JPH076983B2 - 抗体の迅速検出のための組成物、診断キット及び方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生物学的試料における抗体、特にウイルス抗
体の検出に有用な稀釈剤及び洗浄組成物に関する。本発
明は又それらを含有する診断キット及びそれらの抗体の
検出のための迅速且つ高感度方法に関する。本発明は特
にレトロウイルス抗体の検出に有用である。

〔従来の技術〕

人及び動物の免疫系は、驚く程複雑であり且つ宿主を何
等かの形で宿主に入る外来化学的或いは生物学的物質に
より引起される悪い影響から保護するための機構を有し
ている。そのような外来物質としては、ハプテン類、抗
原類、ウイルス類、微生物類、薬品類、ホルモン類、植
物レクチン類及びその他の当業者に容易に明らかな物質
が挙げられる。本明細書において、そのような実質は、
「リガンド類」と称される。宿主がリガンドにより侵さ
れると、宿主は通常リガンドと特異的に複合形成するタ
ンパク質を応答的に産生する。そのようなタンパク質
は、抗体として知られている。適当な診断及び治療のた
めにリガンドの存在を検出することが、しばしば望まし
い。

しかしながら、リガンドは例えばそれが宿主中にその他
の物質によってマスクされているか或いは標準的アッセ
イによっては検出不能の極めて低濃度で存在する場合に
は容易に検出されない場合がある。抗体は対応するリガ
ンドと特異的に反応して免疫学的複合体を形成するの
で、抗体の反応はリガンドの存在が検出不能である場合
にもしばしば検出可能である。従って、免疫学的反応を
用いて、抗体をリガンドの存在の指示として検出するア
ッセイを設計することが可能な場合がある。

その他の場合においては、抗体は自動免疫応答のために
宿主生物体、即ち、抗体が宿主の正常な組織、細胞或い
は器官に対して産生される異常な状況に存在することが
ある。そのような場合における抗体の検出は宿主におけ
る病理学的活動を同定することを助けることがある。

人及び動物内に存在するウイルス類は、それらが宿主生
物に及ぼす影響のみならず、検出、診断、治療及び汚染
防止のための改良された手段に対する継続的な需要のた
めに、今日主たる健康上の関心事である。ウイルスのあ
るものは宿主生物体に害を及ぼさないのに対し、他のも
のは単に小さい不快或いは一時的不便を引起こす。しか
しながら、尚その他のものは深刻な病気及び死の結果を
引起こすことがある。

従って、宿主生物体におけるウイルスの存在を有効な治
療、適切な健康上の安全対策のために、或いは他の人或
いは動物により用いられる生物学的流体、組織或いは器
官をスクリーニングするために、迅速に検出するための
明らかな理由が存在する。

ウイルス粒子及びウイルス感染細胞は、これらの成分に
特異的な抗体を産生する免疫学的応答を誘発しうる特異
的抗原成分を含有する。ある場合においては、これらの
抗原成分はそれらに特異的な抗体を用いてin vitroで検
出することができる。しかしながら、その他の場合にお
いては、生物体内に産生された抗体を検出することがよ
り容易、或いはより好都合であることがある。

ヒトレトロウイルス類は、ある属として、それらが感染
する標的Ｔ−リンパ球上に有意な増殖或いは細胞変成効
果を及ぼす関連した外因性レトロウイルス類の一群を表
わす。これらのレトロウイルス類の得られる効果として
は、ウイルスにより感染された人におけるＴ−細胞増殖
白血病、Ｔ−細胞枯凅及び免疫抑制などが挙げられる。
これらのレトロウイルス類はT4屈性レトロウイルス類の
HTLV（ヒトＴ−細胞白血病リンパ腫ウイルス）及びHIV
（ヒト免疫不全ウイルス）属として知られている。

最初に発見されたレトロウイルス（HTLV-I）が成人Ｔ−
細胞白血病により代表される成熟Ｔ−細胞白血病及びリ
ンパ腫の病原菌であるように思われる（例えば、Poiesz
等、Proc.Nat.Acad.Sci.,U.S.A.,77,1980、及びヨシダ
等上記文献79、1982、参照）。現在では、HTLV-I及びＴ
−細胞悪性が、ある種のカリブ海諸島及び南日本の人口
において増加した率で発生すると思われているが、HTLV
-Iは今や世界的医学上の関心事として広く認識されてい
る。HTLV-Iで感染された或いはこのウイルスに接触した
人々は、一般的にその体液時に血液中にHTLV-Iに向けら
れた抗体を有する。加えて、熱帯性痙攣不全対麻痺（Tr
opical SpasticParaparesis）として知られている神経
障害に悩む相当部分の患者がHTLV-Iに対する抗体を有す
る。

継続的研究は医学的に相当重要である幾つかのレトロウ
イルス類があることを決定した。HTLV-IIの他に第三の
ウイルスが発見され、HTLV-III、リンパ節疾患関連ウイ
ルス（LAV）及びHIV-I（下記に説明）として色々同定さ
れている。

後天性免疫不全症候群（AIDS）は、世界の幾つかの地域
において明らかとなった比較的最近認識された病気であ
る。この病気は、同性愛実行の男性、不法な静脈内薬物
使用者、血友病患者、輸血受容者を含むある種の国の人
口の高危険分子、及びこれらの高危険群と密接な異性関
係を有するものに支配的であることが観察されている。
米国及びフランスの研究者によって、この病気はレトロ
ウイルスHIV-Iの伝達により伝播されることが見出され
た。

今日まで、AIDSに対する何等の治療も見出されておら
ず、医学的及び化学的観察は治療が近い将来に見出され
そうもないことを示している。更に、この病気に悩むも
のは、死亡するようであることが良く知られている。こ
れらの悲劇的結果がこの病気に関連する医学的及び診断
研究における緊急性に拍車をかけている。

その他のウイルス病と同様に、HIV-Iの曝露、或いはそ
れからの感染は、免疫学的応答即ち抗体の産生をもたら
す、具体的には、このウイルスの抗原に対する抗体が、
数多くの血清疫学研究において、研究者及び臨床医によ
って検出されている。数多くの人の生物学的流体はHIV-
I感染に対するベクターと考えられる。ヒト血液はウイ
ルス或いはそれに対する抗体が見出される主たる生物学
的流体である。HIV-I抗体をそれらの血液に有する人々
は、必らずしもそのウイルスを保有或いは自らAIDSを発
生するとは限られないが、そのような個人との接触或い
は血液の供与によるウイルス伝播に関する深刻な心配が
残る。従って、血液試料中にHIV-I抗体の存在を検出す
るための迅速且つ高感度なアッセイを提供する研究及び
開発が続けられている。血液バンクはウイルスのない供
給を確実にするために、供与血液をスクリーニングする
ことに、明らかな関心を有している。病院及びオフィス
における医学及び歯科の開業医は、彼等の患者並びに自
らを適切にウイルス感染から保護するための診断試験を
必要としている。

抗原或いはHIV-I抗体を含む抗体の検出のために多くの
免疫学的技術が知られている。例えば、米国特許4,520,
113号及び4,708,818号明細書は、HIV-I抗体検出のため
にラジオイムノアッセイ、ウエスタンブロット技術及び
ELISA（酵素結合免疫吸着剤アッセイ）を記載してい
る。欧州特許234,941号明細書は競争的アッセイを記載
している。

