JPH08154698A

JPH08154698A - コレステロール脱水素酵素を使用するコレステロールの定量法

Info

Publication number: JPH08154698A
Application number: JP16228392A
Authority: JP
Inventors: Tetsunori Akiba; 哲典秋葉
Original assignee: Amano Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Amano Enzyme Inc
Priority date: 1992-05-27
Filing date: 1992-05-27
Publication date: 1996-06-18

Abstract

(57)【要約】【目的】本発明は、ＮＡＤ依存性コレステロール脱水素
酵素を用いたコレステロールの定量法に関する。【構成】微生物を好気的条件下で培養し、コレステロー
ルに対して特異性の高いＮＡＤ依存性コレステロール脱
水素酵素をその菌体もしくは培養液から製造し、それを
ＮＡＤ存在下でコレステロールと反応せしめ生成するＮ
ＡＤＨを定量する。微生物として、好適にはノカルジア
属、アルカリゲナス属、プロテウス属等が利用できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＮＡＤ依存性コレステ
ロール脱水素酵素（Cholesterol dehydrogenase ：以下
「ＮＡＤ−ＣＤＨ」と略す）に関する。更に詳しく説明
すると、微生物を好気的条件下で培養し、その菌体もし
くは培養液から製造したＮＡＤ−ＣＤＨを使用するコレ
ステロールの定量法に関する。

【０００２】ここでいうＮＡＤ−ＣＤＨとは、補酵素と
してＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）
を要求し、電子供与体（コレステロール）から水素をう
ばい、電子受容体（ＮＡＤ）に付加する反応を触媒する
酵素をいう。

【０００３】

【従来の技術】従来より好気性微生物が、コレステロー
ルオキシダーゼ、コレステロールデヒドラターゼを生産
することは知られている。またノカルジア・エリスルポ
リスがコレステロールの酸化を触媒する酵素を生産する
との報告（Ann. Clin. Biochem., 10巻，79頁, 1973
年）がある。この酵素の場合は、ＮＡＤへの依存性は認
められない。

【０００４】また、マイコバクテリウム・コレステリカ
ム（J. Biol. Chem., 206巻，511頁, 1953年）、ブレビ
バクテリウム・ステロリカム（特公昭48-1190)について
も同様のことがいえる。

【０００５】さらには、絶対嫌気性微生物である、オイ
バクテリウム sp. ATCC21408 がＮＡＤ−ＣＤＨを生産
するとの報告（特開昭53-56090）もあるが、酵素化学的
性質などの記載はほとんどなされていないばかりか、Ｎ
ＡＤ依存性に記載があるにもかかわらず、ＮＡＤの存在
なしにも反応が進行する例が記載されている。したがっ
てこの酵素は、本発明でいうところのＮＡＤ依存性脱水
素酵素とはいえない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従来酵素によるコレス
テロールの定量は、コレステロールオキシダーゼを使用
する方法が広く用いられているが、発色系に導くために
パーオキシダーゼ等が必要であり、操作が繁雑である。
しかも血中のビリルビン、アスコルビン酸等により影響
を受け、これにより誤差が生じやすいという欠点を有し
ている。

【０００７】コレステロールの定量において、ＮＡＤの
存在なしには反応が進行しないＮＡＤ−ＣＤＨを用い、
下記反応式に示される反応により生ずるＮＡＤＨを直接
光度計で測定できれば、操作が簡単であり、前記のコレ
ステロールオキシダーゼを用いる方法の種々の問題も解
決される。コレステロール＋ＮＡＤ→（←）コレステノン＋ＮＡＤＨ上記反応式で「→（←）」は可逆反応であることを示
す。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記反応
に適した酵素すなわち、コレステロールに特異性が高
く、ＮＡＤ依存性である脱水素酵素を広く自然界に求め
たところ、意外にも好気的条件下に生育する微生物が、
著量のＮＡＤ−ＣＤＨを生産することを見い出した。そ
の中で、特に優れた菌株として、ノカルジア sp. No.Ch
2-1（Nocardia sp. No.Ch2-1）、アルカリゲネス sp. N
o.4（Alcaligenes sp. No.4)およびプロテウス・ブルガ
リス IAM1025（Proteus vulgaris IAM1025）が例示され
る。

