリーニングが「細胞外
領域」に存在している（ディルクス(Dyrks)他、１９８
８、EMBOJ.、７：９４９−９５７）。ゲノム地図作成は
人間／げっし動物の体細胞ハイブリッドを使用して人間
染色体２１上にＡＰＰ遺伝子を局在させた（ゴールドガ
バー他、１９８７、上記引用文献；カン他、１９８７、
上記引用文献；タンジ他、１９８７、上記引用文献）。
その場でのハイブリッド技術を適用して、この遺伝子を
染色体２１ｑ２１に亜局在させ（ロバキス他、上記引用
文献）、そして最近では２１ｑ２１−２２の境界に亜局
在させた（ブランクエット(Blanquet)他、１９８７、An
n. Genet.、３０：６８−６９；パターソン他、１９８
８、１９８８、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８５：８
２６６−８２７０）。
【０００７】染色体２１はそれがＤＳ（トリソミー２
１）中に含まれているために大きな研究主題となってき
ている。ＤＳ患者の９５％が染色体２１全体に関してト
リソミー性であり、２−３％がモザイク状でありすなわ
ちいくつかの細胞中でのみトリソミー性であり、そして
３−４％が染色体２１の長い腕（２１ｑ２２）の末梢部
分の三重化（位置交換）により引き起こされている（ク
ローム(Crome)およびスターン(Stern)、１９７２、Path
ology of Mental Retardation、チャーチル・リヴィン
グストーン、エディンブルグ）。そのような位置交換の
発生が、ＤＳが染色体２１の末梢部分（「病理学的病
変」）のトリソミーに寄与できるという結論をもたらし
た（サミット(Summitt)、１９８１、Trisomy 21 (Down
Syndrome): Research Prospectives中、デ・ラ・クルー
ズ(de la Cruz)およびゲラルド(Gerald)編集、２２５−
２３５頁、ユニバーシティ・パーク・プレス、バルチモ
ア）。現在までには、染色体２１のｑ腕上の破壊点がど
こに位置するかは正確には知られておらず、そして部分
的トリソミーを有するＤＳ患者がアルツハイマー病理学
に進むかどうかは知られていない。これに関すれば、Ａ
ＰＰ遺伝子が染色体２１の「病理学的部」内で地図を作
成するかどうかを決めることが特に有利であろう。染色
体２１の長い腕の上でのＡＰＰ遺伝子の局在化が、ＤＳ
患者におけるＡＤ病理学の明白な進行と一緒になって、
ＡＰＰ遺伝子およびＦＡＤ遺伝子座を含む染色体２１上
の多数の遺伝子の過剰表示を基にしてアミロイド生成用
の有効な機構を供している。散在性（非−家族性）ＡＤ
症例および「核型的に正常な」ＤＳ患者からのゲノム性
ＤＮＡの初期の研究は、ＡＰＰ遺伝子を含む染色体２１
部分の微細重複性の存在を示していた（デラバール(Del
abar)他、１９８７、Science、２３５：１３９０−１３
９２；シュヴェーバー(Schweber)他、１９８７、Neurol
ogy、３７：２２２）。しかしながら、その後の数ケ所
の研究所による多数のＡＤ患者分析はこれらの発見を確
認していない（タンジ他、１９８７ｃ、Science、２３
８：６６４−６６６；ポドリンスニー(Podlinsny)他、
１９８７、Science、２３８：６６９−６７１；ワレン
(Warren)他、１９８７、Genomics、１：３０７−３１
２）。
【０００８】人間／げっし動物の細胞ハイブリッド中の
人間ＡＰＰ探針を用いる染色体地図作成実験は、ハツカ
ネズミおよびハムスターのゲノム性ＤＮＡを有する交差
−ハイブリッド化を示した（カン他、１９８７、上記引
用文献；タンジ他、１９８７ａ、上記引用文献；ゴール
ドガーバー他、１９８７、上記引用文献）。種々のＤＮ
Ａのサザーン−ブロット分析は、ＡＰＰ遺伝子が進化中
に高度に保存されていることを示した。ハツカネズミの
ＡＰＰ配列（ヤマダ(Yamada)他、１９８７、Biochem. B
iophys. Res. Commun.、１５８：９０６−９１２）を鼠
からの配列（シヴァーズ(Shivers)他、１９８８、EMBO
J.、７：１３６５−１３７０）と比較すると、蛋白質水
準で９９％の相同性が示され、さらに、人間配列はハツ
カネズミハツカネズミ配列と９６.８％の相同性があり
そして鼠配列と９７.３％相同性がある。ＡＰＰ蛋白質
の著しい保存性を基にして、ヤマダ他（上記引用文献）
はアミノ酸水準における変化発生割合が０.１×１０-9
／部位／年であることを計算し、それはチトクロームＣ
のものに匹敵しており、そしてＡＰＰ蛋白質に関する本
質的生物学的機能を示唆している。最近では、Ｋ.ホワ
イト(White)および彼の同僚がＡＰＰ配列の大きい部分
と高度に相同性であるドロソフィラ(Drosophila)遺伝子
（ｖｎｄ座）をクローニングした。ノザーン−ブロット
実験によりｍＲＮＡ水準におけるこれらのデータが確認
され、そして種々の哺乳動物種類に関してＡＰＰ転写体
の遍在的表示が多数の異なる組織中で示された（マニン
グ(Manning)他、１９８８、Brain Res.、４２７：２９
３−２９７）。
【０００９】カン他、上記引用文献は、探針としてＡＰ
ＰｃＤＮＡを使用する人間胎児脳のｍＲＮＡのノザーン
−ブロット分析により２個の顕著な帯（−３.２ｋｂお
よび−３.４ｋｂ）の存在を報告している。この発見
は、ｍＲＮＡの鑑別接合またはポリアデニル化部位の別
の利用法を示唆している。両方の後−転写事象は数グル
ープによる詳細な研究により操作可能であることが見い
だされた。最初に、カン他（上記引用文献）は報告され
ているＡＰＰ全長ｃＤＮＡの３′−端部の２５９ｂｐ上
方で有効性ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡタン
デム繰り返し）を示した。人間胎児脳のｃＤＮＡライブ
ラリーから得られた他の８個の全長ＡＰＰｃＤＮＡクロ
ーンの分析により（ウンターベック(Unterbeck)、１９
８６、学位論文、ケルン大学、ドイツ）、第一ポリアデ
ニル化シグナルを使用する比較的短いｃＤＮＡ（−３.
２ｋｂ）対第二ポリアデニル化シグナルを使用する元の
ｃＤＮＡ形（−３.４ｋｂ）の間の１：１比が示され
た。興味深いことに、全部で８個のクローンがＡＰＰの
６９５残基をコード付けした。ＡＰＰ転写体中の異なる
ポリアデニル化シグナルの別の用途は他の研究所により
確認された（ゴールドガーアー、１９８８、The Molecu
lar Biology of Alzheimer's Disease、フィンチ(Finc
h)およびデービス(Davis)編集、６６−７０頁、コール
ド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、、コールド
・スプリング・ハーバー、ニューヨーク；ジョンソン(J
ohnson)他、１９８８、Exp. Neurol.、１０２：２６４
−２６８）。多くのグループが数種の腫瘍細胞系統誘導
ｃＤＮＡライブラリーをＡＰＰ転写体の存在に関してス
クリーニングし、そして別の領域を含有している新規な
ＡＰＰ分子をコード付けするクローンを同定した。この
領域はセリンプロテアーゼ抑制剤のクニッツ科と顕著な
相同性を有している(タンジ他、１９８８、Nature、３
５１：５２８−５３０；ポンテ(Ponte)他、１９８８、N
ature、３３１：５２５−５２７；キタグチ(Kitaguchi)
他、１９８８、Nature、３３１：５３０−５３２）。特
に、これらのｃＤＮＡ配列はＡＰＰ−６９５先駆体（図
１）の残基２８９のところに別の１６７ｂｐ挿入部を含
有しており、該先駆体は「トリプシン−様」セリンプロ
テアーゼの良く同定されている抑制剤であるアプロチニ
ン（カスコフスキー(Laskowski)およびカトウ(Kato)、
１９８０、Ann. Rev. Biochem.、４９：５９３−６２
６）と高い配列相同性である５６アミノ酸配列をコード
付けする。この挿入部の範囲と接するペプチド配列は元
のＡＰＰ−６９５クローンと同一であり、７５１残基の
解放読み取りフレームを生じる（ＡＰＰ−７５１）。キ
タグチ他（上記引用文献）は、ＡＰＰ−７５１の５６ア
ミノ酸「アプロチニン−様」領域のＣ−末端のところで
１９アミノ酸領域を別に加えて第三のＡＰＰ形を単離し
て、比較的大きい７７０残基の蛋白質（ＡＰＰ−７７
０）を生じた。ＣＯＳ−１細胞中のＡＰＰ−７７０の一
時的表示が、細胞溶解物中のトリプシン活性を顕著に抑
制した（キタグチ他、上記引用文献）。両方の追加領域
は分離しているエキソンによりコード付けされたことが
見いだされ（キタグチ他、上記引用文献）、そして染色
体２１上での単一遺伝子の特定接合により３種全ての転
写体（ＡＰＰ−６９５、ＡＰＰ−７５１、ＡＰＰ−７７
０）が発生した。最近これらのプロテアーゼ抑制剤領域
がハツカネズミ種中（ヤマダ(Yamada)他、１９８９、Bi
ochem. Biophys. Res. Commun.、１５８：９０６−９１
２）および鼠種中（カンおよびミュラー−ヒル、１９８
９、Nucleic Acids Res.、１７：２１３０）に存在して
いることも見いだされた。
【００１０】３種のアミロイド先駆体形とＡＤ中のアミ
ロイド生成との間の関係は知られていない。特に、特定
形のＡＰＰがＡ４沈着に寄与するかどうかは知られてい
ない。３種のＡＰＰ形の相対的表示水準における不均衡
またはそれらの過剰表示がＡＤ病理学に含まれているる
可能性もある。人間のＣＮＳ切片中でのＡＤｃＤＮＡ探
針を用いる最初のその場でのハイブリッド化分析は、多
くの神経単位細胞型がこれらのｍＲＮＡを表示すること
を示したが（バーマンヤール(Bahmanyar)他、１９８
７、Science、２３７：７７−７９；ゲーデルト(Goeder
t)、１９８７、EMBO J.、６：３６２７−３６３２、コ
ーヘン(Cohen)他、１９８８、Proc. Natl.Acad. Sci. U
SA、８５：１２２７−１２３１；ヒギンズ(Higgins)
他、１９８８、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８５：１
２９７−１３０１；ルイス(Lewis)他、１９８８、Proc.
Natl. Acad. Sci. USA、８５：１６９１−１６９５；
シュメヘル(Schmechel)他、１９８８、Alzheimer Dis.
Assoc. Disord.(US)、２：９６−１１１）、使用した探
針の性質のためにこれらの研究では種々のＡＰＰ転写体
の特定分析はできなかった。さらに、ＡＤ中のＡＰＰｍ
ＲＮＡ水準、アミロイド沈着および神経単位変性の間の
相互関連性はほとんど論じられていない。しかしなが
ら、老化した脳またはＡＤ脳の中では高水準のＡＰＰｍ
ＲＮＡだけでは細胞病理学に関する充分な予備条件を形
成していないようである（ヒギンズ他、上記引用文
献）。ＡＰＰ転写体間を識別する特異的探針がノザーン
分析用に使用されており、そしてその結果はこれらのｍ
ＲＮＡの成長および表示の組織に特異的な模様を示唆し
ている（タンジ他、１９８８、上記引用文献；キタグチ
他、１９８８、上記引用文献；ネヴェ(Neve)他、１９８
８、Neuron、１：６６９−６７７）。
【００１１】最近では、全長ＡＰＰｃＤＮＡクローン
（カン他、１９８７、上記引用文献）の５′−端部ｃＤ
ＮＡ探針を使用して、アルツハイマー病Ａ４アミロイド
蛋白質（ＰＡＤ）遺伝子の先駆体とも称されているＡＰ
Ｐ遺伝子の５′−端部を含有しているゲノム性クローン
が単離されている（サルバウム(Salbaum)他、１９８
８、EMBO J.、７：２８０７−２８１３；ラ・ファウチ
(La Fauci)他、１９８９、Biochem. Biophys. Res. Com
mun.、１５９：２９７−３０４）。最強のＲＮＡ出発部
位の約３.７ｋｂの上流配列がサルバウム他（上記引用
文献）により分析されている。手引き範囲およびＳ１保
護分析法の組み合わせにより、５個の推定転写開始部位
が１０ｂｐ部分内で測定されている。この−３.７ｋｂ
部は典型的なＴＡＴＡボックスを欠失しておりそして生
体内検定システム中でレポーターに促進剤活性を付与す
る部分（−１〜−４００）中で７２％のＧＣに富んでい
る含有量を示している（サルバウム他、１９８８、上記
引用文献）。典型的なＴＡＴＡおよびＣＡＡＴボックス
の不存在並びに複数のＲＮＡ開始部位の存在は管理遺伝
子としてのそれの機能を示唆しているが、構成的遺伝子
表示は意味していない（サルバウム他、１９８８、上記
引用文献）。最強のＲＮＡ開始部位の４００ｂｐ上流内
に含有されている調節部分、２個のＡＰ−１一致部位
（リー(Lee)他、１９８７、Nature、３２５：３６８−
３７２）、単一熱衝撃認識一致因子（ウー(Wu)他、１９
８７、Science、２３８：１２４７−１２５３）、およ
び配列−特異的結合がゲル−遅延研究（サルバウム他、
１９８８、上記引用文献）により起きることが示されて
いるような９ｂｐ−長さのＧＣに富んでいる一致配列の
数個のコピーを含む種々の典型的な促進剤−結合剤因子
を示している。さらに、この促進剤部分中のＣｐＧ：Ｇ
ｐＣ比は１：１であることが見いだされ、それとは対照
的に多くの真核性ＤＮＡ中では１：５の比が見いだされ
ており（ラジン(Razin)およびリッグス(Riggs)、１９８
０、Science、２１０：６０４−６１０）、ＣｐＧジヌ
クレオチド類はＤＮＡメチル化により遺伝子表示を調節
することが知られている（デルフラー(Doerfler)、Ann
u. Rev. Biochem.、５２：９３−１２４）。さらに、ヘ
アピン状構造を生成できる再発性配列がＲＮＡ開始部位
の周りで見いだされた（ラ・ファウチ他、１９８９、上
記引用文献）。
【００１２】最近では、数グループの研究者が多数の異
なるホメオボックス(homeobox)蛋白質に関して一致結合
配列（ＡＴに富んでいる１０量体）を測定しており（デ
スプラン(Desplan)他、１９８８、Cell、５４：１０８
１−１０９０；ヘイ(Hoey)およびレヴィン(Levine)、１
９８８、Nature、３２２：８５８−８６１；コー(Ko)
他、１９８８、Cell、５５：１３５−１４４；オデンワ
ルド(Odenwald)他、１９８９、Genes Dev.、１：４８２
−４９６）、それらの蛋白質はほとんど胚形成中に特定
部分中の転写因子として作用するようである（再調査に
関してはゲーリング(Gehring)、１９８７、Science、２
３６：１２４５−１２５２；ホランド(Holland)および
ホーガン(Hogan)、１９８８、Genes Dev.、２：７７３
−７８２を参照のこと）。これまでに、ホメオボックス
蛋白質により発育的に調節されるであろう目標遺伝子は
同定されていない。しかしながら、そのような遺伝子は
胚形成中および多分全寿命中にわたり重要な役割を有す
るであろう。ＡＰＰ遺伝子促進剤はＲＮＡ開始部位の上
流に少なくとも５個のホメオボックス結合部位を含有し
ている。予備実験により、ホメオボックス蛋白質Ｈｏｘ
−１.３（オデンワルド他、１９８７、Genes Dev.、
１：４８２−４９６；オデンワルド他、１９８９、Gene
s Dev.、３：１５８−１７２）がこれらの部位の２箇所
で結合できることが示されている。従って、表示が発育
的に調節されているＡＰＰ遺伝子がホメオボックス蛋白
質調節用の候補遺伝子であるようである。これらの推定
認識一致因子のいずれがＡＰＰ遺伝子促進剤の表示を調
節するのかはわからない。
【００１３】ＡＰＰ遺伝子に関して知られている全ての
ことにもかかわらず、ＡＤをもたらす主要欠失はこれま
でに知られておらず、そして人間でＡＤを引き起こすＡ
ＰＰ遺伝子または他の遺伝子中での特異的な変異生成は
規定されていない。老齢の霊長類は例外として（プライ
ス(Price)他、１９８９、BioEssays、１０：６９−７
４）、ＡＤ用の研究室動物モデルは存在していない。動
物の胚芽系統中への遺伝子の導入は、ＡＤ機構を含む疾
病機構のより良好な理解をもたらすであろう疾病モデル
の製造に関して非常に強力な技術であり（クスバートソ
ン(Cuthbertson)およびキリントワース(Klintworth)、
１９８８、Laboratory Investigation、５８：４８４−
５０１；イエニッシュ(Jaenisch)、１９８８、Scienc
e、２４０：１４６８−１４７４；ローゼンフェルド(Ro
senfeld)他、１９８８、Ann. Rev. Neurosci、１１：３
５３−３７２）、そして試験管内システムは動物システ
ム中に固有の複雑な生理的相互作用を複写することはで
きない。遺伝子交換性動物はハツカネズミ、羊、および
豚などの多数の種類で成功裡に製造された。当該遺伝子
または遺伝子類を１個の細胞胚の前核中に直接顕微鏡注
入した。高割合の再移植された胚は正常に成長し、そし
て相当な割合の子孫で遺伝子交換染色体ＤＮＡ中に組み
込まれる。普通、交換遺伝子の複数のコピーは頭から尾
への矢印として一体化される。モザイク動物を製造する
ことができるが、交換遺伝子のゲルム系統転換が普通生
じる（ホーガン(Hogan)他、１９８６、Manipulating th
e MouseEmbryo; A Laboratory Manual中、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー、コールド・スプリ
ング・ハーバー、ニューヨーク；デパンフィリス(DePam
philis)他、１９８８、BioTechniques、６：６６２−６
８０）。遺伝子交換性ハツカネズミの製造は、ＡＤの病
理学においてＡＰＰの役割を規定する際に有用となろ
う。例えば、蛋白質−コード付け用配列中またはそれら
の表示水準中で変更されるＡＰＰ交換遺伝子を有するハ
ツカネズミは、ＡＤ病理学において示されるものと似て
いる優性変異体表現型を示すであろう。遺伝子交換性ハ
ツカネズミ中での表示用の組み換え型遺伝子および小遺
伝子の構成が、遺伝子交換性ハツカネズミモデルの開発
における重要な段階である。特に重要なことは、小遺伝
子用の適当な遺伝子促進剤並びに小遺伝子の細胞および
組織特異的表示用の他の調節剤因子の選択である。アミ
ロイドプラークの生成および多分内因性ハツカネズミＡ
ＰＰ遺伝子の表示模様と一致するであろう細胞および組
織特異性を有する組み換え型遺伝子の表示を促進させる
小遺伝子促進剤を使用すべできである。
【００１４】現在までに、多くの遺伝子に関する必須調
節剤因子の同定はあまりされておらず、そしてよくても
予測できるものではない。多数の重要な因子がこの問題
の複雑性に寄与している。最初に、ＤＮＡトランスフェ
クション実験における細胞の特異的調節が遺伝子交換性
動物中で必ずしも細胞および組織特異性を付与するもの
ではない。例えば、トランスフェクション実験により重
要な細胞の特異的調節剤因子が鼠のアルブミン遺伝子の
キャップ部位の４００ｂｐ上流内に存在していることが
示された（オット(Ott)他、１９８４、EMBO J.、３：２
５０５−２５１０；フリードマン(Friedman)他、１９８
６、Mol. Cell. Biol.、６：３７９１−３７９７）。し
かしながら、アルブミン促進剤から１０ｋｂ上流に位置
する別の促進剤が遺伝子交換性ハツカネズミ中での肝臓
−特異的表示を得るために必要であることも見いだされ
た（ピンカート(Pinkert)他、１９８７、Genes Dev.、
１：２６８−２７６）。α−フェト蛋白質遺伝子の促進
剤配列は細胞媒体中で細胞特異性を付与するが（ゴッド
ボウト(Godbout)他、１９８６、Mol. Cell Biol.、６：
４７７−４８７；ムグリア(Muglia)およびロスマン−デ
ネス(Rothman-Denes)、１９８６、Proc. Natl. Acad. S
ci. USA、８３：７６５３−７６５７；ウィデン(Widen)
およびパパコンスタンチノウ(Papaconstantinou)、１９
８６、Proc.Natl. Acad. Sci. USA、８３：８１９６−
８２００）、−１ｋｂおよび−７ｋｂの間に置かれた他
の促進剤因子は遺伝子交換性動物中での肝臓特異的表示
用に必要であることも見いだされた（ハマー(Hammer)
他、１９８７、Science、２３５：５３−５８）。第二
に、種々の遺伝子の構成は相当異なっており、そして必
須調節剤因子は多数の位置で見いだされている。ある場
合には、必須調節剤因子はキャップ部位近くの密な部分
内に置かれている。例えば、鼠のエラスターゼＩ遺伝子
のヌクレオチド−２０５からヌクレオチド＋８内に存在
している配列は遺伝子交換性ハツカネズミ中で適当な表
示模様を付与するのに充分なものである（マクドナルド
(MacDonald)他、１９８７、Progress in Brain Researc
h、７１：３−１２）。人間のγ−クリスタリン遺伝子
中ではきっちり規定されている調節剤領域も同定されて
いる（コーニング(Corning)他、１９８７、Science、２
３５：４５６−４５８）。しかしながら、人間のβ−グ
ロビン遺伝子は少なくとも４個の別の調節剤因子、すな
わち陽性のグロビン特異的促進剤因子、陰性の調節剤因
子、並びに２種の遺伝子促進剤である第二イントロン中
に置かれたものおよび構造的遺伝子の３′に置かれた他
のもの、を有している（ベーリンゲル(Behringer)他、
１９８７、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、８４、７０５
６−７０６０；グロスベルド(Grosveld)他、１９８７、
Cell、５１：９７５−９８５）。第三に、多くの場合
に、一体化部位が交換遺伝子表示の水準および模様に強
い影響を与えている。これらの位置効果を少なくとも部
分的に克服する数種の遺伝子領域は同定されている。β
−グロビン遺伝子の約５０ｋｂ５′から２０ｋｂ３′に
位置するＤＮａｓｅＩ過感作部位が遺伝子交換性ハツカ
ネズミ中のβ−グロビン小遺伝子の位置に依存しないで
高水準の表示を促進させている（グロスベルド他、１９
８７、上記引用文献）。さらに、鼠成長ホルモンおよび
ハツカネズミメタロチオネイン遺伝子のイントロンは交
換遺伝子の転写効率を平均して１０−１００倍に増加さ
せる（ブリンスター(Brinster)他、１９８８、Proc. Na
tl. Acad. Sci.USA、８５：８３６−８４０）。鼠成長
ホルモンイントロン配列は不均質遺伝子構造上でさえメ
タロチオネインまたはエラスターゼ促進剤を利用すると
正の影響を与える。これらのイントロン効果はＲＮＡ処
理の効率増加とは関連していないが、転写速度の実際的
な増加によるものである（ブリンスター、１９８８、上
記引用文献）。イントロンおよび他のゲノム性部分が特
定の成長段階で認識される配列因子を含有することまた
はクロマチン構造に影響を与える因子を含有することも
可能である。多くの場合、表現型を発生させるのに充分
な表示水準を保つには、位置影響を減少させるゲノム因
子の含有が交換遺伝子にとって必須であろう。これらの
因子の同定はある場合には手に負えない作業であり、例
えばＡＰＰ遺伝子座は少なくとも５０ｋｂを包括してい
る（レマイアー(Lemaire)他、１９８９、Nucleic Acids
Res.、１７：５１７−５２２）。そのような因子の同
定は組み換え型ＡＰＰ小遺伝子の構成において非常に有
用である。これらの小遺伝子を次に遺伝子交換性ハツカ
ネズミの胚芽系統中に加えて、ＡＤ用の動物モデルを供
することができる。
【００１５】
【発明の要旨】本発明は、ＡＰＰ−６９５、ＡＰＰ−７
５１、ＡＰＰ−７７０を含む変形ＡＰＰ、並びに種々の
変異形ＡＰＰの表示用の組み換え型小遺伝子を提供する
ものである。本発明は、そのような機能的ＡＰＰ小遺伝
子構造をハツカネズミ中に加えてそれによりＡＤ病理学
の分子機構の同定において有用なＡＤの遺伝子交換性動
物モデルを製造する方法も提供するものである。本発明
に従う組み換え型小遺伝子は、本質的には５種の因子、
すなわち（１）遺伝子促進剤（遺伝子調節に寄与するＤ
ＮＡ因子）、（２）および（３）ＡＰＰ蛋白質コード付
け領域（ｃＤＮＡまたは変異されたｃＤＮＡ）、（４）
ｍＲＮＡポリアデニル化シグナル、（５）ＡＰＰ−コー
ド付け用ＤＮＡの発育上適しておりおよび／または細胞
／組織−特異的表示に必要なＲＮＡ接合シグナルおよび
ゲノム性因子、を含有している。そのようなゲノム性因
子の同定は大変予測できないものである。これらの配列
因子の単離は遺伝子毎に異なっており、そしてそれらは
５′領域中、イントロン内、３′領域中、または他の位
置中で見いだされる。
【００１６】ＲＮＡ開始部位中のＡＰＰに対する−２.
８ｋｂ５′、ＡＰＰ遺伝子の第一エキソンおよび第一イ
ントロンの−１.６ｋｂからなる−４.６ｋｂＥｃｏＲＩ
人間ゲノム性フラグメント（またはそれの部分）は、遺
伝子交換性ハツカネズミ中のレポーター遺伝子の細胞お
よび組織−特異的表示を内因性ハツカネズミＡＰＰ遺伝
子の表示模様と両立する方法で指定するのに充分なもの
である。このゲノム性フラグメントは促進剤および多分
他の調節剤因子を含有しており、それらはアミロイドプ
ラークの生成およびＡＰＰ遺伝子の表示模様と一致する
細胞および組織特異性を有する組み換え型ＡＰＰ小遺伝
子の表示を促進させる。ＡＤをもたらす主要欠失は決め
られておらずしかも人間中でＡＤを引き起こす特異的変
異生成も同定されていないため、本発明に従う組み換え
型ＡＰＰ小遺伝子を有する遺伝子交換性ハツカネズミは
疾病に関する動物モデルを提供するものである。例え
ば、Ａ４類澱粉症用の遺伝子交換性動物モデルの製造は
ＡＤの発病学におけるＡ４の役割を規定するために必須
である。蛋白質−コード付け配列または表示水準におい
て変更されたＡＰＰ遺伝子を有する本発明に従う遺伝子
交換性ハツカネズミは、ＡＤ病変のある種の面を疑似す
る優性変異体表現型を示すものである。アルツハイマー
病変は脳の特定領域に限定されるため、例えば本発明に
より提供されるものの如き適当な細胞および組織−特異
的ゲノム性調節剤因子を有する小遺伝子構造だけがＡＤ
の遺伝子交換性ハツカネズミモデルを開発することがで
きる。
【００１７】
【好適態様の記載】ＡＤ（アルツハイマー、１９０７、
上記引用文献）は人間の脳の広範囲の機能障害により特
徴づけられている。原線維状アミロイド蛋白質は、神経
単位内部に神経原線維濃縮体として（カッツマン、１９
８３、上記引用文献）そして細胞外ではアミロイドプラ
ークおよび芯の両者として（カッツマン、１９８３、上
記引用文献）並びに脳血管アミロイドとして（カッツマ
ン、１９８３、上記引用文献）沈着する。プラークのア
ミロイド原線維、血管沈着物、および見込みとして原線
維濃縮体のの主要蛋白質サブユニット（Ａ４）は、相対
的分子量が４,５００の不溶性の高度凝集性の４０−４
２残基ペプチドである（マスターズ他、１９８５、上記
引用文献、並びにグレナーおよびオン、１９８４、上記
引用文献）。比較的大きいアミロイド先駆体蛋白質から
誘導されたＡ４ペプチドは、染色体２１上で遺伝子によ
りコード付けされる（カン他、１９８７、上記引用文
献；ゴールドガーバー他、１９８７、上記引用文献；タ
ンジ他、１９８７、上記引用文献）。ＡＰＰｍＲＮＡは
脳の内外の両方の神経単位中および他の組織中で検出さ
れる（ゲーデルト、１９８７、上記引用文献；コーヘン
他、１９８８、上記引用文献；ヒギンスおよび、１９８
８、上記引用文献）。
【００１８】年令、遺伝子的因子、および有力には環境
的因子がＡＤ中の細胞病理学に寄与するようであるが、
これらを脳の病変に導く機構はまだ理解されていない。
ＡＤの発病学における基本的問題は、観察された神経単
位の異常とアミロイドの沈着との間の関係である。
【００１９】ＡＤをもたらす主要欠失はまだ知られてお
らずそして人間でＡＤを引き起こす特異的変異生成も規
定されていないため、ＡＤ研究に関する動物モデルは特
に有用であろう。老齢の霊長類を除いて、ＡＤ用の研究
室動物モデルは存在していない。これらの制限のため
に、ＡＤ用の遺伝子交換性ハツカネズミモデルの製造が
ＡＤの病因学におけるＡＰＰの役割を規定する際の最良
の方式となろう。蛋白質−コード付け用配列中または表
示水準中で変更されたＡＰＰ遺伝子を有する遺伝子交換
性ハツカネズミは、ＡＤ病理学により示されているもの
と似ている優性変異体表現型をもたらすであろう。ここ
に記載されている機能性小遺伝子構造のハツカネズミの
胚芽系統中への導入を使用してＡＤのモデルを製造しそ
して病理学の分子機構を同定した。
【００２０】ＡＤ用の遺伝子交換性ハツカネズミモデル
開発用の重要な段階は、予期できない組織−特異的方式
における異種遺伝子の高水準表示を可能にする小遺伝子
の設計であった。本発明に従う組み換え型小遺伝子は本
質的に５種の因子、すなわち遺伝子促進剤（遺伝子調節
に責任のあるＤＮＡ）、蛋白質コード付け用領域（ｃＤ
ＮＡ）、ｍＲＮＡポリアデニル化シグナル、ＲＮＡ シ
グナル、および開発プログラム中に関与するＤＮＡの正
確な成長表示用に必要なゲノム性因子、を含有している
（これらの配列因子の位置は遺伝子毎に変えることがで
き、そしてイントロン、３′領域、および他の位置中で
見いだされる）。
【００２１】下記の章および実施例は、ＡＤ用動物モデ
ルの製造用の小遺伝子の設計および製造を行う必須段階
を記載している。遺伝子交換性ハツカネズミ中で内因性
ハツカネズミＡＰＰ遺伝子の表示模様に匹敵する異種遺
伝子の表示模様を付与する遺伝子促進剤を単離しそして
同定した。ＡＰＰ遺伝子促進剤および変異体形も含む種
々の異なるＡＰＰ遺伝子生成物からなる一連の小遺伝子
を製造した。これらの小遺伝子を表示する遺伝子交換性
動物は、種々のＡＰＰ遺伝子生成物の生体内機能、ＡＰ
Ｐ遺伝子の調節および表示模様、並びにこれらのアミロ
イドの生成方法との関連性の研究において有用である。
小遺伝子中の種々のＲＮＡ接合用シグナルおよびポリア
デニル化シグナルの使用により、後−転写処理および遺
伝子交換性動物中での人間ＡＰＰ転写体の安定性が得ら
れる。
【００２２】適当な組み換え型小遺伝子を製造しそして
試験した。小遺伝子をハツカネズミの１個の細胞胚の雄
の前核中に直接顕微鏡注入した。増殖された胚を次に疑
似妊娠雌の卵管に移した。ゲノム中で転換された小遺伝
子（交換遺伝子）の存在に関して、ポリメラーゼ鎖反応
（ＰＣＲ）分析およびテイルバイオプシイから誘導され
たＤＮＡのサザーン−ブロット分析によりスクリーニン
グした。
【００２３】アルツハイマー病理学は脳の特定部分に限
定されるため（プライス、１９８６、上記引用文献）、
小遺伝子構造用の適当な遺伝子促進剤の選択は遺伝子交
換性ハツカネズミモデルの開発にとって重要であった。
アミロイドプラークの生成およびＡＰＰ遺伝子の表示模
様と一致する細胞および組織特異性を有する組み換え型
遺伝子の表示を促進させる遺伝子促進剤および多分他の
調節剤配列を含む調節剤因子を利用しなければならな
い。本発明はそのような因子を提供するものである。
【００２４】人間ＡＰＰ遺伝子（図３）の５′−端部を
包括しているここに記載されている−４.５ｋｂゲノム
性フラグメントは、遺伝子交換性ハツカネズミ中のレポ
ーター遺伝子である大腸菌(E. coli)ｌａｃＺの蛋白質
生成物の細胞および組織−特異的表示を指定するのに充
分な配列情報を有していた（図２０−２５）。中枢神経
系統（ＣＮＳ）中のレポーター遺伝子生成物であるβ−
ガラクトシダーゼの表示模様は内因性ハツカネズミＡＰ
Ｐ遺伝子の表示模様と顕著に一致しており、そしてＡＤ
患者の老人性プラーク沈着特性の様子と一致している。
探針として人間ＡＰＰｃＤＮＡを用いるその場でのハイ
ブリッド化は、海馬、歯状回、脳皮質、小脳皮質、脳
橋、および脊髄を含む特定の脳部分中でＡＰＰｍＲＮＡ
を示した。遺伝子交換性の脳組織中のβ−ガラクトシダ
ーゼ染色は神経単位核周囲部を含有している区域に制限
された。ほとんどの場合、ＢＥ８０３のＣＮＳ中のβ−
ガラクトシダーゼ染色はハツカネズミＡＰＰｍＲＮＡの
その場でのハイブリッド化模様と一致していた。一例外
は、β−ガラクトシダーゼ染色がハツカネズミＡＰＰｍ
ＲＮＡの観察された水準から予測されるほど強くない海
馬のＣＡ３部分であった。この差異はこの部分中のレポ
ーター遺伝子の表示水準の低下またはβ−ガラクトシダ
ーゼ融合蛋白質の安定性の変化によるものであろう。β
−ガラクトシダーゼ融合蛋白質の大部分は神経単位核周
囲部内の第二リソソーム中に局在しており、従って大腸
菌β−ガラクトシダーゼ融合蛋白質は神経単位中では比
較的不安定であろう。
【００２５】種々の形のＡＰＰおよびＡＰＰの変異体を
コード付けする種々のｃＤＮＡが製造された。ＡＰＰ−
６９５、ＡＰＰ−７７０およびＡＰＰ−７５１と称され
ている３種類のＡＰＰが存在しており、それら全てが人
間染色体２１上での単一共通遺伝子によりコード付けさ
れている。ＡＰＰ遺伝子のｍＲＮＡは特定接合されて長
さが３種類の６９５アミノ酸類（ａａ）、７５１ａａ、
および７７０ａａの遺伝子生成物を生成する。７５１ａ
ａおよび７７０ａａ形はクニッツ型セリンプロテアーゼ
抑制剤との顕著な相同性を有する別の領域を含んでいる
（キタグチ(Kitaguchi)他、１９８８、Nature、３３
１：５３０−５３２；ポンテ(Ponte)他、１９８８、Nat
ure、３３１：５２５−５２７；タンジ(Tanzi)他、１９
８８、Nature、３３１：５２８−５３０）。遺伝子交換
性ハツカネズミ中の１種以上の形の人間ＡＰＰ遺伝子生
成物の表示によりモデルが得られ、それを用いて１種以
上の遺伝子の過剰表示または異例の表示がアルツハイマ
ー病変を引き起こすという説を試験した。この説は、ア
ルツハイマー病理学（すなわち脳組織中のＡ４プラー
ク）が年令が３０−４０歳を越えたＤＳ患者で見られる
という観察と一致している（グレナーおよびオン、１９
８４、Biochem. Biophys. Res. Commun.、１２２：１１
３１−１１３５）。そのような患者はＡＰＰ遺伝子を含
有している染色体２１用にはトリソミー性であり、そし
てこれらの患者中のＡＰＰｍＲＮＡの水準は高められた
ようである（タンジ他、１９８８、Science、２３５：
８８０−８８５）。
【００２６】３種類のＡＰＰ形に相当する人間のＡＰＰ
ｃＤＮＡクローンを単離した。プラスミドｐＦＣ４は、
６９５ａａ形のＡＰＰ用の全長ｃＤＮＡを含有している
（カン他、上記引用文献）。探針としてｐＦＣ４を使用
して、人間の神経芽細胞腫のｃＤＮＡライブラリーを追
加形の人間ＡＰＰに相当する追加転写体の存在に関して
スクリーニングした。ＡＰＰ−７７０中で見られた追加
エキソン（１６７ｂｐおよび５８ｂｐ）を含有しており
そしてｍＲＮＡの部分的ｃＤＮＡを表示している−１.