〔発明が解決しようとする課題〕

数多くの有用なアッセイが公知であるが、それらは一般
的にアッセイに長時間を必要とし（欧州特許公開公報23
4,941号、実施例３）、及び又正確な結果を得るために
広汎な設備及び複雑な実験方法を必要とする。これが試
験の費用並びに誤診を増大させる。

更に、そのような面倒な且つ時間のかかる試験はレトロ
ウイルス（或いは任意のその他のウイルス）の存在の決
定が迅速に必要とされる場合には、適当でない。例え
ば、警察署、外傷センター、病院緊急室、移民オフィス
及び歯科並びに医学オフィスにおける開業医又は臨床医
は、患者があるウイルスに感染しているかどうかを直ち
に知る必要があることがある。そのような場合について
迅速なウイルス試験は有意義な進歩である。又、迅速ウ
イルス試験は、通常の医学的或いは試験施設が存在しな
い世界の遠隔地域において使用するために極めて貴重な
ものとなる。

よって、生物学的試料におけるウイルス抗体の迅速且つ
高感度のアッセイの需要が技術的に存在する。

〔課題を解決するための手段〕

前記した従来のアッセイにおける問題は本発明によって
克服される。

即ち、本発明に従えば、５〜10のpHに緩衝化され、且つ
非イオン性、アニオン性又は両性界面活性剤、分子量20
0未満の水混和性極性有機溶媒、並びに少なくとも0.25
のイオン強度を与えるのに十分な量で存在するアルカリ
金属又はアンモニウム塩を含んでなる免疫分析用水性洗
浄組成物が提供される。

本発明に従えば、また、６〜10のpHに緩衝化され、且つ
未変性又は未誘導化タンパク質又は未変性又は未誘導化
炭水化物、界面活性剤及びアシル化、アルキル化又はス
ルホニル化によって５以下のpIを有するように変性した
タンパク質を含んでなる希釈剤組成物が提供される。

本発明に従えば、更に、 A.あるリガンドに特異的である抗体を含有する疑いのあ
る生物学的試料を、６〜10のpHに緩衝化され且つ未変性
又は未誘導化タンパク質又は未変性又は未誘導化炭水化
物、界面活性剤及び陰性荷電した５以下のpIを有するタ
ンパク質を含んでなる希釈剤組成物と混合する工程、 B.前記した希釈試料をリガンドと接触させてリガンドと
試料中に存在する抗体との免疫学的複合体を形成する工
程、 C.複合体形成前、それと同時又はその後にリガンドを固
体状基体に結合されて不溶化する工程、 D.工程Ｃにおける結合と同時に又はその後複合体をその
上に保持する微多孔性濾過膜を用いて未複合化材料から
複合体を分離する工程、 E.分離工程より前、それと同時、又はその後複合体をリ
ガンド抗体に向けられた酵素標識化抗体と接触させて抗
原−抗体−抗体複合体を形成する工程、 F.膜により保持された抗原−抗体−抗体複合体を水性洗
浄溶液で洗浄して未複合化材料を複合体から分離する工
程、並びに G.酵素の存在下において検出可能な種を与えることので
きる試薬組成物を添加して、試料中の抗原に対する抗体
の存在の指示としてその種の存在を決定する工程を含ん
でなる抗体の決定方法が提供される。

本発明に従えば、更にまた、 （ａ）６〜10のpHに緩衝化され、且つ本変性又は未誘導
化タンパク質又は未変性又は未誘導化炭水化物、界面活
性剤及び陰性荷電した５以下のpIを有するタンパク質を
含む希釈剤、 （ｂ）５〜10のpHに緩衝化され、且つ界面活性剤を含む
水性洗浄組成物、並びに （ｃ）濾過膜を含むテストデバイス を含んでなる生物学的試料中の抗体の決定に有用な診断
キットが提供される。

〔実施態様〕

本発明のキット及びアッセイを用いて人又は動物宿主か
らの生物学的試料中の抗体の存在を迅速に検出すること
ができる。そのようなアッセイが可能な生物学的試料と
しては、全血又はその成分（血清もしくは血漿）、唾
液、涙液、髄液、糞、尿、膣分泌物、精液、人組織又は
器官抽出液及び人乳が挙げられるが、それらに限定され
るものではない。本発明は特に人血清或いは血漿のアッ
セイに有用である。

任意の化学的或いは生物学的リガンドに対する抗体が本
発明を用いて検出することができる。このリガンドは、
宿主を侵す外来物質であり得る（抗原、ウイルス、ハプ
テン、薬物、ホルモン、植物レクチン、毒素、微生物及
び技術的に容易に明らかとなるその他のもの）。或いは
又、抗体は宿主中の自己免疫応答から産生されうる。

本発明は特に人又は運動ウイルスに対する抗体を検出す
るのに有用であり、それらの抗体としては、例えばレト
ロウイルス類もしくはそれらの成分、インフルエンザ
類、ヘルペス、ヘパチチス、サイトメガロウイルス、エ
プスタインバーウイルス及びルベラなどに対する抗体が
挙げられるが、これらに限定されるものではない。特
に、HTLV-I及び−II、HIV-I及び−IIの任意のものに対
する個々の抗体或いは組合わせを検出することができ、
HIV-I抗原に対する抗体が最も注目されるものである。

ある患者から得られる生物学的試料（例えば血清もしく
は血漿）はリガンド（例えば、アッセイを行う人に対し
て健康上の危険を示すウイルス）並びにその抗体を含有
することがあるので被検出抗体に影響を及ぼすことなし
にリガンドを不活性化するために適当な方法で試料を処
理することが望ましいことがある。例えば、有用なウイ
ルス不活性化技術としては、適当な温度における適当な
時間の熱処理、超音波処理又は界面活性剤、アルコー
ル、過酸化物、デキストランサルフェート、漂白剤、又
はその他のウイルスを殺生する試薬による処理などが挙
げられる。その他の技術は当業者に容易に明らかであ
る。ウイルスはアッセイに使用する前に、或いは本発明
のアッセイの初期段階に際して不活性化することができ
る。

ある特異的リガンドに対する抗体の検出は、先ず試料を
本発明の水性稀釈剤組成物と混合することにより達成さ
れる。この組成物は、以下に説明する何等かの方法で追
加の陰性荷電を与えるために変成されるタンパク質及び
炭水化物とは対照的に、それらの未変成又は未誘導化状
態にある１種以上のタンパク質又は炭水化物を含む。こ
れらのタンパク質又は炭水化物は単独で又は混合物とし
て用いることができる。代表的な材料としては、アラビ
アゴム、デキストラン、ゼラチン、アルゴット（argo
t）及び人又は動物の血清又はその成分（例えば、牛血
清アルブミン、牛胎児血清、ウサギ血清、人血清又は山
羊血清）などが挙げられるが、これらに限定されるもの
ではない。アラビアゴム又は牛血清アルブミンが好まし
い。このタンパク質又は炭水化物は通常少なくとも0.5
重量％、好ましくは0.5〜10重量％の量（全組成物重量
基準）で存在する。

試料及び稀釈剤組成物は適当な容器内で通常10°〜40
℃、好ましくは15°〜25℃の範囲の温度で混合される。
混合時間は通常数秒であるが、しかし、必要に応じてよ
り長い時間を使用することができる。

