JPH0817712B2 - 新規ヒトｔｎｆポリペプチド変異体 - Google Patents
新規ヒトｔｎｆポリペプチド変異体Info
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- JPH0817712B2 JPH0817712B2 JP62154239A JP15423987A JPH0817712B2 JP H0817712 B2 JPH0817712 B2 JP H0817712B2 JP 62154239 A JP62154239 A JP 62154239A JP 15423987 A JP15423987 A JP 15423987A JP H0817712 B2 JPH0817712 B2 JP H0817712B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は新規ヒトTNFポリペプチド変異体，その製造
法及びその変異体をコードするDNA等に関する． TNF（tumor necrosis factor）は,1975年カーズウェ
ルら［Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,72,3666（1975）］に
より見い出された生理活性物質であり，インビトロの細
胞培養系で強い細胞障害活性を示し，かつインビボで移
植腫瘍に壊死を生ぜしめる物質として特徴づけられてい
る［L.J.Old,Cancer Res.,41,361（1981）］． 1984年〜1985年に，ウサギ，ヒト及びマウスTNFをコ
ードする遺伝子が単離され［特開昭60-120990，特開昭6
0-185799,L.Fransenら,Nucleic Acids Res.,13,44117
（1985）］，それぞれのTNFポリペプチドの全一次構造
が明らかにされた． TNF遺伝子，特にヒトTNF遺伝子が単離されたことによ
り，遺伝子工学的手法を用いて微生物中でヒトTNFを生
産させることが可能となり，ヒトTNFの諸性質について
更に詳細な検討が加えられ，インビトロにおける強い細
胞障害活性とインビボにおける抗腫瘍活性が確認された
［D.Pennicaら,Nature,312,724（1984）;T.Shiraiら,Na
ture,313,803（1985）,M.Yamadaら,J.Biotechnology,3,
141（1985）］． ヒトTNFポリペプチドの修飾体についての研究もなさ
れており，いくつかの特許出願が公開されている（PCT
国際特許出願公開番号WO 86/02381,同公開番号WO 86/04
606,ヨーロッパ公開特許168214,同公開特許155549,特開
昭62-48632）．このうち前３者の特許出願は主に157の
アミノ酸残基から構成されているヒトTNFポリペプチド
の修飾について言及するか或は特定の修飾体について開
示しているに過ぎない．残りの２者の特許出願は155の
アミノ酸残基から構成されているヒトTNFポリペプチド
の修飾体について開示或いは言及しているが，本発明の
ヒトTNFポリペプチド変異体は，これらの出願明細書に
具体的に開示されている修飾体とアミノ酸配列が異なっ
ている． 本発明者らは,155のアミノ酸残基からなるヒトTNFポ
リペプチド又はそのポリペプチドのＮ末端側からのいく
つかのアミノ酸を欠失させたポリペプチドにおいて，そ
のアミノ酸配列におけるアミノ酸の変換を具体的に遂行
し，得られた種々のポリペプチド変異体の性質を検討し
た結果，特定箇所のアミノ酸の変換を行った場合に限
り，可溶性タンパクとして得られることが判明した．従
って，本発明の目的は，可溶性ヒトTNFポリペプチド変
異体群を提供することにある． 本発明者らは，上記のポリペプチド変異体群の中で，
特定の変異体がインビトロ及びインビボにおいて，ヒト
TNFに匹敵する細胞障害活性，抗腫瘍活性を有すること
を見い出した．従って，本発明の他の目的は，インビト
ロ，インビボにおいて，優れた細胞障害活性，抗腫瘍活
性を有するヒトTNFポリペプチド変異体を提供すること
にある． また，上記ポリペプチド変異体群のうち，別の特定の
変異体が，全く驚くべきことに，インビトロにおける細
胞障害活性が極めて低いにも拘らず，インビボにおいて
は優れた抗腫瘍活性を示すことを見い出した．そしてこ
のポリペプチド変異体においては，医薬として用いる場
合好ましからざる作用である発熱作用等が相当軽減され
ることも併せて見い出した．従って，本発明の更なる他
の目的はインビトロでは極めて低い細胞障害活性しか示
さないが，インビボで優れた抗腫瘍効果を発揮し，かつ
副作用が軽減されたヒトTNFポリペプチド変異体を提供
することにある．この変異体のように，インビトロでは
活性が低いにも拘らず，インビボでは優れた活性を示す