８ｋｂｃＤＮＡを同定した。この１７７５ｂｐフラグメ
ントを元のｐＦＣ４全長クローンに亜クローニングする
ために独特の制限部位（ＡｃｃＩおよびＢｇｌII）を使
用して、７７０ａａ形のＡＰＰ用の全長ｃＤＮＡクロー
ン（ｐＦＣ４−７７０）を製造した。７５１残基ＡＰＰ
コード付け用ｃＤＮＡクローン（ｐＦＣ４−７５１）を
ｐＦＣ４−７７０の試験管内変異生成により設計した。
５８ｂｐの欠失（Ｍ１３−ルーピングアウト）がＤＮＡ
配列分析により確認された。
【００２７】種々のＡＰＰｃＤＮＡを使用して、各ＡＰ
Ｐ形を表示する小遺伝子を製造した：ＡＰＰ−６９５表
示用のｐＭＴＩ−２３１４、ＡＰＰ−７７０表示用のｐ
ＭＴＩ−７７０およびＡＰＰ−７５１表示用のｐＭＴＩ
−２３２０。ＡＰＰ−６９５小遺伝子の製造における最
初の段階として、ＡＰＰのＥｃｏＲＩ促進剤フラグメン
トをブラントエンド結紮によりｐＭＴＩ−２３０１のＨ
ｉｎｄIII部位に挿入して、ｐＭＴＩ−２３０７を製造
した。ＡＰＰ−６９５小遺伝子の製造は段階的方式で完
了した。ｐＦＣ４からのＢａｍＨＩフラグメントをｐＭ
ＴＩ−２３０７のＢａｍＨＩ部位に結紮することによ
り、ｐＭＴＩ−２３１１を製造した。次に、ｐＦＣ４か
らのＸｈｏＩフラグメントをｐＭＴＩ−２３１１のＸｈ
ｏＩ中に挿入して、ｐＭＴＩ−２３１２を製造した。最
後に、ＳＶ４０ＲＮＡ およびポリアデニル化シグナル
を含有しているｐＭＴＩ−２３０４のＳｐｈフラグメン
トをｐＭＴＩ−２３１２のＳｐｈ部位に挿入して、ｐＭ
ＴＩ−２３１４を生成した。ｐＦＣ４−７５１およびｐ
ＦＣ４−７７０からのＡｃｃＩ−ＢｇｌIIフラグメント
をｐＭＴＩ−２３１４のＡｃｃＩ／ＢｇｌII部位中で亜
クローニングしてそれぞれｐＭＴＩ−２３２０およびｐ
ＭＴＩ−２３１９を製造することにより、ＡＰＰ−７５
１およびＡＰＰ−７７０小遺伝子を製造した。
【００２８】ＡＰＰ−６９５、ＡＰＰ−７７０およびＡ
ＰＰ−７５１の表示用の第二小遺伝子系統は、切断され
たＡＰＰ促進剤を使用して製造することができる。小遺
伝子ｐＭＴＩ−２３１０（ＡＰＰ−６９５）用には、Ａ
ＰＰ遺伝子［図３］の５′−端部の−２.６ｋｂＨｉｎ
ｄIIIをｐＭＴＩ−２３０１のＨｉｎｄIII部位中に挿入
して、ｐＭＴＩ−２３０６を製造した（図７ａ）。６９
５形のＡＰＰを表示する小遺伝子であるｐＭＴＩ−２３
１９を、上記のｐＭＴＩ−２３１４と同じ方法で製造し
た（図７ａ）。対応する７５１および７７０小遺伝子は
上記の如くして−１.８ｋｂＡｃｃＩ−ＢｇｌII制限フ
ラグメントを用いて製造することができる。
【００２９】アミロイドプラーク中のＡ４ペプチドの集
積は、１種以上のＡＰＰ形の異例の蛋白質分解変性の結
果であるかもしれない（６９５、７５１、７７０）。Ａ
４ペプチドまたはＡ４の生体内製造中に蛋白質分解中間
生成物として存在できるＡＰＰの他のフラグメントを直
接表示できる小遺伝子を製造した。そのようなＡＰＰフ
ラグメントは、それらがＡ４部分を含有しているなら、
自己−凝集性でありそして細胞によりさらに処理されて
Ａ４を別個に製造することもできる。製造されそしてそ
のような変異体を表示する小遺伝子の型は図４ｂにまと
められている。遺伝子生成物IVは膜交換領域の一部およ
び全細胞質領域を欠いており、Ａ４領域は無傷のまま残
っていた。この変異体遺伝子生成物は細胞から分泌され
ると予測され、そして多分さらに変性されてＡ４ペプチ
ドを製造する。ＡＰＰの少なくとも一部が細胞表面から
細断されたことが示されているため、分泌された蛋白質
は他の生物学的効果も有している。遺伝子生成物Ｖ（Ｍ
Ｃ−１００と称されている）は膜中に翻訳され、従っ
て、Ｎ−末端にＡＰＰの１７−残基シグナルペプチドを
含有している先駆体蛋白質が製造された。シグナルペプ
チドが省略されるなら、Ｃ−１００蛋白質（遺伝子生成
物VI）は細胞質に翻訳されそして多分膜内に挿入された
場合とはかなり異なる性質を有するであろう。シグナル
ペプチドが省略されている遺伝子生成物VIIIは細胞内Ａ
４を直接製造するはずであり、そしてそれは膜内に挿入
されないであろう。ＡＰＰシグナルペプチドを含むＡ４
ペプチドを表示する別の構造物（遺伝子生成物VII）が
製造された。シグナルペプチド分裂点後に、遺伝子生成
物VIIはＡ４ペプチドを包括している４０個のアミノ酸
類並びにＡ４ペプチド部分の１２個の追加アミノ酸類を
含んでいる。この蛋白質は細胞膜を通して位置交換され
そして細胞による細胞質分裂後に凝集してＡ４を製造し
た。
【００３０】切断されたＡＰＰ生成物の表示用の変異体
ＡＰＰ小遺伝子を製造するために、遺伝子生成物IVおよ
びVII変異体であるＣ−末端フレームシフト変異体を製
造した。Ａ４コード付け部分直後のｃＤＮＡ配列のフレ
ームシフト変異生成（−１、＋２）により、翻訳停止コ
ドンがペプチドコード付け領域後の読み取りフレーム中
に運ばれた。生成した配列が切断されたＡＰＰ種類にコ
ード付けする（図４ｂ、遺伝子生成物IV）。ヌクレオチ
ド位置２０４５におけるフレームシフト変異生成（欠失
ヌクレオチドＣ）によりＡ４のＮ−末端からの４０個の
アミノ酸の後で停止コドンが製造され（アミノ酸類３
８、３９および４０は天然Ａ４配列とは異なる）、そし
てヌクレオチド位置２０５０の後の＋２変異生成（Ｔ
Ｇ）によりＡ４配列のＮ−末端からの４１個のアミノ酸
類の後で停止コドンが製造された（最後のアミノ酸は天
然Ａ４配列とは異なる）。＋２変異生成は構造ｐＭＴＩ
−２３２１中で利用された（図８ａ）。これらのフレー
ムシフト変異生成の発生はこれも譲渡された特許出願で
ある米国出願番号１９４,０５３に記載されている。第
三のフレームシフト変異生成である「変異体４０−１」
がヌクレオチド２０５５においてアデノシンヌクレオチ
ドを欠失させ、そして翻訳停止コドンを読み取りフレー
ム中にＡ４ペプチドコード付け部分（プラスミドｐＭＴ
Ｉ−２３２２、ｐＭＴＩ−２３２６、ｐＭＴＩ−２３４
１、ｐＭＴＩ２３４３、ｐＭＴＩ−２３６１中で使用さ
れている）の第４０コドンの直後に運んだ。独特のＢｇ
ｌIIおよびＣｌａＩ制限部位の間の配列領域を交換する
ことにより、フレームシフト変異生成がｐＭＴＩ−２３
１４（ＡＰＰ−６９５）、ｐＭＴＩ−２３１９（ＡＰＰ
−７７０）、またはｐＭＴＩ−２３２０（ＡＰＰ−７５
１）中に挿入された（図８ａ）。停止コドンをＡ４配列
の後に置く部位−指定変異生成により、欠失変異生成も
発生させた（ｐＭＴＩ−２６）。ｐＭＴＩ−２６中の変
異体を小遺伝子中に上記と同様な方法で挿入させた。
【００３１】遺伝子生成物VIII変異体の表示用の変異体
ＡＰＰ小遺伝子を製造するために、下記の段階を行っ
た。小遺伝子ｐＭＴＩ−２３１８（遺伝子生成物VIII；
図４ｂ）を段階的方式で製造した（図９）。４２ａａＡ
４ペプチド配列を含有しているｐＭＴＩ−２６からのＢ
ｇｌII−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＭＴＩ−２３０７
のＢａｍＨＩ部位中に挿入した。次に、ｐＦＣ４のＢａ
ｍＨＩ−ＢａｍＨＩフラグメントをｐＭＴＩ−２３１６
のＢａｍＨＩ部位中に挿入した。最後に、ＳＶ４０ＲＮ
Ａ処理シグナルを含有しているＳｐｈフラグメントをｐ
ＭＴＩ−２３１７のＳｐｈ中に挿入した。
【００３２】ハツカネズミおよび人間のＡＰＰ遺伝子生
成物間の実質的な配列相同性のために、組織切片の免疫
組織化学的分析を用いるＡＰＰの明白な同定を可能とす
る適当な抗体を製造することが難しい。この問題を迂回
するために、チラミジアの高度に抗原性のエピトープを
ＡＰＰ−６９５配列中にクニッツ抑制剤領域挿入部位お
よび蛋白質の極端なＣ−末端のところで挿入した。配列
をＡｃｃＩおよびＢｇｌII制限部位用いて小遺伝子中に
移して、ｐＭＴＩ−２３２５（図８ａ）またはｐＭＴＩ
−２３２４（図１０ａ）を製造した。
【００３３】他の一連の小遺伝子構成体中では、別のＲ
ＮＡ処理シグナルを使用した。人間のＡＰＰからまたは
外因性ハツカネズミの遺伝子から誘導されたＲＮＡ処理
シグナルを利用する小遺伝子は遺伝子交換性ハツカネズ
ミ中においてはＳＶ４０から誘導されたものより有効に
表示されるため、ハツカネズミメタロチオネイン遺伝子
のＲＮＡ切断およびポリアデニル化配列を利用する構成
体を製造した。下記の如くして別のＲＮＡ処理シグナル
を使用して、上記の遺伝子生成物および他の形の全てを
表示する小遺伝子を製造した。
【００３４】ＲＮＡ処理シグナルの原料としてメタロチ
オネイン遺伝子本体（図１０ａ）を用いて、３種類の形
のＡＰＰ（６９５、７７０、７５１）並びに上記の変異
体ＡＰＰ形を表示する小遺伝子を製造した。ＡＰＰ−６
９５の表示用の小遺伝子ｐＭＴＩ−２３２３を製造する
ためには、ハツカネズミメタロチオネイン−Ｉ遺伝子で
あるｐＪＹＭＭＴ（Ｌ）のＥｃｏＲＩゲノム性クローン
からの−２.２ｋｂＢｇｌII−ＥｃｏＲＩフラグメント
をブラントエンド結紮によりｐＭＴＩ−２３１２のＣｌ
ａＩ部位中に挿入して、ｐＭＴＩ−２３２３を製造し
た。ＳＶ４０ポリアデニル化配列（図８ａ）を利用して
小遺伝子（ＡＰＰ−７５１またはＡＰＰ−７７０を表示
する）からの配列領域（ＡｃｃＩ−ＢｇｌII）を交換し
てｐＭＴＩ−２３３１およびｐＭＴＩ−２３３２を製造
することにより、別のＡＰＰ形であるＡＰＰ−７７０お
よびＡＰＰ−７５１を表示する小遺伝子を製造した。Ａ
ＰＰＣ−末端フレームシフト変異体を表示する小遺伝子
ｐＭＴＩ−２３２６を製造するためには、変異４０−１
を含有しているｐＭＴＩ−２３２２（図８ａ）からのＢ
ｇｌII−ＣｌａＩフラグメントをｐＭＴＩ−２３１２
（図７ａ）のＢｇｌII−ＣｌａＩ部位間の配列で交換し
てｐＭＴＩ−２３２６ａを製造した。一方、ｐＭＴＩ−
２３２２のＢｇｌII−ＳｐｅＩフラグメントを直接ｐＭ
ＴＩ−２３２３中で交換させてｐＭＴＩ−２３２を製造
した（図１０ａ）。
【００３５】Ｃ−１００用のコード付け小遺伝子ｐＭＴ
Ｉ−２３２７（遺伝子生成物VI、図４ｂ）を製造するた
めには、ｐＭＴＩ−２３２３のＮｒｕＩおよびＢｇｌII
制限部位間の配列を欠失させた（図１１ａ）。翻訳開始
コドンであるＡＴＧはＡ４配列の第一コドンを直接先に
した。ＭＣ−１００をコード付けする小遺伝子ｐＭＴＩ
−２３３７を製造するためには、ｐＭＴＩ−２３２３
（図１１ａ）のＫｐｎＩおよびＢｇｌII部位間の配列を
欠失させ、そしてクローンを合成オリゴヌクレオチド受
容体であるｓｐ−ｓｐａｃｅｒ−Ａ４（図１２）を使用
して結紮させた。ＭＣ−１００（遺伝子生成物Ｖ、図４
ｂ）は、翻訳された変異体蛋白質の膜中への挿入を指定
するためにＡＰＰの１７残基シグナルペプチドを必要と
した。シグナルペプチドは工程中に分裂されそして除去
されるべきである。ＭＣ−１００のヌクレオチドおよび
アミノ酸配列は図１２に示されている。
【００３６】小遺伝子ｐＭＴＩ−２３４１を製造するた
めには、ｐＭＴＩ−２３３７（図１１ａ）を製造するた
めに使用されたものと同様な工程を使用した。これは、
ｐＭＴＩ−２３１６（図１０ａ）のＫｐｎＩおよびＢｇ
ｌII部位間の配列の欠失並びに合成オリゴヌクレオチド
受容体ｓｐ−ｓｐａｃｅｒ−Ａ４（図１３）を用いるク
ローンの結紮を含んでいた。ｓｐ−Ａ４のヌクレオチド
およびアミノ酸配列は図１３に示されている。
【００３７】人間ＡＰＰ遺伝子−誘導ＲＮＡ処理シグナ
ルを加えるための一連の別の小遺伝子に関しては、ＡＰ
Ｐ遺伝子の３′−端部をクローンｐＶＳ−１中で単離し
た。クローンｐＶＳ−１はｐＵＣ１９、図１５ａ、のＥ
ｃｏＲＩ部位中に挿入された人間ＡＰＰおよびＡＰＰポ
リアデニル化シグナルの末端エキソンの３′−端部を包
括している人間のゲノム性ＤＮＡの−１.５ｋｂＥｃｏ
ＲＩフラグメントを含有していた。−１.５ｋｂＡＰＰ
ゲノム性フラグメントは、人間染色体２１ＤＮＡ（Ａ.
Ｔ.Ｃ.Ｃ.番号ＬＡ２１ＮＳ０１）のチャロン２１Ａラ
ムダライブラリーから単離された。ＡＰＰｃＤＮＡクロ
ーンであるｐＦＣ４からのＳｍａＩ−ＳｐｈＩ（ヌクレ
オチド３１０２−３２６９）フラグメントを探針として
標識付けしそしてＡＰＰ３′−端部ゲノム用のラムダラ
イブラリーをスクリーニングした。−１.５ｋｂＡＰＰ
ゲノムフラグメントのヌクレオチド配列を図１６に示
す。
【００３８】ｐＶＳ−１からの−１.３ｋｂＳｐｈＩフ
ラグメントをｐＭＴＩ−２３１２（図７ａ）のＳｐｈＩ
部位に挿入してｐＭＴＩ−２３３９（図１５ａ）を生成
することにより、ＡＰＰ−６９５を表示するために設計
された小遺伝子構成体ｐＭＴＩ−２３３９を製造した。
ＡＰＰ構成体（図１８ａ）のｐＮｏｔＳＣ２ｎｅｏ亜ク
ローンの配列領域を交換することにより、ＡＰＰ−７５
１およびＡＰＰ−７７０並びに下記の変異体を表示する
小遺伝子を製造した。多くのＡＰＰ小遺伝子のＮｏｔＩ
フラグメントをｐＮｏｔＳＣ２ｎｅｏ（図１８ａ）に亜
クローニングさせて、ＡＰＰ表示をＣＯＳ細胞の一時的
トランスフェクションにおいて測定することができた。
ｐＭＴＩ−２３６３（図１８ａ）からｐＭＴＩ−２３６
９（図１９）でＰｖｕＩ−ＳｐｅＩフラグメントを交換
することにより、ＡＰＰ−７７０（ｐＭＴＩ−２３４
２、図１９）をコード付けする構造体を製造した。ＡＰ
Ｐ−７５１にコード付けする構成体であるｐＭＴＩ−２
３４５を同様な方式で製造した。
【００３９】変異体４０−１を表示する小遺伝子ｐＭＴ
Ｉ−２３４３を製造するためには、ｐＭＴＩ−２３６３
（図１８ａ）からｐＭＴＩ−２３６９（図１９）でＰｖ
ｕＩ−ＳｐｅＩフラグメントを交換することにより、フ
レームシフト変異体である４０−１を包括している配列
領域を製造した。
【００４０】変異体ＭＣ−１００にコード付けする小遺
伝子ｐＭＴＩ−２３４０を製造するためには、ｐＭＴＩ
−２３３９（図１５ａ）のＫｐｎＩおよびＢｇｌII部位
間の配列を欠失させ、そして合成オリゴヌクレオチド結
合剤（ｓｐ−ｓｐａｃｅｒ−Ａ４、図１２）を使用して
クローン結紮させた。
【００４１】変異体ｓｐ−Ａ４にコード付けする小遺伝
子ｐＭＴＩ−２３４４を製造するためには、ｐＭＴＩ−
２３６３（図１８ａ）からｐＭＴＩ−２３６９（図１
９）でＰｖｕＩ−ＳｐｅＩフラグメントを交換すること
により、ｓｐ−Ａ４変異体を下記の実施例中に記載され
ている如くして製造された多数のＡＰＰ小遺伝子を使用
して、ＡＰＰ交換遺伝子を表示する遺伝子交換性ハツカ
ネズミを製造した。そのような遺伝子交換性ハツカネズ
ミはＡＤの研究用モデルとして有用である。
【００４２】
【実施例】実施例１ ＡＰＰ小遺伝子の因子：細胞−および組織−特異的表示
用の遺伝子促進剤および調節剤因子 ＡＤ病理学的用の遺伝子交換性ハツカネズミモデルの開
発における重要な段階は、交換遺伝子として使用される
小遺伝子用の適切な遺伝子促進剤の単離である。遺伝子
促進剤および多分他の調節剤因子は、アミロイドプラー
クの生成と一致する細胞および組織特異性を有する組み
換え型ＡＰＰ小遺伝子の表示を促進させるものであると
同定されるべきである。第一段階として、人間のゲノム
ライブラリーからの人間ＡＰＰ遺伝子の５′−端部の種
々の部分を含有しているフラグメントが単離された。Ａ
ＰＰの５′−端部が細胞培養物中での遺伝子促進剤とし
て機能するＤＮＡ配列因子を含有していることが示され
ている（サルバウム他、上記引用文献）。−２.５ｋｂ
ＨｉｎｄIIIフラグメントは、Ａ.Ｔ.Ｃ.Ｃ.から受け入
れ番号ＬＬ２１ＮＳ０２として入手できる人間のゲノム
ライブラリーであった。このライブラリーは蛍光−活性
化細胞識別剤を使用して製造されており、人間染色体２
１に富んでいるフラグメントを得た。このフラグメント
をＨｉｎｄIIIで消化させそしてラムダベクターチャロ
ン２１Ａにクローン化した。このＨｉｎｄIII人間染色
体２１ライブラリーを６枚の板の上で５×１０4ｐｆｕ
／板の概略密度で平板培養した。３×１０5個の総ｐｆ
ｕライブラリー標本の二重フィルタースクリーニング
は、一般的方法（ベントン(Benton)およびダビス(Davi
s)、１９７７、Science、１９６：１８０）によりプラ
スミドｐＦＣ４から誘導された−１.０ｋｂｃＤＮＡ探
針を用いて実施された。プラスミドｐＦＣ４（図２）は
実施例３中に記載されている。それは図１に示されてい
る配列を有する−３.３ｋｂｃＤＮＡ挿入部を含んでい
る。−１.０ｋｂ探針はヌクレオチド位置５２における
ＡｐａＩ部位からヌクレオチド位置１０５６におけるＸ
ｈｏＩ部位で得られた。−１.０ｋｂ探針を用いる初期
スクリーンを確認するために、９１ｂｐ探針も使用し
た。この小さい確認用探針は、ｐＦＣ４からＡｐａＩ
（ヌクレオチド５２）−ＮｒｕＩ（ヌクレオチド１４
４）フラグメントとして誘導された。ハイブリッド化さ
れたクローンを１００％陽性ハイブリッド化応答が得ら
れるまでスクリーニングおよび精製という３回の連続的
サイクルによりプラーク精製した。そのようにプラーク
精製された１個のクローンはφＭＴＩ３５０９（λ１２
Ａ）と表示された。φＭＴＩ３５０９は−２４９５ｂｐ
のゲノム挿入部を含有していた。このＨｉｎｄIII挿入
部をプラスミドｐＵＣ１８のＨｉｎｄIII部位に亜クロ
ーン化し（ヤニッシュ−ペロン(Yanisch-Peron)他、１
９８５、Gene、３３：１０３）、そしてｐＭＴＩ−３５
０１（ｐＵＣ１８／ｐＡＬ１２Ａ−１２）と表示され
た。プラスミドｐＭＴＩ−３５０１はプラスミドｐＦＣ
４のｃＤＮＡ挿入部の第一ヌクレオチドに対する配列
５′の−４８７ｂｐを含有していることが見いだされた
（図１中に示されている）。
【００４３】ｐＭＴＩ−３５０１（−１２８におけるＡ
ｐａＩ部位から５２におけるＡｐａＩまで）から誘導さ
れた−１８１ｂｐゲノム探針を使用して、Ａ.Ｔ.Ｃ.Ｃ.
