JPH08145997A - 酵素免疫測定法用組成物及び酵素免疫測定用キット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 調製が容易で発色感度、検量線の直線性に優
れた酵素免疫測定法のための組成物の提供。この組成物
を用いることによる再現性の高い測定系の提供。ペルオ
キシダーゼを結合した抗体もしくは抗原分子を用いた固
相酵素免疫測定法において、テトラアルキルベンジジン
またはその塩を用いた場合、再現性の向上。 【構成】 テトラアルキルベンジジンまたはその塩と酸
化性物質並びにジアルキルスルフォキシド又は含窒素ヘ
テロ環化合物から選ばれる少なくとも１種の化合物を30
〜60％(v/v)の割合で含有するpＨが一定の値の緩衝溶液
であることを特徴とする酵素免疫測定法用組成物。テト
ラアルキルベンジジンまたはその塩及びジアルキルスル
フォキシド又は含窒素ヘテロ環化合物から選ばれる少な
くとも１種の化合物を30〜60％(v/v)の割合で含有する
ことを特徴とする酵素免疫測定用キット。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、酵素免疫測定法、生化
学的測定法などの分野において利用されるペルオキシダ
ーゼ様物質及び酸化性物質の測定用組成物及びそれらの
物質を測定するためのキットに関する。さらに詳しく
は、この組成物又はキットの医学的診断もしくは生物学
的評価への利用に関する。

【０００２】

【従来の技術】ペルオキシダーゼ様物質または酸化性物
質を測定するために用いられるベンジジン系の化合物
は、変異原性が低いあるいは全く持たないものが多く、
しかも感度が良いことで知られている。そのため、ベン
ジジン系の化合物、中でもテトラアルキルベンジジンに
関しては数多くの検討及び、改良がなされている。従
来、テトラアルキルベンジジンを使用する際の問題点と
して挙げられてきたものには、テトラアルキルベンジジ
ンの溶解性の低さ、長期保存するときの保存安定性、使
用時にいかに簡便に発色液を調製するか、などがある。
そして、特開昭62-134100号、特開昭63-199270号、特開
平1-104196号、特公平6-38757号、特開平6-165696号な
どに開示されている方法によってこれらの問題点は、解
決されてきている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、発明者
はこれら公知の方法を検討した結果、現在全く問題にさ
れていない驚くべき事実を発見した。その問題とは、現
在知られているテトラアルキルベンジジンを用いた方法
では、特にEIA、ELISAなどペルオキシダーゼ標識抗体を
用いる測定系において検量線が直線にならないという現
象である。この現象は、遊離のペルオキシダーゼを用い
た系では観察されず、ペルオキシダーゼ標識抗体を用い
た反応系のみで観察されている。また、ペルオキシダー
ゼ標識抗体を用いた測定系であってもo-フェニレンジア
ミンなどベンジジン系ではない発色剤を用いた場合では
検量線は、ほぼ直線となる。このことから、この問題が
ベンジジン系の発色剤に特有のものであり、しかもペル
オキシダーゼ標識抗体を用いた反応系のみで観察されて
いる。

【０００４】上記に示した公知の方法の検討により、ジ
メチルホルムアミド(DMF)、メタノールなどの有機溶媒
を用いた場合においても、また、酸性度の高い溶液に溶
解する方法を用いた場合においても、検量線が直線にな
らないという現象は再現的に観察されることが明らかに
なった。

【０００５】この現象により結果の再現性及び測定の精
度が低下することは明らかであり、得られたデータの信
頼性にもかかわる。特に、利用対象となる分野が医療分
野であるだけに大きな誤差は、誤診にもつながりかねな
い危険性をはらんでいる。にもかかわらず、この現象は
これまでに報告例もなく、問題提起されていないなど、
注目されていなかったと考えられる。当然のことなが
ら、これまでに報告されたいずれの方法においてもこの
問題を解決するには至っていない。

【０００６】本発明の目的は、調製が容易で発色感度、
検量線の直線性に優れた酵素免疫測定法のための組成物
を提供すること、そして、この組成物を用いることによ
る再現性の高い測定系を提供することにある。更に、本
発明はペルオキシダーゼを結合した抗体もしくは抗原分
子を用いた固相酵素免疫測定法において、テトラアルキ
ルベンジジンまたはその塩を用いた場合、再現性の向上
を目的とする。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明の上記目的は下記
の構成により達成される。

