JPH02306991A - インドフェニル配糖体の環状アセタール誘導体、その製法及びα―アミラーゼ活性測定用試薬への利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、多糖加水分解酵素、例えばアミラーゼの活性
を測定するのに有用なインドフェニル配糖体の環状アセ
タール誘導体およびその製法に関する。

〔従来の技術〕

膵臓や尿などの体液に含有されるα−アミラーゼの活性
を測定することにより、各種疾患の診断が行われている
。アミラーゼの活性測定法にはオリゴ糖の還元末端位に
フェノール誘導体が結合した、例えばｐ−ニトロフェニ
ルマルトペンタオシド（特公昭５７−５３０７９号公報
）、Ｐ−ニトロフェニルマルトへキサオシド（特公昭５
７−５３０７９号公報）、ｐ−ニトロフェニルマルトへ
ブタオシド（特開昭５４−５１８９２号公ｔｌ）　、ｐ
−ニトロフェニルマルトへブタオシド（特開昭５４−５
１８９２号公報）、２，４−ジクロ−ロフェニルマルト
ベンタオシド（特開昭５６−３５９９８号公報）などが
基質として利用される。

これらの基質は体液中のアミラーゼにより加水分解され
、生成したフラグメントがさらに予め含有しであるα又
はβ−グルコシダーゼによる加水分解を受けて例えばｐ
−二トロフェノールが′１ＪｉＬ離して来る。このｐ−
ニトロフェノールを光学的に測定することにより、α−
アミラーゼ活性が容易に測定されうる。しかしこのよう
な基質を用いてα−アミラーゼ活性を測定する場合に光
吸収の測定は４１０ｎｍ付近のかなり短い波長で行う必
要があり、試料液例えば血清中に、ビリルビン等の短波
長に吸収を有する物質が存在すると、その妨害を受は易
い。

一方、このような問題のない方法としてインドキシルマ
ルトデキストリンを用いる方法が知られている（特開昭
５６−１０３１９９号公報）。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、インドキシルマルトデキストリンは製造
が難しいこと、酸化剤によるインジコ色素の生成が遅い
点で優れた基質とは言い難い。また、予め含有しである
α又はβ−グルコシダーゼが僅かではあるが基質に作用
するため、ブランク値が上昇する欠点がある。このよう
な欠点を解消するため、マルトオリゴ塘の非還元性末端
のグルコースの４位又は６位のヒドロキシル基が修飾さ
れたタイプの基質を用いる方法が提案されている（例え
ば、特開昭６０−２３７９９８号公報、特開昭６１−６
３２９９号公報、特開昭６３−１７８９５号公報、特開
昭６３−１７８９５号公報、特開昭６３−７７９７号公
報に開示されている。）、シかしながら、これらの基質
を用いた場合にも吸収波長のピークが４１０ｎｍ付近に
あるため血清の光吸収が大きく測定誤差が大きくなると
いう問題があった。

本発明の目的は、α−アミラーゼにおいて血中の色素、
例えばビリルビンやヘモグロビンによる妨害や、予め含
有しであるα又はβ−グルコシダーゼによる基質の分解
を受けにくく、簡単な操作で、しかも検出感度の高い測
定を可能にする手段を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明のα−アミラーゼの活性測定用゛試薬として適す
るインドフェニル配糖体の環状アセタール誘導体は非還
元性末端のグルコースの４位と６位がアセタール誘導体
で修飾され、還元性末端がインドフェニル誘導体で修飾
された化合物（１）で〔１〕 （式中、Ｘ、ないしＸ、は水素原子、ハロゲン原子、ニ
トロ基、シアノ基、アジド基、アシル基、スルホン酸基
、ニトロソ基、スルホニル基、スルホキシル基、チオシ
アノ基、イソチオシアノ基、イソニトリル基、イミノ基
、アゾ基、ジアゾ基、アルキル基、アリル基又はアリー
ル基を意味し、Ｘ３とＸ４及び／又はＸ、とＸ６は連結
して縮合芳香環を形成してもよい、Ｒ１又はＲ２は同一
または異なって水素原子、低級アルキル基またはフェニ
ル基を意味し低級アルキル基としてはメチル、エチル、
プロピル、イソプロピル、ブチル等を又はＲ８とＲ２が
共同してシクロヘキサン環、シクロペンクン環を形成し
てもよい。）で表されるインドフェニル配糖体である。