【０００９】次にノカルジア sp. No.Ch2-1およびアル
カリゲナス sp. No.4の菌学的性質を以下に述べる。

【００１０】(1) ノカルジア sp. No.Ch2-1（Nocardia
sp. No.Ch2-1）の菌学的性質 (A) 形態学的性質 1)細胞の形および大きさ：培養初期、菌糸状に生育し分
岐を生ずる。その後、不規則な分断が生じ細胞は、桿菌
状となる。大きさは0.8〜1.0μ×1.5〜4.0μ位である。
気菌糸を形成せず胞子のう胞子も形成しない。 2)グラム染色性：陽性 3)抗酸性：陽性 4)運動性：無し

【００１１】(B) 化学的組成分析細胞壁中にmeso−ジアミノピメリン酸、アラビノース、
ガラクトースが含まれ、L,L-ジアミノピメリン酸、グリ
シンは含まない。

【００１２】(C) 各培地における生育状態 1)肉汁寒天平板培地： 30℃で４日培養後、直径0.5
〜1.0mmの円形コロニーを形成する。周辺は全縁もしく
は、波状である。表面は平滑で半球状であり、中心部が
凸状に隆起する場合もある。色調は薄いクリーム色で不
透明である。培地中に色素は出さない。 2)シュークロース硝酸塩寒天培地：生育中程度で集落の
色は白色ないし薄クリーム色である。水溶性色素は出さ
ない。 3)グルコース・アスパラギン寒天培地：生育中程度で集
落の色は薄クリーム色である。水溶性色素は出さない。 4)グリセリン・アスパラギン寒天培地：生育中程度で集
落の色は白色ないし薄クリーム色である。水溶性色素は
出さない。 5)スターチ無機塩寒天培地：生育中程度で集落の色は白
色ないし薄クリーム色である。水溶性色素は出さない。 6)チロシン寒天培地：生育中程度で集落の色は白色
ないし薄クリーム色である。水溶性色素は出さない。 7)栄養寒天培地：生育良好で集落の色は薄クリ
ーム色である。水溶性色素は出さない。 8)イースト麦芽寒天培地：生育良好で集落の色は薄クリ
ーム色である。水溶性色素は出さない。 9)オートミール寒天培地：生育中程度で集落の色は白色
ないし薄クリーム色である。水溶性色素は出さない。

【００１３】(D)生理的性質 1)生育温度： 15℃〜43℃で生育する。10
℃、45℃で生育しない。最適温度は30〜35℃である。 2)硝酸塩還元性：陽性 3)カタラーゼ：陽性 4)オキシダーゼ：陰性 5)ウレアーゼ：陽性 6)デンプン加水分解：陰性 7)ゼラチン液化：陰性 8)チロシン加水分解：陰性 9)カセイン加水分解：陰性 10)キサンチン加水分解：陰性 11)ＤＮＡの分解：陰性 12)リトマスミルク：アルカリ性、ペプトン化、
凝固共にしない。 13)メラニン様色素の生成：無し 14)エスクリン加水分解：陽性 15)Tween 20.40.60.80加水分解：すべて陽性 16)ペニシリン耐性試験：耐性 17)酸素の対する態度：好気性 18)無機窒素源の利用：アンモニウム塩、硝酸塩共
に利用する。 19)NaCl生育範囲：０〜６％で生育する。７％
で生育しない。 20)各種炭素源の同化性（プリドハム、ゴドリーブ寒天
培地）：D-グルコース、D-フラクトース、マンノース、
グリセリン、トレハロースを同化する。L-アラビノー
ス、D-キシロース、サッカロース、イノシット、L-ラム
ノース、ラフィノース、D-ガラクトース、D-マンニッ
ト、マルトース、ソルビットを同化しない。 21)各種糖から酸の生成：D-グルコース、D-マンノー
ス、D-フラクトース、トレハロース、グリセリンから酸
を生成する。L-アラビノース、D-キシロース、D-ガラク
トース、マルトース、サッカロース、ラクトース、D-ソ
ルビット、D-マンニット、イノシット、デンプンから酸
を生成しない。