【０００８】１） テトラアルキルベンジジンまたはそ
の塩と酸化性物質を含有し、かつ、ジアルキルスルフォ
キシド及び含窒素ヘテロ６員環化合物から選ばれる少な
くとも１種の化合物を30〜60％(v/v)の割合で含有する
ことを特徴とする酵素免疫測定法用組成物。

【０００９】２） テトラアルキルベンジジンまたはそ
の塩と酸化性物質を含有し、かつ、下記一般式〔Ｉ〕で
表される化合物の少なくとも２種を30〜60％(v/v)の割
合で含有することを特徴とする酵素免疫測定法用組成
物。

【００１０】

【化２】

【００１１】式中、Ｒは置換又は非置換のアルキル基を
表す。

【００１２】３） テトラアルキルベンジジンまたはそ
の塩と酸化性物質を含有し、かつ、ジアルキルスルフォ
キシド及び含窒素ヘテロ環化合物から選ばれる少なくと
も１種の化合物並びに上記一般式〔Ｉ〕で表される化合
物から選ばれる少なくとも１種の化合物を30〜60％(v/
v)の割合で含有することを特徴とする酵素免疫測定法用
組成物。

【００１３】４） テトラアルキルベンジジンまたはそ
の塩を含有し、かつ、ジアルキルスルフォキシド及び含
窒素ヘテロ環化合物から選ばれる少なくとも１種の化合
物を反応液中に30〜60％(v/v)の割合で含有することを
特徴とする酵素免疫測定用キット。

【００１４】５） テトラアルキルベンジジンまたはそ
の塩を含有し、かつ、上記一般式〔Ｉ〕で表される化合
物から選ばれる少なくとも２種の化合物を反応液中に30
〜60％(v/v)の割合で含有することを特徴とする酵素免
疫測定用キット。

【００１５】６） テトラアルキルベンジジンまたはそ
の塩を含有し、かつ、ジアルキルスルフォキシド及び含
窒素ヘテロ環化合物から選ばれる少なくとも１種の化合
物並びに上記一般式〔Ｉ〕で表される化合物から選ばれ
る少なくとも１種の化合物を反応液中に30〜60％(v/v)
の割合で含有することを特徴とする酵素免疫測定用キッ
ト。

【００１６】７） テトラアルキルベンジジンが3,3′,
5,5′-テトラメチルベンジジンであることを特徴とする
前記１、２、３、４、５又は６記載の酵素免疫測定法用
組成物色原体又は酵素免疫測定用キット。

【００１７】本発明において、ジアルキルスルフォキシ
ド又は含窒素ヘテロ環化合物（以後化合物群１とする）
に属する化合物としては、例えば、ジメチルスルフォキ
シド、ピペリジン、N-メチルピペリジン、2-メチルピペ
リジン、1-メチル-4-ピペリジノン、2-(2-ピリジル)エ
タノール、2-ピリジルメタノール、3-ピリジルメタノー
ル、モルホリン、N-ホルミルモルホリン等が挙げられ
る。

【００１８】発明者は、化合物群１から選択される化合
物を測定法用組成物中に高濃度に含有させることによっ
て、驚くべきことに検量線の直線性が大幅に改善される
ことを見いだした。既に知られている方法では、測定法
用組成物は、添加剤を5〜３０％含有し、添加剤の濃度
はなるべく低く抑えるということが常識であった。しか
しながら、発明者の検討の結果、化合物群１より選択さ
れる化合物を３０％以上含有させることで検量線の直線
性が改善される傾向が得られ、特に、35％以上の高濃度
で含有させた場合、極めて良好な直線性が得られること
が判明したのである。加えて、60％よりも混合率を上げ
ると、感度の低下が観察されることから、好ましくは35
〜60％の範囲で用いるのが効果的である。また、化合物
群１より選択される化合物は複数選択することも可能で
ある。この場合、測定法用組成物中に占める化合物の総
量の割合が35〜60％であれば２種ないし３種を組み合わ
せて使用することも可能である。そして、この発色液を
用いることにより、ペルオキシダーゼにより標識化され
た抗体または抗原を用いた酵素免疫測定法の系における
検量線の直線性が大幅に改善され、問題を解決するに至
った。