から受け入れ番号ＬＡ２１ＮＳ０１として入手できるＥ
ｃｏＲＩ人間ゲノム染色体２１細胞識別剤が富んでいる
ライブラーを、以上でＨｉｎｄIIIライブラーに関して
記されている方法と同様にしてスクリーニングした。φ
ＭＴＩ３５２２（λｐＥ−１）と表示された１個のプラ
ーク精製されたクローンは−４６３８ｂｐの挿入部を含
んでいた。この−４.６ｋｂ挿入部をプラスミドｐＵＣ
１９のＥｃｏＲＩ部位に亜クローン化し（ヤニッシュ−
ペロン他、上記引用文献）、そしてそれはｐＭＴＩ−３
５１５（ｐＵＣ１９／ｐＥ−１２）と表示された。プラ
スミドｐＭＴＩ−３５１５はプラスミドｐＦＣ４のｃＤ
ＮＡ挿入部の第一ヌクレオチドに−２８３１ｂｐ５′を
含有していることが見いだされた（図１）。
【００４４】ｐＦＣ４のｃＤＮＡに対する配列５′を含
有しているｐＭＴＩ−３５０１およびｐＭＴＩ−３５１
５の両者のゲノム挿入部が、位置２０７におけるｐＦＣ
４のｃＤＮＡ挿入部のＫｐｎＩ部位を中断させている。
このＫｐｎＩ部位はゲノム性ＤＮＡ中にはエキソン１お
よびイントロン１の間の境界の結合点では存在していな
かったが、ｍＲＮＡの組み継ぎ部位で製造された。プラ
スミドｐＭＴＩ−３５０１およびプラスミドｐＭＴＩ−
３５１５はそれぞれイントロンの−１.６ｋｂおよび−
１.４ｋｂをコード付けした。図３に示されている如
く、プラスミドｐＭＴＩ−３５１５は転写体のＡＰＰ出
発部位に対する配列５′の−２.８ｋｂを、エキソン１
（ＡＰＰのアミノ酸類１−１９をコード付けしている）
および第一イントロンの一部（−１.６ｋｂ）と共に含
有していることが示された。
【００４５】実施例２ ＡＰＰ小遺伝子の因子：ＳＶ４０−誘導ポリアデニル化
およびＲＮＡ接合シグナル ＳＶ４０ウィルス粒子ＤＮＡ（ヘイ(Hay)およびデパン
フィリス(DePamphilis)、１９８２、Cell、２８：７６
７−７７９；これはインターナショナル・バイオテクノ
ロジース・インコーポレーションからカタログ番号３３
２００としても市販されている）をＢａｍＨＩおよびＢ
ｃｌＩを用いて消化させた。２個のＲＮＡポリアデニル
化シグナル（各菌株中に１個）を含有している小さい−
０.２ｋｂＢａｍＨＩ−ＢｃｌＩフラグメント（２５３
３ｂｐ−２７７０ｂｐ）（デパンフィリスおよびブラド
リー(Bradley)、１９８６、The Papoyaviridae、１巻、
ザルツマン(Salzman)（編集）、プレヌム・パブリッシ
ング・コーポレーション、ニューヨーク）を下記の如く
してプラスミドｐＵＣ１９に「ショットガン」クローン
化させた。ＢａｍＨＩ−ＢｃｌＩで消化させたＳＶ４０
ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化させたｐＵＣ１９ＤＮＡと混
合した。制限酵素をフェノール−クロロホルム抽出によ
り除去し、そしてＤＮＡを１２℃においてＴ４リガーゼ
（ニューイングランド・バイオラブス（ＮＥＢ）からカ
タログ番号２０２として市販されている）を用いて一夜
結紮させた。残存フェノールまたはクロロホルムを含む
不純物を結紮されたＤＮＡからゲネクリーン（カリフォ
ルニア州ラジョラ、Ｐ.Ｏ.ボックス２２８４のＢＩＯ１
０１インコーポレーションから市販されている）により
除去した。このＤＮＡを使用して受容能力のあるＤＨ５
α大腸菌細胞（メリーランド州２０８７７ガイセルスブ
ルグのベテスダ・リサーチ・ラボラトリース（ＢＲＬ）
から市販されている）を転換させた。被転換体をＢａｍ
ＨＩ消化およびＨｐａＩ／ＨｉｎｄIII消化を用いるミ
ニプレプ分析によりスクリーニングして、挿入されたＤ
ＮＡの方向を測定した。希望する−２.９ｋｂプラスミ
ドは、ｐＭＴＩ−２３０２と称された（図５）。
【００４６】プラスミドｐＦＣ４からのＳＶ４０−誘導
ＲＮＡ接合シグナルを下記の如くしてｐＭＴＩ−２３０
２中に挿入した。最初に、ＡＰＰｃＤＮＡ配列（図１に
示されている）のヌクレオチド位置１４４におけるＮｒ
ｕＩ制限エンドヌクレアーゼ部位をブラント−エンド結
合剤を用いてＢｇｌII制限エンドヌクレアーゼ部位に転
化させて、プラスミドｐＭＴＩ−２３０３を製造した
（図５）。この転化のためには、ｐＦＣ４をＮｒｕＩを
用いて消化させ、そして線状の−６.４ｋｂＤＮＡフラ
グメントをゲネクリーンを用いて精製し、そして次に
０.５ＯＤ260単位のＢｇｌII結合剤（ＮＥＢカタログ番
号１０３６）を用いてＴ４リガーゼ［１６℃において５
時間培養］を使用して結紮させた。結合剤をゲル−濾過
により「急速回転カラム」（ベーリンゲル・マンハイ
ム、カタログ番号１００４０８）を用いて除去した。線
状ＤＮＡをゲネクリーンを用いて回収し、そしてＴ４リ
ガーゼを用いて循環させて、ｐＭＴＩ−２３０３を製造
した［ＢｇｌIIおよびＸｈｏＩ消化を用いる診断用ミニ
プレプは−０.３５ｋｂ、−１.４ｋｂ、および−２.９
５ｋｂのフラグメントを示した］。この工程は、ＡＰＰ
コード付け配列をヌクレオチド位置１４５からヌクレオ
チド位置１９１５の下流のＢｇｌII部位まで欠失させ
た。ＳＶ４０接合シグナルを含有している−０.３５ｋ
ｂフラグメントは、プラスミドｐＭＴＩ−２３０３ＤＮ
ＡからＸｈｏＩおよびＢｇｌIIを用いる消化により励起
させることができた。このＸｈｏＩ−ＢｇｌIIフラグメ
ントを５％ポリアクリルアミドゲル上でゲル−精製し、
次にＳａｌＩ−ＢａｍＨＩで消化されたｐＭＴＩ−２３
０３ＤＮＡを用いる結紮用に使用してプラスミドｐＭＴ
Ｉ−２３０５を製造した（図５）。プラスミドｐＭＴＩ
−２３０５をＥｃｏＲＩを用いて消化させて−３.２ｋ
ｂフラグメントを製造し、そして次にＣＩＡＰ（牛の腸
のアルカリ性ホスファターゼ、製造業者であるベーリン
ゲル・マンハイム、カタログ番号１０９７０７５により
示唆されている反応条件）を用いて脱ホスホリル化し
た。ＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルア
ルコール（２４／２４／１）を用いて抽出し、そして
２.５Ｍ酢酸アンモニウムおよび７０％エタノール中で
沈澱させた。ＤＮＡフラグメントをＴ４リガーゼを用い
て結紮させて、ＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩアダプターとし
た。該アダプターは自己−焼還性オリゴヌクレオチド
（配列５′−ＡＡＴＴＣＣＣＧＣＡＴＧＣＧＧＧ−
３′、アプライド・バイオシステムス・インスツルメン
トおよび製造業者の推奨方法、モデル番号３８０ＡＤＮ
Ａ合成器、を用いて合成された）であり、そして溶液
（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ トリス、ｐＨ７.６）中
で６５℃に加熱しそして試料を自然にゆっくり室温に冷
却することにより焼還された。ＳｐｈＩを用いるｐＭＴ
Ｉ−２３０４の診断用ミニプレプは、−０.６および−
２.６のフラグメントを示した。
【００４７】ＳＶ４０−誘導された接合シグナルおよび
ポリアデニル化シグナルを含有している−０.６ｋｂＳ
ｐｈＩカセットは、ｐＭＴＩ−２３０４ＤＮＡからＳｐ
ｈＩを用いる消化により励起させることができた。この
カセットは下記の実施例で記載されているＡＰＰ小遺伝
子の製造において有用であった。
【００４８】実施例３ ＡＰＰ小遺伝子の因子：ＡＰＰ−６９５、−７７０、−
７５１蛋白質コード付け範囲 プラスミドｐＦＣ４はカング(Kang)他、１９８７、Natu
re、３２５：７３３−７３６により記載されているクロ
ーン９−１１０と同様なｃＤＮＡクローンであり、そし
て全長ｃＤＮＡコード付け用ＡＰＰ−６９５を含有して
いる（図２）。カング他の上記引用文献により記されて
いるｃＤＮＡライブラリーは、オカヤマ(Okayama)およ
びベルグ(Berg)、１９８３、Mol. Cell. Biol.、３：２
８０−２８９の方法により、５月の堕胎した人間胎児の
脳皮質から単離されたポリＡ+ＲＮＡを使用して製造さ
れていた。このｃＤＮＡライブラリー（−１０5個の大
腸菌ＨＢ１０１被転換体）を最初に探針として６４個の
２０量体の混合物を用いてスクリーニングした。２０量
体は配列 ５′−ＴＴＴＴＧＡＴＧＡＴＧＣＡＣＴＴＣＡＴＡ−３′ Ｃ Ｇ Ｇ Ｇ ＧＧ を有していた。この配列はＡ４ペプチドの残基１０−１
６のアミノ酸配列から推定された。９個の陽性クローン
が得られ、そして１個（クローン９−１１０）が配列分
析用に選択された。全長ＡＰＰ−６９５配列をコード付
けするクローン９−１１０挿入部の完全配列は、カング
他の上記引用文献の図１に示されている。このｃＤＮＡ
ライブラリーを再び平板培養し、そして１７および２０
ヌクレオチド類の２種の合成オリゴヌクレオチド探針混
合物を用いてスクリーニングした。１７量体は配列 を有しており、ここでＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴである。
２０量体は配列 ５′−ＴＴＴＴＧＧＴＧＧＴＧＮＡＣＴＴＣＧＴＡ−３′ Ｃ Ａ Ａ Ｃ Ａ を有しており、ここでＮはＡ、Ｇ、ＣまたはＴである。
制限エンドヌクレアーゼ地図および部分的ＤＮＡ配列分
析により測定された同一の挿入部を含有しているｐＦＣ
４およびｐＦＣ７と称されている２種の陽性クローンが
得られた。クローンｐＦＣ４をその後の分析用に選択
し、そしてそれは図１に示されている全長ＡＰＰ−６９
５をコード付けする−３.４ｋｂ挿入部を含有してい
た。ヌクレオチド配列は、カング他の上記引用文献の図
１に示されている如き９−１００の配列と同一であっ
た。
【００４９】人間の神経芽細胞腫ｃＤＮＡライブラリー
をカリフォルニア州パラアルトのクロンテクからカタロ
グ番号ＨＬ１００７ａとして購入し、そして人間ＡＰＰ
の７５１ａａおよび７７０ａａ形のＡＰＰ転写体の存在
に関してスクリーニングした。このλライブラリーをｐ
ＦＣ４の−１.４ｋｂＢａｍＨＩフラグメント（ヌクレ
オチド９９−１４７５）を用いて探針した。同一挿入部
を有する２種の陽性クローン（λＥ1−ｂ1−１およびλ
Ｅ1−ｂ1−３）が得られた。これらの２種のクローンは
ＡＰＰ−７７０中で見られる追加エキソン（１６７ｂｐ
および５８ｂｐ）の両者を含んでいる−２.０ｋｂｃＤ
ＮＡ挿入部をそれぞれ含有していたが、ＡＰＰ−７７０
に関しては全長ｍＲＮＡの部分的ｃＤＮＡだけを表示し
た。−２.０ｋｂ挿入部をプラスミドｐＵＣ１９のＥｃ
ｏＲＩ部位に亜クローン化して、プラスミドｐＭＴＩ−
３５２５を製造した。ｐＦＣ４の−１.７ｋｂＫｐｎＩ
−ＢｇｌIIフラグメント（図１に示されているｐＦＣ４
配列のヌクレオチド２０７−ヌクレオチド１９１５）を
ｐＭＴＩ−３５２５の−.９６ｋｂＫｐｎＩ−ＢｇｌII
フラグメントで置換してプラスミドｐＭＴＩ−３５２１
（ｐＦＣ４−７７０）を製造することにより、ＡＰＰ−
７７０用の全長ｃＤＮＡが得られた。特に、ＰＭＴＩ−
３５２５をＫｐｎＩおよびＢｇｌIIを用いて消化させ、
そして−.９６ｋｂＫｐｎＩ−ＢｇｌIIフラグメントを
ゲル−精製した。プラスミドｐＦＣ４を同様にＫｐｎＩ
およびＢｇｌIIを用いて消化させ、そして−４.７ｋｂ
ＫｐｎＩ−ＢｇｌIIフラグメントをゲル−精製した。２
種のゲル−精製されたフラグメントを混合し、結紮さ
せ、そして大腸菌ＤＨ５α細胞の転換用に使用した。生
成した−６.６ｋｂプラスミドｐＭＴＩ−３５２１は、
ＡＰＰ−７７０表示用の小遺伝子の製造用のＡＰＰ遺伝
子フラグメントの原料であった。
【００５０】ＡＰＰの７５１ａａ形をコード付けする全
長ｃＤＨを得るために、プラスミドｐＭＴＩ−３５２１
の試験管内変異生成を行って、ＡＰＰ−７７０の７５ａ
ａプロテアーゼ抑制剤領域のＣ−末端１９アミノ酸類を
コード付けする５８ｂｐ配列を欠失させた。これは、ガ
イセルソダー(Geisselsoder)他、１９８７、Biotechniq
ues、５：７８６−７９１により記載されているＭ１３
−ルーピングアウト工程により得られる。ＤＮＡ配列分
析で、プラスミドｐＭＴＩ−３５２４を製造するｐＭＴ
Ｉ−３５２１の５８ｂｐ断片の連続的欠失が確認され
た。プラスミドｐＭＴＩ−３５２４は、ＡＰＰ−７５１
表示用の小遺伝子の製造用のＡＰＰ遺伝子フラグメント
の原料であった。
【００５１】プラスミドｐＭＴＩ−３５２４を、下記の
一連の段階に従い製造した。最初に、プラスミドｐＭＴ
Ｉ−３５２２をＡｃｃＩを用いて部分的に消化させ、次
にＤＮＡポリメラーゼ（クレナウ）のクレナウフラグメ
ントと共に充填して、２種のＡｃｃＩ部位の一方を除去
し、結紮させ、そして大腸菌ＤＨ５α細胞を転換させて
プラスミドｐＭＴＩ−３５２６を製造するために使用し
た。プラスミドｐＭＴＩ−３５２６をＡｃｃＩおよびＢ
ｇｌIIを用いて消化させ、−３.８ｋｂの大きいフラグ
メントをゲル−精製し、そしてｐＭＴＩ−３５２５から
の−１.７ｋｂＡｃｃＩ−ＢｇｌIIゲル−精製されたフ
ラグメントを用いて結紮させ、次に大腸菌ＤＨ５α細胞
を転換させるために使用した。希望する被転換体プラス
ミドはｐＭＴＩ−３５２２と称された。プラスミドｐＭ
ＴＩ−３５２２を次に使用してウラシルＮ−グリオシラ
ーゼ不足である受容能力のある大腸菌ＣＪ２３６細胞を
転換させた。数種の被転換体を増殖させ、そしてｐＭＴ
Ｉ−３５２２（ファージ）ＤＮＡを含有している単一−
ストランド化ウラシルをＲ４０８ヘルパーファージ（ス
トラタジーンからカタログ番号２００２５２として得ら
れる）を使用して製造した。ＡＰＰ−７５１およびＡＰ
Ｐ−６９５の結合部に及んでいる合成６０量体であるＭ
ＵＴＡ−１を使用してｐＭＴＩ−３５２２の５７ヌクレ
オチドをループアウトしてｐＭＴＩ−３５２３を製造し
た。ＭＵＴＡ−１は配列： 5′agtactgcatggccgtgtgtggcagcgccattcctacaacagcagcc
agtacccctgatg3′ を有しており、そして５′ホスホリル化されており、そ
して補充ストランドのコピーにおける酵素Ｔ４ＤＮＡポ
リメラーゼを補助する遺伝子３２蛋白質の存在下で焼還
して単一−ストランド化ｐＭＴＩ−３５２２ＤＮＡとし
た。この混合物を使用して、ウラシルＮ−グリコシラー
ゼ陽性である受容能力のある大腸菌ＸＬ−１青色細胞
（スタラタジーンからカタログ番号２００２６８として
得られる）を転換させた。無色のプラクをミニプレプお
よび配列分析用に取り出した。この工程（ゲイセルソダ
ー他、１９８７、バイオテクニクス、５：７８６−７９
１）は親ファージを大きく減少させて、変異体ストラン
ドを富ませた。これらの陽性クローンの１種はｐＭＴＩ
−３５２３と称された。
【００５２】実施例４ ＡＰＰ−６９５の表示用の小遺伝子であるｐＭＴＩ−２
３１４およびｐＭＴＩ−２３１０の製造 Ａ.小遺伝子ｐＭＴＩ−２３１４ ＡＰＰ−６９５の表示用の小遺伝子であるｐＭＴＩ−２
３１４製造の第一段階用に、プラスミドｐＭＴＩ−３５
１５から誘導された−４.６ｋｂＥｃｏＲＩフラグメン
ト（実施例１：図３）をブラントエンド結紮によりプラ
スミドｐＭＴＩ−２３０７のＨｉｎｄIII部位に挿入し
て、プラスミドｐＭＴＩ−２３０７を製造した（図７ａ
および７ｂ）。プラスミドｐＭＴＩ−２３０１はＮｏｔ
Ｉ制限エンドヌクレアーゼ部位が接している独特なＨｉ
ｎｄIIIクローニング部位を含有しており、そしてそれ
は最初にｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII多重結
合剤（メリーランド州ガイサースブルグのベテスダ・リ
サーチ・ラボラトリース、ライフ・テクノロジース・イ
ンコーポレーションからカタログ番号９５５７として得
られた）をｐＷＥ１（ストラタジーンからカタログ番号
２５１２０２として得られた）で置換しそして次にアダ
プターを用いてＨｉｎｄIII部位をＥｃｏＲＩ部位に転
換させることにより、製造された。ｐＭＴＩ−２３０１
の製造における第一段階用には、ＮＥｂから購入された
２種のオリゴヌクレオチド類（カタログ番号１１０７お
よび１１０５）を焼還して下記の二重−ストランド化ア
ダプターを生成した： ５′−ＡＡＴＴＣＧＡＡＣＣＣＣＴＴＣＧ−３′ （＃１１０５） ３′−ＧＣＴＴＧＧＧＧＡＡＧＣＴＣＧＡ−５′（＃１１０７） 次に、プラスミドｐＵＣ１９ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよび
ＨｉｎｄIIIを用いて消化させ、そして−２.７ｋｂフラ
グメントをゲル−精製し（低融点アガロース）、アダプ
ターを用いて結紮し、そして大腸菌ＤＨ５α細胞を転換
させるために使用した。希望する被転換体はｐＭＴＩ−
２２１０と称された（図６ａ）。ｐＭＴＩ−２３０１の
製造における第二段階用には、プラスミドｐＭＴＩ−２
１１０ＤＮＡをＥｃｏＲＩを用いて消化させ、次に牛の
腸のアルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）で処理し、
次にゲル−精製した。ＣＩＡＰはインディアナ州４６２
５０インディアナポリス、Ｐ.Ｏ.ボックス、ベーリンゲ
ル・マンハイム・バイオケミカルス、バイオケミカルス
部門から得られた（カタログ番号７１３０２３）。プラ
スミドｐＷＥ１６ＤＮＡも、ＥｃｏＲＩを用いて消化さ
せた。ＥｃｏＲＩで消化させたｐＷＥ１６およびゲル精
製されたＥｃｏＲＩで消化させたｐＭＴＩ−２１１０Ｄ
ＮＡを混合し、結紮し、ジーンクリーンで処理し、そし
て大腸菌ＤＨ５α細胞を転換させるために使用した。希
望する被転換体プラスミドはｐＭＴＩ−２３００と称さ
れた。ミニプレプ分析は、ＮｏｔＩが−２.７ｋｂプラ
スミドを線状化させたことを示した。ｐＭＴＩ−２３０
１の製造における第三段階用に、プラスミドｐＭＴＩ−
２３００ＤＮＡをＢａｍＨＩを用いて消化させ、そして
ＢａｍＨＩ部位をＨｉｎｄIII部位に転換させるために
自己−焼還性合成オリゴヌクレオチドアダプター（配列
５′−ＧＡＴＣＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣ−３′；アプ
ライド・バイオシステムス・インスツルメントおよび製
造業者の推奨方法、モデル番号３８０ＡＤＮＡ合成器を
使用して合成された）に結紮させた。オリゴヌクレオチ
ドを焼還して、下記の二重−ストランド化アダプターを
生成した： ５′−ＧＡＴＣＧＧＧＡＡＧＣＴＴＣＣＣ−３′ ５′−ＣＣＣＴＴＣＧＡＡＧＧＧＣＴＡＧ−５′ 結紮されたＤＮＡをジーンクリーンで処理し、そして大
腸菌ＤＨ５α細胞を転換させるために使用した。被転換
体ＤＮＡのミニプレプ分析を、ＢａｍＨＩ（プラスミド
は未切断のままであった）およびＨｉｎｄIII（プラス
ミドを線状化させる）を用いて行った。希望する被転換
体はｐＭＴＩ−２３０１と称された。
【００５３】このようにして得られたプラスミドｐＭＴ
Ｉ−２３０１ＤＮＡをＨｉｎｄIIIを用いて消化させ、
ゲル−精製し、次にクレナウおよびＣＩＡＰで処理し
た。次に、プラスミドｐＭＴＩ−３５１５ＤＮＡをＥｃ
ｏＲＩを用いて消化させ、そして−４.６ｋｂフラグメ
ントをゲル−精製し、クレナウで処理し、そして上記の
如くして製造されたｐＭＴＩ−２３０１ＤＮＡを用いて
ブラントエンド結紮させた。結紮されたＤＮＡをジーン
クリーンで処理し、そして大腸菌ＤＨ５α細胞を転換さ
せるために使用した。被転換体をＥｃｏＲＩを用いるミ
ニプレプ分析によりスクリーニングした。希望する被転
換体プラスミドはｐＭＴＩ−２３０７と称され、そして
それはミニプレプ分析によると−４.７ｋｂおよび−２.
６ｋｂのＥｃｏＲＩフラグメントを含有していた。
【００５４】ｐＭＴＩ−２３１４の製造の第二段階用
に、ヌクレオチド類１００−１４７５を含んでいる−
１.４ｋｂＢａｍＨＩフラグメント（実施例３、図１）
をプラスミドｐＭＴＩ−２３０７中のＡＰＣｃＤＮＡ配
列のヌクレオチド位置９９のところでＢａｍＨＩ部位中
に結紮させてプラスミドｐＭＴＩ−２３１１を製造した
（図７ａ）。ＸｈｏＩおよびＮｏｔＩを用いて消化させ
たｐＭＴＩ−２３１１ＤＮＡの診断用ミニプレプ分析
は、−３.９ｋｂ、−２.７ｋｂおよび−２.２ｋｂのフ
ラグメントを示した。
【００５５】ｐＭＴＩ−２３１４の製造の第三段階用
に、ヌクレオチド類１０５６−３３５３を含んでおり且
つオカヤマおよびベルグのベクトル（オカヤマおよびベ
ルグ、１９８３、上記引用文献）中で見られる３′配列
であるポリＡトラックおよびＳＶ４０配列を含んでいる
ｐＦＣ４の−２.４ｋｂＸｈｏＩフラグメントをヌクレ
オチド位置１０５６においてＸｈｏＩ部位に結紮させ
て、プラスミドｐＭＴＩ−２３１２を製造した（図７ａ
および７ｃ）。
【００５６】ｐＭＴＩ−２３１４の製造の最終段階用
に、ＳＶ４０−誘導されたＲＮＡ接合用シグナルおよび
ポリデニル化シグナルを含有しているｐＭＴＩ−２３０
４の−０.６ｋｂＳｐｈＩフラグメントをｐＭＴＩ−２
３１２のＳｐｈＩ部位に結紮させてプラスミドｐＭＴＩ
−２３１４を製造した（図７ａおよび８ｂ）。プラスミ
ドｐＭＴＩ−２３１４ＤＮＡを、下記の実施例１１中に
記載されている如き遺伝子交換性ハツカネズミを表示す
るＡＰＰ−６９５の製造用の小遺伝子として使用した。 Ｂ.小遺伝子ｐＭＴＩ−２３１０ ＡＰＰ−６９５、ｐＭＴＩ−２３１０の表示用の第二小
遺伝子（図８ａ）をｐＭＴＩ−２３１４の製造に関して
以上で略記されているのと同じ四段階に従い製造した
が、但し、第一段階においてプラスミドｐＭＴＩ−３５
０１から誘導された−２.４ｋｂＨｉｎｄIIIフラグメン
ト（実施例１）をｐＭＴＩ−２３０１のＨｉｎｄIII部
位（上記の部分Ａ）中に挿入させてプラスミドｐＭＴＩ
−２３０６を製造した。その後の三段階で、プラスミド
類ｐＭＴＩ−２３０８（ＮｏｔＩおよびＸｈｏＩを用い
る診断用ミニプレプは−２.６、−２.３および−１.６
ｋｂのフラグメントを示した）、ｐＭＴＩ−２３０９
（方向を測定するためのＨｉｎｄIIIを用いる診断用ミ
ニプレプは−３.４、−２.９および−２.６ｋｂのフラ
グメントを示した）およびｐＭＴＩ−２３１０（Ｅｃｏ
ＲＩを用いる診断用ミニプレプは−２.７、−２.４、−
２.３、−１.１および−０.９ｋｂのフラグメントを示
した）をそれぞれ製造した。ｐＭＴＩ−２３１４と同一
のＡＰＰ−６９５遺伝子を含有しているが切断された調
節部分を有するプラスミドｐＭＴＩ−２３１０は、下記
の実施例１１中に記載されている如きＡＰＰ−６９５表
示用遺伝子交換性ハツカネズミの製造用の小遺伝子とし
ても使用された。
【００５７】実施例５ ＡＰＰ−７７０およびＡＰＰ−７５１の表示用の小遺伝
子であるｐＭＴＩ−２３１９およびｐＭＴＩ−２３２０
の製造 それぞれＡＰＰ−７７０およびＡＰＰ−７５１の表示用
の小遺伝子であるｐＭＴＩ−２３１９およびｐＭＴＩ−
２３２０（図８ａ）を、それぞれ単一段階消化および結
紮工程でＡｃｃＩ−ＢｇｌIIフラグメントの簡単な交換
により製造した。ＡＰＰ−７７０用の全長ｃＤＮＡをコ
ード付けするプラスミドｐＭＴＩ−３５２１ＤＮＡ（実
施例３）をＡｃｃＩおよびＢｇｌIIを用いて消化させ
た。ｐＦＣ４−７７０の−１.８ｋｂＡｃｃＩ−ＢｇｌI
IフラグメントをｐＭＴＩ−２３１４のＡｃｃＩおよび
ＢｇｌII部位中に結紮させてｐＭＴＩ−２３１９を製造
した。ＳｃａＩを用いて消化されたｐＭＴＩ−２３１９
ＤＮＡの診断用ミニプレプ分析は、−７.３および−４.
８ｋｂのフラグメントを示した。ＳｃａＩ部位はＡＰＰ
−７７０およびＡＰＰ−７５１の領域をコード付けする
抑制剤中に存在している。同様に、ＡＰＰ−７５１用の
全長ｃＤＮＡをコード付けするプラスミドｐＭＴＩ−３
５２４ＤＮＡ（実施例３）をＡｃｃＩおよびＢｇｌIIを
用いて消化させた。ｐＭＴＩ−３５２４の−１.７５ｋ
ｂＡｃｃＩ−ＢｇｌIIフラグメントをｐＭＴＩ−２３１
４のＡｃｃＩおよびＢｇｌII部位中に結紮させてｐＭＴ
Ｉ−２３２０を製造した。ＳｃａＩを用いて消化された
ｐＭＴＩ−２３２０ＤＮＡの診断用ミニプレプ分析は、
−７.２および−４.８ｋｂのフラグメントを示した。そ
れぞれＡＰＰ−７７０およびＡＰＰ−７５１用の全長ｃ
ＤＮＡを含有しているプラスミド類であるｐＭＴＩ−２
３１９およびｐＭＴＩ−２３２０を、下記の実施例１２
中に記載されている如き遺伝子交換性ハツカネズミを表
示するＡＰＰ−７７０およびＡＰＰ−７５１の製造用の
小遺伝子として使用した。従って、ＡＰＰ−７７０およ
びＡＰＰ−７５１中で見られた領域にコード付けする抑
制剤を、独特なＡｃｃＩおよびＢｇｌII部位の間の配列
領域を交換することにより、ｐＭＴＩ−２３１４のＡＰ
Ｐ−６９５配列中に挿入することができた。
【００５８】実施例６ ＡＰＰＣ−末端フレームシフト変異体の表示用のｐＭＴ
Ｉ−２３２１およびｐＭＴＩ−２３２２小遺伝子の製造 ＡＰＰコード付け配列のＣ−末端領域中でフレームシフ
ト変異を起こすことにより切断されたＡＰＰ蛋白質の表
示用の小遺伝子であるｐＭＴＩ−２３２１およびｐＭＴ
Ｉ−２３２２（図８ａ）を製造した。これらのフレーム
シフト変異はＡＰＰｃＤＮＡ配列中でＡ４コード付け部
分の直後のところで行われて、翻訳停止コドンをＡ４ペ
プチドコード付け領域の次の読み取りフレーム（すなわ
ちフレーム内終結）中に加えた。生じた変異された配列
は、図４ｂ中に示されている遺伝子生成物IVにより例示
されている如き切断されたＡＰＰ種をコード付けする。
【００５９】クンケル(Kunkel)他、１９８７、Methods
In Enzymol.、１５４：３６７−３８２により記載され
ている試験管内変異生成工程を使用して下記に簡単にま
とめられているフレームシフト変異体を発生させた。変
異生成用の出発物質はプラスミドｐＭＴＩ４はストラタ
ジーンから得られる変異生成ベクトルＫＳブルースクリ
プト（＋）であり、その中にＡＰＰ−６９５ｃＤＮＡの
断片を含有しているｐＦＣ４の−２.３ｋｂＮｒｕＩ−
ＳｐｅＩフラグメントが挿入されていた。この製造用に
は、ｐＦＣ４をＮｒｕＩおよびＳｐｅＩを用いて消化さ
せ、クレナウで処理し、次にＳｍａＩで消化させたＫＳ
ブルースクリプト（＋）ＤＮＡのＳｍａＩＶ中にブラン
トエンド結紮させて、ｐＭＴＩ−４を生成した。単一−
ストランド化ｐＭＴＩ４ＤＮＡは大腸菌ＣＪ２３６宿主
細胞から製造され、その細胞中ではウラシルがＤＮＡ中
のチミンを置換している。次にＤＮＡを、特定製造用の
プライマーとして以下に記載されている３種の変異生成
用合成オリゴヌクレオチド類の１種を使用する試験管内
ＤＮＡ合成により二重−ストランド化とした。異種二重
螺旋ＤＮＡ（１種のウラシル−含有正常ｐＭＴＩ４スト
ランドおよび１種の合成されたてのチミン−含有変異生
成ストランド）を使用して大腸菌ＭＶ１１９０細胞を転
換させ、該細胞中ではチミン−該変異生成ストランドの
配列はウラシル−含有野性型ストランドが変性されるた
め選択的に繁殖する。そのような転換された大腸菌集落
からのミニプレププラスミド製剤を、直接的ＤＮＡ配列
分析による変異生成の導入用にスクリーニングした。配
列分析用に、プライマーはＡＰＰｃＤＮＡのヌクレオチ
ド位置１８８１−１８９７からの配列を有するオリゴヌ
クレオチドであった。プライマーの配列−２００ヌクレ
オチドの下流を分析して、変異した配列を確認した。希
望するＡＰＰコード付け配列の変異を有するこれらのク
ローンを、切断されたＡＰＰ小遺伝子の製造において使
用するための一般的方法による変異体プラスミドＤＮＡ
の予備精製用に使用した。
【００６０】３種の型の変異体（ａ、ｂ、ｃ）を発生さ
せ、それらはＡＰＰｍＲＮＡ中の早期翻訳終結シグナル
を導入して切断されたＡＰＰ蛋白質を製造した。ヌクレ
オチド位置２０４０のところで始まる野生型（ｗｔ）お
よび変異体の配列は下記の如く下線が引かれている終結
コドンで示されている： a b c wt GTG GGC GGT GTT GTC ATA GCG ACA GTG ATC... Val Gly Gly Val Val Ile Ala a GTG GGG GTG TTG TCA TAG CGA CAG TGA TCG... Val Gly Val Leu Ser * b GTG GGC GGT GTT GTG TCA TAG CGA CAG TGA TCG... Val Gly Gly Val Val Ser * c GTG GGC GGT GTT GTC TAG CGA CAG TGA TCG... Val Gly Gly Val Val * 変異生成用に使用された合成オリゴヌクレオチド類は下
記のものであった： a 5′-CATGGTGGGGGTGTTGTCATAGC-3′ [23量体、2036-2
059] b 5′-GGGCGGTGTTGTGTCATAGCGACAG-3′ [25量体、2042
-2064] c 5′-GGCGGTGTTGTCTAGCGACAGTGA-3′ [24量体、2043-
2067] 変異体ａに関しては、文字「ａ」の付いた野生型配列の
上に標識付けされている１個のヌクレオチド（Ｃ）が欠
失されて、２個のフレーム内終結コドンを生成してい
る。変異体ａ中の第一のフレーム内終結コドンは、Ａ４
配列のａａ４０用のコドンである。変異体ａ中では、ア
ミノ酸類３８、３９および４０は野生型配列のものとは
異なっている。変異体ｂに関しては、２個のヌクレオチ
ド類（ＴＧ）が文字「ｂ」の付いた野生型配列の上に標
識付けされて位置で挿入されて、２個のフレーム内終結
コドンを生成した。変異体ｂ中の第一のフレーム内終結
コドンは、Ａ４配列のａａ４１用のコドンの後にある。
変異体ｂ中では、ａａ４１は野生型の配列のものとは異
なっている。変異体ｂ（＋２変異体としても知られてい
る）を下記のプラスミドｐＭＴＩ−２３２１の製造にお
いて使用した。変異体ｃに関しては、文字「ｃ」の付い
た野生型配列の上に標識付けされている１個のヌクレオ
チド（Ａ）が欠失されて、Ａ４配列のＡＡ４０用のコド
ンの直後に読み取りフレーム中のフレーム内終結コドン
を製造する。変異体ｃは変異体４０−１と称されてお
り、そして下記のプラスミドｐＭＴＩ−２３２２の製造
において使用された。
【００６１】Ａ４コード付け配列を含有しているＡＰＰ
−６９５ｃＤＮＡの一部は−０.７ｋｂＢｇｌIII−Ｃｌ
ａＩフラグメント（ヌクレオチド位置１９１５−２６２
０に相当する）内にあり、ＢｇｌIIIおよびＣｌａＩが
それぞれ一度だけＡＰＰ−６９５ｃＤＮＡを分裂させる
ため、該フラグメントは簡単に１個のＡＰＰ遺伝子構成
体から他へ移動させることができる。下記の段階を使用
してｐＭＴＩ４の変異生成部分を他のＡＰＰ構成体に挿
入させて、切断されたＡＰＰ蛋白質の表示用の小遺伝子
を製造した。第一段階において、変異生成されたｐＭＴ
Ｉ４ＤＮＡをＢｇｌIIIおよびＣｌａＩを用いて消化さ
せた。次に−０.７ｋｂＢｇｌIII−ＣｌａＩフラグメン
トを予備的アガロースゲルから単離した。第二段階にお
いて、他の構成体からのＤＮＡをＢｇｌIIIおよびＣｌ
ａＩを用いて消化させそして次にＣＩＡＰで処理した。
プラスミドｐＭＴＩ−２３２１およびｐＭＴＩ−２３２
２の製造用には、この別の構成体はＡＰＰ−６９５用の
全長（野生型）ｃＤＮＡをコード付けするｐＭＴＩ−２
３１４（実施例４）であった。ｐＭＴＩ−２３１４の小
さい−０.７ｋｂＢｇｌIII−ＣｌａＩフラグメントを消
化物から予備的アガロースゲル電気泳動により除去し
た。第三段階において、置換しようとする−０.７ｋｂ
フラグメントの除去（段階２）後に残っているｐＭＴＩ
−２３１４の大きい−１１.１ｋｂＢｇｌIII−ＣｌａＩ
フラグメントを−０.７ｋｂ変異生成したＢｇｌIII−Ｃ
ｌａＩフラグメント（段階１）と混合し、次に結紮さ
せ、そして大腸菌ＤＨ５α細胞を転換させるために使用
した。被転換体であるプラスミド類を最初にミニプレプ
分析により、適当な挿入部に関してスクリーニングし
た。ＥｃｏＲＩを用いるプラスミド類の診断用ミニプレ
プ分析は、−４.７、−２.７、−２.６、−１.１および
−０.９ｋｂのフラグメントを示した。次に、それぞれ
選択されたプラスミド製剤の一体性を、変異生成した配
列および変異の周辺の配列のＤＮＡ配列分析により確認
した。ｐＭＴＩ−２３２１（変異体−ｂ）およびｐＭＴ
Ｉ−２３２２（変異体４０−１）と称されている生成し
た選択されたプラスミド類を、切断されたＡＰＰ蛋白質
を表示する遺伝子交換ハツカネズミの製造用の小遺伝子
として使用した。変異体ａの表示用のプラスミドを、以
上で変異体ｂ（ｐＭＴＩ−２３２１）および変異体４０
−１（ｐＭＴＩ−２３２２）に関して記されている如き
フラグメント交換により製造しそして選択できる。
【００６２】実施例７ Ａ４アミロイドペプチド表示用の小遺伝子ｐＭＴＩ−２
３１８の製造 Ａ４ペプチド表示用の小遺伝子を含有しているプラスミ
ドｐＭＴＩ−２３１８（図９）を製造するために、最初
に４２ａａＡ４ペプチド配列をコート付けする移動可能
な遺伝子を製造した。この遺伝子は、上記の実施例６に
記載されてる如きＡＰＰ−６９５のフラグメントの試験
管内変異生成により得られた。出発物質は実施例６に記
載されているプラスミドｐＭＴＩ−４と同じであった。
Ａ４配列に相当しているがフレーム内終結（ＴＡＧ）生
成用の希望する変化がなされておりそしてフレーム内終
結コドンの直後に一般的なＢａｍＨＩ制限部位を有する
３８−ベースオリゴヌクレオチド変異生成プライマーを
化学的に合成した。この合成プライマーの配列は以下の
如くであった： このプライマーを使用し上記の実施例６中の工程に実質
的に従ってｐＭＴＩ４中のＡＰＰ−６９５を変異させて
プラスミドｐＭＴＩ−２６を製造した。野生型（天然）
および変異された配列を下記に示す： BglII wt AGATCTCTGAAGTGAAGATG GAT...GGT GTT GTC ATA GCG AGA GTG ATC. MET asp gly val val ile ala thr val ile BglII BamHI 変異体 AGATCTCTGAAGTGAAGATG GAT...GGT GTT GTC ATA GCG TAGGATCCGT MET asp gly val val ile ala ter ＡＴＧコドンの前にある生成したてのＢａｍＨＩ部位お
よびＢｇｌII部位が、Ａ４遺伝子を他のＡＰＰ構成中に
クローン化させて４２ａａ４Ａ４ペプチド表示用の小遺
伝子を製造するための簡便な制限部位を与える。１種の
そのような小遺伝子構成体は、次の段階（図９）に従い
製造されたｐＭＴＩ−２３１８であった。第一段階にお
いて、ｐＭＴＩ−２６ＤＮＡをＢｇｌIIおよびＢａｍＨ
Ｉを用いて消化させた。次に−１５０ｂｐフラグメント
を５％ポリアクリルアミドゲルから電気溶離により単離
した。第二段階において、例えばｐＭＴＩ−２３０７
（実施例４）の如き他の構成体からのＤＮＡをＢａｍＨ
Ｉを用いて消化させ、ゲル−精製し、そしてＣＩＡＰで
処理した。第三段階において、−１５０ｂｐ変異生成Ｂ
ｇｌII−ＢａｍＨＩフラグメント（段階１）をＢａｍＨ
Ｉ−切断ｐＭＴＩ−２３０７ＤＮＡ（段階２）と混合
し、次に結紮させ、そして大腸菌ＤＨ５α細胞を転換さ
せるために使用した。被転換体プラスミドをミニプレプ
およびＤＮＡ配列分析により適当な挿入部に関してスク
リーニングした。各ミニプレプ分析のために、出発およ
び最終物質を区別できそして希望する方向を決めること
のできるような制限エンドヌクレアーゼを選択した。次
に、他の制限エンドヌクレアーゼを選択して、構成体の
一体性（例えば異例の転位のないこと）を確認した。生
じた−７.６ｋｂプラスミドはｐＭＴＩ−２３１６と称
された。ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩを用いるミニプレ
プ分析は、−６.８および−０.８ｋｂのフラグメントを
示した。次の段階で、ｐＭＴＩ−２３１６ＤＮＡをＢａ
ｍＨＩを用いて消化させ、次にｐＦＣ５の−２.０ｋｂ
ＢａｍＨＩフラグメントと混合し、そしてそれと結紮さ
せて上記の如き転換および選択によりｐＭＴＩ−２３１
７を製造した。Ｈ ｉｎｄIIIを用いる−９.６ｋｂのミニ
プレプ分析は、−７.３および−２.２ｋｂのフラグメン
トを示した。このＢａｍＨＩの挿入が３′の未翻訳配列
の一部に沿って簡便なＳｐｈＩ部位を供して安定な寸法
のメッセンジャーＲＮＡ転写用の鋳型となった。最終的
段階において、ＳＶ４０接合シグナルおよびポリアデニ
ル化シグナルを含有しているｐＭＴＩ−２３０４の−
０.６ｋｂＳｐｈＩフラグメントを、上記の如き適当な
制限エンドヌクレアーゼ消化、結紮、転換および選択に
より、ｐＭＴＩ−２３１７のＳｐｈＩ部位のところに挿
入して、希望するプラスミドｐＭＴＩ−２３１８を製造
した。ＥｃｏＲＩを用いるｐＭＴＩ−２３１８のミニプ
レプ分析は、−２.９、−２.７、−２.０、−１.１、−
０.９および−０.６ｋｂのフラグメントを示した。プラ
スミドｐＭＴＩ−２３１８は、４２ａａＡ４ペプチドを
表示する遺伝子交換性ハツカネズミの製造用の小遺伝子
として使用された。
【００６３】実施例８ 組み換え的に表示されたＡＰＰのエピトープ標識 合成ペプチド類および／または組み換え先駆体蛋白質に
惹起される抗体を使用するＡＰＰ−６９５、ＡＰＰ−７
７０およびＡＰＰ−７５１などの変形ＡＰＰ並びに変異
形のＡＰＰの亜細胞局在および処理の免疫化学的研究
は、下記の理由から難しい。第一に、ＡＰＰは種類間で
高度に保存されており（ハツカネズミおよび鼠９９％、
人間および鼠９７.３％）、そして至るところで表示さ
れている。種々のＡＰＰペプチド類および組み換え蛋白
質に対する適当な抗体を容易に製造するためには、チラ
ミジアの高度抗原性エピトープ（フグエネル(Huguenel)
他、１９８９、Intl. Soc. Sex. Trans. Dis. Res.、８
回会議、デンマーク、コペンハーゲン、アブストラクツ
番号２２）を蛋白質のクニッツ抑制剤領域または極端な
Ｃ−末端におけるＡＰＰ配列中に挿入した。そのような
標識付けされたＡＰＰｃＤＮＡを含有している小遺伝子
を使用して遺伝子交換性ハツカネズミを製造し、そして
そのようなハツカネズミ中のＡＰＰ翻訳生成物をこのエ
ピトープに対する抗体を使用して検出することができ
た。
【００６４】チラミジアエピトープのペプチド配列はＴ
ＶＦＤＶＴＴＬＮＰＴＩである。このエピトープは単離
されたペプチドおよび比較的大きい蛋白質の一部として
非常に抗原性であることが示されている（フグエネル
他、上記引用文献；ベール(Baehr)他、１９８８、Proc.
