JPH0772154A - ヘモグロビンの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 大腸癌の診断に用いられる臨床検査法に有用
な、糞便試料中のヘモグロビンの分解抑制方法を提供す
る。 【構成】 ヘモグロビン含有試料に、非ペニシリン系抗
生物質を共存させることを特徴とするヘモグロビンの分
解抑制方法および被検試料中のヘモグロビンの測定方法
において、試料中に非ペニシリン系抗生物質を共存させ
ることを特徴とする方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用方法】本発明はヘモグロビン含有試料の
長期保存を必要とする臨床検査法に有用なヘモグロビン
の分解抑制方法に関する。該分解抑制方法を、ヘモグロ
ビン含有試料の長期保存を必要とする臨床検査法に適用
することにより、正確なヘモグロビンの測定方法が提供
される。

【０００２】

【従来の技術】大腸癌等の消化器癌を検査する方法とし
て、消化管からの出血に起因する糞便中の潜血成分（ヘ
モグロビン）を、抗ヘモグロビン抗体を用いた免疫学的
測定法により測定する方法が行われている。これらの臨
床検査方法においては、ヘモグロビンを含有した検便試
料を長期間保存するため、保存期間中に試料中のヘモグ
ロビンが分解し、正確にヘモグロビンを測定できないこ
とがある。糞便中のヘモグロビンの分解を抑制する目的
でペニシリンを添加する方法が開示されている（特開昭
５９ー１２５０６４号公報）が、該方法によるヘモグロ
ビンの分解抑制効果は必ずしも十分でない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】郵送検便試料による大
腸癌の検診等が普及するのに伴い、保存試料中のヘモグ
ロビンの分解抑制方法の開発が望まれている。該分解抑
制方法をヘモグロビン含有試料を長期保存する臨床検査
法に適用することにより、正確なヘモグロビンの測定が
可能な臨床検査法が提供される。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明はヘモグロビン含
有試料に非ペニシリン系抗生物質を共存させることを特
徴とするヘモグロビンの分解抑制方法に関する。さらに
本発明により、該ヘモグロビンの分解抑制法を適用し、
被検試料中に非ペニシリン系抗生物質を共存させること
を特徴とするヘモグロビンの測定法を提供することがで
きる。

【０００５】本発明に用いる非ペニシリン系抗生物質と
しては、例えば、セファマイシンＡ、セファマイシン
Ｂ、セファマイシンＣ，セファロスポリン、セファロチ
ン、セファロニウム、セファレキシン、セファラジン、
ヘタスポリン、セファピリン、ロラカルベフ等のセファ
ロスポリン系抗生物質、ストレプトマイシンＡ、ストレ
プトマイシンＢ、デハイドロストレプトマイシン、オキ
シストレプトマイシン、カナマイシン、カスガマイシ
ン、ゲンタマイシンＡ、ゲンタマイシンＣ、リンコマイ
シン、ブレオマイシン、マンノシドハイドロオキシ・ス
トレプトマイシン等のアミノグリコシド系抗生物質、ポ
リオキシンＡ、ポリオキシンＢ、ポリオキシンＣ、ポリ
オキシンＤ、ポリオキシンＥ、ポリオキシンＦ、ポリオ
キシンＧ、ポリオキシンＨ、ポリオキシンＪ、ポリオキ
シンＫ、ポリオキシンＬ、ポリオキシンＭ、ツベルシジ
ン、フォルマイシンＢ等のヌクレオシド系抗生物質、ア
ンサマイシン、リフアマイシン、リフアマイシンＢ、リ
フアマイシンＬ、リフアマイシンＳ、リフアマイシン
Ｖ、リフアマイシンＹ、リファムピシン等のアンサマイ
シン系抗生物質、ポリミキシン、グラマイシンＡ、グラ
マイシンＢ、グラマイシンＣ，ビオマイシン、バシトラ
シン、アクチノマイシン、チロシジンＡ、チロシジン
Ｂ、チロシジンＣ、チロシジンＤ、チロシジンＳ、スタ
フィラマイシン等のポリペプチド系抗生物質、その他チ
クロヘキシミド、チクロセリン、ザルコマイシンＡ、ス
ペクチノマイシン、クロラムフェニコール、ミトマイシ
ン、ブラスチシンＳ、フマジリン、モネシシン、ピロー
ルニトリン、フォスフォノマイシン等を用いることがで
きるが、例えばミノサイクリン、テトラサイクリン、ハ
イドロオキシテトラサイクリン、クロノサイクリン、テ
ラマイシン、ニトロサイクリン、アミサイクリン、アン
トラサイクリン、メタサイクリン、デオキシクリン、グ
リコサイクリン、アンハイドロテトラサイクリン等のテ
トラサイクリン系抗生物質、アセチルスピラマイシン、
エリスロマイシン、ピクロマイシン、ピマリシン、レセ
ンソマイシン、アンフォテリシンＢ，カンジシンＡ、カ
ンジシンＢ等のマクロライド系抗生物質を用いることが
好ましい。前記のヘモグロビンに添加する非ペニシリン
系抗生物質は、単独または二種以上混合して、ヘモグロ
ビン１に対して０．００２〜５００万の重量比で用いら
れるが、ヘモグロビン１に対して０．００４〜２００万
の重量比で用いることが好ましい。