この組成物は又、組成物のpHを６〜10、好ましくは7.5
〜8.5に維持する１種以上の緩衝剤も包含する。有用な
緩衝剤は周知であり、例えば、トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン、ホスフェート、グリシン、モルホリ
ノプロパンスルホン酸、モルホリノエタンスルホン酸そ
の他の周知のものが挙げられるが、これらに限定される
ものではない。

更に、この稀釈剤組成物は、１種以上の水溶性或いは水
分散性界面活性剤を含有する。これらの界面活性剤は非
イオン性、アニオン性或いは両性でありうる。ウイルス
抗原と対応する抗体の複合化或いは稀釈剤組成物内のそ
の他の成分の望ましい感度を提供する能力に悪影響を及
ぼさない任意の適当な界面活性剤を用いることができ
る。

特に有用な界面活性剤としては、ポリオキシエチレン誘
導体、例えばエトキシル化脂肪エステル類或いはその混
合物などを含む非イオン性界面活性剤が挙げられるが、
これらに限定されるものではない。代表例としては、ポ
リオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキ
シエチレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエ
チレンソルビタンモノステアレートなどが挙げられる。
代表的なエトキシル化脂肪エステル類はTweenの商標名
（ICI Americas,Inc.）及びT-MAZ （MazerChemicals）
として市販されている。Tween-20は特に有用な非イオン
性界面活性剤である。界面活性剤は通常少なくとも0.0
1、好ましくは0.1〜３重量％の量で存在する。

この稀釈剤組成物は又陰性荷電した有機化合物又はその
混合物も含んでなる。この５以下のpIを有するタンパク
質は抗体及び抗原による非−特異的相互作用が有意に減
少されるようにアッセイに高度の陰性の環境を提供する
ものである。この環境は化学的に変成されたタンパク質
もしくは炭水化物、アニオン性界面活性剤、陰性荷電し
た緩衝剤又はその他の稀釈剤及び生物学的試料内の他の
陰性荷電した材料を有効に反撥するのに必要な陰性荷電
を有する化学的又は生物学的化合物により与えることが
できる。

特に有用な陰性荷電した５以下のpIを有するタンパク質
は何等かの方法で化合物に低pIを与えるように変成され
た水溶性タンパク質である。タンパク質の混合物も又使
用することができる。pIという用語（即ち、等電点）
は、分子が荷電において中性であるように分子内に等数
の陽電荷及び陰電荷があるpHとして知られている。pIは
標準的材料及び操作を用いて測定することができる。例
えば、それは3.5〜9.5のpH範囲を有するLKB Ampholine
PAGプレート（商標名、LKB-Produkter AB、スウェーデ
ン、ブロンマから販売）及び標準的目盛測定器を用いる
等電収束法により測定することができる。

有用な変成タンパク質としては、カゼイン誘導体その他
の陰性荷電したタンパク質誘導体（例えば、カゼインの
アシル化、アルキル化又はスルホン化から得られた誘導
体、例えばスクシニル化カゼイン、スクシニル化牛血清
アルブミン、カルボキシメチルカゼイン及びスクシニル
化コラーゲン）などが挙げられる。これらの材料は、適
当な条件を用いて利用可能なアミン基を有するタンパク
質をアシル化、アルキル化又はスルホン化することによ
り容易に調製される。有用なアシル化剤としては、米国
特許4,591,571号明細書に記載されるもの、例えばジカ
ルボン酸及びポリカルボン酸から誘導される無水物、ア
シルハライド及びエステル類などが挙げられるが、これ
らに限定されるものではない。スクシニル化カゼインの
製法を以下に説明する。

タンパク質を変成するのに有用なアルキル化及びスルホ
ン化剤としては、ブロモ酢酸、クロロ酢酸、フルオロニ
トロベンゼン、ｍ−（クロロスルホニル）安息香酸、ブ
ロモマロン酸、ブロモプロピオン酸及びｐ−（クロロス
ルホニル）安息香酸が挙げられるが、これらに限定され
るものではない。

好ましい低pIタンパク質としては、スクシニル化カゼイ
ン、スクシニル化牛血清アルブミン及びスクシニル化コ
ラーゲンなどが挙げられる。スクシニル化カゼインが最
も好ましい。

低pIタンパク質は少なくとも0.1重量％、好ましくは１
〜３重量％（全組成物重量基準）の量で存在する。

稀釈剤は又稀釈剤組成物の他の成分を妨害したり、或い
は他の成分に悪影響を及ぼしたりしない過酸化物又はデ
キストランサルフェートなどの１種以上のウイルス不活
性化剤を含むこともできる。

一度試料を稀釈剤組成物と混合すると、稀釈試料を次い
で試料中の抗体と反応性の適当なリガンドと接触させ
る。抗体が存在するならば、この接触はリガンドとその
リガンドに向けられた抗体の免疫学的複合体を生成す
る。この接触及び複合体の形成は迅速に、通常５分以
内、好ましくは１分以内に起こる。この稀釈試料及び免
疫学的試薬は通常適当な時間一緒に混合され、15〜30℃
の温度、より好ましくは18〜25℃の温度でインキュベー
トされる。

一つの実施態様において、リガンド及び抗体は反応して
水溶性複合体を形成し、それは更に反応して不溶性複合
体を形成する。例えば、リガンドを不溶性基材上のアビ
ジンに結合するために、ビオチニル化することが可能で
ある。その他の結合手段も公知である。この可溶性複合
体は更にリガンドに対してその他の抗体又は試料中のリ
ガンド抗体に対して特異的な抗−抗体と更に反応させる
ことも可能である。

好ましい実施態様において、リガンドは得られる複合体
が複合化反応により不溶化されるように不溶性基体に結
合されている。適当な基体としては、磁性粒子、ガラス
又は重合体粒子、ガラス又は重合体繊維、膜、試験管の
側面、試験装置、マイクロタイターウェル及びその他の
当業者に容易に明らかなものが挙げられるが、これらに
限定されるものではない。リガンドの基体への結合は任
意の適当な方法、例えば反応性基を介しての吸着或いは
共有結合、アビジン−ビチオン結合、タンパク質その他
の結合性化合物、又はその他の公知の技術により達成す
ることができる。

より好ましくは、リガンドは、リガンドが適当に結合し
た重合体粒子よりなる免疫学的試薬の一部である。この
試薬は任意の適当な組成の重合体粒子から形成すること
ができる。ポリアミド、ポリカーボネート、ポリビニル
芳香族、ポリエステルその他の重合体から作製される多
くの適当な粒子が公知である。正確な組成は、リガンド
の結合方法及び所望とされる特別のリガンド密度に応じ
て異る。一般的に粒子上のリガンドの表面密度はアッセ
イにおける満足できる感度を与えるのに十分なものであ
る。それは結合されるリガンドに応じて異る。リガンド
結合の方法が吸着である場合に、有用な重合体粒子の種
類はある種の材料により構成されるのに対し、好ましい
共有結合に対してはその他の材料がより有用である。上
記の如き結合方法は周知である。リガンドの共有結合は
通常リガンドの遊離アミン又はスルフヒドリル基と直接
に又は結合（例えばアビジン−ビオチン或いはタンパク
質類）を介して反応することのできる表面反応性基を用
いて通常達成される。そのような表面反応性基として
は、カルボキシ、エポキシ、アルデヒド、活性ハロゲン
原子、活性化２−置換エチルスルホニル及びその他の公
知の基を挙げることができるが、これらに限定されるも
のではない。以下の好ましい実施態様に関する説明は例
示を目的としたものにすぎず、限定を意図するものでは
ない。