【００１９】本発明の一般式〔Ｉ〕で表される化合物
は、例えば、N-メチル-2-ピロリジノン、N-エチル-2-ピ
ロリジノン、N-プロピル-2-ピロリジノン、N-ブチル-2-
ピロリジノン、N-オクチル-2-ピロリジノン、N-ドデシ
ル-2-ピロリジノン、N-ヒドロキシメチル-2-ピロリジノ
ン、N-(2-ヒドロキシエチル)-2-ピロリジノン、N-(3-ヒ
ドロキシプロピル)-2-ピロリジノン、N-(5-ヒドロキシ
ペンチル)-2-ピロリジノン、N-(8-ヒドロキシオクチル)
-2-ピロリジノン、2-ピロリジノン-1-酢酸、N-(2-カル
ボキシエチル)-2-ピロリジノン、N-(3-カルボキシプロ
ピル)-2-ピロリジノン等が挙げられる。

【００２０】本発明でいうペルオキシダーゼを結合した
抗体もしくは抗原分子を用いた酵素免疫測定法とは、医
学書院より1982年に初版が発行された「酵素免疫測定
法」(石川榮治らの編集)の30〜49ページ及び、東京化学
同人より1989年に初版が発行された「エンザイムイムノ
アッセイ」(P.TIJSSEN著、監訳石川榮治)の８〜19ペー
ジに記載されているような酵素免疫測定法であって、ペ
ルオキシダーゼ標識抗体または抗原を用い、ペルオキシ
ダーゼ活性量を酸化性物質及び発色剤で構成される発色
液を用いて測定する方法なら、どの様なものでも適合で
きる。

【００２１】本発明に用いられるテトラアルキルベンジ
ジンは、置換アルキル基としては、メチル基、エチル
基、プロピル基が挙げられるが、メチル基が好ましい。
特に好ましいテトラアルキルベンジジンは、3,3′,5,
5′-テトラメチルベンジジンである。

【００２２】本発明の測定法用組成物又は測定用キット
において、テトラアルキルベンジジンまたはその塩の濃
度は、0.01ないし5.0mg／mlであり、好ましくは0.05な
いし2.0mg／mlである。

【００２３】本発明の測定法用組成物又は測定用キット
は緩衝剤を含有することが好ましく、緩衝剤としては、
クエン酸、酢酸、シュウ酸などの有機酸とクエン酸ナト
リウム、リン酸ナトリウムなどのナトリウム塩やカリウ
ム塩など有機酸塩または無機酸塩を選択することが出来
る。より好ましい緩衝剤としてはクエン酸が挙げられ
る。

【００２４】また、発色を補助する成分として、キレー
ト剤（特開昭63-199270号）、非イオン性界面活性剤
（特開昭62-294099号）、トリポリりん酸（特開平1-243
998号）などを色原体を安定化させるために反応系に添
加することも出来る。

【００２５】本発明に係るペルオキシダーゼ様物質とし
ては、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、サイトク
ロムｃペルオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミ
エロペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダー
ゼ、また、鉄、金、銀などの金属及び金属化合物、ヘモ
グロビン等が挙げられるが、好ましくは西洋ワサビペル
オキシダーゼである。

【００２６】さらに、本発明で述べている酸化性物質と
は、ペルオキシダーゼの共存下で、テトラアルキルベン
ジジンを酸化することが可能なものであれば、どのよう
なものでも良い。具体的には、過酸化水素、アルキルヒ
ドロキシペルオキシド、p-ニトロペルオキシ安息香酸、
クメンヒドロキシペルオキシド、過酸化尿素等が挙げら
れるが、特に過酸化水素が好ましい。また、酸化性物質
の濃度は0.001ないし0.1％が好ましい。0.001％以下で
は感度が悪化し、0.1％以上では酵素活性が阻害され良
好な判定を行うことが不可能となるため再現性の点で好
ましくない。より好ましくは、0.005ないし0.02％であ
る。以上の条件を満たすものであれば、従来、同様の用
途に用いられてきた試薬と比較して、感度の面で優れた
結果が得られる。

【００２７】本発明をペルオキシダーゼを結合した抗体
もしくは抗原分子を用いた酵素免疫測定法に適合する場
合、EIA、ELISAなどにおいて通常行われている方法に準
じ、得られたペルオキシダーゼ活性を標準物質を用いる
ことにより得られたペルオキシダーゼ活性の検量線との
対比によって、検体中の測定対象物質の濃度(または
量、単位)を求めることが出来る。