【００１４】以上の菌学的性質をBergey's Manual of D
eterminative Bacteriology（第８版）を参考に検討し
た結果、細胞壁中にmeso-ジアミノピメリン酸、アラビ
ノース、ガラクトースを含み、L,L-ジアミノピメリン
酸、グリシンが含まれていないこと、好気性で菌糸状に
よく生育し、後に分断して桿菌状となること、抗酸性で
あること、胞子のう胞子及び気菌糸を着生しないことな
どから本菌はNocardiaに属する菌である。

【００１５】よって本菌は、本発明者らがノカルジア s
p.（Nocardia sp.）No. Ch2-1と命名し、工業技術院微
生物工業技術研究所に菌寄第6217号（FERM-P No.6217）
として寄託されている。

【００１６】(2) アルカリゲネス sp. No.4（Alcaligen
es sp. No.4）の菌学的性質 (A) 形態 1)細胞の形および大きさ：0.4〜0.6μ×0.8〜1.2μの桿
菌である。 2)細胞の多形成の有無：多形成は認められない。 3)運動性の有無：周鞭毛を有し運動する 4)グラム染色性：陰性 5)抗酸性：陰性

【００１７】(B) 各培地における生育状態 1)肉汁寒天平板培養：円形コロニーで表面は平滑、
半レンズ状の隆起、全縁状で薄クリーム色、半透明、光
沢あり 2)肉汁寒天斜面培養：生育中程度、糸状に生育、薄
クリーム色で半透明 3)肉汁液体培養：菌膜をつくらない、やや濁り
沈渣も少しある。 4)肉汁ゼラチン穿刺培養：ゼラチンは液化しない。 5)リトマスミルク培養：アルカリ性になるがペプトン
化しない、凝固しない。

【００１８】(C)生理的性質 1)硝酸塩の還元性：陽性 2)脱窒反応：陰性 3)ＭＲテスト：陰性 4)ＶＰテスト：陰性 5)インドールの生成：陰性 6)硫化水素の生成：弱陽性 7)デンプンの加水分解：陰性 8)クエン酸塩の利用： Koserの培地とChristensenの
培地で共に利用する。 9)無機窒素源の利用：硝酸塩およびアンモニウム塩
を利用する。 10)色素の生成：水溶性色素を生成しない。 11)ウレアーゼ：陰性、弱陽性 12)オキシダーゼ：陽性 13)カタラーゼ：陽性 14)生育範囲pH： pH5.0〜10.0で生育する。温度：５℃〜37℃で生育する。42℃で生育
しない。 15)酸素に対する態度：好気性 16)ＯＦテスト（Hugh−Leifson法）：フラクトースから
好気的に酸を生成する。 17)糖類から酸およびガスの生成の有無：Ayers, Rupp a
nd Johnsonの培地でフラクトースとグリセリンから酸を
生成するがガスは生成しない。アラビノース、キシロー
ス、グルコース、マンノース、ガラクトース、麦芽糖、
ショ糖、乳糖、トレハロース、ソルビット、マンニッ
ト、イノシット、デンプンからは酸もガスも生成しな
い。 18)独立栄養的生育：水素ガス、炭酸ガス、酸素
ガスを含有する気体中で生育しない。 19)Tween80の分解性：陽性 20)資化性： D-フラクトース、L-フェニ
ルアラニン、レブリン酸カルシウム、L-スレオニンを資
化する。マンノース、マルトース、マンニット、ベタイ
ンを資化しない。

【００１９】以上の菌学的諸性質かBergey's manual of
Determinative Bacteriology（第８版）の記載に照合
して検討すると短桿菌で周ベン毛により運動すること、
グラム陰性、好気性であること、栄養要求性はなく、ア
ンモニウム塩、硫酸塩を利用すること、カゼイン及びゼ
ラチンを分解しないこと、オキシダーゼ陽性であること
等からAlcaligenes属に分類される。