特に有用な重合体粒子は、通常0.01μｍより大きい平均
粒子径を有する水不溶性ラテックス粒子である。それら
は、その少なくとも一つが活性ハロゲン原子或いは活性
化２−置換エチルスルホニル或いはビニルスルホニル基
を有する１種以上のエチレン性不飽和重合性単量体から
製造される重合体により構成される。

活性ハロゲン原子を有する単量体としては、ビニルクロ
ロアセテート、ビニルブロモアセテート、ハロアルキル
化ビニル芳香族（例えば、クロロメチルスチレンもしく
はブロモメチルスチレン）、ハロアルキルアクリル又は
メタクリルエステル類（例えば、クロロメチルメタクリ
レート、３−クロロ−２−ヒドロキシプロピルメタクリ
レート及び３−クロロプロピルアクリレート）、N-｛3-
〔Ｎ′‐（３−クロロプロピオニル）ウレイド〕プロピ
ル｝メタクリルアミド、4-（３−クロロプロピオンアミ
ド）スチレン、4-〔Ｎ′‐（３−クロロプロピオニル）
ウレイド〕スチレン、2-（３−クロロプロピオンアミ
ド）エチルメタクリレート、N-〔3-（３−クロロプロピ
オンアミド）プロピル〕メタクリルアミド、N-（３−ク
ロロアセトアミドプロピル）メタクリルアミド、N-（２
−クロロアセトアミドエチル）メタクリレート、４−ク
ロロアセトアミドスチレン、４−クロロアセトアミドメ
チルスチレン、N-〔3-（Ｎ′−クロロアセチルウレイ
ド）プロピル〕メタクリルアミド、N-〔2-（Ｎ′−クロ
ロアセチルウレイド）エチル〕メタクリルアミド、4-
（Ｎ′−クロロアセチルウレイド）スチレン、ｍ＆p-
（Ｎ′−クロロアセチルウレイドメチル）スチレン及び
当業者に公知のその他の単量体が挙げられる。ハロアル
キル化ビニル芳香族、例えば炭素数１〜３の活性ハロア
ルキル基を有するものは、活性ハロゲン原子を反応基と
して用いる場合に好ましい。クロロメチルスチレンが最
も好ましい。

好ましい活性２−置換エチルスルホニル及びビニルスル
ホニル単量体は一般式（Ｉ）により表わすことができ
る： 式中、Ｒは水素又は置換もしくは未置換アルキル（一般
的に炭素数１〜６のもの、例えばメチル、エチル、イソ
プロピル又はヘキシル）である。好ましくは、Ｒは水素
又はメチルである。

R¹は−CH＝CHR²又は−CH₂CH₂Xであり（式中Ｘは求核試
薬により置換されるか又は塩基による処理でHXの形で除
去される離脱基（例えば、ハロ、アセトキン、メチルス
ルホニルオキシなどのアルキルスルホニルオキシ、ｐ−
トリルスルホニルオキシなどのアリールスルホニルオキ
シ、トリアルキルアンモニオ例えばトリメチルアンモニ
オ塩もしくはピリジニオ塩）である。R²は水素又は置換
もしくは未置換のアルキル（通常、Ｒについて規定され
た炭素数１〜６のもの）、又は置換もしくは未置換のア
リール（通常核炭素数６〜12のもの、例えばフェニル、
ナフチル、キシリルもしくはトリル）である。好ましく
は、R¹は−CH₂CH₂Xである。活性化２−置換エチル基で
あるこの基は離脱基Ｘの置換を害しない任意の基によっ
て置換することができる。

Ｌは通常炭素数１〜20であり、骨格中にヘテロ原子を有
する置換もしくは未置換のアルキレンであり得る結合基
である。このアルキレンの定義は、オキシ、チオ、−NR
³−に〔茲にR³は水素又は炭素数１〜６の置換もしくは
未置換のアルキル（例えば、メチル、クロロメチルもし
くは２−ヒドロキシ基）又は炭素数６〜10の置換もしく
は未置換のアリール（例えばフェニル、ナフチルもしく
はキシリル）である〕、エステル（−COO−）、アミド
（−CONH−）、ウリレン スルホニル（−SO₂−）、カーボネート、スルホンアミ
ド、アゾ、ホスホノ又はその他の同様な基により中間或
いは末端に有するアルキレン基を含むものである。代表
的なアルキレン基としては、メチレン、エチレン、イソ
ブチレン、ヘキサメチレン、カルボニルオキシエチレン
オキシカルボニルエチレン、メチレンビス（イミノカル
ボニル）エチレン、カルボニルオキシドデシレンカルボ
ニルオキシエチレン、カルボニルイミノメチレンイミノ
カルボニルイミノエチレン、カルボニルイミノメチレン
イミノカルボニルエチレン及び当業者に公知のその他の
基が挙げられる。

Ｌは又通常６〜12個の核炭素原子を有する置換もしくは
未置換アリーレンでもありうる。代表的アリーレン基と
しては、上記特許に示されるフェニレン、トリレン、ナ
フチレンなどが挙げられる。この定義のＬには又上記ア
ルキレンとアリーレンのそれぞれ１種以上の組合わせで
ある二価基（例、アリーレンアルキレン、アルキレンア
リーレンアルキレンその他の当業者により容易に決定さ
れるもの）並びに１種以上のアミドもしくはエステル基
を中間もしくは末端に含む組合わせ（例、カルボニルイ
ミノアリーレンアルキレン）などが含まれる。好ましく
は、Ｌは置換もしくは未置換のフェニレンアルキレン
〔例、１種以上のアルキル基で置換（Ｒについて規定さ
れたもの）、アルコキシ基（通常炭素数１〜６を含有す
る。例えばメトキシ、プロポキシもしくはブトキシ）又
はハロ基で置換されたもの〕、カルボニルイミノアリー
レンアルキレン（茲にアリーレン及びアルキレンは上記
の通りである）、又はカルボニルイミノアルキレンイミ
ノカルボニルアルキレン（茲にアルキレンは上記の通り
である）である。

代表的な有用な単量体としては、ｍ＆ｐ−（２−クロロ
エチルスルホニルメチル）スチレン、ｍ＆p-〔2-（ｐ−
トリルスルホニルオキシ）エチルスルホニルメチル〕ス
チレン、ｍ＆ｐ−ビニルスルホニルメチルスチレン、N-
〔ｍ＆p-（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニ
ル〕アクリルアミド及びN-〔2-（２−クロロエチルスル
ホニル）エチルホルムアミドメチル〕アクリルアミドな
どが挙げられる。最初の単量体が好ましい。

上記単量体の１種以上を単独で又は組合わせて重合させ
て単独又は共重合体を形成することができる。或いは、
及び好ましくは、１種以上の単量体を少なくとも１種の
その他のエチレン性不飽和重合性単量体と共重合させ
る。通常そのような単量体は、疎水性、分散性、或いは
その他の特徴などの各種望ましい特性を与える。