Natl Acad. Sci. USA、８５：４０００−４００４；ス
テフェンス(Stephens)他、１９８８、J. Exp. Med.、１
６７：８１７−８３１）。合成オリゴヌクレオチド類を
ＡＰＰコード付け範囲内の部位−方向指定変異生成用に
製造して、Ｍ１３「ループイン」実験によりチラミジア
エピトープ用の配列に挿入した。合成オリゴヌクレオチ
ド 5′ Aat II GGCTGCTGTG GCGGGGGTCTA AAT AGT TGG GTT CAG AGT GGT GAC GTC AAA * I T P N L T T V D F GAC AGT GTT CTG CAT CTG CTC AAA GA 77量体(CC-TAG) V T N Q M Q B F F を使用して、チラミジアエピトープをコード付けする配
列のＣ−末端追加をＡＰＰ６９５に運ぶｐＭＴＩ−６３
を処理した。合成オリゴヌクレオチド 5′ Aat II G GGT ACT GGC TGG TGT TGT AGG AAT AGT TGG GTT CAG AGT GGT GAC GTC T S A A T T P I T P N L T T V D AAA GAC AGT AAC TCG AAC CAC CTC TTC C 77量体(IC-TAG) F V T V R V V E E を使用して、チラミジアエピトープをコード付けするア
ミノ酸配列をアミノ酸残基２８９のＡＰＰ配列中に追加
させるｐＭＴＩ−３５を処理し、ここで（クニッツ）プ
ロテアーゼ抑制剤様領域はＡＰＰ−６９５分子中に接合
されている。
【００６５】このチラミジアエピトープに対して製造さ
れた抗体は、生体内での標識の付いたＡＰＰ蛋白質の組
織、細胞および亜細胞局在を研究するため、トランスフ
ェクタントの細胞識別などのトランスフェクション化動
物細胞中のＡＰＰの生化学的性質および処理を研究する
ため、試験管内翻訳生成物中のＡＰＰおよびウェスター
ン−ブロッツ上でのＡＰＰ転換された大腸菌生成物を研
究するため、並びに遺伝子交換動物中でのＡＰＰおよび
それの亜細胞局在の処理を行うため、に有用である。そ
のような研究は、正常人およびＡＤもしくはＤＳ患者中
でのＡＰＰの機能的役割の同定を可能にするはずであ
る。ＡＰＰ−６９５（ＩＣ−ＴＡＧ）の表示用の小遺伝
子であるｐＭＴＩ−２３２４およびｐＭＴＩ−２３２５
（図８ａ）をそれぞれ単一段階消化および結紮工程でＡ
ｃｃＩおよびＢｇｌIIフラグメントの簡単な交換により
製造した。プラスミドｐＭＴＩ−３５ＤＮＡをＡｃｃＩ
およびＢｇｌIIを用いて消化させた。ｐＭＴＩ−３５の
−１.６ｋｂＡｃｃＩ−ＢｇｌIIフラグメントをゲル−
精製し、そしてｐＭＴＩ−２３１４の大きなＤＮＡフラ
グメントのＡｃｃＩおよびＢｇｌII部位中に結紮させて
ｐＭＴＩ−２３２５を発生させるか（図８ａ）、または
ｐＭＴＩ−２３２３のゲル精製された大きいフラグメン
トのＡｃｃＩおよびＢｇｌII部位中に結紮させてｐＭＴ
Ｉ−２３２４を発生させる（実施例９、図１０ａ）。Ｈ
ｉｎｄIIIを用いて消化させたｐＭＴＩ−２３２４ＤＮ
Ａの診断用ミニプレプ分析は、−１.３、−４.４および
−７.７ｋｂのフラグメントを示した。ＡａｔIIを用い
て消化させたｐＭＴＩ−２３２５ＤＮＡの診断用ミニプ
レプ分析は、−４.２、−３.３、−３.１、−０.６およ
び−.０５５ｋｂのフラグメントを示した。同様な方法
で、ｐＭＴＩ−３５の−１.６ｋｂＡｃｃＩ−ＢｇｌII
フラグメントをｐＭＴＩ−２３２９のゲル−精製された
大きいＤＮＡフラグメントのＡｃｃＩおよびＢｇｌII部
位中に結紮させて（実施例９、図１４）、ｐＭＴＩ−２
３３５を製造することができた。
【００６６】実施例９ メタロチオネイン−誘導された調節剤または処理シグナ
ルを有するＡＰＰ小遺伝子 Ａ.メタロチオネイン−誘導されたＲＮＡ処理シグナル
を有するＡＰＰ小遺伝子 内因性ハツカネズミ遺伝子から誘導されたＲＮＡ処理シ
グナルを有する小遺伝子は、上記の実施例４−８に記載
されているＳＶ４０−誘導されたＲＮＡ処理シグナルを
使用する小遺伝子と比べて、より効果的に表示するであ
ろう。従って、ハツカネズミメタロチオネイン遺伝子の
ＲＮＡ接合およびポリアデニル化配列が利用される別の
小遺伝子構成体を製造した。ハツカネズミメタロチオネ
インの一原料は、プラスミドｐＪＹＭＭＴ（Ｌ）（ｐＣ
Ｌ−２８またはＴ２５とも称されている）である。プラ
スミドｐＪＹＭＭＴ（Ｌ）は、ハマー(Hamer)およびワ
リング(Walling)、１９８２、J. Mol. App. Gen.、１：
２７４−２８８により記載されているメタロチオネイン
遺伝子の−１２.４ｋｂゲノム性クローンである。メタ
ロチオネインＲＮＡシグナルを使用するこの別系列の小
遺伝子はｐＪＹＭＭＴ（Ｌ）を用いて製造された。これ
らの別の小遺伝子の多くは、実施例４−８に記載されて
いるＳＶ４０ＲＮＡシグナルを含有している小遺伝子を
用いるフラグメント交換により製造された。 １.ＡＰＰ−６９５、ＡＰＰ−７７０およびＡＰＰ−７
５１を表示する別の小遺伝子 ハツカネズミのメタロチオネイン−Ｉ遺伝子ＲＮＡ処理
シグナル（接合およびポリアデニル化）を利用しそして
ＡＰＰ−６９５を表示する小遺伝子を下記の如き単一段
階で製造した。促進剤以外の全てのハツカネズミのメタ
ロチオネイン−Ｉゲノム性遺伝子配列を含有しているｐ
ＪＹＭＭＴ（Ｌ）のクレナウ−処理された−２.２ｋｂ
ＢｇｌII−ＥｃｏＲＩフラグメントを、ブラントエンド
結紮により、ＣｌａＩを用いて消化されているプラスミ
ドｐＭＴＩ−２３１２ＤＮＡのＣｌａＩ部位（実施例
４）中に挿入させ、そしてクレナウおよびＣＩＡＰで処
理して、プラスミドｐＭＴＩ−２３２３を製造した（図
１０ａおよび１０ｂ）。プラスミドｐＭＴＩ−２３２３
は二段階スクリーニング工程で選択された。最初に、ブ
ラントエンド結紮からの被転換体プラスミドを探針とし
ての32Ｐの標識が付いているｐＪＹＭＭＴ（Ｌ）の挿入
フラグメント（−２.２ｋｂＢｇｌII−ＥｃｏＲＩ）を
用いる集落ハイブリッド化によりスクリーニングした。
ベクトルだけ（挿入部なし）である被転換体プラスミド
の背景が高い時には、集落ハイブリッド化を種々のここ
に開示されている構成体をスクリーニングする際に第一
段階として使用した。第二スクリーニング段階では、希
望するプラスミドを陽性にハイブリッド化された集落か
ら制限エンドヌクレアーゼ消化されたＤＮＡのミニプレ
プ分析により選択した。ｐＭＴＩ−２３２３（−１３.
３ｋｂ）に関しては、ＨｉｎｄIIIを使用するミニプレ
プ分析が−７.７、−４.４および−１.３ｋｂのフラグ
メントを示した。
【００６７】メタロチオネインＲＮＡシグナルを利用し
そしてＡＰＰ−７７０またはＡＰＰ−７５１を表示する
小遺伝子は、それぞれｐＭＴＩ−３５２１またはｐＭＴ
Ｉ−３５２４（実施例３）を用いるＡｃｃＩ−ＢｇｌII
フラグメント交換（図１０ａ）により製造できる。特
に、ｐＭＴＩ−３５２１の−１.８ｋｂＡｃｃＩ−Ｂｇ
ｌIIフラグメントはｐＭＴＩ２３２３のＡｃｃＩ−Ｂｇ
ｌII部位に挿入されて、ｐＭＴＩ−２３２３の−１.５
ｋｂＡｃｃＩ−ＢｇｌIIフラグメントを置換して、プラ
スミドｐＭＴＩ−２３３１を製造する（図１０ａ）。例
えば、ｐＭＴＩ−２３３１に関すると、ｐＭＴＩ−２３
２３ＤＮＡをＡｃｃＩおよびＢｇｌIIを用いて消化さ
せ、そして−１１.８ｋｂＡｃｃＩ−ＢｇｌIIフラグメ
ントをゲル−精製し、ＣＩＡＰで処理し、そしてｐＭＴ
Ｉ−３５２１ＤＮＡからゲル−精製された−１.８ｋｂ
ＡｃｃＩ−ＢｇｌIIフラグメントを結紮させた。結紮混
合物を使用して、大腸菌ＤＨ５α細胞を転換させた。希
望するプラスミドであるｐＭＴＩ−２３３１（−１３.
３ｋｂ）をミニプレプ分析により同定した。ＳｃａＩを
用いて、ｐＭＴＩ−２３３１のミニプレプ分析は−９.
０および−５.０ｋｂのフラグメントを示した。 ２.ＡＰＰＣ−末端フレームシフト変異体を表示する別
の小遺伝子 メタロチオネインＲＮＡシグナルを利用しそして切断さ
れたＡＰＰ蛋白質を表示する小遺伝子を、ＳＶ４０ＲＮ
Ａシグナルを含有している小遺伝子ｐＭＴＩ−２３２２
（実施例６、図８ａ）を用いるフラグメント交換により
製造した。特に変異体４０−１を含有しているｐＭＴＩ
−２３２２の−０.７ｋｂＢｇｌII−ＣｌａＩフラグメ
ント（実施例６）をｐＭＴＩ−２３１２（実施例４、図
７ａ）中に、ｐＭＴＩ−２３１２の−１０.５ｋｂＢｇ
ｌII−ＣｌａＩフラグメント（これはゲル−精製されそ
して結紮の前にＣＩＡＰで処理されている）を用いるｐ
ＭＴＩ−２３２２の−０.７ｋｂフラグメントの結紮に
より、挿入した。ＨｉｎｄIIIを用いる−１１.２ｋｂｐ
ＭＴＩ−２３２６ａのミニプレプ分析は、−７.８およ
び−３.４ｋｂのフラグメントを示した。次に、ｐＪＹ
ＭＭＴ（Ｌ）の−２.２ｋｂＢｇｌII−ＥｃｏＲＩメタ
ロチオネインフラグメントをｐＭＴＩ−２３２６ａのＣ
ｌａＩ部位中にブラントエンド結紮により挿入してｐＭ
ＴＩ−２３２６ａを製造した。ＨｉｎｄIIIを用いる−
１３.４ｋｂｐＭＴＩ−２３２６ＤＮＡのミニプレプ分
析は、−７.７、−４.４および−１.３ｋｂのフラグメ
ントを示した。一方、プラスミドｐＭＴＩ−２３２６を
一段階フラグメント交換で製造することもできる。特
に、ｐＭＴＩ−２３２２の−０.６ｋｂＢｇｌII−Ｓｐ
ｅＩフラグメント（実施例６、図８ａ）を直接ｐＭＴＩ
−２３２３中に挿入して、ｐＭＴＩ−２３２３の−０.
６ｋｂＢｇｌII−ＳｐｅＩフラグメントを置換して、ｐ
ＭＴＩ−２３２６を製造することができる（図１０
ａ）。別の小遺伝子を、ｐＭＴＩ−２３２３と別の切断
形のＡＰＰ−６９５にコード付けする構成体との間の同
様なＢｇｌII−ＳｐｅＩ交換により製造することもでき
る（実施例６および７）。 ３.Ｃ−１００（プラスミドｐＭＴＩ−２３２７）およ
びＭＣ−１００（プラスミドｐＭＴＩ−２３３７）ＡＰ
Ｐ変異体を表示する別の小遺伝子 メタロチオネインＲＮＡシグナルを利用しそしてＣ−１
００と称された変異体（遺伝子生成物IV、図４ｂ）用の
コード付けをする小遺伝子を、ｐＭＴＩ−２３２３の−
１.８ｋｂＮｒｕＩ−ＢｇｌIIフラグメント（この実施
例、部分Ａ）をブラントエンド結紮により欠失させてプ
ラスミドｐＭＴＩ−２３２７を発生させることにより、
製造した（図１１ａ）。プラスミドｐＭＴＩ−２３２３
ＤＮＡをＮｒｕＩおよびＢｇｌIIを用いて消化させ、−
１１.５ｋｂフラグメントをゲル−精製し、クレナウで
処理し、結紮させ、そして大腸菌ＤＨ５α細胞を転換さ
せるために使用した。被転換体プラスミドをミニプレプ
分析によりスクリーニングし、そして希望するプラスミ
ドｐＭＴＩ−２３２７を選択した。ＨｉｎｄIIIを用い
るｐＭＴＩ−２３２７ＤＮＡのミニプレプ分析は、−
７.７、−２.６および−１.３ｋｂのフラグメントを示
した。翻訳開始コドンであるＡＴＧは直接Ｃ−１００中
のＡ４配列の最初のコドンに進化する。
【００６８】ＭＣ−１００と称されている変異体を表示
する小遺伝子（遺伝子生成物Ｖ、図４ｂ）もプラスミド
ｐＭＴＩ−２３２３から製造されて、ｐＭＴＩ−２３３
７を製造した（図１１ａおよび１１ｂ）。特に、ｐＭＴ
Ｉ−２３２３の−１１.６ｋｂフラグメントのゲル精製
によりｐＭＴＩ−２３２３の−１.７ｋｂＫｐｎＩ−Ｂ
ｆｌIIフラグメントを欠失させそして合成オリゴヌクレ
オチド結合剤であるｓｐ−ｓｐａｃｅｒ−Ａ４を用いて
結紮させることにより、ｐＭＴＩ−２３３７を製造し
た。結合剤であるｓｐ−ｓｐａｃｅｒ−Ａ４はＡＰＰ−
６９５中の位置２０７におけるＫｐｎＩ部位と位置１９
１５における−ＢｆｌII部位との間に挿入され、そして
それは下記の配列を有していた： 5′-GGACGGAGGA-3′ 10量体 3′-CATGCCTGCCTCCTCTAG-5′ 18量体 ｓｐ−ｓｐａｃｅｒ−Ａ４を含んでいる２種のオリゴヌ
クレオチド配列を（アプライド・バイオシステムス・イ
ンスツルメントおよび製造業者の推奨方法、モデル番号
３８０ＡＤＮＡ合成器を使用して）合成し、キナーゼ処
理し、そして一般的方法に従い焼還し、その後に、ｐＭ
ＴＩ−２３２３のゲル−精製された−１１.６ｋｂＫｐ
ｎＩ−ＢｇｌIIフラグメントを用いて結紮させた。Ｈｉ
ｎｄIIIを用いるｐＭＴＩ−２３３７ＤＮＡのミニプレ
プ分析は、−７.７、−２.６および−１.３ｋｂのフラ
グメントを示した。
【００６９】膜中への変異体蛋白質の直接的翻訳および
挿入用に、ＭＣ−１００はＡＰＰの１７個の残存シグナ
ルペプチドを必要とした。シグナルペプチドは分裂さ
れ、そして膜挿入中に除去された。ＭＣ−１００のヌク
レオチドおよびアミノ酸配列は図１２に示されている。 ４.Ａ４ペプチドを表示する別の小遺伝子（プラスミド
ｐＭＴＩ−２３４１） Ａ４ペプチドを表示するためのメタロチオネインＲＮＡ
シグナルを利用する小遺伝子（遺伝子生成物VIIまたは
ｓｐ−Ａ４、図４ｂ）を、プラスミドｐＭＴＩ−２３２
６の−１１.６ｋｂＫｐｎＩ−ＢｇｌIIフラグメント
（この実施例、部分Ａ,２）を欠失させそしてｓｐ−ｓ
ｐａｃｅｒ−Ａ４結合剤（上記のＡ,３に記載されてい
る）を用いて結紮させて、プラスミドｐＭＴＩ−２３４
１を製造した。小遺伝子ｐＭＴＩ−２３４１はｓｐ−Ａ
４を製造し、それはＡ４ペプチドをＡＰＰシグナル配列
と結合させた。ｓｐ−Ａ４のヌクレオチドおよびアミノ
酸配列を図１３に示す。 Ｂ.メタロチオネイン−誘導された促進剤を用いるＡＰ
Ｐ小遺伝子 遺伝子を正常に表示しない細胞および組織中でＡＰＰ
（またはＡＰＰの誘導体）を表示する遺伝子交換性ハツ
カネズミの製造は、優性表現型をもたらすであろう。新
規な表現型はＡＰＰの機能のより良好な理解を促進させ
るであろう。この端部には一連の小遺伝子が構成されて
おり、それらの小遺伝子はハツカネズミのメタロチオネ
イン遺伝子促進剤の調節下にある（図１４）。 １.ＡＰＰ−６９５、ＡＰＰ−７７０およびＡＰＰ−７
５１を表示する別の小遺伝子 メタロチオネイン促進剤を利用しそしてＡＰＰ−６９５
を表示する小遺伝子は下記の如くして製造された。プラ
スミドｐＭＴＩ−２３０１ＤＮＡ（実施例４）をＨｉｎ
ｄIIIを用いて消化させ、クレナウおよびＣＩＡＰで処
理した。プラスミドｐＪＹＭＭＴ（Ｔ）ＤＮＡ（上記の
Ａ部）をＥｃｏＲＩを用いて消化させた。−４.０ｋｂ
ＥｃｏＲＩフラグメントをゲル−精製し、クレナウで処
理し、そして上記の如く処理されたｐＭＴＩ−２３０１
ＤＮＡとブラントエンド結紮させた。希望する被転換体
プラスミドはｐＭＴＩ−２３２８（−６.７ｋｂ）と称
された。次の段階で、このようにして得られたｐＭＴＩ
−２３２８ＤＮＡをＢｇｌIIを用いて消化させ、クレナ
ウおよびＣＩＡＰで処理し、ゲル−精製し、そして次に
ｐＭＴＩ−２３１４（−１１.８ｋｂ、実施例４）の−
２.８ｋｂゲル−精製されたＳｍａＩ−ＨｉｎｄIIIフラ
グメントとブラントエンド結紮させた。被転換体プラス
ミドをミニプレプ分析によりスクリーニングし、そして
希望すプラスミドであるｐＭＴＩ−２３２９（図１４）
を選択した。ＥｃｏＲＩを使用するｐＭＴＩ−２３２９
ＤＮＡのミニプレプ分析は、−３.７、−３.１および−
２.７ｋｂのフラグメントを示した。
【００７０】ｐＭＴＩ−２３２９からのメタロチオネイ
ン促進剤を利用しそしてＡＰＰ−７７０またはＡＰＰ−
７５１を表示する小遺伝子を、それぞれｐＭＴＩ−２３
１９（またはｐＭＴＩ−２３３１もしくはｐＭＴＩ−２
３４２）或いはｐＭＴＩ−２３２０（またはｐＭＴＩ−
２３４５）とのフラグメント交換により製造した。特
に、−７.４ｋｂＡｃｃＩ−ＳｐｅＩフラグメントをゲ
ル−精製し、そしてｐＭＴＩ−２３１９またはｐＭＴＩ
−２３３０の−２.４ｋｂＡｃｃＩ−ＳｐｅＩフラグメ
ントと結紮させて、それぞれＡＰＰ−７７０の表示用の
ｐＭＴＩ−２３３３およびＡＰＰ−７５１表示用のｐＭ
ＴＩ−２３３４を生成した。 ２.同様なフラグメント交換により、メタロチオネイン
促進剤を利用しそして切断されたＡＰＰ蛋白質を表示す
る小遺伝子を構成した。特に、変異体４０−１（実施例
６）を含有しているｐＭＴＩ−２３２２（またはｐＭＴ
Ｉ−２３４３もしくはｐＭＴＩ−２３２６）の−２.１
ｋｂＡｃｃＩ−ＳｐｅＩゲル−精製されたフラグメント
を上記のｐＭＴＩ−２３２９の−７.４ｋｂＡｃｃＩ−
ＳｐｅＩゲル−精製されたフラグメントと結紮させた。 ３.ＭＣ−１００ＡＰＰ変異体を表示する別の小遺伝子 メタロチオネイン促進剤を使用するＭＣ−１００変異体
（上記のＡ部）の表示用の別の小遺伝子も製造すること
ができる。例えば、ｐＭＴＩ−２３２９の−１.７ｋｂ
ＫｐｎＩ−ＢｇｌIIフラグメントを、ＫｐｎＩおよびＢ
ｇｌIIを用いる消化、その後の−７.８ｋｂＫｐｎＩ−
ＢｇｌIIフラグメントのゲル精製、および最後のｓｐ−
ｓｐａｃｅｒ−Ａ４（上記のＡ部）を用いる結紮によ
り、欠失させることができる。希望するプラスミドは配
列分析により確認された。
【００７１】実施例１０ ゲノム性ＡＰＰ−誘導されたＲＮＡ処理シグナルを有す
るＡＰＰ小遺伝子 人間のＡＰＰ遺伝子から誘導されたＲＮＡ処理シグナル
を利用するＡＰＰ小遺伝子は、上記の実施例４−８中に
記載されているＳＶ４０誘導されたＲＮＡ処理シグナル
を利用する小遺伝子または上記の実施例９中に記載され
ているメタロチオネイン遺伝子誘導されたシグナルを利
用する小遺伝子と比較して、遺伝子交換ハツカネズミ中
ではるかに効率的に表示されるであろう。従って、人間
のＡＰＰ遺伝子のＲＮＡポリアデニル化シグナルが利用
されている小遺伝子構成が製造された。これらの製造用
の人間ＡＰＰゲノム性配列の原料は、プラスミドｐＶＳ
−１であった。プラスミドｐＶＳ−１は人間ＡＰＰ遺伝
子の−４.２ｋｂゲノム性クローンであり、それは図１
５ａ中に示されている方向でｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部
位に挿入される−１.５ｋｂＥｃｏＲＩゲノム性フラグ
メントからなっており、その結果、ＡＰＰポリアデニル
化シグナルは−１.３ｋｂＳｐｈＩフラグメントとして
回収することができた。−１.５ｋｂＥｃｏＲＩフラグ
メントは人間ＡＰＰの末端エキソンの３′およびＡＰＰ
ポリアデニル化シグナルを包含しており、そして下記の
如くして単離された。人間染色体２１ＤＮＡ（Ａ.Ｔ.
Ｃ.Ｃ.から受け入れ番号ＬＡ２１ＮＳ０１として得られ
る）のチャロン２１Ａラムダ・ライブラリーを探針とし
て標識付けられたプラスミドｐＦＣ４からの小さいＳｍ
ａＩ−ＳｐｈＩフラグメント（ヌクレオチド３１０２−
３２６９）を用いて３′−末端ゲノム性配列に関してス
クリーニングした。−１.５ｋｂＡＰＰゲノム性フラグ
メントのヌクレオチド配列は図１６中に示されている。
ｐＶＳ−１から誘導されたＡＰＰＲＮＡシグナルを利用
する別の一連の小遺伝子を製造した。これらの別の小遺
伝子の多くはＡＰＰ構成部のｐＮｏｔＳＶ２ｎｅｏ亜ク
ローンを用いるフラグメント交換により製造した。これ
らのｐＮｏｔＳＶ２ｎｅｏ亜クローンは、一般的なＰｖ
ｕＩおよびＳｐｅＩ制限酵素部位の存在のために、フラ
グメント交換により配列領域を交換するために利用され
た。実施例４−８に記載されているＡＰＰ小遺伝子の多
くのＮｏｔＩフラグメントをｐＮｏｔＳＶ２ｎｅｏに亜
クローン化させると（図１７および１８ａ参照）、ＡＰ
Ｐ表示はＣＯＳ細胞の一時的トランスフェクション中に
測定できるであろう（グルツマン(Gluzman)、１９８
１、セル(Cell)、２３：１７５−１８２）。プラスミド
ｐＮｏｔＳＶ２ｎｅｏ（図１７）は、ｐＳＶ２−ｎｅｏ
（Ａ.Ｔ.Ｃ.Ｃ.から受け入れ番号３７１４９として得ら
れる）の独特なＢａｍＨＩ部位を結合剤（ＮＥＢカタロ
グ番号１０４５）を使用してＮｏｔＩ部位に転化させる
ことにより、製造された。プラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏ
をＢａｍＨＩを用いて消化し、クレナウおよびＣＩＡＰ
で処理し、そして供給業者により推奨されているＮｏｔ
Ｉ結合剤と結紮させた。別の小遺伝子の製造で使用され
るＡＰＰ構成体のｐＮｏｔＳＶ２ｎｅｏ亜クローンは下
表Ｉおよび図１８ａ中にまとめられている。表Ｉに挙げ
られているｐＶＳ−１からのＡＰＰゲノム性ＲＮＡ処理
シグナルを利用するＡＰＰ小遺伝子のそれぞれの構成体
を以下に記載する。
【００７２】
【表１】 Ａ.ＡＰＰ−６９５、ＡＰＰ−７７０およびＡＰＰ−７
５１を表示する別の小遺伝子（プラスミドｐＭＴＩ−２
３３９、ｐＭＴＩ−２３４２およびｐＭＴＩ−２ ３４
５） ＡＰＰ−６９５を表示するために設計された小遺伝子構
成体は、ｐＶＳ−１からの−１.３ｋｂＳｐｈＩフラグ
メントをｐＭＴＩ−２３１２（実施例４）のＳｐｈＩ部
位中に挿入してｐＭＴＩ−２３３９（図１５ａおよび１
５ｂ）を発生させることにより、製造された。ＡＰＰ−
７７０形のＡＰＰを表示する小遺伝子ｐＭＴＩ−２３４
２は、ｐＭＴＩ−２３６３（表Ｉ、図１８ａ）の−６.
９ｋｂＰｖｕＩ−ＳｐｅＩフラグメントをｐＭＴＩ−２
３６９（図１９）のＰｖｕＩ−ＳｐｅＩフラグメント中
に挿入することにより、製造された。プラスミドｐＭＴ
Ｉ−２３６９それ自体は、ｐＭＴＩ−２３３９の−９.
８ｋｂＮｏｔＩフラグメントをｐＮｏｔＳＶ２ｎｅｏ
（表Ｉおよび図１９）中に挿入することにより、製造し
た。ＡＰＰ−７５１形のＡＰＰを表示する小遺伝子ｐＭ
ＴＩ−２３４５も同様にして、ｐＭＴＩ−２３６８（表
Ｉ）の−６.９ｋｂＰｖｕＩ−ＳｐｅＩフラグメントを
ｐＭＴＩ−２３６９（表Ｉ）の−８.８ｋｂＰｖｕＩ−
ＳｐｅＩフラグメント中に挿入することにより、製造し
た。 Ｂ.Ｃ−末端フレームシフト変異体を表示するための別
の小遺伝子 １.変異体４０−１（プラスミドｐＭＴＩ−２３４３） ４０−１フレームシフト変異体を表示する小遺伝子ｐＭ
ＴＩ−２３４３を、フラグメント交換により製造した。
ｐＭＴＩ−２３６１（表Ｉ、図１８ａ）の−６.７ｋｂ
ＰｖｕＩ−ＳｐｅＩフラグメントをｐＭＴＩ−２３６９
（図１９）中に挿入した。 Ｃ.ＭＣ−１００変異体用の別の小遺伝子 ＭＣ−１００欠失変異体を表示する小遺伝子ｐＭＴＩ−
２３４０を、ｐＭＴＩ−２３３９（図１５ａおよび１５
ｂ）の−１.７ｋｂＫｐｎＩ−ＢｇｌIIフラグメントを
欠失させそして上記の実施例９に記載されているｓｐ−
ｓｐａｃｅｒ−Ａ４を用いて結紮させることにより、製
造した。 Ｄ.Ａ４ペプチド用の別の小遺伝子 Ａ４ペプチドを表示する小遺伝子ｐＭＴＩ−２３４４を
フラグメント交換（図１９）により製造した。ｐＭＴＩ
−２３６５（表Ｉ、図１８ａ）の−５.０ｋｂＰｖｕＩ
−ＳｐｅＩフラグメントをｐＭＴＩ−２３６９（図１
９）の−８.８ｋｂＰｖｕＩ−ＳｐｅＩフラグメント中
に挿入した。
【００７３】実施例１１ ＡＰＰ小遺伝子を表示する遺伝子交換ハツカネズミの製
造および分析 遺伝子交換ハツカネズミは、外因性ＤＮＡをそれらのゲ
ノム中で一体化して含有しているハツカネズミである
（ゴードン(Gordon)およびラドル(Ruddle)、１９８１、
サイエンス(Science)、２１４：１２４４−１２４
６）。それにより一体化されたＤＮＡは、交換遺伝子と
称されている。実施例４−１０に記載されている如くし
て製造されたＡＰＰ小遺伝子を使用して、これらの交換
遺伝子を表示する対応する遺伝子交換性ハツカネズミを
製造することができる。遺伝子交換性ハツカネズミの製
造用の工程の技術的面は、ゴードンおよびラドル、１９
８３、Methods Enzymol.、１０１Ｃ：４１１−４３３、
およびホーガン(Hogan)他、１９８６、ハツカネズミ胚
の処理：研究室手引き(Manipulation of the Mouse Emb
ryo: A Laboratory Manual)、ニューヨーク州コールド
・スプリング・ハーバーのコールド・スプリング・ハー
バー・ラボ、およびそこに引用されている参考文献によ
り広く論じられている主題である。
【００７４】一般的工程は、顕微鏡注入による遺伝子交
換を含んでいる。受精した１−細胞ハツカネズミの胚
を、雄のハツカネズミ（種類：Ｈｓｄ：(ＩＣＲ)ＢＲま
たはＢ６Ｄ２Ｆ1／ＨｓｄＢＲ）と交配させた排卵過度
の雌のハツカネズミ［種類：Ｈｓｄ：(ＩＣＲ)ＢＲ］か
ら解剖した。均質なすなわち同系交配された種類のハツ
カネズミから製造した遺伝子交換性ハツカネズミをＣ５
７ＢＬ／６ＮＨｓｄＢＲ交配相手からの胚を使用して製
造した。胚をホーガン他（上記）中に記載されている如
く試験管内で培養した。顕微鏡注入はデパンフィリス他
（上記）中に記載されている如くして行われた。ＡＰＰ
小遺伝子（表IIに挙げられている）の線状ＮｏｔＩフラ
グメント（寸法は−６-１１ｋｂ）の約１００−５００
コピーを顕微鏡注入ピペット中に充填し、そして１−細
胞ハツカネズミ胚の前核中の１個の中に追い出す。約１
−３ｐｌのＤＮＡ注入フラグメント溶液（約５−１０μ
ｇ／ｍｌの線状ＤＮＡ、０.３ｍＭのＥＤＴＡ、および
１０ｍＭのトリスｐＨ７.５）をそれぞれ１個の細胞胚
の前核中に注入する。注入中に、ハツカネズミ胚は顕微
鏡細胞支持器により定位置に保持されている。次にデパ
ンフィリス他（上記）およびホーガン他（上記）中に記
載されている如くして生存胚を外科的に疑似−妊娠フォ
スターハツカネズミ（種類：Ｈｓｄ：(ＩＣＲ)ＢＲ）に
再移植させた。子孫ハツカネズミは移植後約１９日で生
まれそして子孫の約１０−３０％が遺伝子交換性であり
（すなわち、それらの染色体は注入されたＡＰＰ小遺伝
子の１個以上のコピーを有する）、そして遺伝子交換性
ファウンダーとして示されている。陽性の遺伝子交換性
ハツカネズミは尾の生検ＤＮＡのサザン−ブロットまた
はＰＣＲ分析により示される（下記参照）。遺伝子交換
性ファウンダーハツカネズミに適当な相手、非近交系の
系統背景用には系統：Ｈｓｄ：(ＩＣＲ)ＢＲまたは近交
系の系統背景用にはＣ５７ＢＬ／６ＮＨｓｄＢＲ）、を
交配させて、異型接合体Ｆ１後代を製造する。遺伝子交
換子孫（Ｆ１）を次に近交させてハツカネズミの同型接
合性（交換遺伝子用）線を製造した。マイクロフュージ
（デフォンブルン−方；モンタナ州セントルイスのテク
ニカル・プロダクツ・インターナショナル・インコーポ
レーション）上でホウ珪酸ガラス毛管（外径１ｍｍおよ
び内径０.５８ｍｍ；カリフォルニア州サンラファエル
のスッター・インストルメンツ・カンパニー製、部品＃
Ｂ１００−５８−１５）を用いてガラス製の細胞支持器
を製作した。細胞支持器の先端を火炎で研磨し、そして
それは約５０ミクロンの直径を有していた。顕微鏡注入
ピペットを斜めに切り、そしてそれはそれらの終点で約
２ミクロンの直径を有していた。顕微鏡注入ピペットを
製造するために、ガラス毛管（外径１ｍｍおよび内径
０.７８ｍｍ；スッター・インストルメンツ・カンパニ
ー製、部品＃Ｂ１００−７８−１５）をスッター・イン
ストルメンツ・カンパニー・プラー（モデル＃Ｐ−８０
／ＰＣ）上で引っ張りそして次に先端をスッター・マイ
クロピペット・ベヴェラー（モデル＃ＢＶ−１０；斜め
切り角度約２５°−３０°）上で斜めに切った。引っ張
られたピペットをヘキサメチルジシラザン（ＨＭＤＳ；
ピアース＃８４７６９）を飽和させたガラス室中で室温
で約８時間にわたり培養することによりシリコーン化す
る。顕微鏡注入をツァイスＩＭ−３５倒立顕微鏡上でノ
マルスキー光学を使用して行った。顕微鏡注入ピペット
および細胞支持器はナリシギ（日本）顕微操作器（モデ
ル＃ＭＯ−１０２Ｍおよび３ＭＮ−２）を用いて調節す
る。顕微鏡注入ピペット中の注入溶液流はエッピンドル
フ微細注入器（モデル＃５２４２）を用いて調節されて
いる。ツァイスＳＶ８解剖顕微鏡を用いて外科的再移植
を行う。
【００７５】ＤＮＡ注入フラグメントをベクトル配列か
らＮｏｔＩ消化およびアガロースゲル電気泳動により単
離した。線状ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルから
ＮＡ４５膜（シュライヘル・アンド・シュエル、カタロ
ブ番号２３４１０）上での電気泳動により回収した。Ｎ
ｏｔＩ線状ＤＮＡフラグメントを膜から製造業者の指示
に従い回収した。臭化エチジウムをＤＮＡ溶液からイソ
プロパノール（飽和された緩衝液、１ｍＭのＥＤＴＡお
よび１０ｍＭのトリス、ｐＨ７.８）を用いて抽出し
た。半量の７.５Ｍ酢酸アンモニウムそして次に２.４容
量の無水エタノールの添加により、ＤＮＡを沈澱させ
た。ＤＮＡペレットをＴＥ緩衝液（１ｍＭＥＤＴＡおよ
び１０ｍＭトリスｐＨ７.８）中に再懸濁させ、そして
次に酢酸アンモニウムおよびエタノール中で上記の如く
して再沈澱させた。ＤＮＡは合計３−４回再沈澱させ
た。ＤＮＡ注入フラグメントを最後に注入緩衝液（０.
３ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭのトリス、ｐＨ７.
５）中に再懸濁させた。フラグメントのＤＮＡ濃度を、
標準としての既知濃度に対する診断用アガロースゲル上
での臭化エチジウム染色により推定した。この方法で得
られたフラグメントを５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。
【００７６】陽性の遺伝子交換性ハツカネズミは、尾の
生検ＤＮＡのサザーン−ブロットまたはＰＣＲ分析によ
り同定される。サザーン−ブロット分析はウィラク(Wir
ak)他、１９８５、Mol.Cell Biol.、５：２９２４−２
９３５およびマニアシス他（上記）中に記載されている
如くして実施される。尾の生検ＤＮＡのＰＣＲ分析は以
下で記載されている。
【００７７】尾の生検は、各ハツカネズミからの約１ｃ
ｍのハツカネズミの尾を切開することにより行われる。
尾の断片を小さいフラグメントに切断し、そして１.０
ｍｌの尾の抽出緩衝液（０.５ｍｇ／ｍｌのプロテイナ
ーゼＫ、０.５％のＳＤＳ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、お
よび５０ｍＭのトリス、ｐＨ８.０）中で５５℃におい
て１２−１６時間にわたり培養する。次に試料を１.０
ｍｌのフェノール（１ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍＭの
トリス、ｐＨ７.６で平衡化されている）で抽出した。
試料をさらに１.０ｍｌのＣＩＡ（クロロホルム：イソ
アミルアルコール、２４：１）を添加して抽出した。試
料を１０,０００×ｇにおいて室温で１０分間遠心し、
そして０.７ｍｌの水相をエッペンドルフ管に移した。
ＤＮＡを、室温における２時間にわたる１２,０００×
ｇでの遠心により、ペレット化した。エタノールを傾斜
させ、ＤＮＡペレットを１.０ｍｌの７０％エタノール
で洗浄し、そして試料を１２,０００×ｇにおいて室温
で１分間延伸した。ＤＮＡペレットを真空乾燥し、そし
て０.０５ｍｌのＴＭ（１ｍＭのＥＤＴＡおよび１０ｍ
ＭのトリスｐＨ７.６）中に再懸濁させた。試料を５５
℃において５分間培養し、そして一夜冷蔵してＤＮＡを
再水和させた。ＤＮＡ濃度は、分光計中で２６０ｎｍに
おける吸収を読み取ることにより、測定された。
【００７８】尾の生検ＤＮＡのＰＣＲ分析は２組のオリ
ゴヌクレオチド類を使用して行われ、１組（オリゴヌク
レオチド＃１１および＃１２または＃４０および＃４
１）はそれぞれ３２２ｂｐまたは３２０ｂｐＤＮＡフラ
グメントを製造する。これらのオリゴヌクレオチド類は
人間ＡＰＰ小遺伝子からの特定ＤＮＡ配列を増殖させ
る。第２組のオリゴヌクレオチド類（オリゴヌクレオチ
ド類＃６および＃７）が各反応に含まれ、それはＰＣＲ
反応用の内部調節剤として作用しそしてハツカネズミの
リボソーム蛋白質Ｌ３２遺伝子からの１５４ｂｐＤＮＡ
を増殖させた（デュドフ(Dudov)およびペリー(Perry)、
１９８４、セル(Cell)、３７：４５７−４６８）。オリ
ゴヌクレオチド類の配列は下記の如くである： オリゴヌクレオチド＃６： 5′-CCTCGGCCTTTGGTGTGTGTTTTATATGACATGACCCCCTTGA-
3′ オリゴヌクレオチド＃７： 5′-CACCCCTGTTGTCAATGCCTCTGGGTTTCCGCCAGTTTCG-3′ オリゴヌクレオチド＃１１： 5′-ATGAACTTCATATCCTGAGTCCATGTCGGAATTCT-3′ オリゴヌクレオチド＃１２： 5′-GGCAACATGATTAGTGAACCAAGG-3′ オリゴヌクレオチド＃４０： 5′-GGAGGGTGCTCTGCTGGTCTTCAATTACC-3′ オリゴヌクレオチド＃４１： 5′-AAGGGTTTGTCCAGGCATGCCTTCCTCATCC-3′ ＰＣＲ反応条件は、５０μｇ／ｍｌのＤＮＡ、５.０μ
ｇ／ｍｌの各オリゴヌクレオチド、２５単位／ｍｌのＴ
ａｑポリメラーゼ（セツス）、０.２ｍＭのｄＡＴＰ、
０.２ｍＭのｄＧＴＰ、０.２ｍＭのｄＣＴＰ、０.２ｍ
ＭのＴＴＰ、５０ｍＭのＫＣｌ、１.５ｍＭのＭｇＣ
ｌ2、０.０１％のゼラチン、および１０ｍＭのトリス、
ｐＨ８.３であった。多くの場合には、オリゴヌクレオ
チド類は実施例１３中に記載されている如くポリヌクレ
オチドキナーゼを使用して32Ｐで末端標識が付けられて
いた。各オリゴヌクレオチドの比活性は、約２×１０5
ｃｐｍ／μｇであった。ＰＣＲ反応はパーキネルマーＤ
ＮＡ熱循環器中で下記の反応サイクル（ファイルス）を
使用して実施した：連続３−１０秒間／サイクルに関し
て自動延長する、９４℃における１分間、次に５５℃に
おける２分間、次に７２℃における１２分間の２１回の
サイクル、並びにその後の、連続３−１０秒間／サイク
ルに関して自動延長する、９４℃における１分間、次に
５５℃における２分間、次に７２℃における１２分間の
１回のサイクル。ＤＮＡフラグメントを５％ポリアクリ
ルアミドゲル上での電気泳動により分離し、そしてそれ
は臭化エチジウムを用いる染色によりまたは放射線自動
透過写真により可視化された。
【００７９】表IIは、遺伝子交換性ハツカネズミの製造
において有用な多数のＡＰＰ小遺伝子構成体を示してい
る。表IIIは、上記の方法で製造した代表的なＡＰＰ遺
伝子交換性ファウンダーのリストを示している。遺伝子
交換性ファウンダーハツカネズミを交配させて、上記の
如き永久的系統を制定した。表IIにIは、実施例１２、
１３、１４および１５中に記載されている種々の遺伝子
交換性ハツカネズミ中のＡＰＰ小遺伝子のＲＮＡおよび
蛋白質表示もまとめている。
【００８０】
【表２】
【００８１】
【表３】
【００８２】実施例１２ ｌａｃＺレポーター遺伝子を用いる遺伝子交換性ハツカ
ネズミ中のＡＰＰ小遺伝子の組織−特異的表示 組み換え型小遺伝子の設計は、Ａ４−類澱粉症用の遺伝
子交換性ハツカネズミモデルの製造における重要な段階
である。必須因子は、組織−特異性遺伝子表示用に必要
な遺伝子−調節剤部分である。小遺伝子構成体は、ＡＤ
脳中のアミロイドの発生および内因性のハツカネズミＡ
ＰＰ遺伝子の好適に似通っている表示様式と一致する遺
伝子交換性動物中での表示様式を示さなければならな
い。この目的用には、人間のＡＰＰ遺伝子調節剤部分を
実施例１中に記載されている如くして単離し、そしてＡ
ＰＰ小遺伝子の構成体用に利用する。遺伝子交換性ハツ
カネズミ中でのこの人間の調節剤因子の組織特異性を監
視するために、レポーター遺伝子である大腸菌ｌａｃＺ
コード付け用β−ガラクトシダーゼを使用した。このレ
ポーター遺伝子は人間のＡＰＰ遺伝子調節剤部分により
調節される蛋白質表示の簡単な組織化学的局在を可能に
させる。このレポーター遺伝子を使用して、人間ＡＰＰ
遺伝子の５′−端部配列が下記の如き内因性ハツカネズ
ミＡＰＰ遺伝子表示と一致する模様を有する遺伝子交換
性動物のＣＮＳ中での表示に目標つけるのに充分な情報
を得ることが示された。小遺伝子ｐＭＴＩ−２４０２
（図２０）は、ＡＰＰ促進剤を含んでいる人間ＡＰＰ遺
伝子調節剤部分を含む実施例１中に記載されている−
４.６ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントを下記の段階でｌａ
ｃＺレポーター遺伝子と共に融合することにより、製造
した。最初に、クローニングベクトルｐＭＴＩ−２３０
１を製造した。プラスミドｐＭＴＩ−２３０１はＮｏｔ
Ｉ制限位置と接しており独特のＨｉｎｄIIIクローニン
グ部位を含有しており、そしてそれは実施例４に記載さ
れている如くして製造された。第二に、実施例１に記載
されている如き染色体２１ライブラリーから単離された
人間ＡＰＰ遺伝子の５′−端部を包括している−４.６
ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントをブラントエンド結紮によ
りｐＭＴＩ−２３０１のＨｉｎｄIII部位中に挿入して
ｐＭＴＩ−２３０７を製造した。最後に、ｌａｃＺ融合
蛋白質およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有し
ているプラスミドｐＣＨ１２６からの−３.９ｋｂＨｉ
ｎｄIII−ＢａｍＨＩフラグメントのブラントエンド結
紮によりｐＭＴＩ−２３０７のＮｒｕＩ部位中に挿入す
ることにより、ｌａｃＺ遺伝子を含有している小遺伝子
ｐＭＴＩ−２４０２を製造した。プラスミドｐＣＨ１２
６は、ＳＶ４０促進剤（ＰｖｕII−ＨｉｎｄIIIフラグ
メント、ホール(Hall)他、１９８３、J. Mol. Appl. Ge
n.、２；１０１−１０９中の図１参照）が欠失されてい
るがＨｉｎｄIII部位は残っていること（ゴーリング(Go
ring)他、１９８７、サイエンス(Science)、２３５；４
５６−４５８）以外は、ホール他、１９８３、J. Mol.
Appl. Gen.、２；１０１−１０９により記載されている
プラスミドｐＣＨ１１０と同一である。
【００８３】プラスミドｐＭＴＩ−２４０２ＤＮＡをＣ
ｓＣｌ／臭化エチジウム平衡密度勾配で二重精製した。
ＡＰＰ／ｌａｃＺレポーター遺伝子を包括している−
８.６ｋｂ線状ＤＮＡフラグメントをベクトル配列から
ＮｏｔＩを用いて惹起させ、そしてアガロースゲルから
ＮＡ４５紙（ニューハンプシャー州キーンのシュライヘ
ル・アンド・シュエル）を用いて単離した。ＤＮＡをエ
タノール−酢酸アンモニウム中で３回沈澱させ、そして
濾過（０.２μ膜）された注入緩衝液（１０ｍＭのトリ
ス、ｐＨ７.５および０.３ｍＭのＥＤＴＡ；ブリンスタ
ー(Brinster)他、１９８５、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA、８２：４４３８−４４４２）中で６μｇ／ｍｌの濃
度で再懸濁させた。精製されたＤＮＡフラグメントをＨ
ｓｄ：(ＩＣＲ)ＢＲ雌ハツカネズミおよびＢ６Ｄ２Ｆ1
／ＨｓｄＢＲ雄ハツカネズミの１個の細胞胚中に顕微鏡
注入し、そして記されている如く（デパンフィリス他、
１９８８、バイオテクニクス、６：６６２−６８０）Ｈ
ｓｄ：(ＩＣＲ)ＢＲ雌ハツカネズミ中に再移植した。遺
伝子交換性ファウンダーハツカネズミは、尾の生検ＤＮ
ＡのＰＣＲ分析により、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を相補性
である３０ｂｐオリゴヌクレオチド類＃１５および＃１
６並びに内部調節剤オリゴヌクレオチド類＃６および＃
７（実施例１１中に記載されている）を用いて同定され
た。オリゴヌクレオチド類＃１５および＃１６の配列は
下記の如くである： #15 5′-CCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACAT-3′ #16 5′-AATAAATGTGAGCGAGTAACAACCCGTCGGATTCT-3′ 遺伝子交換性ハツカネズミからのＤＮＡをさらに制限酵
素消化およびサザーン−ブロット分析（ウィラク他、１
９８５、Mol. Cell. Bio.、５：２９２４−２９３５）
により分析した。 Ａ.その場でのハイブリッド化 その場でのハイブリッド化技術を使用して、正常ハツカ
ネズミ中でのＡＰＰｍＲＮＡの細胞分布を規定した。他
の種類（人間、霊長類、鼠）の中枢神経系統（ＣＮＳ）
内のＡＰＰｍＲＮＡの分布は、神経単位細胞質に局在す
る多数のＣＮＳＡＰＰｍＲＮＡを用いてあらかじめ測定
されていた。これらの実験のために、生後４−５週間の
ハツカネズミに麻酔をかけ、そして０.０８Ｍ燐酸塩緩
衝液、ｐＨ７.６中の４％のパラホルムアルデヒドを灌
流させた。その後の組織を除去し、そして標準的工程に
より処理してパラフィンとした：脳半球および間脳、脳
橋、髄質、頚部および腰部脊髄、三叉神経、並びに肝
臓。個々のハツカネズミからの組織を１個の塊中に埋め
た。切片を６μｍの厚さに切断し、そして出版されてい
る工程（トラップ(Trapp)他、１９８７、Proc. Natl. A
cad. Sci. USA、８４：７７７３−７７７７；トラップ
他、１９８８、J. Neuro Sci.、８：３５１５−３５２
１）に従いハイブリッド化した。簡単に述べると、予備
−ハイブリッド化処理は３７℃における２０分間にわた
る０.２Ｎ ＨＣｌおよび１５分間にわたる２５μｇ／ｍ
ｌのプロテアーゼＫからなっていた。スライドを、クレ
ナウ工程により35Ｓで標識が付けられている０.２ｎｇ
／μｌの単一−ストランドの全長人間ＡＰＰｃＤＮＡ
（比活性、２×１０9ｃｐｍ／μｇ）を含有している標
準的緩衝液中で室温において１６時間にわたりハイブリ
ッド化した。切迫洗浄は、室温における３０分間にわた
る０.３ＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび５ｍＭ
のトリス（ｐＨ８.０）を含有している５０％ホルムア
ミド、並びに５５℃における１時間にわたる１ｍＭのＥ
ＤＴＡ中の２回のＳＳＣ（１回のＳＳＣ＝０.３ＭのＮ
ａＣｌ、０.０３Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７.４）
を含んでいる。次にスライドを脱水し、空気乾燥し、乳
化液（コダック、ＮＴＢ−３）中に浸漬し、７日間露光
し、自動放射透過写真用に現像し、そしてヘモトキシリ
ンで対比染色した。部分をツァイス・アキシオフォトを
用いて暗い背景および明るい背景光度を使用して写真を
とった。特定の脳部分および神経単位亜集団を出版され
ている基準に従い同定した（シドマン(Sidman)他、１９
７１、Atlas of the MouseBrain and Spinal Cord、マ
サチュセッツ州ケンブリッジのハーバード大学出版）。
全ての脳部分中の神経単位の一般的分布を反映している
集団中で生じたＡＰＰｍＲＮＡを表示している銀粒子を
研究した（図２１）。例えば、海馬の三角骨層および歯
状回の粒状層中に存在してる神経単位核周囲部が強く標
識付けられた（図２１ａ）。皮質下部白色物質中の海馬
生成の他の層中ではかなり少ないハイブリッド化シグナ
ルが検出された。脳皮質は相当な水準のＡＰＰｍＲＮＡ
を含有しており（図２１ａ）、そして種々の皮質性区域
（例えば後頭、側頭、および前頭）中の標識模様は種々
の層中の神経単位核周囲部の分布を反映している。２、
３個の神経単位を含有している層Ｉは全ての皮質性部分
で最も低いハイブリッド化シグナルを有していた。脳皮
質の切片中では、プルキニエ細胞および粒状細胞がＡＰ
ＰｎＤＮＡにより標識が付けられていた（図２１ｂ）。
三叉神経節（末梢神経系統から）の切片をＡＰＰｎＤＮ
Ａを用いてハイブリッド化し、そして集団状で生じる核
周囲部は強く標識が付けられたがＰＮＳ中の有髄鞘性繊
維器官中ではほとんどハイブリッド化シグナルは見られ
なかった（図２１ｃ）。ＡＰＰｍＲＮＡは肝臓の切片で
は検出されず（図２１ｄ）、この発見はノザーン−ブロ
ット分析と一致している（ヤマダ(Yamada)他、１９８
９、Biochem. Biophys. Res. Commun.、１５８：９０６
−９１２）。銀粒子の分布は神経単位の核周辺細胞質内
で濃縮された（図２１ｅ）。わずかな銀粒子が神経単位
核上に存在しているかまたは向神経中に拡散されてい
た。 Ｂ.β−ガラクトシダーゼの組織化学的検出 ＡＰＰ／ｌａｃＺレポーター遺伝子を有する遺伝子交換
性ハツカネズミ中のβ−ガラクトシダーゼの光学的顕微
鏡による組織化学的検出用に、生後４−５週間の遺伝子
交換性ハツカネズミおよび対照用の正常ハツカネズミに
麻酔をかけ、そして４％パラホルムアルデヒドおよび
０.０８Ｍ燐酸塩緩衝液、ｐＨ７.６を灌流させた。ＣＮ
Ｓ、三叉神経、および肝臓を取り出し、そして４℃にお
いて一夜固定させた。これらの組織を０.５ｃｍの厚さ
の片に切断し、それらをβ−ガラクトシダーゼ用に組織
化学的に染色するかまたは染色前に振動マイクロトム上
で２０μｍの厚さに分割した。
【００８４】組織を３０℃に１８−２４時間にわたり保
たれていた反応緩衝液［２.７ｍＭのＫＨ2ＰＯ4、８.０
ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4・Ｈ2Ｏ、ｐＨ７.６、２.７ｍＭの
ＫＣｌ、１４０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＭｇＣｌ2、
２２.５ｍＭのＫ4Ｆｅ(ＣＮ)6、２５.０ｍＭのＫ3Ｆｅ
(ＣＮ)6、０.２７ｍｇ／ｍｌのナトリウムスペルミジ
ン、０.５ｍｇ／ｍｌのＸ−ガル（ジエチルホルムアミ
ド中の２０ｍｇ／ｍｌの原料）、０.０２％のＮＰ−４
０、および０.０１％のナトリウムデオキシコレート］
中で培養することにより、β−ガラクトシダーゼ活性を
組織化学的に検査した。
【００８５】上記の組織化学的方法により測定された成
長した遺伝子交換性ハツカネズミ中でのＡＰＰ促進剤−
ｌａｃＺレポーター遺伝子の組織および細胞表示模様
は、内因性ハツカネズミおよび外因性人間ＡＰＰｍＲＮ
Ａの分布と非常に似ていた。遺伝子交換性ハツカネズミ
中のレポーター遺伝子の表示用小遺伝子ｐＭＴＩ−２４
０２は上記の如くして、ｌａｃＺ融合蛋白質およびＳＶ
４０ポリアデニル化シグナルをコード付けする配列を人
間ＡＰＰ遺伝子の５′−端部を包括している−４.５ｋ
ｂゲノム性フラグメント中に挿入することにより、製造
された。ゲノム性フラグメントは、最初の転写出発部位
に対する２８３１ｂｐの配列５′、エキソンＩ、および
約１.６ｋｂの第一イントロンを含有していた。無傷の
レポーター遺伝子の複数の頭から尾までの一体性を有す
る遺伝子交換性ハツカネズミの３本の線を同定した（表
III）。３本の線の組織分布から、１本の線ＢＥ８０３
がＣＮＳ全体にわたり強いβ−ガラクトシダーゼ表示を
示したが２本の線（ＢＥ１８０５およびＢＥ３００２）
はそれより低い水準の表示を示したことが、示された。
【００８６】成長したＢＥ８０３ハツカネズミの脳中で
は、染色は高濃度の神経単位核周囲部を有する部分で濃
縮された（図２２および２３ａ−ｃ）。すなわち、脳皮
質、歯状回、脳底神経節、視床およびの海馬部分は強く
染色された。例えば脳梁並びに内包および外包の如き隆
起白色物体痕跡は染色されなかった。脳幹および脊髄組
織の染色は、内因性白色ＡＰＰｍＲＮＡと同様な模様で
観察された。β−ガラクトシダーゼは、対照用として使
用された正常ハツカネズミ脳の切片中では検出されなか
った（図２３ｄ）。
【００８７】高濃度の神経単位核周囲部を含有している
脳皮質の部分は、三叉神経節中の神経単位周囲部の如
く、β−ガラクトシダーゼに関して陽性であった（図２
４ａおよび２４ｂ）。ＢＥ８０３ハツカネズミからの小
脳および三叉神経（図２４ｃ)並びに肝臓切片（図２４
ｄ）中の白色物質痕跡は、β−ガラクトシダーゼに関し
て陰性であった。数匹のＢＥ８０３遺伝子交換性ハツカ
ネズミからの組織切片中では、同一のβ−ガラクトシダ
ーゼ染色模様が観察された。β−ガラクトシダーゼの細
胞および亜細胞分布は光学的顕微鏡工程によりいくつか
の脳部分で測定された。β−ガラクトシダーゼは２０μ
ｍの厚さのヴィブラトーム切片中では組織化学的に局在
していた。これらの部分中で、β−ガラクトシダーゼ反
応生成物は小さい点状で生じており、それらの点は神経
単位核周囲部を含有しているＣＮＳの部分に限定されて
いた。反応生成物は脳皮質の全層中で検出され（図２５
ａ）、層Ｉ中にある偶然の沈着物を含んでいた。ノマル
スキー光学を用いて比較的高い倍率で試験した時には、
β−ガラクトシダーゼ反応生成物は神経単位の核周辺部
分に限定されていた（図２５ｂおよび２５ｃ）。β−ガ
ラクトシダーゼは内皮細胞および細胞核周囲部中では白
色物体痕跡内で検出できなかった。細胞皮質中では、β
−ガラクトシダーゼはプルキニエ細胞の核周辺部分に局
在していた。ヴィブラトーム切片の分析は、脳片中で強
く標識付けられていないＣＮＳ部分中のβ−ガラクトシ
ダーゼの存在も検出した。例えば、海馬のＣＡ−３部分
中の一部であるが全部でない神経単位の一定の弱い染色
が見られた。 Ｃ.β−ガラクトシダーゼの免疫細胞化学的検出 β−ガラクトシダーゼの電子顕微鏡（ＥＭ）免疫細胞化
学的検出のために、生後４−５週間の遺伝子交換性ハツ
カネズミに０.０８Ｍ燐酸塩緩衝液中の２.５％グルタル
アルデヒドおよび４％パラホルムアルデヒドを灌流させ
た。脳を取り出しそして４℃で一夜固定した。脳皮質の
部分（２ｍｍ2）に２.３Ｍ庶糖および３０％ポリビニル
ピロリドンを浸潤させ、検定試料台の上に置き、そして
液体窒素中で凍結させた。超薄凍結部分（−１２０ｎｍ
の厚さ）を約−１１０℃に保たれているライヘルト・ウ
ルトラカット−ＦＣ４超低温ミクロトーム中で切断し
た。切片をフォルムヴァルおよび炭素がコーテイングさ
れている六角形のメッシュグリッドに移し、そして標準
工程の変法を用いて免疫金工程により染色した。免疫染
色後に、グリッドを２.５％のグルタルアルデヒドを含
有しているＰＢＳ中に１５分間入れ、そしてすすいだ。
部分を中性酢酸ウラニルで染色し、その後に、０.３％
の酢酸ウラニルを含有している１.３％のメチルセルロ
ース中に埋めた。グリッドを日立Ｈ６００電子顕微鏡で
試験した。
【００８８】免疫金工程により測定された脳皮質および
他の脳部分中のβ−ガラクトシダーゼの細胞および亜細
胞分布は、電子顕微鏡写真中の大部分の金粒子が神経単
位の核周辺細胞質中に局在していることを示した（図２
５ｄ）。神経膠細胞および内皮細胞は標識付けされてい
なかった。
【００８９】ハツカネズミＡＰＰおよびβ−ガラクトシ
ダーゼのその場でのハイブリッド化、光学的顕微鏡およ
び電子顕微鏡から得られた顕著な結論は、実施例１に記
載されている如くして単離された人間ＡＰＰ遺伝子の
５′−端部を包括している−４.５ｋｂゲノム性フラグ
メントは遺伝子交換性ハツカネズミ中のレポーター遺伝
子である大腸菌ｌａｃＺの細胞−および組織−特異的表
示を与えるのに充分な配列情報を有していたことであ
る。ＣＮＳ中のレポーター遺伝子の表示模様は内因性ハ
ツカネズミＡＰＰ遺伝子の表示模様と著しく良く一致し
ていた。ＡＰＰ促進剤および多分他の調節剤因子も含ん
でいるこの−４.５ｋｂゲノム性フラグメントは、上記
の実施例４−１０中に記載されているほとんど全てのＡ
ＰＰ小遺伝子構成体中に加えられていた。そのような構
成体は実施例１１中に記載されている如き遺伝子交換性
ハツカネズミの製造において特に有用である。ＡＤ病理
学は脳の特定部分に限定されているため、小遺伝子構成
用のそのような適当な遺伝子促進剤および他の調節剤因
子の同定はＡＤ用の遺伝子交換性ハツカネズミモデルの
開発用の重要な段階である（プライス(Price)、１９８
６、Annu. Rev. Neurosci.、９：４８９−５１２）。こ
こに記載されそして同定されている−４.５ｋｂゲノム
性フラグメントは、アミロイドプラークの生成およびＡ
ＰＰ遺伝子の表示模様と一致する細胞および組織特異性
を有する組み換え型ＡＰＰ遺伝子の表示を促進するため
に使用すべき型の調節剤因子である。
【００９０】実施例１３ 遺伝子交換性ハツカネズミ中の人間ＡＰＰｍＲＮＡの表
示 数本の遺伝子交換性ハツカネズミ線は脳組織中で人間Ａ
ＰＰｍＲＮＡを表示する（図２６、２７および４６）。
遺伝子交換性動物中での人間ＡＰＰｍＲＮＡの表示は、
ヌクレアーゼＳ１保護分析（図２６および２７）により
そしてリボ探針分析（図４６）により測定された。 Ａ.ヌクレアーゼＳ１保護分析 Ｓ１ヌクレアーゼは単一−ストランドＤＮＡおよびＲＮ
Ａを消化するが二重−ストランド種は消化しない。従っ
て、相補性ｍＲＮＡ配列でハイブリッド化する特異的32
Ｐ−標識付けされたオリゴヌクレオチド類をＳ１ヌクレ
アーゼによる消化から保護し、そしてポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）の変性により同定すること
ができる。人間特異的オリゴヌクレオチド（オリゴヌク
レオチド＃２９と表示されておりそして以下に記載され
ている）はＳ１検定中でのハツカネズミＡＰＰｍＲＮＡ
に対して焼還された時に約５０ｂｐ−保護されたフラグ
メントを生成するであろう。検定では、人間細胞線であ
るＨｅｌａからのＲＮＡ（Ａ.Ｔ.Ｃ.Ｃ.番号ＣＣＬ２）
を人間ＡＰＰＲＮＡ用の陽性対照として使用し（Ｈｅｌ
ａ細胞はＡＰＰを表示する：ワイデマン(Weidemann)
他、１９８９、セル(Cell)、５７：１１５−１２６）、
そして対照用の非−遺伝子交換性ハツカネズミからのＲ
ＮＡを陰性対照として使用した。
【００９１】人間のＡＰＰｍＲＮＡ配列と相補性である
オリゴヌクレオチド（オリゴヌクレオチド＃２９）また
はハツカネズミのものと相補性であるオリゴヌクレオチ
ド（オリゴヌクレオチド＃３０）を、自動化されたアプ
ライド・バイオシステムス・オリゴヌクレオチド合成器
（モデル３８０Ａ）を使用して合成した。製造業者によ
り提唱されている試薬および処方を用いてオリゴヌクレ
オチド類を製造した。オリゴヌクレオチド＃２９の配列
は、 5′-GAGATAGAATACATTACTGATGTGTGGATTAATTCAAGTTCAGGCA
TCTACTTGTGTTAGAGCACAGCTGGGCGTCCATA-3′ である。この８０ｂｐオリゴヌクレオチドは３′−端部
に１０ｂｐ非−均質配列領域を含有しているため、Ｓ１
消化後に、保護されたオリゴヌクレオチドフラグメント
（約７０ｂｐ）は非−ハイブリッド化オリゴヌクレオチ
ド探針から区別することができる。特定の単一−および
二重−ストランドヌクレオチド配列はＳ１に対するそれ
らの感度で変動性を示すため、保護されたフラグメント
の実際の寸法は実験によってのみ決められる。オリゴヌ
クレオチド＃３０の配列は、 5′-CGCGGGTGGGGCTTAGTTCTGCATTTGCTCAAAGAACTTGTAAGTT
GGATAGGTTCCAAG-3′ である。この６０ｂｐオリゴヌクレオチドは３′−端部
に１０ｂｐ非−均質配列領域を含有しているため、Ｓ１
消化後に、保護されたオリゴヌクレオチドフラグメント
（約５０ｂｐ）は非−ハイブリッド化オリゴヌクレオチ
ド探針から区別することができる。
【００９２】各オリゴヌクレオチドの５′−端部はＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼおよび[ガンマ−32Ｐ]ｄＡＴ
Ｐを用いて32Ｐで標識付けされている。反応条件は下記
の如くである：２００ｎｇのオリゴヌクレオチド、１μ
ｌ（１０,０００単位／ｍｌ）のポリヌクレオチドキナ
ーゼ（ＮＥＢ）、１.０ｍＣｉ[ガンマ−32Ｐ]のｄＡＴ
Ｐ（３０００Ｃｉ／ｎモル；アメルシャムＰＢ１５０６
８）、IXキナーゼ緩衝液（マニアチス他、上記引用文
献）、３７℃における４５分間にわたる培養。導入され
なかったヌクレオチドはゲル−濾過（セファデックスＧ
−５０）により除去された。各探針の特異的活性は、オ
リゴヌクレオチド＃２９、６.０４×１０8ｃｐｍ／μ
ｇ；オリゴヌクレオチド＃３０、５.７２×１０8ｃｐｍ
／μｇであった。
【００９３】Basic Methods in Molecular Biology（デ
ービス(Davis)他、１９８６、エルスヴィア、ニューヨ
ーク、アムステルダム、およびロンドン、１３０−１３
５頁）中に記載されている工程を使用して、ＲＮＡをハ
ツカネズミの脳およびヒラ細胞ペレットから抽出した。
【００９４】５０μｇ／試料の全ＲＮＡを１×１０6ｃ
ｐｍのそれぞれ32Ｐで標識付けされたオリゴヌクレオチ
ド（オリゴヌクレオチド＃２９およびオリゴヌクレオチ
ド＃３０）と混合し、そして次に真空中で乾燥した。Ｒ
ＮＡ／オリゴヌクレオチドペレットを２０μｌのハイブ
リッド化緩衝液（１ｍＭのＥＤＴＡ、０.４ＭのＮａＣ
ｌ、５０％のホルムアミド、および４０ｍＭのパイプス
ｐＨ６.４）中に再懸濁させた。ハイブリッド化をパー
キン・エルマー・セツスＤＮＡ温度循環器（モデル＃Ｐ
ＣＲ−１００００）中で行った。試料を９０℃において
１０分間そして次に７０℃において２０分間培養した。
温度を次に３０℃に達するまで１８分間毎に１℃ずつ下
げた。試料を氷上に置くことにより、反応を終結させ
た。３００μｌのＳ１反応緩衝液（０.２ＭのＮａＣ
ｌ、５ｍＭのＺｎＣｌ2、３０ｍＭの酢酸ナトリウムｐ
Ｈ４.５、および４００単位のＳ１）の添加によりＳ１
ヌクレアーゼ消化を開始させ、そして試料を２０℃で２
時間培養した。２５ｍＭの最終的濃度までＥＤＴＡを添
加することにより、Ｓ１反応を終結させた。試料を等容
量のフェノールでそして次にフェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコール（２４／２４／１）で抽出し
た。１０μｇのｔＲＮＡ、１７５μｌの７.５Ｍ酢酸Ｎ
Ｈ4、および８７５μｌの無水エタノールの添加によ
り、各試料中のオリゴヌクレオチド類を−７０℃におい
て１時間にわたり沈澱させた。オリゴヌクレオチド類を
１０μｌの１０ｍＭのトリスおよび１ｍＭのＥＤＴＡ、
ｐＨ７.６中に再懸濁させた。１０μｌの２Ｘ配列用充
填緩衝液（ＵＳＢ製）の添加および９０℃における３分
間にわたる培養により、試料を変性させた。試料を次に
氷に移し、そして次に１６００Ｖの一定電圧において２
０分間にわたり予備運転されている１０％変性ポリアク
リルアミドゲル（IXＴＢＥおよび７Ｍ尿素）上に充填し
た。試料を１６００Ｖにおいて約１時間電気泳動させ
た。ゲルを乾燥し、そしてオリゴヌクレオチドの泳動を
コダックＸ線フィルムを使用して自動放射透過写真によ
り検出した。
【００９５】図２６は、線ＡＥ３０１、ＡＥ１０１、Ｆ
Ｅ８０１、ＦＥ４０３、ＥＤ１００１、ＥＤ８０１、お
よびＤＨ１０６が脳中の人間ＡＰＰ ＲＮＡを表示する
こと（すなわちＳ１消化後に約７０ｂｐ−保護フラグメ
ントを有すること）を示している。これらの試料中の保
護されたフラグメントの約７０ｂｐ帯の強度は対照用ハ
ツカネズミの脳ＲＮＡ（レーン３）中で観察される背景
より大きい。しかしながら、人間−特異的表示の水準は
内因性ハツカネズミＡＰＰ表示水準と比較して低い。寸
法標識剤に関すると、ゲルレーン１はオリゴヌクレオチ
ド２９および３０（それぞれ９.７×１０2および６.１
×１０2ｃｐｍ）を含有しており、そしてレーン２は１
ｂｐのＤＮＡ配列はしごを含有していた。オリゴヌクレ
オチド２９および３０の両者を焼還して５０μｇの脳Ｒ
ＮＡとし、そして試料を前記の如くＳ１ヌクレアーゼを
用いて消化させた。ゲルは下記のＲＮＡ試料を含有して
いた：レーン３、ハツカネズミの正常脳；レーン４、ヘ
ラ細胞；レーン５、ＡＥ３０１脳；レーン６、ＡＥ３０
２脳；レーン７、ＡＥ６０１脳；レーン８、ＡＥ１０１
脳；レーン９、ＦＥ８０１脳；レーン１０、ＦＥ４０３
脳；レーン１１、ＥＤ１００１脳；レーン１２、ＥＤ１
０６脳；レーン１３、ＥＤ８０１脳；レーン１４、ＪＥ
７１１脳；レーン１５、ＪＥ１００５脳；レーン１６、
ＤＨ１０６脳；レーン１７、ＧＥ１０７脳。
【００９６】図２７は、遺伝子交換性系統ＩＥ５０４、
ＩＥ８０１、ＩＥ３０１、ＩＥ６０６、ＩＥ２０６、Ｄ
Ｍ１０１、ＤＭ４０５、ＤＭ４０６、およびＤＭ６０６
が脳中の人間ＡＰＰ ＲＮＡを表示すること（すなわち
Ｓ１消化後に７０ｂｐ−保護されたフラグメントを有す
ること）を、示している。これらの試料中の保護された
フラグメントの約７０ｂｐ帯の強度は、対照用ハツカネ
ズミの脳ＲＮＡ（レーン３）中で観察される背景より相
当大きかった。しかしながら、人間−特異性表示の水準
は内因性ハツカネズミＡＰＰ表示水準と比較して低い。
寸法標識剤に関すると、ゲルレーン１はオリゴヌクレオ
チド２９および３０（それぞれ９.７×１０2および６.