【００２０】種については、文献を参考に検討し
たところAlcaligenes eutrophus、A. paradpxus、A. ru
hlandiiおよびA. latusとは主に独立栄養的生育の点で
異なる。またA. faecalisとは主に42℃における生育、
Ｄ−フラクトースの資化性の点で、A. aquamarinusとは
主にデンプンの分解性、マルトースの資化性の点で、A.
pacificusとは主にスレオニン、ベタインの資化性の点
で、A. cupidusとは主にオキシダーゼおよびマンニッ
ト、マンノースの資化性の点で、A. venustusとは主に
レブリン酸塩、スレオニン、ベタインの資化性の点で、
A. aestusとは主にマンニット、スレオニン、フェニル
アラニンの資化性の点でそれぞれ異なる。

【００２１】よって本菌は本発明がアルカリゲネス s
p.（Alcaligenes sp.）No.4と命名し、工業技術院微生
物工業技術研究所に菌寄第6216号（FERM-P No.6216）と
して寄託されている。

【００２２】 Bergey's manual of Determinative B
acteriology（第８版） J. Bact., 110(1),402-429（1972）坂崎和一訳：医学細菌同定の手びき（２版）近代
出版、東京、1974

【００２３】次にこれらの菌を用いてＮＡＤ−ＣＤＨを
製造する方法について詳述する。これらの菌はいづれも
構成的にＮＡＤ−ＣＤＨを生産する能力を有し、通常の
ペプトン、酵母エキス又は硫酸アンモニウム等のチッソ
源及びグルコース、グルセロール等の炭素源、その無機
塩等を含有する培地でもＮＡＤ−ＣＤＨを生産するが、
コレステロールを培地に添加することよりさらに多量に
ＮＡＤ−ＣＤＨを生産する。この際コレステロールの添
加は、培養開始時あるいは途中からのいずれでもよい。
またその他培養条件に関しては、通常行われる範囲で実
施できる。

【００２４】これらの菌により生産されたＮＡＤ−ＣＤ
Ｈは、菌体のみならず、培養液中にも蓄積され、その何
れからでも酵素を回収することができる。これらの培養
濾液又は菌体抽出液を硫酸アンモニウム等による塩析又
は、アセトン、エタノール等の溶剤沈殿して得た粗酵素
は、そのままコレステロールの定量に使用するか、ある
いは、さらに精製して使用することもできる。例えば、
精製については、イオン交換クロマトグラフィー、分子
節クロマトグラフィー等公知の方法により可能である。

【００２５】ここで得られるＮＡＤ−ＣＤＨは、コレス
テロール含有物質中のコレステロールの定量に使用で
き、例えば、血液、血中のコレステロール定量等に有利
に使用できる。

【００２６】本発明に使用するＮＡＤ−ＣＤＨの活性測
定法を以下に示す。ＮＡＤ−ＣＤＨの酵素活性は、コレ
ステロールとＮＡＤを基質として反応した場合のＮＡＤ
Ｈの生成量を、340nmにおける吸光度の増加として、分
光光度計で測定し算出する。すなわち、0.1Mトリス・塩
酸緩衝液（pH8.6）2.65ml、28mM NAD溶液0.1ml、８％ト
リトンX-100溶液0.15ml、１％コレステロール溶液0.05m
l及びＮＡＤ−ＣＤＨ水溶液0.05mlを混合し、30℃で反
応させ、反応開始後１分間の340nmにおける吸光度の増
加を測定する。

【００２７】対照として上記組成でコレステロールの代
わりに水を用い同様の操作を行い、対照液の340nmにお
ける吸光度の増加を試験液のそれから差し引く。得られ
た値からＮＡＤＨの生成量を求め、これより試料中のＮ
ＡＤ−ＣＤＨ活性を算出する。

【００２８】酵素活性の表示は、pH8.6、30℃の条件下
で１分間に１μmoleのＮＡＤＨを生成する酵素を１単位
とした。次に本発明に使用するＮＡＤ−ＣＤＨの作用を
示す。コレステロール＋ＮＡＤ→（←）コレステノン＋ＮＡＤＨ上記反応式で「→（←）」は可逆反応であることを示
す。