【０００６】ヘモグロビン含有試料は、ヘモグロビンを
含有する試料であればどのようなものでもよいが、糞
便、血液、尿、痰等を用いることが好ましい。

【０００７】被検試料は通常非ペニシリン系抗生物質を
添加した緩衝液等に溶解した状態で、ヘモグロビンの測
定に供せられる。非ペニシリン系抗生物質の添加量は、
緩衝液中に０．００５〜０．５重量％、好ましくは０．
０１〜０．２重量％の濃度になるように添加する。緩衝
液としてはリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、イミダゾール
緩衝液、グリシン緩衝液、トリスー塩酸緩衝液などが用
いられ、これらの緩衝液はＰＨ６．０〜９．０、好まし
くは６．５〜８．５の範囲がよい。緩衝液中には塩化ナ
トリウム等の塩類、アルブミン等の安定化剤やアジ化ナ
トリウム等の抗菌剤、乳酸等を含んでもよい。

【０００８】緩衝液中に含有するアルブミンとしては、
ヒト、ウサギ、羊、山羊、馬、牛、ブタ等の動物アルブ
ミン、卵白アルブミンがあげられる。非ペニシリン系抗
生物質の効果を増強するため、緩衝液中にアルブミン、
アジ化ナトリウム、乳酸等を加えるときは、アルブミン
０．０５〜５重量％、好ましくは０．１〜２重量％、ア
ジ化ナトリウム０．０５〜０．５重量％、好ましくは
０．１〜０．３重量％、乳酸０．１〜１５重量％、好ま
しくは０．５〜５．０重量％の濃度で加えることが好ま
しい。これらの添加剤は試料のヘモグロビンに対して
は、ヘモグロビン１に対して重量比でアルブミン０．０
２〜５０００万、アジ化ナトリウム０．０２〜５００
万、乳酸０．０４〜１億５０００万の比で用いればよ
い。

【０００９】被検液はそのままヘモグロビンの測定法に
供してもよいが、４〜５０℃で１〜３０日間保存した後
にヘモグロビンの測定法に供することも可能である。

【００１０】本発明におけるヘモグロビンの測定方法と
してはヘモグロビンの検出方法または定量法であればい
ずれでもよいが、例えば抗ヘモグロビン抗体を用いた免
疫学的測定法等があげられる。