１×１０2ｃｐｍ）を含有しており、そしてレーン２は
１ｂｐのＤＮＡ配列はしごを含有していた。オリゴヌク
レオチド類２９および３０の両者を焼還して５０μｇの
脳ＲＮＡとし、そして試料を下記の如くしてＳ１ヌクレ
アーゼを用いて消化させた。ゲルは下記のＲＮＡ試料を
含有していた：レーン３、ハツカネズミの正常脳；レー
ン４、ヘラ細胞；レーン５、ＩＥ６０２脳；レーン６、
ＩＥ５０４脳；レーン７、ＩＥ８０１脳；レーン８、Ｉ
Ｅ３０１脳；レーン９、ＩＥ２０５脳；レーン１０、Ｉ
Ｅ６０６脳；レーン１１、ＩＥ２０６脳；レーン１２、
ＩＥ５０５脳；レーン１３、ＩＥ８０３脳；レーン１
４、ＤＭ１０１脳；レーン１５、ＤＭ３０９脳；レーン
１６、ＤＭ４０５脳；レーン１７、ＤＭ４０６脳、レー
ン１８；ＤＭ６０６脳。 Ｂ.リボ探針分析 ＲＮａｓｅＡおよびＲＮａｓｅＴ１は単一−ストランド
ＲＮＡを消化するが二重−ストランドＲＮＡ種は消化し
ない。従って、相補性ｍＲＮＡ配列でハイブリッド化す
る特異的リボ探針（32Ｐで標識付けされた抗−敏感性Ｒ
ＮＡ）はＲＮａｓｅＡおよびＲＮａｓｅＴ１の混合剤に
より消化から保護されており、そして変性ポリアクリル
アミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により同定することが
できる。ブルースクリプトＭ１３ファージミド（ストラ
タゲン、カリフォルニア州サンディエゴ）はＴ７および
Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ用の促進剤と接している複数制
限酵素多重結合剤を含有していた。促進剤は反対方向に
置かれ、そして多重結合剤部分中に挿入される配列に特
異的な32Ｐで標識付けされた抗−敏感性ＲＮＡ探針を転
写させるために利用できる。クローンｐＭＴＩ−２３７
１（実施例１６、部分Ｂ、および図４１）はブルースク
リプトＫＳ＋中に挿入されたＭＣ−１００遺伝子生成物
（遺伝子生成物Ｖ、図４ｂ；図１２および実施例９、部
分Ａ、章３も参照のこと）をコード付けする人間ＡＰＰ
配列を含有している。人間ＡＰＰｍＲＮＡに特異的にハ
イブリッド化するリボ探針が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ
および線状化されたｐＭＴＩ−２３７１（ＨｉｎｃIIで
消化されたファージミド）を鋳型として使用して製造さ
れた。リボ探針は長さが−４０８ｂｐでりそして人間Ａ
ＰＰと相補性である部分は−３７３ｂｐであった。従っ
て、人間のＡＰＰｍＲＮＡでハイブリッド化されたリボ
探針のＲＮａｓｅＡ／ＲＮａｓｅＴ１消化は−３７３ｂ
ｐ−保護されたフラグメントを生じるであろう。ハツカ
ネズミのＡＰＰｍＲＮＡでハイブリッド化されたリボプ
ローブのＲＮａｓｅＡ／ＲＮａｓｅＴ１消化は３７３ｂ
ｐより相当少ない数のフラグメントを生じるであろう。
鋳型を製造し、そして32Ｐで標識付けされたリボ探針
を、（アメルシャム（イリノイ州アーリントン・ハイ
ツ）から得られた６０μＣｉの32Ｐ−ｒＵＴＰ[ｓｐ．
ａｃｔ／：８００ｍＣｉ／ミリモル]を使用して）製造
した。実施例１３、部分Ａに記載されている方法を使用
して、ヘラ細胞系統、正常ハツカネズミの脳、並びに下
記の遺伝子交換性ハツカネズミの系統からの個々の脳：
ＡＥ１０１、ＡＥ３０１、ＣＡ５０７、ＦＡ２０１、Ｆ
Ｅ１００１、ＦＥ４０３、ＩＥ８０１、ＪＡ４０７、Ｊ
Ａ１２０１、ＳＡ１１０、ＳＡ６０２、およびＳＡ７０
６からＲＮＡを製造した。ＲＮＡ試料（２０μｇ）を１
／１０容量の３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５.２および２.
５容量のエタノールを用いて沈澱させた。各ＲＮＡ試料
を２０μｌの１×ハイブリッド化緩衝液（８０％のホル
ムアミド、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６.４、０.４Ｍ
のＮａＣｌ、および１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁させ
た。試料を８５℃において１０分間培養し、そして次に
４５℃で一夜培養した。３５０μｌのリボヌクレアーゼ
緩衝液（１０ｍＭのトリス、ｐＨ７５.５、３００ｍＭ
のＮａＣｌ、および５ｍＭのＥＤＴＡ）の添加により、
ＲＮＡ試料を消化させ、そして３０℃で６０分間培養し
た。各試料に２０μｌの１０％ＳＤＳおよび２.５μｌ
の２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを加えた。試料を
３７℃において１５分間にわたり培養し、そして次にフ
ェノール／イソアミルアルコール／クロロホルムで抽出
した。１０μｇのｔＲＮＡおよび１ｍｌのエタノールの
添加により、試料を沈澱させた。試料を再懸濁させ、そ
して実施例１３、部分Ａ中に記載されている如くして変
性ポリアクリルアミド／尿素ゲル上で電気泳動させた。
図４６に表示されているゲルは下記のＲＮＡ試料を含有
していた：レーン１、ヘラ細胞ＲＮＡ；レーン２、正常
ハツカネズミ；レーン３、ＡＥ３０１；レーン４、ＡＥ
３０１；レーン５、ＡＥ１０１；レーン６、ＣＡ５０
７；レーン７、ＦＡ２０１；レーン８、ＦＥ１００１；
レーン９、ＦＥ４０３；レーン１０、ＩＥ８０１脳；レ
ーン１１、ＪＡ４０７；レーン１２、ＪＡ１３０１；レ
ーン１３、ＳＡ１１０；レーン１４、ＳＡ６０２；レー
ン１５、ＳＡ７０６；レーン１６、ブランク；レーン１
７、リボプローブ（未消化）、およびレーン１８、リボ
探針（未消化）。保護されたリボプローブフラグメント
は図４６に示されている如き自動放射透過写真により検
出された。実験により、下記の遺伝子交換性ハツカネズ
ミ系統が人間のＡＰＰ ＲＮＡ：ＡＥ１０１、ＡＥ３０
１、ＣＡ５０７、ＥＦ１００１、ＩＥ８０１、ＪＡ４０
７、ＪＡ１３０１、ＳＡ６０２、およびＳＡ７０６を表
示することが示された（表III参照）。
【００９７】実施例１４ 遺伝子交換性ハツカネズミ中の人間ＡＰＰおよびＡＰＰ
誘導体類の表示 Ａ.ＡＰＰ−７５１の表示 遺伝子交換性ハツカネズミ系統ＩＥ８０１（表III参
照）は脳中の人間ＡＰＰ−７５１蛋白質を表示する。人
間ＡＰＰ−７５１表示（図２８ｂ）は、人間−特異的モ
ノクローン性抗体（ｍＡｂ）であるｍＡｂ５６−１（実
施例１７参照）を用いるウェスタン−ブロット分析によ
り、遺伝子交換性ハツカネズミ脳の蛋白質抽出物中で検
出された。遺伝子交換性ハツカネズミ脳からの蛋白質抽
出物のウェスタン−ブロットも、人間およびハツカネズ
ミの両者からのＡＰＰ−６９５、ＡＰＰ−７５１および
ＡＰＰ−７７０と反応するｍＡｂ２２Ｃ−１１を用いて
染色した（図２８ａ）。モノクローン性抗体であるｍＡ
ｂ２２Ｃ−１１は、ベイルーサー(Beyruether)博士から
の供与品であった（ヴァイデマン(Weidemann)他、１９
８９、セル(Cell)、５７：１１５−１２６）。
【００９８】図２８ａは下記の試料を含有していた：レ
ーン１、低分子量蛋白質標識剤；レーン２、ＤＨ１０６
脳溶解物；レーン３、ＤＭ６０６脳溶解物；レーン４、
ＪＥ７１１脳溶解物；レーン５、ＩＥ５０８脳溶解物；
レーン６、ＩＥ８０１脳溶解物；レーン７、ＩＥ３０１
脳溶解物；レーン８、正常ハツカネズミ（ＩＣＲ種）脳
溶解物；レーン９、細胞系統ｃＭＴＩ−５３からの媒
体；およびレーン１０、高分子量蛋白質標識剤。
【００９９】図２８ｂは下記の試料を含有していた：レ
ーン１、高分子量蛋白質標識剤；レーン２、細胞系統ｃ
ＭＴＩ−５３；レーン３、正常ハツカネズミ（ＩＣＲ）
脳溶解物；レーン４、ＩＥ３０１脳溶解物；レーン５、
ＩＥ８０１脳溶解物；レーン６、ＩＥ５０８脳溶解物；
レーン７、ＪＥ７１１脳溶解物；レーン８、ＤＭ６０６
脳溶解物；レーン９、ＤＨ１０６脳溶解物；およびレー
ン１０、低分子量蛋白質標識剤。
【０１００】図２８ａは、各脳抽出物がほぼ等量のＡＰ
Ｐ蛋白質を含有していることおよびＡＰＰ−６９５がハ
ツカネズミ脳抽出物中の優性形ＡＰＰであることを示し
ている。細胞外形のＡＰＰ−６９５およびＡＰＰ−７５
１（または７７０）はそれぞれ−９３−１０５ｋＤａお
よび−１１２−１２５ｋＤａの見掛け分子量を有してい
る（ヴァイデマン他、１９８９、上記引用文献、および
パルマート(Palmert)他、１９８９、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA、８６：６３３８−６３４２）。人間ＡＰＰ
−７５１を分泌するハツカネズミ細胞系統（系統ｃＭＴ
Ｉ−５３、実施例１６参照）の培養媒体からの蛋白質が
対照用として含まれている（図２８ｂ、レーン２）。ハ
ツカネズミおよび人間ＡＰＰ−６９５に関するｍＡｂ２
２Ｃ−１１の交差反応性のために、遺伝子交換性ハツカ
ネズミ系統であるＤＭ１０１またはＤＨ１０６のいずれ
が人間ＡＰＰ−６９５を表示するかを決めることができ
ない。
【０１０１】図２８ｂは、遺伝子交換性ハツカネズミ系
統ＩＥ８０１（レーン５）がｍＡｂ５６−１と反応する
蛋白質を表示しそして細胞系統ｃＭＴＩ−５３（レーン
２）により分泌されるＡＰＰ−７５１のものと同等なゲ
ル泳動可動性を有することを示している。非−遺伝子交
換性ハツカネズミ（レーン３）または人間ＡＰＰ−６９
５にコード付けする小遺伝子を有する遺伝子交換性ハツ
カネズミ（ＤＭ１０１およびＤＨ１０６）は、この蛋白
質の免疫染色を示さない。遺伝子交換性ハツカネズミ系
統ＩＥ５０８も交差反応性蛋白質種を表示する。しかし
ながら、この蛋白質の泳動は人間ＡＰＰ−７５１には相
当していない。ＩＥ３０１系統中では人間ＡＰＰ−７５
１が不規則的に表示されるかまたは代謝されそしてＪＥ
７１１系統中ではＡＰＰ−７７０表示は観察されないこ
とがあり得る。
【０１０２】蛋白質は、非−遺伝子交換性の対照用のハ
ツカネズミ（ＩＣＲ種）の脳および下記の系統からの遺
伝子交換性動物の脳から抽出された：ＤＨ１０６、ＤＭ
６０６、ＪＥ７１１、ＩＥ５０８、およびＩＥ３０１。
脳全体を動物から解剖しそして重量を計測して組織量を
推定した。溶解緩衝液（０.２ＭのＮａＣｌ、１％のト
リトンＸ−１００、２ｍＭのＰＭＴＳ（シグマ＃Ｐ−７
６２６）、１ｍＭのＤＦＴ、１Ｘプロテアーゼ抑制剤溶
液、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８.０）をそれぞれの脳に
加えた。プロテアーゼ抑制剤溶液、１００Ｘ、は１ｍｇ
／ｍｌのロイペプチン（シグマ＃Ｌ−２８８４）、１ｍ
ｇ／ｍｌのペプスタチン−Ａ（シグマ＃Ｐ−４６２
５）、１０ＴＩＵ／ｍｌのアプロチニン（シグマ３Ａ−
６０１２）、０.１ｍＭのＥＤＴＡ、および０.２Ｍのト
リス、ｐＨ８.０からなっていた。次に脳組織を−１分
間にわたりポリトロン均質器（モデルＣＨ６０１０）を
用いて均質化させた。各試料を１０,０００ｘｇにおい
て４℃で３０分間遠心し、そして上澄み液（脂質層は除
去された）すなわち「脳溶解物」を−７０℃で貯蔵し
た。細胞系統ｃＭＴＩ−５３用の培養媒体中の蛋白質を
酸沈澱により濃縮した。約１.５ｍｌの氷冷培養媒体を
収穫し、そして１.５ｍｌ部分の氷冷２５％トリクロロ
酢酸（ＴＣＡ）を加えた。試料を１５,０００ｘｇにお
いて室温で１０分間遠心した。蛋白質ペレットを１００
％アセトンで３回洗浄し、そして次に各洗浄後に１５,
０００ｘｇにおいて室温で１０分間遠心した。ペレット
を真空中で−２０秒間乾燥し、１００μｌのＮＲＳＢ緩
衝液（２％のＳＤＳ、５％のベータメルカプトエタノー
ル、５％の充填用染料、１０％のグリセロール、０.１
２５Ｍのトリス、ｐＨ６.８）中に再懸濁させ、そして
５分間沸騰させた。
【０１０３】「脳溶解物」蛋白質およびｃＭＴＩ−５３
細胞上澄み液をポリアクリルアミドゲル電気泳動により
分別し（１０％の走行性ゲルおよび４％の粘着性ゲ
ル）、そして電子ブロッティング技術によりバイオラド
・ミニ−プロテアンII装置を用いてそして製造業者によ
り推奨される工程を用いてインモビロン−Ｐ膜に移し
た。電気泳動前に、１０μｌの人間ＡＰＰ−７５１対照
用細胞上澄み液（細胞系統ｃＭＴＩ−５３）、１μｌの
対照用ハツカネズミ脳溶解物、および２μｌの遺伝子交
換性ハツカネズミ脳溶解物を１Ｘ ＮＲＳＢの添加およ
び５分間の沸騰により変性させた。各ゲルは予備染色さ
れた高分子量および低分子量標準（それぞれＢＲＬカタ
ログ＃６０４１ＬＡおよび＃６０４０ＳＡ）も含んでい
る。
【０１０４】ポリアクリルアミドゲルからインモビロン
−Ｐ膜に移された人間およびハツカネズミのＡＰＰ蛋白
質は、ウエスタン−ブロット染色により検出された。ハ
ツカネズミおよび人間のＡＰＰ−６０５、ＡＰＰ−７５
１およびＡＰＰ−７７０蛋白質はｍＡｂ２２Ｃ−１１を
用いて検出された。人間のＡＰＰ−７５１はｍＡｂ５６
−１を用いて検出され、この抗体はハツカネズミのＡＰ
Ｐ−７５１は認識しない。蛋白質転換後に、インモビロ
ン膜（１２×１２ｃｍ）を５０ｍｌの１Ｘ遮蔽用緩衝液
（０.１５ＭのＮａＣｌ、５％の非脂肪ドライミルク、
および１０ｍＭのトリス、ｐＨ８.０）を用いて室温で
１時間培養した。次に膜に１０ｍｌの「第一」抗体溶液
（２２Ｃ−１１：遮蔽用緩衝液中へのｍＡｂ原料の１：
１０,０００希釈；またはｍＡｂ５６−１：遮蔽用緩衝
液中へのｍＡｂ原料の１：１００希釈）を室温で２時間
染色した。膜を次に遮蔽用緩衝液で洗浄し、そして次に
１５ｍｌの「第二」抗体溶液［アルカリ性ホスファター
ゼと共役された山羊の抗−ハツカネズミＩｇＧ（プロメ
ガ）：遮蔽用緩衝液中への抗体の１：７５００希釈］で
室温で３０分間染色した。膜を次に遮蔽用緩衝液で洗浄
し、そして次にＡＰ緩衝液（０.１ＭのＮａＣｌ、５ｍ
ＭのＭｇＣｌ2、０.１Ｍのトリス、ｐＨ９.５）で洗浄
した。膜を次に「ＡＰ基質」溶液（１５ｍｌのＡＰ緩衝
液、９９μｌのＮＢＴ原料溶液、および４９μｌのＢＣ
ＩＰ原料溶液）で室温で１時間染色した。ＮＢＴ貯蔵溶
液は７０％ジメチルホルムアミド中の５０ｍｇ／ｍｌの
ニトロブルーテトラゾリウム（シグマ＃Ｎ−６８７６）
からなっており、そしてＢＣＩＰ原料溶液は１００％ジ
メチルホルムアミド中の５０ｍｇ／ｍｌの燐酸５−ブロ
モ−４−クロロ−３−インドリルからなっている。ＡＰ
染色反応は、膜を脱イオン水中で洗浄することにより、
測定された。 Ｂ.Ａ４ＡＰＰペプチドの表示 遺伝子交換性ハツカネズミ系統ＡＥ３０１（表III参
照）は小遺伝子ｐＭＴＩ−２３１８（遺伝子生成物VII
I、図４ｂ）を有しており、それはＡＰＰの４２アミノ
酸Ａ４ペプチドをコード付けする（上記の実施例７参
照）。遺伝子交換性ハツカネズミのこの系統は、脳中の
ＡＰＰ ＲＮＡを表示することが示されている（上記の
実施例１３参照）。別の研究では、ＡＥ３０１遺伝子交
換性ハツカネズミが脳の海馬部分中のＡ４凝集を示すこ
とも示された。この遺伝子交換性系統を使用して脳組織
中のＡ４ペプチドの神経毒性を試験することができる。
さらに、遺伝子交換性ハツカネズミ中に存在しているＡ
４凝集は老人性プラーク生成の初期段階を表わしている
かもしれない。従って、これらの遺伝子交換性ハツカネ
ズミはＡＤに罹っている患者において生じる初期の病理
学的事象用のモデルとして使用できる。Ａ４ペプチドの
凝集は、免疫細胞化学分析および電子顕微鏡（ＥＭ）分
析などの数種の方法により示された。 １.Ａ４凝集の免疫細胞化学分析 免疫細胞化学分析用に使用された兎のポリクローン性抗
体（ｐＡｂ）９０−２５、９０−２８および９０−２９
は、標準的方法により製造した。Ａ４ペプチド（ｐＡｂ
９０−２５用にはアミノ酸残基１−２８、そしてｐＡｂ
９０−２８および９０−２９用にはアミノ酸残基１−４
２）の皮下注射をフレウンド佐薬を使用して兎に投与し
た。兎の血清をＡ４ペプチドに対する免疫反応性に関し
てスクリーニングし、そしてｐＡｂ９０−２５、９０−
２８および９０−２９を含む数種が陽性と試験された。
これらの陽性抗体はさらにＡＤ患者からの病理学的人間
脳組織との反応により同定された。ｐＡｂ９０−２５、
９０−２８および９０−２９免疫染色Ａ４アミロイドプ
ラーク（老人性プラーク）は病理学的組織中で見られ
た。
【０１０５】Ａ４ペプチドを有するｐＡｂ９０−２５、
９０−２８および９０−２９の特異性が制定された後
に、これらの抗体を使用してハツカネズミからの脳組織
断面に免疫染色した。トラップ(Trapp)他、１９８３、
J. Neurochem.、４０：４７−５４の方法に従い、パラ
フィン組織を使用して光学的顕微鏡免疫化学法を行っ
た。結果は、図３４、３５、および３６中に示されてい
る如くＡＥ３０１遺伝子交換性ハツカネズミからの脳の
海馬部分の特定区域免疫染色を示した。この免疫細胞化
学法用に使用されたＡＥ３０１＋２０７（Ｆ１）と表さ
れている遺伝子交換性ハツカネズミは、ＡＥ３０１（Ｆ
０）、ファウンダーハツカネズミ、および非−遺伝子交
換性雌（ＩＣＲ２００）の間の交配の遺伝子交換性後代
であった。この交配の遺伝子交換性後代は、上記の実施
例１１中に記されている如きＰＣＲ分析により同定され
た。
【０１０６】図３４は、ｐＡｂ９０−２９で免疫染色さ
れたハツカネズミＡＥ３０１＋２０７（Ｆ１）からの脳
断面を示している。Ａ４免疫反応性部分は暗褐色部分と
して観察でき、小斑点があり、そして海馬中で集団状で
出現する（図３４、代表的な免疫染色された集団は矢印
で目立たせてある）。図３５は、比較的大きい倍率のｐ
Ａｂ９０−２９で染色されたハツカネズミＡＥ３０１＋
２０７（Ｆ１）脳組織の海馬部分である（代表的な免疫
染色された集団は矢印で目立たせてある）。ＡＥ３０１
＋２０７（Ｆ１）脳組織の海馬中の同様な免疫染色は、
第二のＡ４免疫反応性抗体であるｐＡｂ９０−２８を用
いて観察することもできる（図３６、代表的な免疫染色
された集団は矢印で目立たせてある）。第三のＡ４免疫
反応性抗体であるｐＡｂ９０−２５も同様な免疫染色を
示した。
【０１０７】この免疫染色はＡＥ３０１遺伝子交換性系
統に特異的であり、その理由はｐＭＴＩを有する遺伝子
交換性系統ＦＥ８０３からのＦＥ８０３＋１０５（Ｆ
１）と称されている年令の合っているハツカネズミは海
馬中または脳断面の他の部分中でｐＡｂ９０−２９を用
いる免疫染色を示さないからである（図３７）。 ２.電子顕微鏡分析 固定されそして染色された脳組織の薄い部分の電送電子
顕微鏡分析は、トラップ他、１９８２、J. Neurosci.、
２：９８６−９９３の方法に従い行われた。この電子顕
微鏡分析用に使用された遺伝子交換性ハツカネズミはＡ
Ｅ３０１＋２０１（Ｆ２）と称されており、そしてＡＥ
３０１＋２１０（Ｆ１）およびＡＥ３０１＋２０７（Ｆ
１）の間の交配の後代であり、ＡＥ３０１＋２１０（Ｆ
１）およびＡＥ３０１＋２０７（Ｆ１）はＡＥ３０１＋
（Ｆ０）および非−遺伝子交換性雌（ＩＣＲ２００）の
間の交配の後代である。これらの遺伝子交換性後代は上
記の実施例１１中に記載されている如きＰＣＲ分析によ
り同定された。
【０１０８】結果は、この遺伝子交換性ハツカネズミか
らの脳の海馬部分の特定区域中で電子密度の高い凝集を
示していた。この電子密度の高い凝集は、ｐＡｂ９０−
２５、９０−２８および９０−２９で免疫化学的染色を
示した同じ脳部分でも見られた。凝集は神経単位樹枝の
細胞内空間に位置しているようである。図３８ａおよび
３８ｂは、遺伝子交換性ハツカネズミＡＥ３０１＋２０
１（Ｆ２）から単離された海馬脳組織の切片中での電子
密度の高い凝集を示している。電子密度の高い凝集の境
界は矢印で目立たせてある。
【０１０９】ｐＡｂ９０−２９との免疫反応性は電子密
度の高い凝集と共に局在されるため、電子密度の高い部
分がＡ４ペプチドの凝集であることが示された（図３
９）。この共局在化は、トラップ他、１９８９、J. Cel
l Biol.、１０９：２４１７−２４２６の方法に従い実
施される超薄低温切片のＥＭ免疫細胞化学法を使用して
示された。ｐＡｂ９０−２９の免疫反応性は免疫金粒子
を使用する電子顕微鏡中で検出された。免疫金粒子は電
子顕微鏡写真中で均一寸法の分離点として現れる。金粒
子が電子密度の高い凝集と共に局在している代表的な部
分は矢印により示されている。
【０１１０】実施例１５ ＣＯＳ細胞トランスフェクション中の人間ＡＰＰ遺伝子
生成物の表示 ＣＯＳ細胞のＤＮＡトランスフェクション（グルツマン
(Gluzman)、１９８１、セル(Cell)、２３：１７５−１
８２）は、ｐＭＴＩ−２３６０、ｐＭＴＩ−２３６２、
ｐＭＴＩ−２３６９、およびｐＭＴＩ−４６が前記の如
くしてそして図２９に示されている如くして人間ＡＰＰ
−６９５を表示しおよび分泌することを示している。
【０１１１】ＤＮＡトランスフェクション用に、６０ｍ
ｍの培養皿に３ｍｌのＤＭＥＭおよび１０％の牛胎児血
清中の約２−５×１０5ＣＯＳ細胞／皿（−５０％融合
性）を種つけした。細胞を６％ＣＯ2雰囲気中で３７℃
において一夜培養した。細胞をＰＢＳ（Ｃａ++またはＭ
ｇ++なし）で洗浄し、そして次に２ｍｌのＤＭＥＭおよ
び１０％のＮｕＳｅｒｕｍ（カタログ＃５００００）を
各板に加えた。２μｌの１０００Ｘクロロキン原料溶液
（０.１Ｍクロロキン、シグマ・カンパニーＣ−６６２
８）、３２μｌのＤＥＡＥ硫酸デキストラン原料溶液
（２５ｍｇ／ｍｌのＤＥＡＥ硫酸デキストラン、シグマ
・カンパニーＤ−９８８５）、および４μｇのＤＮＡを
各板に加えた。細胞を６％ＣＯ2雰囲気中で３７℃にお
いて３.５時間培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、そし
て次に２ｍｌのＰＢＳ中１０％ＤＭＳＯを用いてショッ
クを与え、そして６％ＣＯ2雰囲気中で３７℃において
ＤＭＥＭおよび１０％の牛胎児血清と共に４８時間培養
し、次にＰＢＳで３回洗浄し、そしてさらに細胞を６％
ＣＯ2雰囲気中で３７℃において「カッター」媒体と共
にさらに２４時間培養した。
【０１１２】ＣＯＳ細胞、トランスフェクション化され
たＣＯＳ細胞、および人間の神経膠腫細胞系統Ｈ４
（Ａ.Ｔ.Ｔ.Ｃ.番号ＨＴＢ１４８）からの培養媒体中の
蛋白質を酸沈澱により濃縮した。氷冷されている約３ｍ
ｌの各培養媒体を収穫し、そして３ｍｌ試料の氷冷され
ている２５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を加えた。試料
を２０,０００ｘｇにおいて４℃で３０分間遠心した。
蛋白質ペレットを１００％アセトンで３回洗浄し、そし
て次に各洗浄後に１０,０００ｘｇにおいて４℃で１５
分間遠心した。ペレットを真空中で〜２０秒間乾燥し、
１０μｌのＮＲＢＳ緩衝液（２％のＳＤＳ、１０％のベ
ータメルカプトエタノール、５％の充填用染料、１０％
のグリセロール、０.１２５Ｍのトリス、ｐＨ６.８）中
に再懸濁させ、そして５分間沸騰させた。
【０１１３】細胞上澄み液をポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分別し（８％の走行ゲルおよび４％の粘着
ゲル）、そして電子ブロッティング技術によりビオラド
・ミニ−プロテアンII装置を使用しそして製造業者によ
り推奨されている工程を使用してインモビロン−Ｐ膜に
移した。ポリアクリルアミドゲルからインモビロン−Ｐ
膜中に移された人間およびハツカネズミのＡＰＰ蛋白質
は、実施例１４に記載されている如きウェスタン−ブロ
ット染色により検出された。ハツカネズミおよび人間の
ＡＰＰ−６９５、ＡＰＰ−７５１およびＡＰＰ−７７０
蛋白質は、モノクローン性抗体（ｍＡｂ）２２Ｃ−１１
を用いて検出された。
【０１１４】種々のトランスフェクション化された細胞
培養物から媒体中に分泌されたＡＰＰ蛋白質は、ｍＡｂ
２２Ｃ−１１を用いるウェスタン−ブロットで検出され
た。ＣＯＳ細胞は主としてＡＰＰ−７５１（および／ま
たは７７０）並びに少量のＡＰＰ−６９５（図２９、レ
ーン８）を表示する。分泌形のＡＰＰ−６９５およびＡ
ＰＰ−７５１（または７７０）はそれぞれ−９３−１０
５ｋＤａおよび−１１２−１２５ｋＤａの見掛け分子量
を有している（ヴァイデマン他、１９８９、上記引用文