【００２９】本発明におけるＮＡＤ−ＣＤＨは全てこの
反応を触媒する。以下に本発明に使用するＮＡＤ−ＣＤ
Ｈの一般的性質をノカルジア sp. No.Ch2-1（Nocardia
sp. No.Ch2-1）及びアルカリゲネス sp. No.4（Alcalig
enes sp.No.4）の生産するものについて示す。

【００３０】(1) ノカルジア sp. No. Ch2-1（Nocardia
sp. No.Ch2-1）の生産するＮＡＤ−ＣＤＨ 1)至適pH 第１図に30℃におけるpHと活性の関係を示した。 2)pH安定性第２図に37℃におけるpHと安定性の関係を示した。 3)至適温度第３図にpH8.6における温度と活性の関係を示した。 4)熱安定性第４図にpH7.0における温度と安定性の関係を示した。 5)基質特異性本酵素は、３β位に水酸基を持つステロイドに反応し、
コレステロールを100とするとスティグマステロール3
5、β−シトステロール25、その他デヒドロエピアンド
ロステロン、エルゴステロール等にわずかに作用する。 6)補酵素ＮＡＤを要求する。

【００３１】(2)アルカリゲネス sp. No.4（Alcaligene
s sp. No.4）の生産するＮＡＤ−ＣＤＨ 1)至適pH 第５図に30℃におけるpHと活性の関係を示した。 2)ｐＨ安定性第６図に37℃におけるpHと安定性の関係を示した。 3)至適温度第７図にpH8.6における温度と活性の関係を示した。 4)熱安定性第８図にpH7.0における温度と安定性の関係を示した。 5)基質特異性本酵素は、３β位に水酸基を持つステロイドに反応し、
コレステロールを100とするとβ−シトステロール36、
スティグマステロール20、その他デヒドロエピアンドロ
ステロン、エルゴステロール等にわずかに作用する。 6)補酵素ＮＡＤを要求する。

【００３２】次に本発明のＮＡＤ−ＣＤＨを使用したコ
レステロールの定量法について詳述する。コレステロー
ルを定量する場合、実際には緩衝液、ＮＡＤ、基質（血
清、コレステロール等）及びＮＡＤ−ＣＤＨを混合し、
一定時間反応し、生成するＮＡＤＨの増加を吸光度340n
mで測定する。また必要に応じて、生成したＮＡＤＨの
水素をフェナジンメソサルフェート（PMS）、ジアフォ
ラーゼ等により、ホルマザン色素等の発色系に導くこと
も可能である。さらには、反応系にコレステロールエス
テラーゼ、界面活性剤、及び安定化剤などの添加も可能
である。反応時のpHは６〜10の範囲で実施できるが、優
れているpH範囲は７〜９である。

【００３３】次にＮＡＤ−ＣＤＨによるコレステロール
定量用試薬の量的組成についての１例を述べれば、反応
系３ml当り、ＮＡＤ−ＣＤＨ 0.1〜10単位、ＮＡＤ 1
0〜100mM（トリトンX-100 1.0％以下）、コレステロー
ルエステラーゼ（ベーリンガー社製）0.1〜10単位が有
利である。しかし本発明はこれらの量的組成に限定され
るものではない。本発明の測定法における特別な利点
は、生成するＮＡＤを直接測定できることであり、また
完全に定量できることである。

【００３４】次に試験例及び実施例につき述べる。試験例１本発明における菌株３種につき、コレステロール５g/
L、肉エキス５g/L、酵母エキス0.2g/L、少量の消泡剤の
組成よりなる培地（pH7.2）100mlをいれた500ml容坂口
フラスコに植菌し、30℃で40時間振盪培養した。培養液
50mlを遠心分離（8000rpm、10分間）により集菌し、0.1
Mリン酸緩衝液pH7.0、50mlで洗浄した。次に同じ緩衝液
50mlに菌体を懸濁し、超音波にて菌体を破砕した。この
破砕液を遠心分離（10000rpm、10分間）し、清澄液を得
た。得られた清澄液のＮＡＤ−ＣＤＨ活性を測定し、表
１の結果を得た。