という事実は,TNFの有する代表的な生物活性である細胞
障害活性と抗腫瘍活性を発現するのに必須な構造（活性
中心）が、TNFポリペプチド分子内で同一部位ではない
ことを示すものである．更にTNFの有する多様な生物活
性の活性中心もそれぞれ異なっているものと推察され
る． 本発明の他の目的は以下の記述から明かとなるであろ
う． 本明細書では記載の簡略化のために以下の略号を用い
ることにする． A アデニン C シトシン G グアニン T チミン Ala アラニン Arg アルギニン Asn アスパラギン Asp アスパラギン酸 Cys システイン Gln グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グリシン His ヒスチジン Ile イソロイシン Leu ロイシン Lys リジン Met メチオニン Phe フェニルアラニン Pro プロリン Ser セリン Thr スレオニン Trp トリプトファン Tyr チロシン Val バリン DNA デオキシリボ核酸 cDNA 相補DNA dATP デオキシアデノシン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸 bP 塩基対 SDS ドデシル硫酸ナトリウム MW 分子量 KD キロダルトン SD配列 シャイン−ダルガーノ配列 本明細書では，単鎖で示した塩基配列は正鎖（センス
ストランド）の塩基配列を，その左端は５′−末端，
右端は３′−末端を示す．アミノ酸配列の左端はＮ−末
端，右端はＣ−末端を示す． 本発明は表１の式［１］で示されるアミノ酸配列にお
いて，第16番目，第31〜34番目，第36番目，第48番目，
第73番目，第82番目，第85番目，第89番目，第94番目，
第97番目，第98番目，第103番目，第113番目，第115番
目，第117番目，第118番目，第131番目，第132番目，第
141〜146番目及び第153番目のアミノ酸残基の少くとも
１つが他のアミノ酸残基に変換されたアミノ酸配列を有
するポリペプチド（但し，第115番目のアミノ酸残基が
他のアミノ酸残基に変換されている場合は，第67番目及
び１又は第99番目のアミノ酸残基は他のアミノ酸残基に
変換されていてもよい．）又はそのポリペプチドのＮ末
端側のアミノ酸がＮ末端から順次最高８つ欠失したポリ
ペプチドに関する． 本発明のヒトTNFポリペプチド変異体を更に具体的に
例示すると， （Ａ） 表１の式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列におい
て， 第16番目のAlaがValに， 第31番目のAlaがThrに， 第32番目のAsnがAla,Cys,Asp,His,Ile,Arg,Ser,Thr,V
al,Tyrに， 第34番目のLeuがIleに， 第36番目のAlaがValに， 第48番目のValがMetに， 第73番目のLeuがProに， 第82番目のAlaがAspに， 第85番目のTyrがHisに， 第89番目のValがIleに， 第94番目のAlaがThrに， 第97番目のSerがAsnに， 第98番目のProがHis,Leuに， 第103番目のThrがProに， 第113番目のTyrがCysに， 第115番目のProがLeu,His,Gln,Ser,Ala,Phe,Asn,Thr,
Gly,Tyr,Val,Gln,Met,Ile,Asp,Trp,Lys,Arg,Thrに， 第117番目のTyrがHisに， 第118番目のLeuがGlnに， 第131番目のSerがIleに， 第132番目のAlaがThrに， 第141番目のAspがTyrに， 第143番目のAlaがValに， 第144番目のGluがLysに， 第145番目のSerがCysに， 第146番目のGlyがGluに， 第153番目のIleがLeuに変換されたアミノ酸配列を有
するヒトTNFポリペプチド， （Ｂ） 表１の式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列におい
て，第67番目及び／又は第99番目のCysがSerに変換さ
れ，かつ第115番目のProがPro以外の他のアミノ酸に変
換されたアミノ酸配列を有するヒトTNFポリペプチド変
異体， 及び（Ｃ）上記（Ａ）又は（Ｂ）のヒトTNFポリペプチ
ド変異体のＮ末端側から１〜８個のアミノ酸が順次欠失
したヒトTNFポリペプチド変異体が挙げられる． 上記ポリペプチド変異体（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）群の
中で，インビトロ，インビボにおいて優れた細胞障害活
性，抗腫瘍活性を示すポリペプチド変異体を例示すれば