又ｎが３．４または５であることが特に好ましい。

Ｒ７、Ｒｔの低級アルキル基はメチル基、エチル基、プ
ロピル基、イソプロピル基、ブチル基等であり、ｎは３
．４又は５であることが特に好ましい。

次にインドフェニル配糖体の環状アセタール誘導体とし
ては例えば下記の化合物が挙げられる。

ただし以下の式でＱは、 を表す（ｎは３又は５を表す）。

式ｉのインドフェニル配糖体の環状アセタール誘導体は
次式 する。）で表わされる４−アミノフェニル−配ｔｉ体の
環状アセタール誘導体に、次式 ２式％ （式中Ｘ、ないしＸｈは前記の意味を有する。）で表わ
されるキノン誘導体を作用させることにより製造するこ
とができる。

化合物■は例えば公知の方法（特開昭６１−６３２９９
号公報）で４−二トロフェニルーα−マルトペンタオシ
ドの非還元性末端４及び６位の水酸基をベンジリデンで
保護し、常法に従って、例えばラネーニッケル又はパラ
ジウム−カーボンを触媒に用い接触還元によってニトロ
基をアミン基に変換させることにより■を合成できる（
Ｃａｎ、Ｊ、Ｃｈｅｍ、３８巻３６３頁１９６０年）。

化合物Ｈの例としては４−アミノフェニル−α−マルト
ペンタオース、４−アミノフェニル−２−クロロ−β−
マルトヘプタオース、４−アミノ−２，６−ジフルオロ
−β−マルトヘキサオース、４−アミノ−２−ブロモフ
ェニル−β−ヘプタオース等の環状アセタール誘導体が
挙げられ、更に具体的には頁８の（１）〜（６）に示し
た化合物が挙げられる。

化合物■としては例えばＰ−キノン、２−クロロ−ｐ−
キノン、２，６−ジクロロ−ｐ−キノン、２．５−ジブ
ロモ−ｐ−キノン、２．３，５．６−テトラクロロ−ｐ
−キノン（クロラニル）、１．４−ナフトキノン、アン
スラキノン等が挙げられる。

目的物質である化合物■を製造するに際しては、化合物
■を無水条件下で、中性有機溶媒に溶解し、中性脱水剤
を共存させ、触媒量の強酸を加えたのち、化合物■を作
用させることが好ましい。

化合物■の使用量は、化合物■の１０〜５０倍モル当量
、好ましくは１５〜２５倍モル当量である。

中性有機溶媒としては、エーテル類例えばジエチルエー
テル、ＴＨＦ、ジオキサン等、炭化水素’Ｍ、例えばノ
ルマルヘキサン、ベンゼン、トルエン等、ハロゲン化炭
化水素類例えばジクロロメタン、クロロホルム、ジクロ
ロエタン、四塩化炭素等、ジメチルホルムアミド（ＤＭ
Ｆ）、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、ヘキサホスホ
ラミド（ＨＭＰＡ）　、ジメチルスルホキシド（Ｄ　Ｍ
　Ｓ　Ｏ）などが挙げられ、これらを組み合わせて用い
てもよい。

溶媒の量は、化合物■の重量の１０〜１００倍程度、好
ましくは４０〜６０倍である。

中性脱水剤としてはモレキュラシーブ、ＡｈＯｒ、Ｓｉ
ｎｇ、無水Ｎａ、ＳＯａ、無水ＭｇＳＯ４等が挙げられ
、これらを組み合わせて用いてもよい。その量は、化合
物■の重量の０．５〜５倍、好ましくは０．８〜１．５
倍である。強酸としてはトリフルオロ酢酸、トリクロロ
酢酸、Ｐ−）ルエンスルホン酸、メタノスルホン酸、発
煙硫酸、ＡｌＣｌ３、ＢＦｆｆ／Ｅｔ、０、ＴｉＣｌ４
、ＦｅＣｌｆｆ等が挙げられ、これらを組み合わせて用
いてもよい。その量は化合物■の０．０１〜０．１倍モ
ル当量好ましくは０．０２〜０．０４倍モル当量である
。

反応温度及び反応時間は、化合物■、化合物■、溶媒及
び強酸の種類によって異なるが、通常反応温度は１５〜
２５゛Ｃであり、０．５〜４時間反応を継続して行うこ
とにより反応は終了する。

反応終了後は反応液にアルカリを加えて中和し、水を加
えて化合物Ｉを水層に移行させる。中性有機溶媒層を分
離することによりそのなかに含まれている未反応のキノ
ン類を除く０分離した水層にアルコールを加えて化合物
を沈澱させ再結晶により精製することができる。さらに
ゲルクロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなど
を利用することにより単一化合物として分離することが
できる。