【００１１】ヘモグロビンの免疫学的測定法としては、
抗ヘモグロビン抗体を用いた免疫学的測定法であればど
のようなものでもよく、例えば、寒天平板上で抗ヘモグ
ロビン抗体と被検試料中のヘモグロビンとを反応させる
単純免疫拡散法、二重免疫拡散法等の免疫拡散法や、抗
ヘモグロビン抗体を感作した動物血球を用いる逆受身赤
血球凝集法、酵素で標識した抗ヘモグロビン抗体を用い
る酵素免疫法、抗ヘモグロビン抗体を感作したラテック
ス粒子を用いるラテックス凝集法、ラテックス凝集阻止
法、抗ヘモグロビン抗体を感作した金コロイド粒子を用
いる金コロイド凝集法等があげられる。

【００１２】以下にラテックス凝集法を用いた場合の免
疫学的測定法について例示する。

【００１３】通常のポリクローナル抗体の作製方法（実
験生物学講座１４，「免疫生物学」，村松繁ら編，１９
８５年，丸善刊）に従い、ヒトヘモグロビンを抗原とし
てウサギ、羊、山羊、等の抗体産生能のある動物を該抗
原で免疫した後、採血する。採血後、通常用いられる精
製方法（例えば、硫酸アンモニウムによる塩析、ＤＥＡ
ＥセルロースでのＩｇＧ分画）で精製して抗ヒトヘモグ
ロビン抗体を得る。なお抗ヒトヘモグロビン抗体は常法
（モノクローナルとがん，谷内昭ら編，１９８５年，サ
イエンスフォーラム社刊；単クローン抗体，岩崎辰夫ら
編，１９８４年，講談社サイエンティフィック社刊）等
により作製したモノクローナル抗体を用いてもよいし、
市販の抗ヒトヘモグロビン抗体を用いてもよい。

【００１４】得られた抗体を物理吸着法または共有結合
法［タンパク質化学１（アミノ酸、ペプチド），赤堀四
郎ら編，１９６９年，共立出版刊］等の常法によりラテ
ックス粒子（０．１〜０．６μｍ）に結合させ、牛血清
アルブミン等を含む緩衝液などで遠心分離洗浄を行い抗
ヒトヘモグロビン抗体感作ラテックス試薬を作製する。

【００１５】この様にして得られたラテックス試薬を用
い、スライド板法によりスライド板上での凝集像を判定
する方法や、凝集反応の速度を分光光度計、濁度計等に
より光学的または電気的に測定する方法によってヒトヘ
モグロビンを測定する。

【００１６】以下、本発明の実施例を示す。

【００１７】

【実施例】

実施例１ （１）抗ヒトヘモグロビン抗体感作ラテックス試薬の調
製 ヒトヘモグロビンをウサギに免疫して作製したポリクロ
ーナルの抗ヒトヘモグロビン抗体２ｍｇを含む０．２Ｍ
トリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．２）２ｍｌと１％のポリ
スチレンラテックス〔粒径０．３５μｍ；協和発酵工業
社製〕を懸濁させた０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ
８．２）２ｍｌとを混合し、４℃で２４時間撹拌してラ
テックスに抗体を吸着させた。その後、遠心分離機を用
いてラテックスを上記のトリスー塩酸緩衝液で洗い、ラ
テックスが１％になるように０．５％牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）を含む０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ
８．２）に懸濁させ、抗ヒトヘモグロビン抗体感作ラテ
ックス試薬を調製した。

【００１８】（２）糞便溶解用緩衝液 糞便溶解用緩衝液として、アジ化ナトリウム０．１％、
ＢＳＡ０．２％、塩化ナトリウム０．８５％が入った
０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ８．０）に、第１表に記
載した量の非ペニシリン系の抗生物質を濃度を変えて溶
解させた。

【００１９】（３）比較用緩衝液 （２）で作製した糞便溶解用緩衝液の比較対照として第
１表に記載した量のペニシリンの入った０．０５Ｍホウ
酸緩衝液（ＰＨ８．０）を作製した。

【００２０】（４）対照用糞便溶解用緩衝液 （２）で作製した糞便溶解用緩衝液の対照としてアジ化
ナトリウム０．１％、ＢＳＡ０．２％、塩化ナトリウム
０．８５％が入った０．０５Ｍホウ酸緩衝液（ＰＨ８．
０）を作製した。