献、およびパルメルト他、１９８９、上記引用文献）。
人間の脳脊髄流体（ＣＳＦ）は主としてＡＰＰ−６９５
を含有しており（パルメルト他、１９８９、上記引用文
献）、そしてＡＰＰ−６９５表示用の対照としてウェス
タン−ブロット上に含まれている（レーン９、図２
９）。数個のＤＮＡトランスフェクション（ｐＭＴＩ−
２３６０、レーン７；ｐＭＴＩ−２３６２、レーン６；
ｐＭＴＩ−２３６９、レーン５；およびｐＭＴＩ−４
６、レーン４）は、ＡＰＰ−７５１（７７０）免疫染色
と比較してＡＰＰ−６９５免疫染色において相当な増加
を示している（図２９）。従って、これらの構成体はＣ
ＯＳ細胞中の人間ＡＰＰ−６９５を表示する。これらの
ＡＰＰ−６９５コード付け用小遺伝子は、ＡＰＰの別の
形または変異体形にコード付け用小遺伝子の構成用の
「鋳型」として使用される。親のＡＰＰ−６９５構成は
蛋白質を表すため、他の構成体もそれらの蛋白質を表す
ようである。
【０１１５】実施例１６ 哺乳動物の細胞系統中のＡＰＰの表示 ＡＰＰの６９５、７５１および７７０形、並びにＡＰＰ
ＭＣ−１００の変異体形を表示する安定な細胞系統
は、下記の如くして牛の乳頭腫ウィルス−（ＢＰＶ）を
基にしたベクトルを用いて製造された。 Ａ.ＡＰＰ−６９５、ＡＰＰ−７５１およびＡＰＰ−７
７０の細胞系統 実施例６に記載されているプラスミドｐＭＴＩ−４をＡ
ＰＰ−６９５ｃＤＮＡの５′−端部で変異生成させて新
しいＳａｌＩ制限部位を生じた。さらに、変異生成工程
中に、開始コドンであるＡＵＧと接しちる基底を変更し
てコザク(Kozak)により記載されている翻訳開始用の最
適配列を確認した（コザク、１９８９、Cell Biol.、１
０８：２２９−２４１）。変異生成および生じたベクト
ルであるｐＭＴＩ−３８の地図で使用されるオリゴヌク
レオチドは図３０ａに示されている。
【０１１６】プラスミドｐＭＴＩ−４１は、ブルースク
リプトＫＳ中の独特なＫｐｎＩ部位を欠失させすること
により、製造された（ストラタジーン；ｐＭＴＩ−４用
の親ベクトル）。ブルースクリプトＫＳをＫｐｎＩで消
化させ、そして突出部は標準的方法によりムングビーン
ヌクレアーゼで消化させた。消化されたＤＮＡをリガー
ゼで処理して、ベクトルおよびｐＭＴＩ−４１を環状化
して、欠けているＫｐｎＩ部位を単離した。
【０１１７】ＡＰＰ−６９５ｃＤＮＡを含有しているｐ
ＭＴＩ−３８からのＸｂａＩ−ＨｉｎｄIIIフラグメン
トを図３０中に示されている如くしてＸｂａＩ−Ｈｉｎ
ｄIII消化されたｐＭＴＩ−４１中に加えて、ＡＰＰｃ
ＤＮＡ内に１個だけのＫｐｎＩ部位を有するｐＭＴＩ−
４２を得た。それぞれ７５１および７７０形のＡＰＰを
含有しているｐＭＴＩ−４３およびｐＭＴＩ−４４は、
ｐＭＴＩ−４２中のＫｐｎＩ−ＢｇｌIIフラグメントを
実施例３に記載されているｐＦＣ４−７５１およびｐＦ
Ｃ４−７７０からの対応するフラグメントで置換するこ
とにより、製造された。
【０１１８】ｐＭＴＩ−４２、ｐＭＴＩ−４３およびｐ
ＭＴＩ−４４中のＳａｌＩフラグメント含有しているＡ
ＰＰ部分をＢＰＶベクトルのＸｈｏＩ部位に加えて、そ
れらを実施例３１中に示されているハツカネズミのメタ
ロチオニン促進剤の調節下に置いた。図３１中で示され
ている如く、ｐＭＴＩ−５２はｃｏｌＥ１レプリコン、
アンピシリン抵抗性遺伝子、ハツカネズミのメタロチオ
ニン促進剤を含有しており、ｃＤＮＡ用の独特なクロー
ニング部位の直後にＳＶ４０のポリアデニル化シグナル
がある。特に、ｐＭＴＩ−５２は当該ｃＤＮＡの導入用
のＢａｍＨＩおよびＫｈｏＩクローニング部位を含有し
ている。さらに、ｐＭＴＩ−５２ベクトルはＢＰＶの全
８ｋｂゲノムも含有している。ＢＰＶ配列の存在によ
り、該ベクトルはハツカネズミＣ１２７およびＮＩＨ３
Ｔ３細胞中で複数コピーエピソームとして重複できて、
安定な転換された細胞系統を生じた。プラスミドｐＭＴ
Ｉ−５２は、ＳＶ４０ウィルス性ＤＮＡからの−２３７
ｂｐＢａｍＨＩ−ＢｃｌＩフラグメント（ウィルス性ポ
リアデニル化シグナルを含有している）をｐＭＴＩ−３
２の独特なＢａｍＨＩ部位中に結紮させることにより、
製造された。ＢａｍＨＩおよびＰｒｕIIを用いるｐＭＴ
Ｉ−５２の診断用制限消化により、下記のＤＮＡ制限フ
ラグメントが得られた：−１１.５ｋｂ、−０.５５ｋ
ｂ、および−０.２５ｋｂ。ｐＭＴＩ−３２は、ｐＭＴ
Ｉ−２９からの−１.８ｋｂＢａｍＨＩ−ＢｇｌII制限
フラグメント（このＤＮＡフラグメントはハツカネズミ
のメタロチオニン遺伝子促進剤を含有しており、それは
別の原料から得られ、例えば実施例９に記載されている
プラスミドｐＪＹＭＭＴ（Ｌ）からの−１.９ｋｂＥｃ
ｏＲＩ−ＢｇｌIIフラグメントも同様な促進剤フラグメ
ントを含有している）をプラスミドＢＰＶ−２４０.７
の独特なＢａｍＨＩ制限部位中に結紮さえることによ
り、製造した。プラスミドＢＰＶ−２４０.７は全ＢＰ
Ｖゲノムの原料として使用され、そしてそれはハウリー
(Howley)他、１９８３、Methods of Enzymology、１０
１巻、ウー(Wu)他、編集、アカデミック・プレス、ニュ
ーヨーク、３８７−４０２頁中に記載されておりそして
製造されているＢＰＶベクトルの変種である。−８ｋｂ
ＢＰＶゲノムの別の原料を使用することもでき、特にハ
ウリー他の上記引用文献中に記載されている多数のＢＰ
Ｖベクトルを制限酵素分裂部位を少し変えてｐＭＴＩ−
５２の製造においてＢＰＶ２４０.７の代わりに使用す
ることもできる。ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIIIを用い
るｐＭＴＩ−３２の診断用制限消化により、下記のＤ制
限フラグメントが得られた：８.０ｋｂおよび４.１ｋ
ｂ。ｐＭＴＩ−２９は、ＢｇｌII、ＸｂａＩ、およびＳ
ａｌＩ制限部位を（合成ＤＮＡ結合剤を使用して）プラ
スミドｐＭＶＢｎｅｏの独特なＥｃｏＲＩ制限部位中に
挿入することにより、製造された。プラスミドｐＭＶＢ
ｎｅｏは、パヴラキス(Pavlakis)他、１９８７、Gene T
ransfer Vectors、ミラー(Miller)およびカロス(Calos)
編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨ
ーク、２９−５８頁により記載されており、そしてそれ
はハツカネズミのメタロチオニン遺伝子促進剤として使
用された。この促進剤の別の原料は例えばプラスミドｐ
ＪＹＭＭＴ（Ｌ）である（実施例９参照）。ＳａｌＩま
たはＸｂａＩのいずれかを用いるｐＭＴＩ−２９の診断
用制限消化により、単一の６.７ｋｂＤＮＡ制限フラグ
メントが製造された。ＢＰＶベクトルであるｐＭＴＩ−
５３、ｐＭＴＩ−５７およびｐＭＴＩ−５８はそれぞれ
６９５、７５１および７７０形のＡＰＰを含有してい
る。
【０１１９】各ＢＰＶベクトルであるｐＭＴＩ−５３、
ｐＭＴＩ−５７およびｐＭＴＩ−５８はハツカネズミの
Ｃ１２７Ｉ細胞（エール大学のＤ.ジマイオ(DiMaio)博
士から得られたＣ１２７の変種）中にトランスフェクシ
ョン化させ、該細胞はＢＰＶベクトルの高コピー数のエ
ピソーム複写が可能である（ハウリー他、１９８３、Me
thods in Enzymol.、１０１、３８７−４０３）。ベク
トルを細胞中に燐酸カルシウム沈澱により加え、そして
転換された焦点を前記の如くして単離した（ハウリー
他、１９８３、上記引用文献）。一方、ある場合には、
ベクトルを構成物質Ｇ４１８に抵抗性を与えることので
きるｐＳＶ２ｎｅｏ(サザーン(Southern)およびベルグ
(Berg)、１９８２、J. Mol. Appl. Gen.、１：３２７−
３４１）を用いて共トランスフェクション化した（ハウ
リー他、１９８３、上記引用文献）。ＢＰＶベクトルＤ
ＮＡをｐＳＶ２ｎｅｏＤＮＡと５−１０モル倍過剰量
（ＢＰＶベクトルが過剰）で混合し、そして燐酸カルシ
ウム沈澱によりＣ１２７Ｉ細胞中にトランスフェクショ
ン化させた。Ｇ４１８に抵抗性である集団を単離した。
ｐＳＶ２ｎｅｏＤＮＡに対してモル過剰量であるＢＰＶ
ＤＮＡにより、ほとんど全てのＧ４１８抵抗性集団が共
トランスフェクション化されたＢＰＶベクトルを確実に
含有していた。
【０１２０】種々の細胞型中へのＡＰＰｃＤＮＡのトラ
ンスフェクションは、クニッツ領域を含むＡＰＰのアミ
ノ−末端部分が媒体中に放出されたことを示した（ヴェ
イデマン他、１９８９、セル(Cell)、５７：１１５−１
２６およびパルマート他、１９８９、上記引用文献）。
従って、ウェスタン−ブロット分析による適当な形のＡ
ＰＰ用に、転換された焦点およびＧ４１８抵抗性集団か
らの血清を含まない２４時間上澄み液をスクリーニング
した。２５平方ｃｍフラスコ中で半融合から融合への
１.５ｍｌの上澄み液をトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用
いる沈澱により約１５倍に濃縮し、その後、ポリアクリ
ルアミドゲル上に充填した。ＡＰＰ帯をハツカネズミの
モノクローン性抗体２２Ｃ１１（実施例１４）を使用し
て可視化した。高水準の適当なＡＰＰ形を生成するクロ
ーンを培養中で拡大させそして増殖させた。これらの細
胞系統であるｃＭＴＩ−５３、ｃＭＴＩ−５７およびｃ
ＭＴＩ−５８からの上澄み液が３種の形の人間ＡＰＰ用
の標準を与えた。 Ｂ.ＭＣ−１００用の細胞系統 プラスミドベクトルであるｐＭＴＩ−７０（−１２.９
ｋｂ、図４０）を使用して、ハツカネズミＣ１２７Ｉ細
胞の別のトランスフェクションを行った。このプラスミ
ドは、ベクトルｐＭＴＩ−２３７１（図４１）からの−
６１５ｂｐＸｈ ｏＩ−ＰｖｕIIフラグメントをＢＰＶベ
クトルｐＭＴＩ−５２中にクローニングすることによ
り、製造された。ｐＭＴＩ−５２を最初にＢａｍＨＩで
消化させ、そして次にブラント−エンドをクレナウを用
いて製造した。次にベクトルをＸｈ ｏＩで消化させ、そ
して大きな制限フラグメントをゲル−精製し、そしてベ
クトルｐＭＴＩ−２３７１からの−６１５ｂｐＸｈｏＩ
−ＰｖｕIIフラグメントと結紮させて、ｐＭＴＩ−７０
を製造した。ＨｉｎｄIIIを用いるｐＭＴＩ−７０の診
断用消化は、−３.６ｋｂおよび−９.３ｋｂ制限フラグ
メントを示した。ｐＭＴＩ−２３７１プラスミドは、ｐ
ＭＴＩ−２３３７からの−７０７ｂｐＢａｍＨＩ−Ｓｐ
ｅＩフラグメントをブルースクリプトＫＳ＋ベクトル
（実施例６参照）のＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ部位の間
でクローニングすることにより、誘導された。プラスミ
ドｐＭＴＩ−２３３７の構造は実施例９（部分Ａ、章
３）中に記載されている。
【０１２１】プラスミドｐＭＴＩ−７０は、ＭＣ−１０
０と称されている変異生成をコード付けするｐＭＴＩ−
２３３７から誘導された配列を含有している（遺伝子生
成物Ｖ、図４ｂ、図１２も参照のこと）。ｐＭＴＩ−７
０の製造用に使用されたｐＭＴＩ−２３３７（中間生成
物としてのｐＭＴＩ−２３７１を有する）から得られた
フラグメントは、ＡＰＰの分泌シグナル（すなわちシグ
ナルペプチド）より先にあるＡ４部分を含む３種類の形
のＡＰＰ（６９５、７５１、７７０）に共通のＣ−末端
断片にコード付けする。従って、このＡＰＰ小遺伝子の
翻訳がこの小遺伝子を用いてトランスフェクション化さ
れた細胞の膜中へのＡＰＰＣ−末端の導入をもたらすと
予期される。
【０１２２】プラスミドｐＭＴＩ−７０は上記の如くハ
ツカネズミＣ１２７細胞中にトランスフェクション化さ
れ、そしてＧ４１８に抵抗性である集団を単離して、下
記の系統を含んでいる安定なトランスフェクタント細胞
系統を製造した：ｃＭＴＩ１７０−Ａ２、ｃＭＴＩ１７
０−Ａ３、ｃＭＴＩ１７０−Ａ６、ｃＭＴＩ１７０−Ｂ
１、ｃＭＴＩ１７０−Ｂ２、およびｃＭＴＩ１７０−Ｂ
３。そのような抵抗性集団の細胞溶解物をウェスタン−
ブロッティングにより兎のポリクローン性抗体（ｐＡ
ｂ）ＳＧ３６９を使用して分析した。ｐＡｂＳＧ３６９
（バックスバウム(Buxbaum)他、１９９０、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA、８７：６００３−６００６中に記載
されている）を、標準的免疫化工程および技術（バック
スバウム他、１９９０、上記引用文献中に記載されてい
る如きもの）を使用する人間ＡＰＰ−６０５のＣ−末端
に対応する合成ペプチドを用いる兎の免疫化により、隆
起させた。合成ペプチドはＡＰＰアミノ酸残基６４５−
６９４からなっており、ここでアミノ酸類の数はカン他
の上記引用文献（１９８７）中に記されている如き人間
ＡＰＰ−６９５のものと対応しており、そしてそれはエ
ール・プロテイン・アンド・ヌクレイック・アシド・ケ
ミストリー・ファシリティ（コネチカット州ニューヘブ
ン）により製造された。ｐＡｂＳＧ３６９のものと同様
な特徴を有する兎のポリクローン性抗体も、種々の人間
ＡＰＰ−６９５Ｃ−末端ペプチドを使用して他の研究所
により製造されている（イシイ(Ishii)他、１９８９、N
europath. Appl. Neurobiol.、１５：１３５−１４７；
パルメート他、１９８９、上記引用文献、およびブッシ
ュ(Bush)他、１９９０、J. Biol. Chem.、２６５：１５
９７７−１５９８３）。図４２は、ｐＭＴＩ−７０トラ
ンスフェクション化ＢＰＶ細胞系統であるｃＭＴＩ７０
−Ｂ１、ｃＭＴＩ７０−Ｂ２、およびｃＭＴＩ７０−Ｂ
３の細胞溶解物のウェスタン−ブロット分析の結果を示
している。図４２に示されているウェスタン−ブロット
分析は、ＭＣ−１００を表示しない対照用ＢＰＶ細胞ト
ランスフェクタントからの細胞抽出物の使用結果も示し
ている。細胞培養物を１００％融合となるまで成長さ
せ、ＰＢＳ中の１ｍＭのＥＤＴＡで洗浄し、そして１Ｘ
ＳＳＢ（２％のＳＤＳ、６３ｍＭのトリス、ｐＨ６.
８、および１０％のグリセロール）、５％のβ−メルカ
プトエタノール、並びに５％のブロモフェノールブルー
中で１０分間沸騰させることにより抽出した。ウェスタ
ン−ブロット分析は前記の如くして行われた。図４２に
示されているウェスタン−ブロットは下記の試料を含ん
でいた：レーン１、分子量標識剤；レーン２、ｃＭＴＩ
５２−Ａ４細胞抽出物；レーン３、ｃＭＴＩ６６−Ｂ６
細胞抽出物；レーン４、ｃＭＴＩ６６−Ｃ５細胞抽出
物；レーン５、ｃＭＴＩ６９−Ｃ６細胞抽出物；レーン
６、ｃＭＴＩ６９−Ａ４細胞抽出物；レーン７、ｃＭＴ
Ｉ６９−Ａ５細胞抽出物；レーン８、ｃＭＴＩ７０−Ｂ
１細胞抽出物；レーン９、ｃＭＴＩ７０−Ｂ２細胞抽出
物；レーン１０、ｃＭＴＩ７０−Ｂ３細胞抽出物。この
ウェスタン−ブロット分析ではポリクローン性抗体ＳＧ
３６９を使用した。ＢＰＶ細胞系統ｃＭＴＩ５２−Ａ４
をｐＭＴＩ−５２（ＢＰＶクローニングベクトル）でト
ランスフェクション化させ、ＢＰＶ細胞トランスフェク
タント系統であるｃＭＴＩ６６−Ｂ６およびｃＭＴＩ６
６−Ｃ５は人間のＡＰＰ（遺伝子生成物VIII、図４ｂ；
上記の実施例７参照）のＡ４ペプチドをコード付けする
ＢＰＶベクトルｐＭＴＩ−６６を有しており、そしてＢ
ＰＶ細胞トランスフェクタント系統であるｃＭＴＩ６９
−Ｃ６、ｃＭＴＩ６９−Ａ４、およびｃＭＴＩ６９−Ａ
５は人間のＡＰＰ（遺伝子生成物VII、図４ｂ；上記の
実施例９Ａ、章４参照）のＳｐｐｍ−Ａ４ペプチドをコ
ード付けするＢＰＶベクトルｐＭＴＩ−６９を有してい
た。ＡＰＰ小遺伝子の生成物を表示する１４ｋＤおよび
２１ｋＤの間の主要免疫反応性帯が見られる。主要翻訳
生成物（矢印により示されている）の凝集生成物と一致
する高分子量の免疫反応性帯も存在していた。
【０１２３】ｐＭＴＩ−７０中のＡＰＰ小遺伝子の転写
は、例えばカドミウムの如き重金属により誘導されるハ
ツカネズミのメタロチオニン促進剤の調節下である（ハ
ーマー(Hamer),Ｄ.Ｈ.およびウェリング(Welling),Ｍ.
Ｊ.、１９８２、J. Mol. Appl. Genet.、１：２７３−
２８８）。カドミウムを用いる細胞系統ｃＭＴＩ７０−
Ａ２、ｃＭＴＩ７０−Ａ３、ｃＭＴＩ７０−Ａ６、ｃＭ
ＴＩ７０−Ｂ１、ｃＭＴＩ７０−Ｂ２、およびｃＭＴＩ
７０−Ｂ３の誘導は、図４３中に記載されているウェス
タン−ブロット中に示されているｍＲＮＡ水準の増加お
よびＭＣ−１００蛋白質水準の増加生成をもたらすであ
ろうと予期されている。細胞培養物を１００％融合まで
成長させ、ＰＢＳで洗浄し、５μｇ／ｍｌの塩化カドミ
ウムを有するＤＭＥＭと共に３７℃において５％ＣＯ2
中で１６時間にわたり培養し、そして次に１ＸＳＳＢ
（２％のＳＤＳ、６３ｍＭのトリス、ｐＨ６.８、およ
び１０％のグリセロール）、５％のβ−メルカプトエタ
ノール、並びに５％のブロモフェノールブルー中で１０
分間沸騰させることにより抽出した。図４３に示されて
いるウェスタン−ブロットは下記の試料を含んでいた：
レーン１、ｃＭＴＩ６３−Ｂ１細胞抽出物；レーン２、
ｃＭＴＩ６３−Ｃ２細胞抽出物；レーン３、分子量標識
剤；レーン４、ｃＭＴＩ５３−Ａ１細胞抽出物；レーン
５、ｃＭＴＩ７０−Ａ２細胞抽出物；レーン６、ｃＭＴ
Ｉ７０−Ａ３細胞抽出物；レーン７、ｃＭＴＩ７０−Ａ
６細胞抽出物；レーン８、ｃＭＴＩ７０−Ｂ１細胞抽出
物；レーン９、ｃＭＴＩ７０−Ｂ２細胞抽出物；レーン
１０、ｃＭＴＩ７０−Ｂ３細胞抽出物。ＢＰＶ細胞トラ
ンスフェクション系統であるｃＭＴＩ６３−Ｂ１および
ｃＭＴＩ６３−Ｃ２はチラミジア(Chlamydia)エピトー
プ（実施例８参照）のＣ−末端付加で人間のＡＰＰ−６
９５をコード付けするＢＰＶベクトルｐＭＴＩ−６３を
有しており、そしてＢＰＶ細胞トランスフェクタント系
統であるｃＭＴＩ５３−Ａ１は人間のＡＰＰ−６９５を
コード付けするＢＰＶベクトルｐＭＴＩ−５３を有して
いた。凝集分子に対応している比較的高い分子量の帯
は、カドミウム誘導時に強度が増加する（矢印により示
されている）。この観察は、凝集が濃度依存性現象であ
るという予測と一致している。
【０１２４】ｐＭＴＩ−７０トランスフェクション化さ
れそしてＧ４１８選択された細胞は、染色された細胞の
免疫蛍光およびＳＧ３６９抗体を用いる細胞溶解物の免
疫沈澱によっても分析された。結果は、トランスフェク
ション化された細胞中のＭＣ−１００フラグメントの堆
積を示した。図４４ａおよび４４ｂは、ｃＭＴＩ７０−
Ａ６細胞中の限定された細胞数が強い蛍光を示す２個の
代表的場面の免疫蛍光結果を示している。トランスフェ
クション化された細胞系統ｃＭＴＩ−Ａ６（これは人間
ＡＰＰ６９５細胞を表示する）はこれらの免疫蛍光細胞
を示さない（図４４ｃ）。細胞系統ｃＭＴＩ７０−Ａ６
（ｐＭＴＩ−７０を用いてトランスフェクション化され
た、上記参照）およびｃＭＴＩ５３−Ａ１（人間ＡＰＰ
を表示する）を標準的培養条件を用いて７０％融合性と
なるまで成長させ、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして５μ
ｇ／ｍｌの塩化カドミウムが補充されているＤＭＥＭと
共に１６時間培養した。誘導されたｃＭＴＩ５３−Ａ１
およびｃＭＴＩ７０−Ａ６細胞を次にＰＢＳで２回洗浄
し、そしてＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用い
て室温で１０分間固定させた。細胞を０.２％のトリト
ンＸ−１００、１０ｍＭのトリス、ｐＨ８.０、０.２ｍ
ＭのＥＤＴＡを用いて室温で５分間にわたり透過させ
た。固定されそして透過された細胞を次にＰＢＳおよび
３％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）中の親和性精製され
たｐＡｂＳＧ３６９（原料の１：２００希釈）と共に室
温において６０分間にわたり培養した。次に細胞をＰＢ
Ｓ中の３％ＢＳＡで５回洗浄した。細胞の蛍光性を設置
されたスライド上でツァイスＩＭ蛍光顕微鏡を用いて観
察した。図４４中に示されている如く、染色は斑点状で
ありそして内質細（ＥＲ）およびゴルジ中での合成部位
から離れて細胞周辺に局在している。この染色模様は、
ＭＣ−１００蛋白質の高度に局在化された濃度を示唆し
ている。Ｃ１２７１／ｐＭＴＩ−７０トランスフェクシ
ョン化された細胞を連続的に通過させると、蛍光性細胞
が連続的通過で集団から失われていることが観察され
た。このことは、ＭＣ−１００の製造がこれらの細胞に
対して選択的欠点を与えるかもしれないことを示唆して
いる。
【０１２５】図４５は、細胞系統ｃＭＴＩ７０−Ａ６
（ｐＭＴＩ−７０でトランスフェクション化された、上
記参照）からの抽出物からの免疫沈澱させたＭＣ−１０
０のウェスタン−ブロットを示している。結果は、図４
２および４３で観察されるＭＣ−１００凝集は細胞溶解
物から免疫沈澱させられることを示している（図４５、
レーン６）。細胞系統ｃＭＴＩ７０−Ａ６（ｐＭＴＩ−
７０でトランスフェクション化された、上記参照）の培
養物を標準的培養条件を使用して１００％融合性となる
まで成長させ、細胞をＰＢＳで洗浄し、そして５μｇ／
ｍｌの塩化カドミウムが補充されたＤＭＥＭと共に１６
時間培養した。誘導されたｃＭＴＩ７０−Ａ６細胞を２
回再懸濁させ、ＰＢＳ中の１ｍＭのＥＤＴＡで洗浄し、
そして細胞を遠心（１０００ｘｇ）によりペレット化
し、そしてＩＰ（溶解）緩衝液（１００ｍＭのトリスｐ
Ｈ７.４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＮａＮ3、１
％のノニデットＰ−４０、０.５％のナトリウムデオキ
シコレート、０.１％のＳＤＳ、および４０単位／ｍｌ
のアプロチニン）中に再懸濁させた。この細胞溶解物の
部分標本は図４５、レーン１で見られる。細胞溶解物を
親和性精製されたｐＡｂＳＧ３６９の１：５０希釈物と
共に４℃において２時間培養した。次に抽出物を蛋白質
−Ｇセファロース球（原料、ＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍｌ；
シグマから得られる）の１：１０希釈物と共に４℃にお
いて一夜静かに撹拌しながら培養した。次に蛋白質−Ｇ
セファロースを遠心（１２,０００ｘｇ、４℃において
１５分間）により集め、そして上澄み液の部分標本は図
４５、レーン２に示されている。ペレットをＩＰ（）緩
衝液で３回洗浄した。各洗浄の部分標本は図４５、レー
ン３、４および５に示されている。蛋白質を１ＸＳＳＢ
（２％のＳＤＳ、６３ｍＭのトリスｐＨ６.８、および
１０％のグリセロール）、５％のβ−メルカプトエタノ
ール、並びに５％のブロモフェノールブルー中で１０分
間沸騰させて溶解させた。溶解した免疫沈澱の部分標本
は図４５、レーン６に示されている。ウェスタン−ブロ
ット分析は、上記の如くしてＳＧ３６９抗体を使用して
実施された。
【０１２６】このようにしてＣ１２７Ｉ／ｐＭＴＩ−７
０クローンは哺乳動物細胞宿主／ベクトルシステムを与
え、そこではＡ４部分を含有しているＡＰＰ部分の凝集
が観察された。この反応はアミロイド生成における重要
な段階であるため、この宿主／ベクトルシステムは研究
する価値がある：（ｉ）試験管内の凝集工程の研究によ
るアミロイド生成における段階、および（ii）アミロイ
ド凝集を促進または妨害する化学的および物理的試薬の
同定によるこの方法への調停方法。さらに、ｐＭＴＩ−
７０中のＭＣ−１００小遺伝子は神経単位を含む他の細
胞系統でも表示できるため、種々の細胞系統中でのアミ
ロイド生成も研究できる。
【０１２７】実施例１７ 人間のＡＰＰ−特異的ハツカネズミモノクローン性抗体
である５６−１および５６−２の製造 ＡＰＰの５６および７５アミノ酸クニッツ領域挿入部に
対して反応性であるモノクローン性抗体は下記の如くし
て製造された。
【０１２８】免疫原：ハツカネズミの免疫処理で使用さ
れる免疫原は、大腸菌ｒｅｃＡ蛋白質の最初の３６アミ
ノ酸に対する融合体としてクニッツ領域の７５アミノ酸
を表示するバクテリア大腸菌の富んでいるペレット留分
である（サンカー(Sancar)他、１９８０、Proc. Natl.