【００３５】

【表１】

【００３６】試験例２コレステロール（片山化学社製）0.67mg/ml、ＮＡＤ又
はＮＡＤＰ（オリエンタル酵母社製）1.0mg/ml、トリト
ンX-100（片山化学社製）4.0mg/mlを含む0.1Mトリス塩
酸緩衝液3.0mlを25℃、５分間予熱後、希釈したＮＡＤ
−ＣＤＨ液0.1mlを加え、25℃で反応させ、340nmにおけ
る吸光度の増加を測定して、各種ＮＡＤ−ＣＤＨの各補
酵素に対する反応性を調べた。その結果を表２に示す。

【００３７】

【表２】

【００３８】その結果、本発明に用いるＮＡＤ−ＣＤＨ
はいずれもＮＡＤに対する反応性に比較してＮＡＤＰに
対する反応性が著しく低いことがわかる。

【００３９】

【実施例】

実施例１ Nocardia sp. Ch2-1（FERM-P No.6217）をグルコース５
g/L、肉エキス５g/L，酵母エキス0.2g/L、少量の消泡剤
の組成よりなる培地（pH7.2）200mlをいれた500ml容坂
口フラスコに植菌し、30℃で24時間振盪培養する。この
種培養液をコレステロール５g/L、KH₂PO₄ ５g/L、MgSO₄
・7H₂O 0.2g/L、消泡剤0.5g/Lの組成よりなる培地（pH7.
2）20Lを入れた30L容ジャーファーメンターに植菌し、3
0℃で通気、攪拌（0.5V/V/min、200rpm）しながら40時
間培養した。

【００４０】培養液を遠心分離し、得られた菌体を0.1M
リン酸緩衝液pH7.0に懸濁し、ガラスビーズにより菌体
を破砕した。この菌体破砕液を遠心分離（1000rpm、10
分間）し、清澄な菌体抽出液を得た。得られた清澄液に
硫酸アンモニウムを35％飽和になるように加え酵素を沈
殿せしめた。

【００４１】沈殿を遠心分離（8000rpm、10分間）で集
め、20mMリン酸緩衝液pH7.0、100mlに溶かし、セロファ
ンチューブで、20mMリン酸緩衝液pH7.0に対して24時間
透析した。

【００４２】次に得られた透析液を20mMリン酸緩衝液pH
7.0で平衡化したＤＥＡＥ・セルロース200mlを充填した
カラムに通し、酵素を吸着せしめた。同様の緩衝液でカ
ラムを洗浄後、緩衝液濃度を0.1Mに上げてＮＡＤ−ＣＤ
Ｈを溶出した。ＮＡＤ−ＣＤＨを含む画分を集め、これ
を濃縮後20mMリン酸緩衝液pH7.0に対して透析した。こ
れを同様の緩衝液で平衡化したヘキシルセファロース20
mlを充填したカラムに通し、吸着せしめた。このカラム
を20mMリン酸緩衝液pH7.0で洗浄した。次に0.5M NaClを
含む同様の緩衝液でＮＡＤ−ＣＤＨを溶出し、活性画分
を集め、濃縮し、50単位/mlのＮＡＤ−ＣＤＨ溶液5.0ml
を得た。全体の活性収率は30％であった。

【００４３】実施例２ Alcaligenes sp. No.4（FERM-P No.6216）をコレステロ
ール10g/L、グリセロール２g/L、コーンスチープリカー
５g/L、KH₂PO₄ ５g/L，MgSO₄・7H₂O 0.2g/L、消泡剤0.5g
/Lの組成よりなる培地に培養し、実施例１と同様に操作
を行い、40単位/mlのＮＡＤ−ＣＤＨ溶液5.0ml得た。全
体の活性収率は40％であった。

【００４４】実施例３ Proteus vulugaris IAM1025を用い、実施例１に準ずる
操作を行い、37単位/mlのＮＡＤ−ＣＤＨ溶液４mlを得
た。全体の活性収率は52％であった。