【００２１】（５）即時検出操作 （２）で調製した糞便溶解用緩衝液、（３）で調製した
比較用緩衝液または（４）で作製した対照用糞便溶解用
緩衝液にヒトヘモグロビンの濃度を変えて溶解し、更に
健常人の糞便を６ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解させた。この被
検液１００μｌと前記ラテックス試薬２５μｌをスライ
ド板上に滴下し、撹拌棒で両液を混和してスライド板の
円一杯に広げた。スライド板を前後左右に３分間ゆるや
かに動かした後、ラテックス試薬の凝集像を観察した。
その結果を第１表に示した。

【００２２】

【表１】

【００２３】第１表によれば、即時検出操作では本発明
法、比較対照法、対照法のいずれの方法を用いても、ヒ
トヘモグロビン１２５ｎｇ／ｍｌまで測定可能であっ
た。

【００２４】（７日保存後の検出）（２）で調製した糞
便溶解用緩衝液、（３）で調製した比較用緩衝液、また
は（４）で作製した対照用糞便溶解用緩衝液にヒトヘモ
グロビンを濃度を変えて溶解し、更に健常人の糞便を６
ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解させた。得られた溶液を２３℃で
７日間保存した後、（５）と同様の方法で前記ラテック
ス試薬を滴下し凝集像を観察した。結果を第２表に示し
た。

【００２５】

【表２】

【００２６】第２表によれば、抗生物質無添加の対照で
はヘモグロビン２０００ｎｇ／ｍｌ以上でヘモグロビン
の検出が可能であった。比較例のヘモグロビンではこれ
より僅かに検出感度が向上しヘモグロビン１０００ｎｇ
／ｍｌで弱い凝集による検出が可能であった。これに対
し、アセチルスピラマイシンおよびミノサイクリンは、
共に０．２％濃度でヘモグロビン１２５ｎｇ／ｍｌの弱
い凝集による検出が可能であり、０．０１〜０．０５％
濃度でもヘモグロビン２５０ｎｇ／ｍｌの強い凝集によ
る検出が可能であり、比較例に比べ検出感度が格段に向
上した。

【００２７】（６）高温保存後の検出 （２）で調製した糞便溶解用緩衝液、（３）で調製した
比較用緩衝液または（４）で作製した対照用糞便溶解用
緩衝液にヒトヘモグロビンを濃度を変えて溶解し、更に
健常人の糞便を６ｍｇ／ｍｌ濃度で溶解させた。得られ
た溶液を３７℃で１日間保存した後、（５）と同様の方
法で前記ラテックス試薬を滴下し凝集像を観察した。結
果を第３表に示した。

【００２８】

【表３】

【００２９】第３表によれば、抗生物質無添加の対照で
はヘモグロビン４０００ｎｇ／ｍｌで検出可能であっ
た。比較例のヘモグロビンではこれより僅かに検出感度
が向上しヘモグロビン２０００ｎｇ／ｍｌで弱い凝集に
よる検出が可能であった。これに対し、アセチルスピラ
マイシンおよびミノサイクリンは、ヘモグロビン２５０
ｎｇ／ｍｌの弱い凝集による検出が可能であり、比較例
に比べ検出感度が格段に向上した。

【００３０】

【発明の効果】本発明の糞便試料中のヘモグロビンの分
解抑制方法を、ヘモグロビン含有試料の長期保存方法に
適用することにより、大腸癌の診断に用いられる臨床検
査法において、ヘモグロビンの正しい測定が可能にな
る。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヘモグロビン含有試料に、非ペニシリン
   系抗生物質を共存させることを特徴とするヘモグロビン
   の分解抑制方法。
2. 【請求項２】 被検試料中のヘモグロビンの測定方法に
   おいて、試料中に非ペニシリン系抗生物質を共存させる
   ことを特徴とする方法。