次の通りである． 式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列において， 第16番目のAlaがValに， 第36番目のAlaがValに， 第73番目のLeuがProに， 第98番目のProがHis又はLeuに， 第103番目のThrがProに， 第115番目のProがHis又はGlnに， 第131番目のSerがIleに，又は 第143番目のAlaがValに変換されたアミノ酸配列を有
するポリペプチド． 上記変異体群の中で，インビトロの活性が低いが，イ
ンビボにおいて，優れた抗腫瘍活性を示すポリペプチド
変異体は次の通りである． 式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列において， 第31番目のAlaがThrに， 第32番目のAsnがAla,Cys,Asp,His,Ile,Arg,Ser,Thr,V
al,又はTyrに， 第115番目のProがSer,Ala,Phe,Asn,Thr,Gly,Tyr,Val,
Glu,Met,Ile,Asp,Trp,Leu,又はLysに，又は 第117番目のTyrがHisに変換されたアミノ酸配列を有
するポリペプチド． 特に好ましく変異体としては，式［Ｉ］で示されるア
ミノ酸配列において， 第32番目のAsnがTyr,His,Asp,又はSerに， 第115番目のProがLeu,Ser,Asp又はGlyに，又は 第117番目のTyrがHisに， 変換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げら
れる． 本発明のヒトTNFポリペプチド変異体をコードするDNA
は，公知のヒトTNF又はその前駆体をコードするDNAを公
知の方法，例えばヨーロッパ公開特許155549に記載の方
法によるか或いは全合成等の方法にて作製し、ついでこ
れを例えばA.ワングらの方法［Science,224,1431（198
4）］に準じて目的とする塩基を点変異させたDNAを作製
するか，又は適当な制限酵素によりDNA断片を単離し，
目的とする個所の塩基配列を人為的に変えた合成オリゴ
デオキシヌクレオチドアダプターを用いること等によ
り，本発明のヒトTNFポリペプチド変異体をコードするD
NA,即ちヒトTNFポリペプチドの構成アミノ酸配列の特定
の個所（一ケ所又はそれ以上）を他のアミノ酸に変換し
た本発明のポリペプチド変異体をコードするDNA,或いは
かようなポリペプチド変異体でＮ末端から最高８個のア
ミノ酸が欠失したポリペプチドをコードするDNAを製造
することができる． 例えば，式［Ｉ］の第115番目のアミノ酸（Pro）がLe
uに変換されたポリペプチド変異体をコードするDNAは次
のように製造することができる． ヒトTNF前駆体をコードする塩基配列を含むDNAを，前
記ヨーロッパ公開特許に記載の方法に準じて単離する． このヒトTNF前駆体の塩基配列は表８に示されてお
り，その第235番目の塩基から第699番目の塩基までの塩
基配列がヒトTNFをコードする塩基配列に該当する．ヒ
トTNFのアミノ酸配列における第115番目のアミノ酸であ
るProをコードするコドンは，表８中の第577〜579番目
の塩基（CCC）に相当する． 従って，このコドンを含むDNA断片を適当な制限酵素
の組み合せにより切り出す．別途，このDNA断片中の上
記Proのコドン（CCC）をLeuに対応するコドン（CTC）に
変えられた塩基配列を含むDNA断片を化学的に合成し，
この合成DNA断片を，先に切り出したDNA断片と置換させ
ることにより，上記のポリペプチド変異体をコードする
DNAを製造することができる． より具体的に説明すると，例えば制限酵素DdeＩとPvu
IIを用いて表８中の第555〜603番目に相当するDNA断片
を切り出す． 次に，化学合成するオリゴデオキシリボヌクレオチド
の塩基配列は下式に示すごとくであり,2断片として下記
の２本のDNA断片の塩基配列を合成し，これを上記の切
り出した表８の第555〜603番目に相当するDNA断片と置
き換える． ５′−TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCTCAT−３′ ３′−CCGGTTCGGGACCATACTCGA−５′ 及び ５′−CTATCTGGGAGGGGTCTTCCAG−３′ ３′−GTAGATAGACCCTCCCCAGAAGGTC−５′ このようにして作製されたDNAを当該技術分野で公知
の技術により適当な形質発現ベクターに適切な配列を有
するように挿入し，これを宿主に導入した形質転換体を
培養することにより，本発明のポリペプチド変異体を産
生させることができる．更に詳しくは，例えば本発明の
ポリペプチド変異体それ自体をコードする塩基配列を有
するDNAの５′末端に開始コドンATGを，かつ３′末端に
は終止コドンを有するDNA断片を作製し，これを適当な