代表的な有用な重合体としては、次のものが挙げられ
る：ポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン）、ポリ（ス
チレン−コ−ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン−コ−２−
ヒドロキシエチルアクリレート）（67:30:3モル比）、
ポリ（スチレン−コ−ｍ＆ｐ−クロロエチルスルホニル
メチルスチレン）（95.5:4.5モル比）、ポリ｛スチレン
−コ−N-｛ｍ＆p-（２−クロロエチルスルホニルメチ
ル）フェニル〕−アクリルアミド（99.3:0.7モル比）、
ポリ（ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン−コ−メタクリル
酸）（95:5、98:2及び99.8:0.2モル比）、ポリ（スチレ
ン−コ−ｍ＆ｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレ
ン−コ−メタクリル酸）（93.5:4.5:2モル比）、ポリ
｛スチレン−コ−N-〔ｍ＆p-（２−クロロエチルスルホ
ニルメチル）フェニル〕アクリルアミド−コ−メタクリ
ル酸｝（97.3:0.7:2モル比）及びポリ（スチレン−コ−
ｍ＆ｐ−クロロメチルスチレン）（70:30モル比）。

免疫学的試薬の調製に際して、リガンド（例えばウイル
ス抗原）は、通常結合方法（吸着もしくは共有結合）に
応じて異る適当な条件下に粒子と混合される。反応性ハ
ロ原子、活性化２−置換エチルスルホニルもしくはビニ
ルスルホニル基を有する上記好ましい粒子と結合するた
めには、リガンドを通常粒子と20°〜40℃の温度におい
て24時間まで混合する。粒子懸濁液を通常７〜10のpHに
緩衝化する。混合物中において、粒子は通常少なくとも
0.2重量％の量で存在し、又リガンドは少なくとも１％
（粒子の全重量基準）の量で存在する。

好ましい実施態様の実施に有用なウイルス抗原は、任意
の適当な方法で調製することができる。例えば、それは
細胞培養液或いは感染動物或いは人宿主などの生物学的
源泉から単離するか或いは各種生物技術的技術を用いて
合成することができる。

好ましい実施態様においては、レトロウイルス抗原は任
意の適当な方法により得ることができる。それは、天然
のウイルス物質もしくはその成分、又は例えばPCT公報8
6/01834及び86/02930及び米国特許4,725,669号各明細書
に記載されているような組換えDNA技術を用いて製造さ
れた合成ペプチド類或いはポリペプチド類でありうる。
その他のHTLV-I,HTLV-II,HIV-I,HIV-II及びその他のレ
トロウイルス抗原を産生するための合成方法を記載する
技術文献及び特許文献は、余りにも多くあり、茲に述べ
ることができない。

例えば、HIV-I抗原を得るための好ましい方法は、この
ウイルスを適当な細胞系内で培養した後、細胞からウイ
ルスを取出すことである。取出されたウイルス、或いは
その成分を上記の如く重合体粒子上に固定して試薬を形
成する。例えば、HIV-Iウイルス抗原は適当な宿主細胞
系から単離されたHIV-Iウイルス粒子の洗剤溶解により
得ることができる。HIV-Iの生育に許容可能なそのよう
な細胞系としては、Hut78（ATCC TIB 161）、H9（ATCC
No.CRL 8543）、Molt3,CEM,OKT4₊,Ti7.4,HT及びそのク
ローン、及び例えば米国特許5,647,773号及び4,652,599
号を各明細書に記載されるようなその他のものが挙げら
れるが、これらに限定されるものではない。ウイルス粒
子は又AIDSを有する患者から樹立された新しい細胞系統
即ち「プリーAIDS」（しばしばAIDSに先行する慢性一般
化リンパ節疾患）として知られているものから単離する
こともできる。加えて、抗原物質はHIV-感染者から得る
ことができる。細胞の培養及びウイルス粒子の単離は公
知方法を用いて行われる。ウイルス粒子は、増殖細胞並
びに洗剤或いは界面活性を用いる溶解による上澄液から
得ることができる。一度HIV-Iで感染されたHut78細胞系
統がHIV-I抗原を得る際に好ましい。

HTLV-I抗原を得るための好ましい方法は、適当な宿主細
胞系統から単離されたHTLV-Iウイルス粒子を溶解するこ
とによるものである。そのような細胞系統としては、Hu
t102及びMT−２及びそれらのクローンが挙げられるが、
それらに限定されるものではない。American Type Cult
ure Collectionから入手可能であるHut102細胞系統（AT
CC TIB 162）が好ましい。HTLV-Iは又末梢血液Ｔ細胞か
ら確立された新規細胞系統又は皮膚Ｔ−細胞白血球／リ
ンパ腫患者から得られた組織から単離することもでき
る。細胞の培養及び抗原の単離は公知方法を用いて行わ
れる。HTLV-II抗原も同様にして得ることができる。

一度免疫学的複合体が形成され、何等かの方法で不溶化
されると、それを未複合化物質を複合化させ、複合体を
保持するのに十分な大きさの孔を有する微多孔性濾過膜
を用いて未複合化物質から分離する。複合不溶化は実質
的に分離と同時又はその前に起こりうる。そのような膜
は、その一体性をアッセイ中において維持する任意の適
当な不溶性材料から構成することができる。そのような
材料としては、濾紙、多孔性粒状構造体、多孔性重合体
フィルム、セルロース、ガラス繊維、織布及び不織布、
重合体フィルターその他の公知のものが挙げられるが、
これらに限定されるものではない。特に有用な膜は、Pa
ll Corp.から市販されているポリアミド類である。本発
明において有用な膜は、更に必要に応じて処理或いは被
覆され（例えば界面活性剤、重合体もしくはタンパク質
を用いて）、分離又は流体流度を高め、或いは非特異的
相互作用を減少させることができる。

この膜は本発明のアッセイを行うための適当な容器を用
いて別個の基材として用いることができる。好ましくは
しかしながら、それは試験装置の一部として装填され
る。米国特許3,825,410号、3,888,629号、3,970,429号
及び4,446,232号各明細書に記載されるものを包含する
各種試験装置が公知である。特に有用な装置はヨーロッ
パ特許出願88308558.1号及びSmith-Lewisにより1987年1
2月18日出願の米国特許136,211号に記載されている。

具体的には、試験装置はその各々が生物学的試料及び適
当な試薬に適合することのできる１個以上の試験領域を
有する水不溶性基材よりなるものである。基材は任意の
有用な水不溶性材料、例えばガラス、重合体材料、繊維
材料、セルロース材料及びその他の公知の材料から調製
することができる。

好ましい実施態様において、実験装置は試験結果並びに
陽性及び陰性の対照結果を与えるように設計された三つ
の試験領域、即ちウエルを有する。各試験ウエルはその
中に微多孔性膜を装填して有する。その他の有用な試験
装置の変化は当業者の技術範囲内のものである。上記免
疫学的試薬は必要に応じて例えば膜上の被膜として使い
捨て試験装置中に導入することができる。或いは又、試
薬をアッセイ中に別々に添加することも可能である。

免疫学的複合体の未複合化材料からの分離は膜と試料の
接触と実質的に同時に行われる。換言すれば、それは試
料が免疫学的複合体がその上に保持されながら膜を通し
て排出するのに僅かに数秒、高々1,2分かかるにすぎな
い。

リガンドと試料中の抗体間に形成された免疫学的複合体
はリガンド抗体に向けられた抗体の酵素標識化複合体に
接触されて、標識化抗体−抗体−リガンドの複合体を形
成する。この接触は上記分離工程の前、それと同時或い
はそれに引続いて起こりうる。加えて、この複合体は水
不溶性である。即ち、それはリガンドの不溶化に先立っ
て形成される。しかしながら、好ましい実施態様におい
ては、リガンドはリガンド−抗体−抗体複合体の形成前
に不溶化される。又好ましい実施態様においては、未複
合化材料のリガンド−抗体複合体からの分離はリガンド
−抗体−抗体複合体の形成前に行われる。不溶性複合体
を濾過膜上に集めて引続く検出を行う。