Acad. Sci. USA、７７：２６１１−２６１５）。種を表
示するペレット留分に分割された融合蛋白質を洗剤およ
び水を用いる洗浄により強化させた。生成した不溶性ペ
レットを８Ｍ尿素中に溶解させ、そして尿素を燐酸塩緩
衝食塩水（ＰＢＳ）に対する透析により除去した。透析
から生じた乳化液を使用してハツカネズミを免疫処理し
た。ｒｅｃＡ−７５融合は、乳化液中の蛋白質の３０％
にわたって現れた。
【０１２９】免疫処理：等容量の完全フレンズ佐薬を用
いて乳化させた１００μｇの免疫原を腹腔内に投与し
て、３匹の生後８週間のＢａｌｂ／ｃハツカネズミを免
疫処理した。次に２１日および２８日後に、ハツカネズ
ミに等容量の完全フレンズ佐薬中に乳化されている１０
０μｇの免疫原の腹腔内注射を追加した。さらに７日後
に、ハツカネズミに静脈内に２０μｇの免疫原を補充し
た。３日後に、脾臓を取り出しそして体細胞をヘルゼン
ベルグ方法（ヘルゼンベルグ(Herzenberg)他、１９７
８、Handbook of Experimental Immunology（Ｄ.Ｍ.ウ
ェイル(Weir)、編集）、ブラックウェル・サイエンティ
フィック・パブリケーションズ、オックスフォート、２
５.１−２５.７頁）のよりそれを少し変更して（レルナ
ー(Lerner)他、１９８０、J. Exp. Med.、１５２：１０
８５−１１０１）細胞ハイブリッドを製造した。
【０１３０】ＥＬＩＳＡ検定： ｒｅｃＡ−７５融合体
を含有している強化ペレット留分をＰＢＳ中に溶解さ
せ、そしてＥＬＩＳＡ検定で使用した。陰性対照物とし
て、ｒｅｃＡ（ｒｅｃＡ−７５中と同じ）の同一３６ア
ミノ酸類とＡＰＰ−６９５の断片（これはクニッツ挿入
部を有していない）との融合を表示する大腸菌菌株から
製造された同様なペレット留分を使用した。
【０１３１】ＥＬＩＳＡ検定は下記の如くして行われ
た。成長中のハイブリドマスからの培養流体をＥＬＩＳ
Ａを用いて特異的抗体の存在に関して試験した。１μｇ
のｒｅｃＡ融合蛋白質を含有している抽出物に各ウエル
のイミュノロンIIＥＩＡ板（バージニア州チャンチリー
のダイナテク）を、５０μｌの０.０１Ｍ炭酸ナトリウ
ム、ｐＨ９.５中で４℃において一夜培養することによ
り、吸着させた。各ウエル中の非−特異的蛋白質結合部
位を、０.０５％のツイーン−２０および１％のＢＳＡ
を含有している２００μｌのＰＢＳと共に培養しその後
にＰＢＳ／０.０５％ツイーン−２０を用いて洗浄する
ことにより、遮蔽した。次にウエルを連続的に１００μ
ｌのハイブリドマス組織培養上澄み液と共に培養し、洗
浄し、そして１００μｌのペルオキシダーゼ標識付け親
和性精製された山羊の抗−ハツカネズミＩｇＧ（カーク
ガード(Kirkegaad)およびペリー(Perry)、メリーランド
州ガイセルベルグ）の１：１,０００希釈物（ＰＢＳ／
ツイーン−２０）。それぞれ１時間を要する全ての培養
段階は室温で行われた。結合されたペルオキシダーゼ標
識の付いた「第二抗体」を製造業者の指示に従いペルオ
キシダーゼ基質テトラメチラベンジジン（ＴＭＢ）を用
いて検出し（カークガードおよびペリー、メリーランド
州ガイセルベルグ）、次に４５０ナノメートルにおける
光学的密度を各ウエルに関して測定した。陽性ハイブリ
ッド培養流体のアイソトープをＥＬＩＳＡ検定を使用し
て測定し、そこでは１μｇの抗−ハツカネズミＦａｂは
イミュノロンIIＥＩＡ板の各ウエルに吸着させ、その後
に培養上澄み液およびハツカネズミＩｇＧ1、ＩｇＧ2、
Ｉｇ2b、ＩｇＧ3、およびＩｇ用に特異的なペルオキシ
ダーゼ標識付き抗血清と共に引き続き培養した。
【０１３２】モノクローン性抗体の同定： クニッツ領
域の５６および７５アミノ酸類を有するｒｅｃＡ蛋白質
の最初の３６アミノ酸類の融合での全ｒｅｃＡ蛋白質に
対する抗体の反応性を比較することにより、抗体をウェ
スタン−ブロット上で同定した。これらの比較を用い
て、免疫原のｒｅｃＡ部分に対して向けられた抗体を除
去しそしてクニッツ抗原の７５アミノ酸類を含む５６ま
たは１０アミノ酸部分に反応エピトープを局在化させ
た。５６アミノ酸クニッツ領域と反応する３種の抗体で
ある５６−１、５６−２、５６−３をこの工程により単
離した。次にそれらを実施例１６中に記載されている哺
乳動物から分泌された６９５、７５１および７７０ＡＰ
Ｐ形に対する反応性と同様にして試験した。３種全てが
トランスフェクタントからの人間ＡＰＰ−７５１および
ＡＰＰ−７７０と反応するがＡＰＰ−６９５形とは反応
しないことが見いだされた。
【０１３３】培養中の多くの細胞系統は３種類の形のＡ
ＰＰを全て種々の程度で分泌しており、ＡＰＰ−７５１
およびＡＰＰ−７７０形がほとんどの場合優性であるこ
とが観察された（ヴァイデマン他、１９８９、上記引用
文献、およびパルマート他、１９８９、上記引用文
献）。５６−１および５６−２ｍＡｂはＡＰＰの内因性
ハツカネズミ変形との交差−反応性は示さなかった（図
３２）。全ての形のハツカネズミおよび人間のＡＰＰは
人間６９５先駆体に対して隆起された２２Ｃ１１抗体と
反応することが見いだされた。５６−１ｍＡｂをさらに
実施例１６中に記されている７５１および７７０トラン
スフェクタントの上澄み液に対して並びにハツカネズミ
のＬ細胞およびＣＯＳ猿細胞の上澄み液に対して試験し
た。図３３に示されている如く、５６−１ｍＡｂは７５
１トランスフェクタントの上澄み液および猿のＡＰＰと
強く反応したが、Ｃ１２７ハツカネズミ細胞宿主中もし
くはハツカネズミのＬ−細胞中の内因性ハツカネズミＡ
ＰＰに対しては反応しなかった。２２Ｃ１１ｍＡｂはこ
こで試験された全ての動物種類からの全ての形のＡＰＰ
を検出した。従って、図３２および図３３中の結果か
ら、５６−１および５６−２ｍＡｂが霊長類（人間およ
び猿）用に特異的であることを示している。
【０１３４】本発明の主なる特徴および態様は以下のと
おりである。 １.（ａ）組織および細胞の特異的表示を指定できる調
節剤部分、（ｂ）ＡＰＰまたはそれの誘導体をコード付
けする遺伝子構成体、および（ｃ）ＲＮＡポリアデニル
化シグナルを含有している遺伝子配列を含んでいる、ア
ミロイド先駆体蛋白質（ＡＰＰ）またはそれの誘導体類
の表示用の小遺伝子。 ２.該調節剤部分がさらに、内因性ＡＰＰ遺伝子中で観
察される発育表示パターンと同様な（ｂ）の該遺伝子構
成体の発育表示パターンを与える遺伝因子も含んでい
る、上記１の小遺伝子。 ３.該小遺伝子がさらに、（ｄ）接合用の受容体および
供与体位置を含有しているイントロン配列も含んでい
る、上記１または２の小遺伝子。 ４.該遺伝子構成体がＡＰＰ−６９５、ＡＰＰ−７５
１、ＡＰＰ−７７０、変異したＡＰＰ、切断されたＡＰ
ＰまたはＡ４ペプチドにコード付けする、上記１の小遺
伝子。 ５.（ｂ）の該遺伝子構成体が、該調節剤部分の機能を
評価するために監視可能なレポーター遺伝子により、ま
たはレポーター遺伝子および該ＡＰＰもしくはそれの誘
導体をコード付けする遺伝子を含有している融合蛋白質
により、置換されている、上記１の小遺伝子。 ６.該小遺伝子がさらに、（ｅ）表示を評価するために
検出できる標識付きのＡＰＰまたはＡＰＰ誘導体の表示
用の抗原性標識も含んでいる、上記３の小遺伝子。 ７.（ａ）組織および細胞の特異的表示を指定できる調
節剤部分、（ｂ）ＡＰＰまたはそれの誘導体をコード付
けする遺伝子構成体、（ｃ）ＲＮＡポリアデニル化シグ
ナルを含有している遺伝子配列、および（ｄ）接合用の
受容体および供与体位置を含有しているイントロン配列
を含有しているＮｏｔＩフラグメントを含んでいる、遺
伝子交換性ハツカネズミ中でのＡＰＰまたはそれの誘導
体類の移動および表示用の小遺伝子カセット。 ８.アミロイド先駆体蛋白質（ＡＰＰ）またはそれの誘
導体類を組織および細胞に特異的な方法で表示可能な、
遺伝子交換ハツカネズミから誘導された後代、胚または
細胞を含む遺伝子交換性ハツカネズミ。 ９.アミロイド先駆体蛋白質（ＡＰＰ）またはそれの誘
導体類の表示用の交換遺伝子を含んでいる、遺伝子交換
ハツカネズミから誘導された後代、胚または細胞を含む
遺伝子交換性ハツカネズミ。 １０.該交換遺伝子が（ａ）組織および細胞の特異的表
示を指定できる調節剤部分、（ｂ）ＡＰＰまたはそれの
誘導体をコード付けする遺伝子構成体、（ｃ）ＲＮＡポ
リアデニル化シグナルを含有している遺伝子配列、およ
び（ｄ）接合用の受容体および供与体位置を含有してい
るイントロン配列を含有しているＮｏｔＩ小遺伝子カセ
ットを含んでいる、上記９の遺伝子交換性ハツカネズ
ミ。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｐＦＣ４中でクローン化されたアミロ
イド先駆体蛋白質（ＡＰＰ）のｃＤＮＡ配列である。
【図２】図２は、ｐＦＣ４の環状地図である。
【図３】図３は、ＡＰＰ遺伝子の５′−端部の説明図で
ある。
【図４】図４ａは、ＡＰＰ小遺伝子中でコード付けされ
た非変異生成形のＡＰＰの遺伝子生成物の説明図であ
る。図４ｂは、ＡＰＰ小遺伝子中でコード付けされた変
異生成形のＡＰＰの遺伝子生成物の説明図である。
【図５】図５は、構造中間生成物および生成物であるｐ
ＭＴＩ−２３０２、ｐＭＴＩ−２３０３、ｐＭＴＩ−２
３０５およびｐＭＴＩ−２３０４の説明図である。
【図６】図６ａは、クローン化ベクトルであるｐＷＢ１
６、ｐＭＴＩ−２１１０、ｐＭＴＩ−２３００およびｐ
ＭＴＩ−２３０１中の多重結合剤の説明図である。図６
ｂは、ｐＭＴＩ−２３０１の環状地図である。
【図７】図７ａは、構造中間生成物であるｐＭＴＩ−２
３１４、ｐＭＴＩ−２３１９、ｐＭＴＩ−２１３２０、
ｐＭＴＩ−２３２１、ｐＭＴＩ−２３２２、およびｐＭ
ＴＩ２３２５の説明図である。図７ｂは、ｐＭＴＩ−２
３０７の環状地図である。図７ｃは、ｐＭＴＩ−２３１
２の環状地図である。
【図８】図８ａは、別形のＡＰＰにコード付けする小遺
伝子構造であるｐＭＴＩ−２３１０、ｐＭＴＩ−２３１
４、ｐＭＴＩ−２３１９、ｐＭＴＩ−２１３２０、ｐＭ
ＴＩ−２３２１、ｐＭＴＩ−２３２２、およびｐＭＴＩ
−２３２５の説明図である。図８ｂは、ｐＭＴＩ−２３
１４の環状地図である。
【図９】図９は、構造中間生成物であるｐＭＴＩ−２３
０７、ｐＭＴＩ−２３１６、およびｐＭＴＩ−２３１７
並びに小遺伝子ｐＭＴＩ−２３１８の説明図である。
【図１０】図１０ａは、構造中間生成物であるｐＭＴＩ
−２３１２並びにハツカネズミメタロチオネイン−Ｉゲ
ノム性配列並びに小遺伝子であるｐＭＴＩ−２３２３、
ｐＭＴＩ−２３３１、ｐＭＴＩ−２３３２、ｐＭＴＩ−
２３２４、およびｐＭＴＩ−２３２６の説明図である。
図１０ｂは、ｐＭＴＩ−２３２３の環状地図である。
【図１１】図１１ａは、構成中間生成物であるｐＭＴＩ
−２３２３並びに小遺伝子であるｐＭＴＩ−２３２７お
よびｐＭＴＩ−２３３７の説明図である。図１１ｂは、
ｐＭＴＩ−２３３７の環状地図である。
【図１２】図１２は、ｓｐ−ｓｐａｃｅｒＡ４およびＭ
Ｃ−１００のＤＮＡ／アミノ酸配列を示している。
【図１３】図１３は、ｓｐ−ｓｐａｃｅｒＡ４およびＳ
Ｐ−Ａ４のＤＮＡ／アミノ酸配列を示している。
【図１４】図１４は、構成中間生成物であるｐＭＴＩ−
２３２８、ｐＦＣ４フラグメント、並びに小遺伝子であ
るｐＭＴＩ−２３２９、ｐＭＴＩ−２３３３、ｐＭＴＩ
−２３３４、ｐＭＴＩ−２３３５およびｐＭＴＩ−２３
３６の説明図である。
【図１５】図１５ａは、ＡＰＰ３′−端部ゲノム性クロ
ーンｐＳＶ１および小遺伝子であるｐＭＴＩ−２３３９
の説明図である。図１５ｂは、ｐＭＴＩ−２３３９の環
状地図である。
【図１６】図１６は、ＡＰＰ遺伝子の３′−端部のＤＮ
Ａ配列である。
【図１７】図１７は、ｐＮｏｔＳＶ２ｎｅｏの環状地図
である。
【図１８】図１８ａは、小遺伝子であるｐＭＴＩ２３６
０、ｐＭＴＩ−２３６１、ｐＭＴＩ−２３６２、ｐＭＴ
Ｉ−２３６３、ｐＭＴＩ−２３６４、ｐＭＴＩ−２３６
５、ｐＭＴＩ−２３６６、ｐＭＴＩ−２３６７、ｐＭＴ
Ｉ−２３６８、およびｐＭＴＩ−２３６９用のｐＮｏｔ
ＳＶ２ｎｅｏ亜クローンの説明図である。図１８ｂは、
ｐＭＴＩ−２３６０の環状地図である。
【図１９】図１９は、ｐＮｏｔＳＶ２ｎｅｏ並びに小遺
伝子であるｐＭＴＩ−２３３９、ｐＭＴＩ２３６９、ｐ
ＭＴＩ−２３４２、ｐＭＴＩ−２３４３およびｐＭＴＩ
−２３４４の説明図である。
【図２０】図２０は、ＡＰＰ−ｌａｃＺレポーター遺伝
子であるｐＭＴＩ−２４０２の説明図である。
【図２１】図２１（ａ−ｄ）は、標識の付いた単一−ス
トランド人間ＡＰＰＤＮＡ探針を用いてその場でのハイ
ブリッド化により検出された正常ハツカネズミ中のＡＰ
ＰｍＲＮＡの細胞分布を説明している。
【図２２】図２２は、ＢＥ８０３遺伝子交換性ハツカネ
ズミの脳切片中の大腸菌β−ガラクトシダーゼ活性の組
織化学的染色模様を説明している。
【図２３】図２３（ａ−ｄ）は、ＢＥ８０３遺伝子交換
性ハツカネズミ（ａ、ｂおよびｃ）の脳切片中の並びに
正常ハツカネズミ脳（ｄ）中の大腸菌β−ガラクトシダ
ーゼ活性の組織化学的染色模様を説明している。
【図２４】図２４（ａ−ｄ）は、遺伝子交換性ＢＥ８０
３ハツカネズミからの脳皮質（ａおよびｂ）、三叉神経
節（ｃ）、並びに肝臓（ｄ）中の大腸菌β−ガラクトシ
ダーゼ活性の組織化学的染色模様を説明している。
【図２５】図２５（ａ−ｄ）は、遺伝子交換性ＢＥ８０
３ハツカネズミの脳中の大腸菌β−ガラクトシダーゼの
細胞および亜細胞分布を説明している。脳皮質中の大腸
菌β−ガラクトシダーゼ活性の組織化学的染色の光学的
顕微鏡像（ａ）。脳皮質中の大腸菌β−ガラクトシダー
ゼ活性の組織化学的染色模様のノルマルキシ光学的像
（ｂおよびｃ）。ＢＥ８０３遺伝子交換性ハツカネズミ
からの脳皮質切片中の大腸菌β−ガラクトシダーゼの免
疫金の局在化。
【図２６】図２６は、一連の遺伝子交換性ハツカネズミ
脳中の人間ＡＰＰＲＮＡ表示のＳ１分析を示している。
【図２７】図２７は、第二の一連の遺伝子交換性ハツカ
ネズミ脳中の人間ＡＰＰＲＮＡ表示のＳ１分析を示して
いる。
【図２８】図２８ａは、モノクローン性抗体（ｍＡｂ）
２２Ｃ−IIを使用する人間ＡＰＰ小遺伝子を有する正常
のハツカネズミおよび遺伝子交換性ハツカネズミ脳中の
ＡＰＰ−６９５、ＡＰＰ−７５１およびＡＰＰ−７７０
のウェスタン−ブロットである。図２８ｂは、ｍＡｂ５
６−１を使用する人間ＡＰＰ小遺伝子を有する正常のハ
ツカネズミおよび遺伝子交換性ハツカネズミ脳中のＡＰ
Ｐ−７５１蛋白質表示のウェスタン−ブロットである。
【図２９】図２９は、人間ＡＰＰ小遺伝子でトランスフ
ェクション化されたＣＯＳ細胞中のＡＰＰ−６９５、Ａ
ＰＰ−７５１およびＡＰＰ−７７０蛋白質表示のウェス
タン−ブロット（ｍＡｂ２２Ｃ−II使用）である。
【図３０】図３０ａは、ｐＭＴＩ−４およびｐＭＴＩ−
３８の環状地図を説明している。図３０ｂは、ＫＳブル
ースクリプトであるｐＭＴＩ−４１、ｐＭＴＩ−４３お
よび４４並びにｐＭＴＩ−４２の環状地図を説明してい
る。
【図３１】図３１は、構造中間生成物および生成物であ
るｐＭＴＩ−５２−ｐＭＴＩ−５３、ｐＭＴＩ−５７お
よびｐＭＴＩ−５８の説明図である。
【図３２】図３２はクニッツモノクローン性抗体（５６
−１、５６−２、５６−３）とＡＰＰ蛋白質との反応性
を説明している。
【図３３】図３３は、モノクローン性抗体５６−１の霊
長類特異性を説明している。
【図３４】図３４は、兎のポリクローン性抗体であるｐ
Ａｂ９０−２９を用いる遺伝子交換性ハツカネズミＡＥ
３０１＋２０７（Ｆ１）からの脳組織切片の免疫細胞化
学的染色を示している。
【図３５】図３５は、兎のポリクローン性抗体であるｐ
Ａｂ９０−２８を用いる遺伝子交換性ハツカネズミＡＥ
３０１＋２０７（Ｆ１）からの脳組織切片の免疫細胞化
学的染色を示している（図３４中に記されているのと同
様な場面でそれより高い倍率）。
【図３６】図３６は、兎のポリクローン性抗体であるｐ
Ａｂ９０−２８を用いる遺伝子交換性ハツカネズミＡＥ
３０１＋２０７（Ｆ１）からの脳組織切片の免疫細胞化
学的染色を示している（図３５中に記されているのと同
様な倍率）。
【図３７】図３７は、兎のポリクローン性抗体であるｐ
Ａｂ９０−２９を用いる遺伝子交換性ハツカネズミＡＥ
８０３＋１０５（Ｆ１）からの脳組織切片の免疫細胞化
学的染色を示している（図３５中に記されているのと同
様な倍率）。
【図３８】図３８ａは、遺伝子交換性ハツカネズミＡＥ
３０１＋２０７（Ｆ２）の海馬領域からの脳組織の薄い
切片の電子顕微鏡写真である。図３８ｂは、遺伝子交換
性ハツカネズミＡＥ３０１＋２０７（Ｆ２）の海馬領域
からの脳組織の薄い切片の電子顕微鏡写真である（図３
８ａ中に記されているのとは異なる場面）。
【図３９】図３９は、兎のポリクローン性抗体（ｐＡ
ｂ）９０−２９を用いる遺伝子交換性ハツカネズミＡＥ
３０１＋２０１（Ｆ２）の海馬領域からの脳組織の超薄
切片の免疫金染色の電子顕微鏡写真である。
【図４０】図４０は、ｐＭＴＩ−７０の環状地図であ
る。
【図４１】図４１は、ｐＭＴＩ−２３７１の環状地図で
ある。
【図４２】図４２は、ｐＭＴＩ−７０トランスフェクシ
ョン化された細胞系統であるｃＭＴＩ７０−Ｂ１、ｃＭ
ＴＩ７０−Ｂ２およびｃＭＴＩ７０−Ｂ３、並びに陰性
対照用として含まれている細胞系統であるｃＭＴＩ５２
−Ａ４、ｃＭＴＩ６６−Ｂ６、ｃＭＴＩ６６−Ｃ５、ｃ
ＭＴＩ６９−Ｃ６、ｃＭＴＩ６９−Ａ４、およびｃＭＴ
Ｉ６９−Ａ５中での、ｐＡｂＳＧ３６９を使用するＭＣ
−１００蛋白質表示のウェスタン−ブロットである。
【図４３】図４３は、トランスフェクション化された細
胞系統であるｃＭＴＩ７０−Ａ２、ｃＭＴＩ７０−Ａ
３、ｃＭＴＩ７０−Ａ６、ｃＭＴＩ７０−Ｂ１、ｃＭＴ
Ｉ７０−Ｂ２、およびｃＭＴＩ７０−Ｂ３（ｐＭＴＩ−
７０でトランスフェクション化された）中での、ｐＡｂ
ＳＧ３６９を使用するカドミウム誘導ＭＣ−１００蛋白
質表示のウェスタン−ブロットである。細胞系統ｃＭＴ
Ｉ６３−Ｂ１、ｃＭＴＩ６３−Ｃ２、およびｃＭＴＩ５
３−Ａ１が陰性対照として含まれていた。
【図４４】図４４ａは、ｐＡｂＳＧ３６９を使用するト
ランスフェクション化された細胞系統ｃＭＴＩ７０−Ａ
６中でのＭＣ−１００蛋白質表示の免疫蛍光を示してい
る。図４４ｂは、ｐＡｂＳＧ３６９を使用するトランス
フェクション化された細胞系統ｃＭＴＩ７０−Ａ６中で
のＭＣ−１００蛋白質表示の免疫蛍光を示している（図
４４ａ中で示されているものより大きい倍率、異なる場
面）。図４４ｃは、ｐＡｂＳＧ３６９を使用するトラン
スフェクション化された細胞系統ｃＭＴＩ５３−Ａ１中
での免疫蛍光を示している（図４４ａ中で示されている
ものと同じ倍率）。
【図４５】図４５は、カドミウム誘導ｐＭＴＩ−７０ト
ランスフェクション化された細胞系統ｃＭＴＩ７０−Ａ
６からの免疫沈澱させたＭＣ−１００蛋白質の（ｐＡｂ
ＳＧ３６９を用いる）ウェスタン−ブロットである。
【図４６】図４６は、一連の遺伝子交換性ハツカネズミ
脳中での、リボ探針を用いる人間のＡＰＰ ＲＮＡ表示
を示している。
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１４】
【図１５】
【図１６】
【図１７】
【図１８】
【図１９】
【図２０】
【図２１】
【図２２】
【図２３】
【図２４】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３１】
【図３２】
【図３３】
【図３４】
【図３５】
【図３６】
【図３７】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４１】
【図４２】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年４月１５日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】ｐＦＣ４中でクローン化されたアミロイド先駆
体蛋白質（ＡＰＰ）のｃＤＮＡ配列の一部である。
【図２】図１に続くＡＰＰのｃＤＮＡ配列の一部であ
る。
【図３】図２に続くＡＰＰのｃＤＮＡ配列の一部であ
る。
【図４】図３に続くＡＰＰのｃＤＮＡ配列の一部であ
る。
【図５】図４に続くＡＰＰのｃＤＮＡ配列の一部であ
る。
【図６】図５に続くＡＰＰのｃＤＮＡ配列の一部であ
る。
【図７】図６に続くＡＰＰのｃＤＮＡ配列の一部であ
る。
【図８】ｐＦＣ４の環状地図である。
【図９】ＡＰＰ遺伝子の５′−端部の説明図である。
【図１０】ＡＰＰ小遺伝子中でコード付けされた非変異
生成形のＡＰＰの遺伝子生成物の説明図である。
【図１１】ＡＰＰ小遺伝子中でコード付けされた変異生
成形のＡＰＰの遺伝子生成物の説明図である。
【図１２】構造中間生成物および生成物であるｐＭＴＩ
−２３０２、ｐＭＴＩ−２３０３、ｐＭＴＩ−２３０５
およびｐＭＴＩ−２３０４の説明図である。
【図１３】クローン化ベクトルであるｐＷＢ１６、ｐＭ
ＴＩ−２１１０、ｐＭＴＩ−２３００およびｐＭＴＩ−
２３０１中の多重結合剤の説明図である。
【図１４】ｐＭＴＩ−２３０１の環状地図である。
【図１５】構造中間生成物であるｐＭＴＩ−２３１４、
ｐＭＴＩ−２３１９、ｐＭＴＩ−２１３２０、ｐＭＴＩ
−２３２１、ｐＭＴＩ−２３２２、およびｐＭＴＩ２３
２５の説明図である。
【図１６】ｐＭＴＩ−２３０７の環状地図である。
【図１７】ｐＭＴＩ−２３１２の環状地図である。
【図１８】別形のＡＰＰにコード付けする小遺伝子構造
であるｐＭＴＩ−２３１０、ｐＭＴＩ−２３１４、ｐＭ
ＴＩ−２３１９、ｐＭＴＩ−２１３２０、ｐＭＴＩ−２
３２１、ｐＭＴＩ−２３２２、およびｐＭＴＩ−２３２
５の説明図である。
【図１９】ｐＭＴＩ−２３１４の環状地図である。
【図２０】構造中間生成物であるｐＭＴＩ−２３０７、
ｐＭＴＩ−２３１６、およびｐＭＴＩ−２３１７並びに
小遺伝子ｐＭＴＩ−２３１８の説明図である。
【図２１】構造中間生成物であるｐＭＴＩ−２３１２並
びにハツカネズミメタロチオネイン−Ｉゲノム性配列並
びに小遺伝子であるｐＭＴＩ−２３２３、ｐＭＴＩ−２
３３１、ｐＭＴＩ−２３３２、ｐＭＴＩ−２３２４、お
よびｐＭＴＩ−２３２６の説明図である。
【図２２】ｐＭＴＩ−２３２３の環状地図である。
【図２３】構成中間生成物であるｐＭＴＩ−２３２３並
びに小遺伝子であるｐＭＴＩ−２３２７およびｐＭＴＩ
−２３３７の説明図である。
【図２４】ｐＭＴＩ−２３３７の環状地図である。
【図２５】ｓｐ−ｓｐａｃｅｒＡ４およびＭＣ−１００
のＤＮＡ／アミノ酸配列を示している。
【図２６】ｓｐ−ｓｐａｃｅｒＡ４およびＳＰ−Ａ４の
ＤＮＡ／アミノ酸配列を示している。
【図２７】構成中間生成物であるｐＭＴＩ−２３２８、
ｐＦＣ４フラグメント、並びに小遺伝子であるｐＭＴＩ
−２３２９、ｐＭＴＩ−２３３３、ｐＭＴＩ−２３３
４、ｐＭＴＩ−２３３５およびｐＭＴＩ−２３３６の説
明図である。
【図２８】ＡＰＰ３′−端部ゲノム性クローンｐＳＶ１
および小遺伝子であるｐＭＴＩ−２３３９の説明図であ
る。
【図２９】ｐＭＴＩ−２３３９の環状地図である。
【図３０】ＡＰＰ遺伝子の３′−端部のＤＮＡ配列であ
る。
【図３１】ｐＮｏｔＳＶ２ｎｅｏの環状地図である。
【図３２】小遺伝子であるｐＭＴＩ２３６０、ｐＭＴＩ
−２３６１、ｐＭＴＩ−２３６２、ｐＭＴＩ−２３６
３、ｐＭＴＩ−２３６４、ｐＭＴＩ−２３６５、ｐＭＴ
Ｉ−２３６６、ｐＭＴＩ−２３６７、ｐＭＴＩ−２３６
８、およびｐＭＴＩ−２３６９用のｐＮｏｔＳＶ２ｎｅ
ｏ亜クローンの説明図である。
【図３３】ｐＭＴＩ−２３６０の環状地図である。
【図３４】ｐＮｏｔＳＶ２ｎｅｏ並びに小遺伝子である
ｐＭＴＩ−２３３９、ｐＭＴ１２３６９、ｐＭＴＩ−２
３４２、ｐＭＴＩ−２３４３およびｐＭＴＩ−２３４４
の説明図である。
【図３５】ＡＰＰ−ｌａｃＺレポーター遺伝子であるｐ
ＭＴＩ−２４０２の説明図である。
【図３６】標識の付いた単一−ストランド人間ＡＰＰＤ
ＮＡ探針を用いてその場でのハイブリッド化により検出
された正常ハツカネズミ中のＡＰＰｍＲＮＡの細胞分布
をを示す生物の形態（マウス大脳皮質断面）図に代わる
写真である。
【図３７】標識の付いた単一−ストランド人間ＡＰＰＤ
ＮＡ探針を用いてその場でのハイブリッド化により検出
された正常ハツカネズミ中のＡＰＰｍＲＮＡの細胞分布
をを示す生物の形態（ｂ．マウス小脳皮質断面；ｃ．マ
ウス三叉神経の神経節断面：ｄ．マウス肝臓断面）図に
代わる写真である。
【図３８】ＢＥ８０３遺伝子交換性ハツカネズミの脳切
片中の大腸菌β−ガラクトシダーゼ活性の組織化学的染
色模様を示す生物の形態図に代わる写真である。
【図３９】ＢＥ８０３遺伝子交換性ハツカネズミ（ａ、
ｂおよびｃ）の脳切片中の並びに正常ハツカネズミ脳
（ｄ）中の大腸菌β−ガラクトシダーゼ活性の組織化学
的染色模様を示す生物の形態図に代わる写真である。
【図４０】遺伝子交換性ＢＥ８０３ハツカネズミからの
小脳皮質（ａおよびｂ）、三叉神経節（ｃ）、並びに肝
臓（ｄ）中の大腸菌β−ガラクトシダーゼ活性の組織化
学的染色模様を示す生物の形態図に代わる写真である。
【図４１】遺伝子交換性ＢＥ８０３ハツカネズミの脳中
の大腸菌β−ガラクトシダーゼの細胞および亜細胞分布
を示す生物の形態図に代わる写真である。脳皮質中の大
腸菌β−ガラクトシダーゼ活性の組織化学的染色の光学
的顕微鏡像（ａ）。脳皮質中の大腸菌β−ガラクトシダ
ーゼ活性の組織化学的染色模様のノルマルキシ光学的像
（ｂおよびｃ）。ＢＥ８０３遺伝子交換性ハツカネズミ
からの脳皮質切片中の大腸菌β−ガラクトシダーゼの免
疫金の局在化。
【図４２】遺伝子交換性ＢＥ８０３ハツカネズミの脳中
の大腸菌β−ガラクトシダーゼの細胞および亜細胞分布
を示す生物の形態図に代わる写真である。
【図４３】一連の遺伝子交換性ハツカネズミ脳中の人間
ＡＰＰＲＮＡ表示のＳ１分析の結果を示すポリアクリル
アミドゲル（ＰＡＧ）電気泳動図に代わる写真である。
【図４４】第二の一連の遺伝子交換性ハツカネズミ脳中
の人間ＡＰＰＲＮＡ表示のＳ１分析の結果を示すＰＡＧ
電気泳動図に代わる写真である。
【図４５】モノクローン性抗体（ｍＡｂ）２２Ｃ−Ｈを
使用する人間ＡＰＰ小遺伝子を有する正常のハツカネズ
ミおよび遺伝子交換性ハツカネズミ脳中のＡＰＰ−６９
５、ＡＰＰ−７５１およびＡＰＰ−７７０のウェスタン
−ブロットの結果を示すＰＡＧ電気泳動図に代わる写真
である。
【図４６】ｍＡｂ５６−１を使用する人間ＡＰＰ小遺伝
子を有する正常のハツカネズミおよび遺伝子交換性ハツ
カネズミ脳中のＡＰＰ−７５１蛋白質表示のウェスタン
−ブロットの結果を示すＰＡＧ電気泳動図に代わる写真
である。
【図４７】人間ＡＰＰ小遺伝子でトランスフェクション
化されたＣＯＳ細胞中のＡＰＰ−６９５、ＡＰＰ−７５
１およびＡＰＰ−７７０蛋白質表示のウェスタン−ブロ
ット（ｍＡｂ２２Ｃ−ＩＩ使用）の結果を示すＰＡＧ電
気泳動図に代わる写真である。
【図４８】ｐＭＴＩ−４およびｐＭＴＩ−３８の環状地
図を説明している。
【図４９】ＫＳブルースクリプトであるｐＭＴＩ−４
１、ｐＭＴＩ−４３および４４並びにｐＭＴＩ−４２の
環状地図を説明している。
【図５０】構造中間生成物および生成物であるｐＭＴＩ
−５２−ｐＭＴＩ−５３、ｐＭＴＩ−５７およびｐＭＴ
Ｉ−５８の説明図である。
【図５１】クニッツモノクローン性抗体（５６−１、５
６−２、５６−３）とＡＰＰ蛋白質との反応性を示す電
気泳動図に代わる写真である。
【図５２】モノクローン性抗体５６−１の霊長類特異性
を示す電気泳動図に代わる写真である。
【図５３】兎のポリクローン性抗体であるｐＡｂ９０−
２９を用いる遺伝子交換性ハツカネズミＡＥ３０１＋２
０７（Ｆ１）からの脳組織切片の免疫細胞化学的染色を
示す生物の形態図に代わる写真である。
【図５４】兎のポリクローン性抗体であるｐＡｂ９０−
２８を用いる遺伝子交換性ハツカネズミＡＥ３０１＋２
０７（Ｆ１）からの脳組織切片の免疫細胞化学的染色を
示す（図５３中に記されているのと同様な場面でそれよ
り高い倍率）生物の形態図に代わる写真である。
【図５５】兎のポリクローン性抗体であるｐＡｂ９０−
２８を用いる遺伝子交換性ハツカネズミＡＥ３０１＋２
０７（Ｆ１）からの脳組織切片の免疫細胞化学的染色を
示す（図５３中に記されているのと同様な倍率）生物形
態図に代わる写真である。
【図５６】兎のポリクローン性抗体であるｐＡｂ９０−
２９を用いる遺伝子交換性ハツカネズミＡＥ８０３＋１
０５（Ｆ１）からの脳組織切片の免疫細胞化学的染色を
示す（図５３中に記されているのと同様な倍率）生物の
形態図に代わる写真である。
【図５７】遺伝子交換性ハツカネズミＡＥ３０１＋２０
７（Ｆ２）の海馬領域からの脳組織の薄い切片の断面図
に代わる電子顕微鏡写真である。
【図５８】遺伝子交換性ハツカネズミＡＥ３０１＋２０
７（Ｆ２）の海馬領域からの脳組織の薄い切片の断面図
に代わる電子顕微鏡写真である（図５７中に記されてい
るのとは異なる場面）。
【図５９】兎のポリクローン性抗体（ｐＡｂ）９０−２
９を用いる遺伝子交換性ハツカネズミＡＥ３０１＋２０
１（Ｆ２）の海馬領域からの脳組織の超薄切片の免疫金
染色図に代わる電子顕微鏡写真である。
【図６０】ｐＭＴＩ−７０の環状地図である。
【図６１】ｐＭＴＩ−２３７１の環状地図である。
【図６２】ｐＭＴＩ−７０トランスフェクション化され
た細胞系統であるｃＭＴＩ７０−Ｂ１、ｃＭＴＩ７０−
Ｂ２およびｃＭＴＩ７０−Ｂ３、並びに陰性対照用とし
て含まれている細胞系統であるｃＭＴＩ５２−Ａ４、ｃ
ＭＴＩ６６−Ｂ６、ｃＭＴＩ６６−Ｃ５、ｃＭＴＩ６９
−Ｃ６、ｃＭＴＩ６９−Ａ４、およびｃＭＴＩ６９−Ａ
５中での、ｐＡｂＳＧ３６９を使用するＭＣ−１００蛋
白質表示のウェスタン−ブロットの結果を示す電気泳動
図に代わる写真である。
【図６３】トランスフェクション化された細胞系統であ
るｃＭＴＩ７０−Ａ２、ｃＭＴＩ７０−Ａ３、ｃＭＴＩ
７０−Ａ６、ｃＭＴＩ７０−Ｂ１、ｃＭＴＩ７０−Ｂ
２、およびｃＭＴＩ７０−Ｂ３（ｐＭＴＩ−７０でトラ
ンスフェクション化された）中での、ｐＡｂＳＧ３６９
を使用するカドミウム誘導ＭＣ−１００蛋白質表示のウ
ェスタン−ブロットの結果を示す電気泳動図に代わる写
真である。細胞系統ｃＭＴＩ６３−Ｂ１、ｃＭＴＩ６３
−Ｃ２、およびｃＭＴＩ５３−Ａ１が陰性対照として含
まれていた。
【図６４】ｐＡｂＳＧ３６９を使用するトランスフェク
ション化された細胞系統ｃＭＴＩ７０−Ａ６中でのＭＣ
−１００蛋白質表示の免疫蛍光を示す生物の形態図に代
わる写真である。
【図６５】ｐＡｂＳＧ３６９を使用するトランスフェク
ション化された細胞系統ｃＭＴＩ７０−Ａ６中でのＭＣ
−１００蛋白質表示の免疫蛍光を示す生物の形態図に代
わる写真である（図６４中で示されているものより大き
い倍率、異なる場面）。
【図６６】ｐＡｂＳＧ３６９を使用するトランスフェク
ション化された細胞系統ｃＭＴＩ５３−Ａ１中での免疫
蛍光を示す生物の形態図に代わる写真である（図６４中
で示されているものと同じ倍率）。
【図６７】カドミウム誘導ｐＭＴＩ−７０トランスフェ
クション化された細胞系統ｃＭＴＩ７０−Ａ６からの免
疫沈澱させたＭＣ−１００蛋白質の（ｐＡｂＳＧ３６９
を用いる）ウェスタン−ブロットの結果を示す電気泳動
図に代わる写真である。
【図６８】一連の遺伝子交換性ハツカネズミ脳中での、
リボ探針を用いる人間のＡＰＰＲＮＡ表示を示す電気泳
動図に代わる写真である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図６２】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図６３】
【図１３】
【図１４】
【図１６】
【図１５】
【図２０】
【図１７】
【図２２】
【図２４】
【図１８】
【図３１】
【図５２】
【図１９】
【図３３】
【図６０】
【図２１】
【図３５】
【図２３】
【図２５】
【図２６】
【図２７】
【図６１】
【図２８】
【図２９】
【図３０】
【図３２】
【図３４】
【図３６】
【図３７】
【図４１】
【図４２】
【図３８】
【図３９】
【図４０】
【図４３】
【図４４】
【図４５】
【図４６】
【図４７】
【図６７】
【図４８】
【図４９】
【図５０】
【図５１】
【図５３】
【図６８】
【図５４】
【図５５】
【図５６】
【図５７】
【図５８】
【図５９】
【図６４】
【図６５】
【図６６】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ０１Ｋ 67/027 9123−2Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ 9050−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (72)発明者 トリプレイヤー・ブイ・ラマブハドラン アメリカ合衆国コネチカツト州06437ギル フオード・マレイレイン112 (72)発明者 アクセル・ウンターベツク ドイツ連邦共和国デー5060ベルギツシユグ ラートバツハ２・ロマーシヤイダーヘーエ ３ (72)発明者 ピーター・ラエ ドイツ連邦共和国デー4000デユツセルドル フ・アムオベレンベルト27 (72)発明者 ジヨージ・スカンゴス ドイツ連邦共和国デー4030ラテインゲン・ バルトゼーシユトラーセ（番地なし)

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）組織および細胞の特異的表示を指
    定できる調節領域、（ｂ）ＡＰＰまたはそれの誘導体を
    コード付けする遺伝子構成体、および（ｃ）ＲＮＡポリ
    アデニル化シグナルを含有している遺伝子配列を含んで
    いる、アミロイド先駆体蛋白質（ＡＰＰ）またはそれの
    誘導体類の表示用の小遺伝子。
JP3103981A 1990-04-10 1991-04-09 アルツハイマー病用のモデルとしての遺伝子交換性ハツカネズミ中の表示用組み換え型ａｐｐ小遺伝子 Pending JPH0767650A (ja)

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US507705 1990-04-10
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US656248 1991-02-20

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