JPH0437718B2 - - Google Patents

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JPH0437718B2
JPH0437718B2 JP17004784A JP17004784A JPH0437718B2 JP H0437718 B2 JPH0437718 B2 JP H0437718B2 JP 17004784 A JP17004784 A JP 17004784A JP 17004784 A JP17004784 A JP 17004784A JP H0437718 B2 JPH0437718 B2 JP H0437718B2
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tryptophan
hydroxy
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JP17004784A
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JPS6152277A (ja
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Yukihiro Muro
Juichi Fusho
Masato Mori
Takeo Akashiba
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Resonac Holdings Corp
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Showa Denko KK
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は5−フルオロトリプトフアン耐性及び
アンスラニル酸要求性を有しかつ5−ヒドロキシ
−L−トリプトフアン生産能を有する、バチルス
属に属する微生物を用いた5−ヒドロキシ−L−
トリプトフアンの製造法に関する。
5−ヒドロキシ−L−トリプトフアンは、生理
的活性アミンとして知られているセロトニンの前
駆物質であり、また間代性痙攣などに用いる医薬
としての用途も期待される重要なアミノ酸であ
る。
従来の技術及び発明が解決しようとする問題点 5−ヒドロキシ−L−トリプトフアンを製造す
る方法としては、5−ヒドロキシインドール、ピ
ルビン酸及びアンモニアから5−ヒドロキシ−L
−トリプトフアンを生産する能力を有する微生物
を用いる酵素法が従来知られているが、その転換
率及び収率が必ずしも十分でなく、工業的な製造
法としては満足し得るものとは言い難かつた。
問題点を解決するための手段 前記した従来の5−ヒドロキシ−L−トリプト
フアンの微生物学的製造法の現状に鑑み、本発明
者らは高濃度の5−ヒドロキシアンスラニル酸を
含む培地において高濃度の5−ヒドロキシ−L−
トリプトフアン培養液を製造することのできる微
生物を得るべく鋭意研究を進めた結果、5−フル
オロトリプトフアン耐性及びアンスラニル酸要求
性を有する5−ヒドロキシ−L−トリプトフアン
生産性微生物を得ることに成功し、本発明をする
に至つた。
即ち、本発明に従えば、5−フルオロトリプト
フアン耐性及びアンスラニル酸要求性を有しかつ
5−ヒドロキシ−L−トリプトフアン生産能を有
するバチルス・アミロリクイフアシエンスSD−
53をアンスラニル酸含有栄養培地に5−ヒドロキ
シアンスラニル酸又はその塩を添加して培養せし
め、培養物中に生成した5−ヒドロキシ−L−ト
リプトフアンを採取することから成る5−ヒドロ
キシ−L−トリプトフアンの製造法が提供され
る。この方法に従えば、L−トリプトフアンの培
養液中への蓄積をほとんど起すことなく、5−ヒ
ドロキシ−L−トリプトフアンを培養液中に高蓄
積濃度及び高転換率で蓄積せしめることができ
る。即ち、培養液中へ所望の5−ヒドロキシ−L
−トリプトフアンと共にL−トリプトフアンが蓄
積すると、5−ヒドロキシ−L−トリプトフアン
とL−トリプトフアンとを培養液中より分離する
ことが難しく、生成した5−ヒドロキシ−L−ト
リプトフアンの一部を分離できないまま廃棄せざ
るを得ないためコスト的に甚だ不利であることを
考慮すると培養液中へのL−トリプトフアンの蓄
積が起きないことは実用上非常に望ましいことで
ある。
本発明に従つた5−フルオロトリプトフアン耐
性及びアンスラニル酸要求性を有しかつ5−ヒド
ロキシ−L−トリプトフアン生産能を有するバチ
ルス属に属する微生物バチルス・アミロリクイフ
アシエンスSD−53は以下のようにして取得した。
すなわち、本発明者らは原株バチルス・アミロ
リクイフアシエンス(Bacillus
amyloliquefaciens)IAM1521を常法に従つてN
−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジ
ン(NTG)を用いて人工突然変異誘発処理し、
この変異処理株を最低阻止濃度(MIC)以上の
5−フルオロトリプトフアン(5−FT)を添加