酵素及び抗−抗体の複合体は標準的原料及び周知の製造
操作を用いて製造される。複合体のあるものは市販され
ている。有用な酵素標識としては、パーオキシダーゼ、
グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ウ
レアーゼ及びβ−ガラクトシダーゼなどが挙げられる
が、これらに限定されるものではない。パーオキシダー
ゼ（その形態の任意のもの及び任意の源からのもの）が
好ましい。これらの抗体はそれらがアッセイにおいてリ
ガンドに対する抗体と反応する限り、モノクローナルも
しくはポリクローナル又は全抗体もしくは抗体の部分で
あり得る。例えば、それらはヤギ又はマウス抗−ヒト抗
体であり得る。複合体は、緩衝剤、界面活性剤、タンパ
ク質及びパーオキシダーゼ速度改良剤を含む他の材料と
混合して用いることができる。特別の複合体組成物を以
下に詳細に説明する。

リガンド−抗体−抗体複合体の形成は、通常これらの材
料を15〜30℃の温度で５分間までインキュベートして行
われる。好ましくは、インキュベーションは15〜25℃で
１分間行われる。複合体は不溶化すると、複合体組成物
からの任意の流体が直ちに濾過膜を通して排出される。

それにより形成された不溶性複合体を５〜10のpHに適当
な緩衝剤を用いて緩衝化し、界面活性剤を含む水性洗浄
組成物を用いて洗浄して未複合化材料を除去する。一般
的には、濾過膜を通して未複合化材料を除去するために
は、僅かに数滴の洗浄組成物が必要とされるにすぎな
い。好ましくは、洗浄組成物のpHは6.5〜8.5である。

一つの実施態様において、洗浄組成物はドデシルサルフ
ェートアニオン及びアルカリ金属又はアンモニウムカチ
オンを含んでなる少なくとも0.01重量％の界面活性剤よ
りなる。もう一つの実施態様においては、洗浄組成物は
炭素数６〜10の低級アルコールサルフェートアニオン及
びアルカリ金属或いはアンモニウムカチオンを含んでな
る少なくとも1.5重量％の界面活性剤よりなる。特に有
用な洗浄組成物を以下に説明する。

更にもう一つの実施態様においては、新規洗浄組成物
は、通常200未満の分子量を有する水混和性極性有機溶
媒を含む。有用な溶媒としては、アミド類（例、１−メ
チル−２−ピロリジノン、N,N−ジメチルホルムアミド
及びN,N−ジメチルアセトアミド）ケトン類（例、アセ
トン、メチルエチルケトン及び３−ペンタノン）、アル
コール類（例、メタノール、エタノール、ｔ−ブタノー
ル及びイソプロパノール）などが挙げられる。tert−ブ
タノール及び１−メチル−２−ピロリドンが好ましい。

この洗浄組成物における有用な界面活性剤は非イオン
性、アニオン性又は両性界面活性剤である。有用な非イ
オン性界面活性剤としては、上記ポリオキシエチレン誘
導体、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール界面
活性剤、フルオロカーボン界面活性剤、及びその他の当
業者に容易に明らかとなるものが挙げられる。アニオン
性界面活性剤としては、例えば、デオキシコール酸及び
その誘導体、アルキルサルフェートエステル類及びその
他の当業者に容易に明らかとなるものが挙げられる。

１種以上の単純水溶性塩類も又新規洗浄組成物中に存在
し、例えば塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム、ヨウ化ナトリウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモ
ニウム、その他の公知のものなどのアルカリ金属及びア
ンモニウム塩類が挙げられる。これらの塩類は、少なく
とも0.25、好ましくは0.25〜１のイオン強度を与えるの
に十分な量で存在する。代表的洗浄組成物を以下に説明
する。

膜上に保持される不溶性複合体を酵素標識と反応時に検
出可能種を与えるための１種以上の試薬を含んでなる試
薬組成物と接触させる。これらの試薬類は酵素に応じて
異り、各酵素に対してこの目的のための多くの公知試薬
がある。１種以上の反応が検出可能種を形成するために
必要なことがある。

酵素がパーオキシダーゼである好ましい実施態様におい
ては、試薬組成物は過酸化水素及びパーオキシダーゼの
存在下において検出可能種（クロモゲル或いはフルオロ
ゲン）を形成するための適当な試薬を含んでなる。この
試薬組成物は適当な試薬を含み、その一つはパーオキシ
ダーゼ及び過酸化水素の存在下において検出可能な色素
を与えることのできるパーオキシダーゼ用基質として作
用する。基質それ自体は色素−形成性化合物、例えばベ
ンジジン、テトラメチルベンジジン或いはその他のベン
ジジン誘導体、2,2′−アジノ−ジ−（３−エチル−ベ
ンズチアゾロン−６−スルホン酸）、フェノールレッ
ド、ｏ−フェニレンジアミン、ピロガロール、４−アミ
ノアンチピリン、ブロモピロガロールレッド及びその他
の公知のものなどであり得る。或いは又、水素供与体及
び電子受容体を組合わせて検出可能種を与えることがで
きる（例えば、米国特許4,260,769号明細書に記載の化
合物を参照）。

好ましくは、試薬組成物は過酸化水素及びパーオキシダ
ーゼの存在下において色素を与えるロイコ色素を包含す
る（例えば、米国特許4,089,747号明細書に記載のトリ
アリールイミダゾールロイコ色素又は米国特許4,670,38
5号明細書に記載のトリアリールメタンロイコ色素）。

不溶性複合体の存在下において、一度色素が形成される
と、それを視覚的に或いは分光光度測定装置を用いて評
価してアッセイが試料中におけるリガンド抗体の存在を
示すかどうかを決定することができる。試料試験と共に
陽性及び陰性対照試験の両者が行われるのが望ましい。
望ましい結果を与えるために、各対照試験に対して適当
な試薬が用いられる。

本発明のキットは適当な方法で包装され、組成物を保持
する１種以上の容器を受取ることができるように区分す
ることのできるある種の担体に含まれた本発明において
説明される稀釈及び洗浄組成物を含むことができる。加
えて、それは又、この方法を実施するのに有用な１種以
上の次のものを含むこともできる：濾過膜を含む使い捨
てテストデバイス、試薬組成物、酵素標識化抗体組成物
及び免疫学的試薬。試薬類は乾燥形態或いは適当な溶液
で提供することができる。キットの非反応性成分として
は説明書、混合容器、攪拌手段、ピペットなどが挙げら
れる。

〔実施例〕

以下に例示される具体例において説明されるアッセイを
行う際に、次の組成物が用いられた。全ての％は組成物
の全重量基準である。

免疫学的試薬： この試薬はその上に共有結合的にHIV-I抗原が結合され
たポリ〔スチレン−コ−ｍ＆p-（２−クロロエチルスル
ホニルメチル）スチレン〕（95.5:4.5モル比）の粒子を
含むものであった。