【００２８】

【実施例】以下に実施例を示し本発明の詳細な説明を行
うが、これにより限定されるものではない。

【００２９】実施例１ 発色液の調製 酵素免疫測定法に用いるための測定法用組成物の調製を
行った。3,3′,5,5′-テトラアルキルベンジジンを2-メ
チルピペリジン(MePi)に溶解し、この溶液に表１に示し
た割合で0.1Ｍクエン酸-クエン酸ナトリウム緩衝液(pＨ
3.5)を加え撹拌した。これを発色液とした。同様に、Me
Piの代わりにジメチルスルフォキシド(DMSO)、N-メチル
-2-ピロリジノン(NMP)とジメチルスルフォキシドの1:1
混合物(NMP＋DMSO)及び2-メチルピペリジンとモルホリ
ンの１：１混合物(MePi＋Mo)にそれぞれ溶解し発色液を
作成した。

【００３０】

【表１】

【００３１】比較例として表２に示したように3,3′,5,
5′-テトラメチルベンジジン20mgをメタノール、エタノ
ール又はジメチルホルムアミド(DMF)にそれぞれ溶解
後、0.1Mクエン酸-クエン酸ナトリウム緩衝液(pＨ3.5)
と混合した発色液も作製した。

【００３２】実施例２ ガラクトシルトランスフェラーゼ量の測定 実施例１で調製した、本発明の化合物を含有する3,3′,
5,5′-テトラメチルベンジジンの発色液と従来の方法で
調製された3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジンを含有
する発色液を用いて、酵素免疫測定法の系により検討を
行った。

【００３３】特開平3-259093号に記載されている抗癌関
連ガラクトシルトランスフェラーゼ（以下GATと略記）
モノクローナル抗体MAb8513を、1M塩化ナトリウム含有
0.1M炭酸緩衝液（pＨ9.15）中に10μg／mlに希釈し、こ
の溶液中にポリスチレン製ビーズ（積水化学製）を４℃
・24時間浸漬し抗体の固定化を行った。

【００３４】次に、ブロッキング溶液として牛血清アル
ブミン（以下BSAと略記）を１％含有する0.02Mリン酸緩
衝液（150mM NaCl含有pＨ7.3、以降PBSと称す）を調製
し、この溶液中に抗体固定化後のビーズを移し、37℃、
10時間浸漬・放置し、ビーズ表面の抗体非結合部位の被
覆（ブロッキング）を行った。これら一連の作業により
以下に用いる抗体固定化ビーズを得た。

【００３５】検体としてGATを含有する癌患者プール血
清を用いた。この検体50μlに0.02Mリン酸緩衝液（pＨ
6.5、150mM NaCl及び0.01％ Tween20含有）200μlを添
加し、ここに上記に記載の方法により調製した抗体固定
化ビーズを浸漬し、一次反応（45℃、2時間）を行っ
た。反応後PBSにて洗浄操作を行った。西洋ワサビペル
オキシダーゼ(以下 HRPと称す)にて標識したHRP標識抗G
AT抗体MAb8628（特開平3-259093号に記載）を１％BSA含
有PBS溶液に適宜希釈し、これを250μl添加し、二次反
応を行った。この後、同様にPBSによる洗浄操作を行っ
た。

【００３６】さらに、実施例１で調製した発色液をそれ
ぞれ300μl加え、室温にて30分発色反応を行った。ま
た、比較例として調製した発色液及び有機溶媒を含有し
ない発色液についても同様に反応を行った。反応後、そ
れぞれに１N H₂SO₄を１mlずつ添加し反応を停止させ、4
50nmでの吸光度を測定した。結果は、検量線の相関係数
によって比較した。これらの結果を図１及び表２に示
す。

【００３７】

【表２】

【００３８】その結果、本発明の3,3′,5,5′-テトラメ
チルベンジジンの発色液は、従来の3,3′,5,5′-テトラ
メチルベンジジンを用いた発色液と比較して、直線性に
優れるという結果が得られた。特に、本発明の化合物の
混合比は30〜60％の範囲において良好であるという結果
が得られた。また、複数の化合物が混在した場合の混合
比も化合物の合計量の比率が30〜60％の範囲の場合に良
好な結果が得られている。

【００３９】実施例３ ＜発色液キットの製造＞酵素免疫測定用キットに同包す
るための発色液キットの製造を行った。

【００４０】（1）発色剤の調製 クエン酸一水和物を3.95ｇ秤量し、20ml程度の蒸留水を
加え溶解する。このクエン酸一水和物の溶液に3,3′,5,
5′-テトラメチルベンジジン50mgを加え撹拌して溶解さ
せる。溶解後蒸留水を加え全量を25mlに調整する。ここ
で得られた3,3′,5,5′-テトラメチルベンジジン溶液を
褐色のバイアル瓶に１mlずつ分注し、凍結乾燥を行う。
これを発色剤とした。