本発明の化合物■はα−アミラーゼの検出及び定量測定
のための基質として有用である。

測定方法としては、この化合物１及びα又はβ−グルコ
シダーゼを含む水溶液を作成する。この水溶液には更に
ｐＨ＄ｉ街剤、グルコシダーゼの活性化剤、安定剤等を
含むことができる。グルコシダーゼは別の溶液としても
よいが、化合物■と同じ溶液にするのが測定操作上簡便
である。化合物１とグルコシダーゼを含む溶液に試料液
を加えて一定条件下で加温して酵素反応させる。その後
、酵素反応によって生成したインドフェノール化合物の
特性吸収波長における吸光度の変化を測定し、検Ｍ線を
利用してα−アミラーゼを定量することができる。

（作用〕 本発明のインドフェニル配糖体の環状アセタール誘導体
はグルコース鎖部分とインドフェニル部分からなってお
り、まずα−アミラーゼによってグルコース鎖部分が切
断されてグルコース１又は２分子が残ったインドフェニ
ル化合物が生成する。

次に、α又はβ−グルコシダーゼが作用して残ったグル
コース分子を切り離し、インドフェノール化合物を遊離
させる。その結果、フェニル基の水酸基が解離して吸収
波長が変わる。その吸光度を測定することによってα−
アミラーゼを定量する。

本発明の化合物は非還元性末端のグルコースの４位と６
位がアセタール誘導体で修飾され還元性末端もインドフ
ェニル基が結合されているためグルコース鎖部分がα又
はβ−グルコシダーゼによって全く切断されない。

〔実施例〕

イソプロピリデン−フェノールインド−フェニル−α−
ペンタオサイドの製造とこれを用いたα−アミラーゼの
測定 （１）イソプロピリデン−４−二トロフェニルーα−ペ
ンタオサイド（特開昭６１−６３２９９号公報記載の方
法を参考にして合成した。）５．ＯＯｇをメタノ−ル２
００ｄに溶解し、５％パラジウムカーボン１．０ｇを加
え、常圧下に水素ガスを導入しながら２４時間撹拌した
０次いで、パラジウム−カーボンを濾別し、溶媒留去し
、イソプロパツールから再結晶すると、イソプロピリデ
ン−４−アミノフェニル−α−ペンタオサイドが２８５
ｇ得られた。

融点（’Ｃ）；１９２〜１９５（分解）（２）ｐ−ベン
ゾキノン１８．０　ｇを１，４−ジオキサン１００Ｉｄ
に溶解し、さらにトリフルオロ酢酸０．５−及びモレキ
ュラシープ（４Ａ）１５ｇを加え、混和しておいた。こ
れに上記（１）で得たイソプロピリデン−４−アミノフ
ェニル−α−ペンタオサイド２、ＯＯｇを加え、室温下
３０分間撹拌した。次に、ナトリウムメトキシドで反応
液を中和した。水２０〇−を加えクロロホルムで過剰の
ベンゾキノンを除いた。水層を凍結乾燥し黄色物質を得
た。バイオゲル（Ｐ−２）で精製し、溶出した区分をイ
ンプロパツールから再結晶すると、イソプロピリデン−
フェノールインド−フェニル−α−ペンタオサイド０．
９５　ｇが得られた。

融点（’Ｃ）；１８１〜１８３ 紫外部・可視部吸収スペクトル； スｗａｘ　　（ｎｒｍ）＝４６８．２６５赤外線吸収ス
ペクトル（ＣＩＩ＋−１）：１６４０．１６２０．１４
９１．１２５３．１０８２．１０４４．９９７．８７７ （３）次にアミラーゼ測定に際して問題となるα又はβ
−グルコシダーゼによる影ツの有無を調べた。

フェノールインド−フェニル−α−ペンタオサイドとイ
ソプロピリデン−フェノールインド−フェニル−α−ペ
ンタオサイドをｐｌ＋６．７の５０ｍＭグツド緩衝液に
それぞれ４■／−になるように溶解し、２つの基質溶液
（Ａ）、ＣＢ）を調製した。一方上記と同一の緩衝液に
α−グルコシダーゼが１５００／ｍｌ！、β−グルコシ
ダーゼが２００／ｄになる様に添加溶解して酵素溶液１
種を調製した。

酵素溶液０．５Ｊ！ｆ！に基質溶液（Ａ）、（Ｂ）をそ
れぞれ別々に０．５ｄずつ加えて混合し、３７°Ｃに放
置した。所定時間放置後１０＋Ｈの過ヨウ素酸カリウム
水溶液を添加し、６１０ｎａ＋の吸光度を測定した。そ
の結果を第１表に示す。