【００４５】実施例４実施例１で得られたＮＡＤ−ＣＤＨを用い、標準血清に
おけるコレステロールの定量を行った。

【００４６】0.1Mトリス塩酸緩衝液（pH8.6）2.71ml，
８％トリトンX-100 0.1ml、ＮＡＤ溶液（200mg/ml）１m
l、コレステロールエステラーゼ（ベーリンガー社製）
溶液（100単位/ml）0.05ml、標準血清0.02mlを混合し、
30℃で反応させ、340nmにおける吸光度の増加を測定し
た。反応は３分以内に終点に達した。

【００４７】対照として上記反応組成物のＮＡＤ−ＣＤ
Ｈの代わりに水を用い同様の操作を行い対照液の340nm
における吸光度の増加を試験液のそれから差し引いた。

【００４８】この標準血清における総コレステロール量
は、あらかじめ作成した検量線より、コレステロール28
9mg/dlの値が得られた。コレステロールオキシダーゼを
含む、市販の測定用試薬を用いて行った比較測定から
は、コレステロール290mg/dlの値が得られた。

【００４９】実施例５実施例２〜実施例３で得られたＮＡＤ−ＣＤＨを用い、
実施例４に準じた操作を行い、実質的には同じ結果が得
られた。

【００５０】実施例６実施例１で得られたＮＡＤ−ＣＤＨを使用し、実施例４
と同様の操作により、各種血清サンプルのコレステロー
ルを定量し、表３の結果を得た。

【００５１】

【表３】

【００５２】

【発明の効果】本発明により、従来のコレステロールの
定量に使用されたコレステロールオキシダーゼを使用す
る方法の各種の問題点、即ち、発色系に導くためにパー
オキシダーゼ等が必要であり、操作が繁雑である点、血
中のビリルビン、アスコルビン酸等により影響を受け、
これにより誤差が生じやすいという問題点を解決する方
法が提供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】ノカルジア sp. No. Ch2-1 (FERM-P No.6217)
の生産するＮＡＤ−ＣＤＨの至適pHを示すグラフであ
る。

【図２】ノカルジア sp. No. Ch2-1 (FERM-P No.6217)
の生産するＮＡＤ−ＣＤＨのpH安定性を示すグラフであ
る。

【図３】ノカルジア sp. No. Ch2-1 (FERM-P No.6217)
の生産するＮＡＤ−ＣＤＨの至適温度を示すグラフであ
る。

【図４】ノカルジア sp. No. Ch2-1 (FERM-P No.6217)
の生産するＮＡＤ−ＣＤＨの熱安定性を示すグラフであ
る。

【図５】アルカリゲネス sp. No.4 (FERM-P No.6216)の
生産するＮＡＤ−ＣＤＨの至適pHを示すグラフである。

【図６】アルカリゲネス sp. No.4 (FERM-P No.6216)の
生産するＮＡＤ−ＣＤＨのpH安定性を示すグラフであ
る。

【図７】アルカリゲネス sp. No.4 (FERM-P No.6216)の
生産するＮＡＤ−ＣＤＨの至適温度を示すグラフであ
る。

【図８】アルカリゲネス sp. No.4 (FERM-P No.6216)の
生産するＮＡＤ−ＣＤＨの熱安定性を示すグラフであ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｑ 1/60 Ｃ１２Ｒ 1:37） (Ｃ１２Ｑ 1/32 Ｃ１２Ｒ 1:365） (Ｃ１２Ｑ 1/32 Ｃ１２Ｒ 1:05） (Ｃ１２Ｑ 1/32 Ｃ１２Ｒ 1:37）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】コレステロールに特異性の高いＮＡＤ依存
性コレステロール脱水素酵素を使用することを特徴とす
るコレステロールの定量法
【請求項２】ＮＡＤ依存性コレステロール脱水素酵素が
好気的条件下で生育する微生物の培養液から得られる酵
素である請求項１記載のコレステロールの定量法。
【請求項３】好気的条件下で生育する微生物がノカルジ
ア属、アルカリゲネス属、プロテウス属である請求項２
記載のコレステロールの定量法。