HIV-I抗原は、10％ウシ血清アルブミン及びゲンタマイ
シン（50μg/ml）の存在下においてRoswell Park Memor
ial Institute-1640培地内においてHIV-IをHut78細胞系
統中で培養することにより調製された。細胞密度は約10
⁵〜10⁶個細胞/mlに維持され、細胞をこの密度を維持す
るために新鮮な培地を添加することにより二次培養し
た。ウイルス粒子を育成培養液を細胞培養液を0.45μｍ
フィルターを付したフィルター収納器を通してポンプ送
りさせる保持タンク内にプールすることにより閉鎖系ス
テンレス製濾過／濃縮装置内に単離した。この最初の濾
過工程は、全細胞及び細胞破片を除去した。この細胞の
ない上澄液を次いで0.45μｍフィルターによっては除去
されなかった残存細胞破片を除去するために0.2μｍフ
ィルターを付けた第二のフィルター収納器を通してポン
プ送りした。第二の上澄液を100,000ダルトン分画膜を
付した濃縮カセットを通してポンプ送りして、調剤を適
当な容量に濃縮した。このようにして得られた粗製ウイ
ルス粒子を50,000×ｇで２時間遠心分離によりペレット
化し、通常のゾーンローターを有する緩衝液中の1300ml
線形22〜65％蔗糖勾配上に重層され、30,000×ｇで一晩
超遠心分離された40mlの緩衝溶液〔pH7.8、0.01モル濃
度のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩、
0.01モル濃度のNaCl、0.001モル濃度のエチレンジアミ
ン四酢酸〕中に懸濁した。この勾配を110の画分（各々1
2ml）に分別し、1.14〜1.18g/mlの密度を有する全画分
をプールし、緩衝液で３〜４倍に稀釈し、50,000×ｇで
２時間遠心分離して精製HIV-I粒子を回収した。この粒
子を次いで0.6モル濃度のKCl及び0.5％の非イオン性オ
クチルフェノキシポリエトキシエタノール界面活性剤を
含有する10mlの溶液に懸濁し、３回の５秒間発射による
超音波処理を行い、37℃で１時間インキュベートし、8
0,000×ｇで１時間遠心分離して破片を除去した。この
可溶化HIV-I調剤を次いで等容量の無水エーテルで２回
抽出し、得られた水相を以下の例におけるHIV-I抗原源
として用いた。

稀釈剤組成物： 本発明の二つの稀釈剤組成物を調製した： （１）0.1モル濃度のTris緩衝液（pH8）中のスクシニル
化カゼイン（１％）、アラビアゴム（１％）、Tween20
非イオン性界面活性剤（0.05％）及びThimerosal防腐剤
（0.01％）、及び （２）0.1モル濃度のTris緩衝液（pH8）中のスクシニル
化カゼイン（１％）、ウシ血清アルブミン（４％）、Tw
een20非イオン性界面活性剤（0.05％）。

洗浄組成物： 本発明の二つの洗浄組成物も又調製された： （１）0.05モル濃度のリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
4）中の１−メチル−２−ピロリジン（10％）、Tween20
非イオン性界面活性剤（0.25％）、Nonidet P-40非イオ
ン性界面活性剤（0.1％）、塩化ナトリウム（0.5モル濃
度）、 （２）0.1モル濃度の塩酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）中
のデシル硫酸ナトリウム（2.4％）。

二つのパーオキシダーゼ抗体組成物が調製された： （１）0.5モル濃度のリン酸緩衝化塩水中の1:3000に稀
釈されたウサギ抗−ヒト抗体に複合化したホースラディ
ッシュパーオキシダーゼ、４％ウシ血清アルブミン及び
Thimerosal防腐剤（0.01％）、及び （２）0.1モル濃度Tris緩衝液（pH8）中のスクシニル化
カゼイン（１％）を有する同一複合体、４′−ヒドロキ
シアセトアニリド（0.15％）、ウシ血清アルブミン（１
％）。

色素供与試薬組成物： 過酸化水素及びパーオキシダーゼの存在下に色素を与え
る組成物は次のようにして調製した。即ちロイコ色素溶
液を、リン酸ナトリウム緩衝液（5mmol濃度）中の20％
ポリ（ビニルピロリドン）の溶液中に2-（４−ヒドロキ
シ−3,5−ジメトキシフェニル）−4,5−ビス（４−メト
キシフェニル）イミダゾールを溶解することにより調製
した（0.1％溶液を作成）。この溶液を次いでリン酸ナ
トリウム緩衝液中に過酸化水素（10mmol濃度）、４′−
ヒドロキシアセトアニリド電子移動剤（5mmol濃度）及
びジエチレントリアミン五酢酸キレート化剤（10μmol
濃度）を含有する溶液に添加して１％ポリ（ビニルピロ
リドン）及び0.005％ロイコ色素の最終濃度を得た。

スクシニル化カゼインの調製： スクシニル化カゼインを0.5モル濃度のリン酸緩衝液（p
H8.5）中において等重量の無水コハク酸と25℃で４時間
反応させ、次いで生成物を透析により精製することによ
り調製した。

実施例1:血液血清試料のHIV-I抗体のアッセイ ヒト血清試料を以下の要領で使い捨て試験装置を用いて
HIV-Iに対する抗体の存在についてアッセイを行った。

この試験装置は、各々Loprodyne 濾過膜（PallCorpよ
り市販）を有する三個のウエルを有した。この膜はFluo
rad FC134界面活性剤（0.05g/m²、3Mから市販）で被覆
されていた。陽性対照試験ウエルは上記免疫学的試薬の
試料（0.23mg）及び不活性化HIV-Iを含有する熱処理血
清を含有した。陰性対照試験ウエルは試験ウエルに用い
たのと同様な重合体粒子を含有したが、しかし粒子はカ
ゼインのみによって被覆されたにすぎなかった。試験試
料を受取るように設計された試験ウエルは上記免疫学的
試薬のみを含有した。

ヒト血清試料（50μｌ）を上記第一の稀釈組成物の試料
（5ml）と100:1の稀釈率で混合した。稀釈試料（100μ
ｌ）を次いで各試験ウエルに添加し、室温で約２分間イ
ンキュベートして不溶性免疫学的複合体を形成させた後
流体を排液した。

このペルオキシダーゼ標識化−抗−抗体組成物（40μ
ｌ）を添加し、不溶性標識化抗体−抗体−抗原複合体
を、室温での１分間のインキュベーション時間内に流体
排液なしに形成させた。排液時に、この得られた複合体
を２回上記第一の洗浄組成物（先ず240μｌ次いで60μ
ｌ）を用いて洗浄し、複合体から未複合化材料を分離し
た。

上記色素−供与組成物の試料（40μｌ）を添加した。室
温で２分間インキュベーション後、赤色色素が血清試料
中にHIV-I抗体の存在を示した試料試験ウエル内に観察
された。陰性対照ウエルは、殆んどバックグラウンドを
示さず、陽性対称ウエルは同様な陽性試験を示した。

実施例2:異った稀釈剤及び洗浄組成物を用いるHIV-I抗
体のアッセイ ヒト血清試料について、異った稀釈剤及び洗浄組成物及
び多くのその他の小さい変化を行った以外は実施例１と
同様な試験アッセイを用いてHIV-Iに対する抗体の存在
のアッセイを行った。加えて、多くの比較対照アッセイ
を行った。これらのアッセイは本発明の範囲外のもので
ある。

各試験装置は各々Pall Corporationから市販されている
ナイロン濾過膜を有する３個の試験ウエルを有した。陽
性対照試験ウエルは上記免疫学的試薬のウエル（0.15m
g）及び不活性化HIV-Iを含有する熱処理血清を含有し
た。陰性対照試験ウエルは試験ウエルに用いられた同様
な重合体を含有したが、しかしこの粒子はカゼインのみ
で被覆された。試験試料を受取るように設計された試験
ウエルは上記免疫学的試薬のみを含有した。