第１表 第１表から明らかな如く、フェノールインド−フェニル
α−ペンタオキサイドに対してα−グルコシダーゼとβ
−グルコシダーゼがわずかに作用して６１０ｎｍ吸光度
を１時間で０．３６０上昇させたのに対しイソプロピリ
デン−フェノールインド−フェニル−α−ペンタオサイ
ドはα−グルコシダーゼ等の作用を殆ど受けないので６
１０ｎｍの吸光度が０．０１０上昇したにすぎない。

以上の結果から明らかな如（、一般式（Ｉｌで示される
化合物はα−グルコシダーゼやθ−グルコシダーゼが殆
ど作用しないのでアミラーゼ測定試薬を一液化すること
が可能となり、測定操作上非常に有利であって、且つ測
定精度の向上に大きく寄与することができた。

（４）α〜アミラーゼ活性の測定 前項（２ンで得られた化合物２０ｍ　ｒｍｏρ、塩化カ
ルシウム１０ｍｍｏｆ及びα−グルコシダーゼ５００単
位を精製水に溶かして、水酸化ナトリウムでｐｌ＋６．
９とし、全量を２０７とした。

上記溶液２−に検体血清１００ｐＥを加え、３７°Ｃに
加温した後、この反応液の波長６１０ｎｍに於ける吸光
度変化を測定した。

別に、α−アミラーゼ活性既知の標準検体を用い、上記
と同様に操作し、検量関係を求め、この検量線から検体
のα−アミラーゼ活性を求めた。

このときの標準検体の各希釈段階に於けるα−アミラー
ゼ活性（Ｓｏｍｏｇｙｉ単位／ｄｌ）と波長６１０ｎｍ
に於ける１分間当りの吸光度増加Ｎ（ΔＡ）との関係を
第１図に示す。

第１図より明らかな如く、α−アミラーゼ活性（Ｓｏａ
＋ｏｇｙｉ単位／ｄ）に対単位／口ットした吸光度増加
量（ΔＡ）を結ぶ検量線は原点を通る直線となり、検量
線は良好な定量性を示している。

第１図から明らかなごとく、本発明の分析要素により管
理血清中のアミラーゼ活性を精度よく測定できた。

〔発明の効果〕

本発明のインドフェニル配糖体の環状アセタール誘導体
は、α−アミラーゼにおいて基質として使用した場合に
血中の色素、例えばビリルビンやヘモグロビンによる妨
害や、予め含有しであるα又はβ−グルコシダーゼによ
る基質の分解を受けにく（、簡単な操作で、しかも検出
感度の高い測定をすることができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例で得られた検量線を示し、横軸の各α
−アミラーゼ活性（Ｓｏｍｏｇｙｉ単位／ｄｉ）につい
て得られた吸光度増加量（ΔＡ）を横軸に沿ってプロッ
トした点を結んだものである。 特許出願人　　富士写真フィルム株式会社代　理　人　
　弁理士　国中　政治　はか１名第１図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式〔 I 〕 〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｘ＿１ないしＸ＿６は水素原子、ハロゲン原子
   、ニトロ基、シアノ基、アジド基、アシル基−スルホン
   酸基、ニトロソ基、スルホニル基、スルホキシル基、チ
   オシアノ基、イソチオシアノ基、イソニトリル基、イミ
   ノ基、アゾ基、ジアゾ基、アルキル基、アリル基又はア
   リール基を意味し、Ｘ＿３とＸ＿４及び／又はＸ＿５と
   Ｘ＿６は連結して縮合芳香環を形成してもよい。Ｒ＿１
   、Ｒ＿２は同一又は異なって水素原子、低級アルキル基
   またはフェニル基を意味し、Ｒ＿１とＲ＿２が共同して
   シクロヘキサン環、シクロペンタン環を形成してもよい
   、ｎは０から８までのいずれかの整数を表す。）で表わ
   されるインドフェニル配糖体の環状アセタール誘導体２
   、次式〔II〕 〔II〕 ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中Ｒ＿１、Ｒ＿２、Ｘ＿１及びＸ＿２、ｎは請求項
   １に記載のそれらと同義）で表わされる４−アミノフェ
   ニル配糖体の環状アセタール誘導体に次式〔III〕▲数
   式、化学式、表等があります▼〔III〕 （式中Ｘ＿３ないしＸ＿６は請求項１に記載のそれらと
   同義）で表わされるキノン誘導体を作用させることを特
   徴とする、請求項１に記載のインドフェニル配糖体の環
   状アセタール誘導体の製法 ３、アミラーゼの検出および定量的測定のための基質と
   しての請求項１に記載のインドフェニル配糖体の環状ア
   セタール誘導体の使用 ４、検出および測定が補助酵素としてのα及び／又はβ
   −グルコシダーゼの存在下に行われる請求項３に記載の
   使用