【００４１】（2）基質溶液の調製 クエン酸三ナトリウム（二水和物）を9.18ｇ秤量し、蒸
留水を250ml程度加え溶解する。この溶液にジメチルス
ルフォキシド及びN-メチル-2-ピロリジノンをそれぞれ1
00ml加え、さらに最終的に0.02重量％濃度になるように
過酸化水素水を加え良く撹拌した後、蒸留水を加え、全
量を500mlとする。この溶液を褐色のバイアル瓶に20ml
ずつ分注し、保存する。これを基質液とする。

【００４２】（3）発色液の調製 （1）で製造した発色剤と（2）で調製した基質液を混合
し、発色液を調製した。この時、テトラメチルベンジジ
ンは完全に溶解し析出は認められなかった。

【００４３】

【発明の効果】本発明により、固相に酵素標識抗体を固
定した酵素免疫測定法の系において検量線の直線性が飛
躍的に向上し、結果の再現性及び信頼性が飛躍的に向上
した。特に、ペルオキシダーゼを結合した抗体もしくは
抗原分子を用いた固相酵素免疫測定法において、テトラ
アルキルベンジジンまたはその塩を用いた場合顕著な効
果を示した。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の酵素免疫測定法用組成物と従来の酵素
免疫測定法用組成物を用いた場合の抗原濃度と吸光度の
関係を示す図である。

【符号の説明】

１ ジメチルスルフォキシドとN-メチル-2-ピロリジノ
ンの１：１混合物を40％の混合比で含む発色液を用いた
検量線（本発明） ２ ジメチルフォルムアミドを40％の混合比で含む発色
液を用いた検量線（比較例）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 テトラアルキルベンジジンまたはその塩
   と酸化性物質を含有し、かつ、ジアルキルスルフォキシ
   ド及び含窒素ヘテロ６員環化合物から選ばれる少なくと
   も１種の化合物を30〜60％(v/v)の割合で含有すること
   を特徴とする酵素免疫測定法用組成物。
2. 【請求項２】 テトラアルキルベンジジンまたはその塩
   と酸化性物質を含有し、かつ、下記一般式〔Ｉ〕で表さ
   れる化合物の少なくとも２種を30〜60％(v/v)の割合で
   含有することを特徴とする酵素免疫測定法用組成物。 【化１】 式中、Ｒは置換又は非置換のアルキル基を表す。
3. 【請求項３】 テトラアルキルベンジジンまたはその塩
   と酸化性物質を含有し、かつ、ジアルキルスルフォキシ
   ド及び含窒素ヘテロ環化合物から選ばれる少なくとも１
   種の化合物並びに上記一般式〔Ｉ〕で表される化合物か
   ら選ばれる少なくとも１種の化合物を30〜60％(v/v)の
   割合で含有することを特徴とする酵素免疫測定法用組成
   物。
4. 【請求項４】 テトラアルキルベンジジンまたはその塩
   を含有し、かつ、ジアルキルスルフォキシド及び含窒素
   ヘテロ環化合物から選ばれる少なくとも１種の化合物を
   反応液中に30〜60％(v/v)の割合で含有することを特徴
   とする酵素免疫測定用キット。
5. 【請求項５】 テトラアルキルベンジジンまたはその塩
   を含有し、かつ、上記一般式〔Ｉ〕で表される化合物か
   ら選ばれる少なくとも２種の化合物を反応液中に30〜60
   ％(v/v)の割合で含有することを特徴とする酵素免疫測
   定用キット。
6. 【請求項６】 テトラアルキルベンジジンまたはその塩
   を含有し、かつ、ジアルキルスルフォキシド及び含窒素
   ヘテロ環化合物から選ばれる少なくとも１種の化合物並
   びに上記一般式〔Ｉ〕で表される化合物から選ばれる少
   なくとも１種の化合物を反応液中に30〜60％(v/v)の割
   合で含有することを特徴とする酵素免疫測定用キット。
7. 【請求項７】 テトラアルキルベンジジンが3,3′,5,
   5′-テトラメチルベンジジンであることを特徴とする請
   求項１、２、３、４、５又は６記載の酵素免疫測定法用
   組成物色原体又は酵素免疫測定用キット。