した寒天平板培地(スピザイゼン培地)で生育さ
せて生育した数百のコロニーについてそれぞれ5
−ヒドロキシ−L−トリプトフアンの生産性を調
べ、最も5−ヒドロキシ−L−トリプトフアン生
産能の高い5−FT耐性(即ち、トリプトフアン
濃度の蓄積による微生物固有のフイードバツク抑
制機構を解除した)菌株を得る。この菌株は5−
フルオロトリプトフアンに対し5000ppm以上の耐
性を有する。
次に、この5−FT耐性及び5−ヒドロキシ−
L−トリプトフアン生産能を有する変異菌株を再
び上と同様にしてNTGを用いて人工突然変異誘
発処理し、処理後、遠心分離(10000G×5分)
し、菌体部をM/100トリス緩衝液(PH7.0)に懸
濁し遠心分離することを3回繰返し、NTGを除
去する。菌株部をアンスラニル酸20〜50ppmを含
むスピザイゼン培地のような枯草菌用最小培地に
て30〜40℃で1〜3時間培養する。
培養後、遠心分離によつて集菌し、菌体部を上
記トリス緩衝液で洗浄し、更にトリス緩衝液中に
再懸濁して30〜40℃で1〜3時間振とうする。振
とう終了後、遠心分離によつて集菌し、トリス緩
衝液で洗浄した後、アンスラニル酸要求性菌株を
濃縮すべく、ペニシリン500〜2000ppmを含有す
る枯草菌用最小培地中に懸濁し、30〜40℃で30〜
90分、好ましくは40〜60分間振とうする。振とう
終了後、上と同様に集菌洗浄し、前記ペニシリン
含有枯草菌用最小培地にて同様の操作を3〜10回
繰り返してアンスラニル酸20〜50ppm含有枯草菌
用最小平板培地では生育するが、アンスラニル酸
無添加平板培地では生育しないアンスラニル酸要
求性菌株をスクリーニングする。最適条件では90
%以上に濃縮することが可能である。
このようにして得られた5−フルオロトリプト
フアン耐性及びアンスラニル酸要求性を有し、最
も5−ヒドロキシ−L−トリプトフアン生産能の
高い菌株バチルス・アミロリクイフアシエンス
SD−53を選択した。
この菌株は昭和59年8月14日に工業技術院微生
物工業技術研究所にバチルス・アミロリクイフア
シエンス(Bacillus amyloliquefaciens)SD−
53(微工研菌寄第7773号)として寄託した。なお、
この菌株の菌学的性質は原株バチルス・アミロリ
クイフアシエンスIAM1521と5−FT耐性及びア
ンスラニル酸要求性を有しかつ5−ヒドロキシ−
L−トリプトフアン生産能が高いことを除けば原
株の菌学的性質と同じであつた。
本発明に従つて、5−ヒドロキシ−L−トリプ
トフアンを製造するには、バチルス・アミロリク
イフアシエンスSD−53を5−ヒドロキシアンス
ラニル酸又はその塩を添加した培地中で培養する
ことにより実施する。栄養培地中の5−ヒドロキ
シアンスラニル酸又はその塩の濃度には特に限定
はないが、目的5−ヒドロキシ−L−トリプトフ
アンの収量、培養条件及び経済的観点から一般に
は0.1〜1000mg/、好ましくは50〜300mg/の
濃度を保持し乍ら培養する。なお、前記菌株SD
−53はアンスラニル酸要求性であるので菌の生育
に必要な最小限量(例えば培地中に30〜300ppm)
のアンスラニル酸を培地中に含ませる必要があ
る。
本発明方法において使用することのできる培地
としては、前記微生物が培養により増殖し得るも
のであれば任意のものでよく、例えば炭素源とし
てはブドウ糖、糖蜜、蔗糖、デン粉、デン粉糖化
液、セルロース分解物などの糖類、酢酸、エタノ
ール等が用いられる。窒素源としてはアンモニ
ア、硫安、塩安、硝安、燐安などのアンモニウム
塩や尿素、硝酸塩等が適宜用いられる。無機塩と
しては燐酸、カリウム、マグネシウム、マンガン
等の塩類、例えば燐酸アンモニウム、燐酸カリ、
燐酸ソーダ、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫
酸マンガン、苛性カリ等の通常の工業用薬品で良
く、他に微量元素としてカルシウム、亜鉛、硼
素、銅、コバルト、モリブデン等の塩類を加えて
も良い。また微量有機栄養素としてビタミン、ア
ミノ酸、核酸関連物質等は菌の生育上は特別に必
要とするものではないが、これらを添加したり、
コーンスチープリカー、肉エキス、酵母エキス、
ペプトン等の有機物を加えても良い。5−ヒドロ
キシアンスラニル酸はそのまま又はメタノール、
エタノール、酢酸等の有機溶媒の溶液の形で使用
してもよいが、ナトリウム、カリウム、アンモニ
ウムなどのアルカリ塩や硫酸、塩酸、酢酸等の酸
塩の水溶液として使用するのが好ましい。
本発明方法における培養は好気的条件下に、例
えば通気撹拌や往復振盪方法によつて培養するこ
とができる。培養条件は、特に限定はないが、一
般的に言えば、温度30〜40℃、PH6.0〜8.0及び18
〜72時間程度の条件で実施する。
培養液又は培養物からの目的の5−ヒドロキシ
−L−トリプトフアンの採取方法は慣用方法に従
つて行うことができる。例えば、遠心分離により
菌体部を除いた培養液上清からイオン交換樹脂処
理法、活性炭処理法等の操作を適宜組み合せて5
−ヒドロキシ−L−トリプトフアンを単離晶析す