ヒト血清試料を上記第二の稀釈剤組成物（アラビアビム
の代りにBSAを含有）と80:1の稀釈率で混合した。稀釈
試料（100μｌ）を次いで各試験ウエルに添加し、室温
で約３分間インキュベートして不溶性抗体−抗原免疫学
的複合体を形成し、次いで流体排液をした。

このペルオキシダーゼ標識化−抗−抗体組成物（50μ
ｌ）を添加し、不溶性標識化−抗体−抗体−抗原複合体
を室温における１分間のインキュベーション時間内に排
液なしに形成させた。排液時に得られた複合体を上記デ
シルサルフェート洗浄組成物で２回（最初に240μｌ
で、次いで60μｌで）洗浄し、複合体から未複合化材料
を分離した。

上記色素供与組成物の試料（40μｌ）を添加した。室温
で１分間インキュベーション後、ウエル内に赤色色素が
観察され、色勾配チャート（10が最も濃厚な色を表わす
０〜10の値）に対比して比較的に等級付けられた。

表１に試験及び対照組成物を示し、結果を表IIに示す。

表 Ｉ 試験Ａ ：稀釈剤組成物１、洗浄組成物１及びペルオ キシダーゼ−抗体組成物１。

試験Ｂ ：稀釈剤組成物２、洗浄組成物１及びペルオ キシダーゼ−抗体組成物１。

試験Ｃ ：稀釈剤組成物２、洗浄組成物２及びペルオ キシダーゼ−抗体組成物２。

対照例A:洗浄組成物１、ペルオキシダーゼ−抗体組成物
１、及びアラビアゴム、スクシニル化カゼイン及び界面
活性剤なしの稀釈剤組成物１。

対照例B:洗浄組成物１、ペルオキシダーゼ−抗体組成物
１、及びスクシニル化カゼイン及び界面活性剤なしの稀
釈剤組成物２。

対照例C:洗浄組成物、ペルオキシダーゼ−抗体組成物２
及びスクシニル化カゼイン及び界面活性剤なしの稀釈剤
組成物２。

対照例D:ペルオキシダーゼ−抗体組成物１、稀釈剤組成
物１、及び界面活性剤及び１−メチル−２−ピロリジノ
ンなしの洗浄組成物１。

対照例E:ペルオキシダーゼ−抗体組成物２、稀釈剤組成
物２及び界面活性剤なしの洗浄組成物２。

これらの試験は、低いバックグラウンド（陰性対照例ウ
エル）及び適当な感度（陰性対照例ウエルと試料ウエル
間の少なくとも１の差）を示したのに対し、対照例は高
いバックグラウンド及び貧弱な感度を示した。

〔発明の効果〕

本発明のアッセイは迅速である。即ち、それは実施する
のに通常20分未満かかるにすぎない。熟練した臨床医は
それを10分未満内で行うことができる。更に、このアッ
セイは高感度であり、極めて低いバックグラウンド（即
ち極めて少ない擬陽性）を示し、又従来公知の複雑且つ
時間のかかるアッセイに対比して比較的安価である。本
発明は迅速試験が必要とされ、或いはより複雑な試験が
利用不可能であるか或いは使用が困難である状況におけ
る任意の生物学的条件或いはリガンドに応答して（及
び、特にプロウイルス抗体に応答して）産生される抗体
を検出するのに極めて有利に有用である。例えば、本発
明は医学及び歯科オフィス、病院、外傷センター、警察
署、移民オフィス或いは世界の遠隔領域用の診断キット
として包装することができる。

本発明の利点はある種の稀釈剤及び洗浄組成物の使用に
より達成される。稀釈組成物は６〜10のpHに緩衝化さ
れ、タンパク質又は炭水化物、界面活性剤及び陰性荷電
した５以下のpIを有するタンパク質を含んでなるもので
ある。水性洗浄組成物は５〜10のpHに緩衝化され、界面
活性剤を含んでなるものである。一つの実施態様におい
て、洗浄組成物は又、水混和性極性有機溶媒及び少なく
とも0.25のイオン強度を与える量で存在するアルカリ金
属或いはアンモニウム塩も含んでなる。これらの稀釈剤
及び洗浄組成物は診断キットとして包装することができ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーガレット ジャネット スミス‐ルイ ス アメリカ合衆国，ニューヨーク 14534, ピッツフォード，スミス ロード 534 (56)参考文献 特開 昭60−36964（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−13460（ＪＰ，Ａ) Ｊ．Ｉｎｓｔ．Ｂｒｅｗ．，93（４）, Ｐ．313−318，（1987) Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，257（10）, Ｐ．5589−5593，（1982) Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ, 60，Ｐ．91−96，（1985)

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】５〜10のpHに緩衝化され、且つ非イオン
   性、アニオン性又は両性界面活性剤、分子量200未満の
   水混和性極性有機溶媒、並びに少なくとも0.25のイオン
   強度を与えるのに十分な量で存在するアルカリ金属又は
   アンモニウム塩を含んでなる免疫分析用水性洗浄組成
   物。
2. 【請求項２】６〜10のpHに緩衝化され、且つ未変性又は
   未誘導化タンパク質又は未変性又は未誘導化炭水化物、
   界面活性剤及びアシル化、アルキル化又はスルホニル化
   によって５以下のpIを有するように変性したタンパク質
   を含んでなる希釈剤組成物。
3. 【請求項３】A.あるリガンドに特異的である抗体を含有
   する疑いのある生物学的試料を、６〜10のpHに緩衝化さ
   れ且つ未変性又は未誘導化タンパク質又は未変性又は未
   誘導化炭水化物、界面活性剤及び陰性荷電した５以下の
   pIを有するタンパク質を含んでなる希釈剤組成物と混合
   する工程、 B.前記した希釈試料をリガンドと接触させてリガンドと
   試料中に存在する抗体との免疫学的複合体を形成する工
   程、 C.複合体形成前、それと同時又はその後にリガンドを固
   体状基体に結合させて不溶化する工程、 D.工程Ｃにおける結合と同時に又はその後複合体をその
   上に保持する微多孔性濾過膜を用いて未複合化材料から
   複合体を分離する工程、 E.分離工程より前、それと同時、又はその後複合体をリ
   ガンド抗体に向けられた酵素標識化抗体と接触させて抗
   原−抗体−抗体複合体を形成する工程、 F.膜により保持された抗原−抗体−抗体複合体を水性洗
   浄溶液で洗浄して未複合化材料を複合体から分離する工
   程、並びに G.酸素の存在下において検出可能な種を与えることので
   きる試薬組成物を添加して、試料中の抗原に対する抗体
   の存在の指示としてその種の存在を決定する工程を含ん
   でなる抗体の決定方法。
4. 【請求項４】（ａ）６〜10のpHに緩衝化され、且つ未変
   性又は未誘導化タンパク質又は未変性又は未誘導化炭水
   化物、界面活性剤及び陰性荷電した５以下のpIを有する
   タンパク質を含む希釈剤、 （ｂ）５〜10のpHに緩衝化され、且つ界面活性剤を含む
   水性洗浄組成物、並びに （ｃ）濾過膜を含むテストデバイス を含んでなる生物学的試料中の抗体の決定に有用な診断
   キット。