ることができる。
実施例 以下に本発明の実施例を説明するが、本発明の
範囲をこれらの実施例に限定するものでないこと
はいうまでもない。
例 1 (5−ヒドロキシ−L−トリプトフアンの製造
例) グルコース10%、硫安0.2%、Na2SO40.1%、
KH2PO40.5%、MgSO4・4〜6H2O0.05%、Fe+
+1ppm、Mn++1ppm及びアンスラニル酸200ppm
の組成の液体培地2を5ジヤーフアーメンタ
ー入れ、115℃で20分間加熱滅菌した。
この培養槽に、予じめブイヨン培地中で30℃で
12時間振とう培養したバチルス・アミロリクイフ
アシエンスSD−53を5%接種し、溶存酸素量を
0.5ppm以上に保ち乍ら35℃で通気撹拌培養を行
つた。培養は、10%の5−ヒドロキシアンスラニ
ル酸アンモニウム塩溶液を培養液中の5−ヒドロ
キシアンスラニル酸濃度が50〜100ppmになるよ
うに連続的に添加し、培養液のPHを7.0に保ちな
がら30時間実施した。
得られた培養液中に21.0g/の5−ヒドロキ
シ−L−トリプトフアンが生成蓄積した。この時
の5−ヒドロキシ−L−トリプトフアンの対消費
糖収率は16.0%、5−ヒドロキシアンスラニル酸
に対するモル収率は92%であつた。なお、培地中
のL−トリプトフアンの濃度は5ppm以下であつ
た。
なお、上記培養実験と並行して前記したバチル
ス・アミロリクイフアシエンスSD−53の親株で
ある非アンスラニル酸要求性菌株を上と同様にし
て30時間培養したところ、培養液中の5−ヒドロ
キシ−L−トリプトフアン蓄積濃度は20.3g/
、5−ヒドロキシ−L−トリプトフアンの対消
費糖収率は15.55%、対5−ヒドロキシアンスラ
ニル酸モル収率は93%であつたが、L−トリプト
フアンの蓄積濃度は2g/であつた。
例 2 (5−ヒドロキシ−L−トリプトフアンの製造
例) バチルス・アミロリクイフアシエンスSD−53
を例1で用いた培地で5ジヤーフアーメンター
にて20時間培養し、この培養物2を同じ培地
200を含む500ジヤーフアーメンターに接種
し、溶存酸素を0.5ppm以上に保ち乍ら35℃で30
時間通気撹拌培養を行なつた。培養中、培養液中
の5−ヒドロキシアンスラニル酸の濃度が50〜
100ppmになるように、20%の5−ヒドロキシア
ンスラニル酸アンモニウム塩溶液を連続的に添加
し、培養液のPHは7.0に保持した。培養完了後の
液中の5−ヒドロキシ−L−トリプトフアンの生
成蓄積濃度は23.5g/であり、5−ヒドロキシ
−L−トリプトフアンの対消費糖収率は17.5%、
対5−ヒドロキシアンスラニル酸モル収率は93%
であり、培養液中のL−トリプトフアンの蓄積濃
度は3ppm以下であつた。
発明の効果 本発明に従えば、5−ヒドロキシ−L−トリプ
トフアンとの分離が難しいL−トリプトフアンが
培養液中に蓄積することがないため、目的とする
5−ヒドロキシ−L−トリプトフアンを高収率で
取得することが可能となる。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 1 5−フルオロトリプトフアン耐性及びアンス
    ラニル酸要求性を有しかつ5−ヒドロキシ−L−
    トリプトフアン生産能を有するバチルス・アミロ
    リクイフアシエンスSD−53をアンスラニル酸含
    有栄養培地に5−ヒドロキシアンスラニル酸又は
    その塩を添加して培養せしめ、培養物中に生成し
    た5−ヒドロキシ−L−トリプトフアンを採取す
    ることを特徴とする5−ヒドロキシ−L−トリプ
    トフアンの製造法。
JP17004784A 1984-08-16 1984-08-16 5―ヒドロキシ―l―トリプトファンの製造法 Granted JPS6152277A (ja)

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JP17004784A JPS6152277A (ja) 1984-08-16 1984-08-16 5―ヒドロキシ―l―トリプトファンの製造法

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JP17004784A JPS6152277A (ja) 1984-08-16 1984-08-16 5―ヒドロキシ―l―トリプトファンの製造法

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JPS6152277A JPS6152277A (ja) 1986-03-14
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WO2003051849A1 (en) * 2001-12-19 2003-06-26 Ube Industries, Ltd. Process for producing quinazolin-4-one and derivative thereof

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