プロモーター及びSD配列に続いて結合させ，ついでベク
ターに組み込むことにより本発明のポリペプチド変異体
生産用の形質発現ベクターを製造することができる．プ
ロモーターとしては，例えばlac，trp，tac，phoS，pho
A，PL,SV40初期プロモーター等が挙げられる．ベクター
としては，例えばプラスミド（pBR322等），ファージ
（λファージ誘導体等），ウイルス（SV40等），ランナ
ウェイプラスミドが挙げられる．この本発明のポリペプ
チド変異体生産用の形質発現ベクターを適当な宿主に、
例えば大腸菌にコーエンらの方法［Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA,69,2110（1972）］により，導入することにより
形質転換体を得ることができる．ついでこの形質転換体
をそれに応じた適当な培養条件下で培養することによ
り，目的とするポリペプチド変異体或はそのＮ末端にMe
tが結合したポリペプチド変異体を産生させることがで
きる．この培養物を例えば，リゾチーム消化と凍結融解
や超音波破砕，フレンチプレス等により破壊したのち，
遠心分離又はろ過することにより本発明のポリペプチド
変異体含有抽出液を得ることができる．この抽出液を蛋
白質の一般的な精製法（限外ろ過，透析，イオン交換ク
ロマトグラフィー，ゲルろ過，電気泳動，アフイニティ
ークロマトグラフィー等）に従い精製することにより，
本発明のポリペプチド変異体を純粋な形で得ることがで
きる．また，本発明のポリペプチド変異体に有機酸，無
機酸又は塩基を常法に従い作用させることにより本発明
のポリペプチド変異体の塩を製造することができる． 以下に実験例を挙げて本発明のポリペプチド変異体に
ついて説明する．対照として用いたヒトTNFはヨーロッ
パ公開特許155549の実施例（５）に開示されている精製
ヒトTNFポリペプチドを用いた． （１） 後記実施例および参考例で製造した形質転換体
を培養することにより，各種のポリペプチド変異体を生
産し，その溶解性を,SDS-PAGE［Laemmli,U.K.,Nature
（London）227,680（1970）］及びEIAにより評価した． 即ち，各種のポリペプチド変異体生産用の形質転換体
を後記の実施例１に示した方法に従って培養し，その大
腸菌体内で生産された各ポリペプチド変異体を,0.1％リ
ゾチーム及び30mM Nacl含有50mMトリス−塩酸緩衝液（p
H8）中に抽出した． その抽出液中に回収された目的とするポリペプチド変
異体の量をSDS-PAGE及びEIAにより測定し，各ポリペプ
チド変異体の上記媒体中での溶解性を評価した． SDS-PAGEでは，目的とするポリペプチド変異体の計算
分子量に相当する位置に検出されるタンパクの有無を指
標として判定した． また,EIAでは抗ヒトTNF抗体と免疫学的に反応するポ
リペプチド変異体の量を定量した.EIAによるヒトTNFポ
リペプチド変異体の定量法は，次の原理に基づくもので
ある． 即ち，検体中のヒトTNFポリペプチド変異体とβ−ガ
ラクトシダーゼで標識されたヒトTNFとの間で，抗ヒトT
NFウサギ抗血清に対し競合的な結合反応をおこさせた．
次いで，細菌細胞壁を結合させ不溶化した抗ウサギIgG
ヤギ抗血清を添加することにより，酵素標識ヒトTNF−
抗ヒトTNFウサギ抗体−抗ウサギIgGヤギ抗体の複合体を
形成させた．反応液を遠心分離し，固相を得た．固相中
に回収された上記複合体中の酵素標識ヒトTNF量を，そ
の酵素活性を指標として定量した． 即ち，酵素基質として２−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドを加え，酵素反応により生じた基質
分解物（２−ニトロフェノール）量を，波長410nmにお
ける吸光度により求めた．この複合体中の酵素標識ヒト
TNF量は，検体中のヒトTNFポリペプチド変異体量を反映
する． 別途にヒトTNFを用いて作成した標準曲線を用いて，検
体中のヒトTNFポリペプチド変異体量をヒトTNF相当量と
して求めた． 抗ヒトTNFウサギ抗血清の作製には，山田ら［J.Biote
chnology,3,141（1985）］の方法で製造された純粋なヒ
トTNFを抗原として用いた． 結果を下記表３に示す． 各菌体抽出液中に検出された目的とするポリペプチド
変異体が対照としたヒトTNFの場合にほぼ比敵する場合
を（）と表示した．これは，該ポリペプチド変異体が
可溶性タンパクであることを意味している． 一方，その検出量がやや少ない場合を（＋）と表示
し，極めて少ないか若しくは認められない場合を（−）
と表示した． （−）で表示されたポリペプチド変異体は特定のアミ
ノ酸変換により，ポリペプチドの構造に変化が生じたた
め，溶解性が著しく低下したか或いは大腸菌体中で分解
されてしまったものと考えられる． （２） 後記の実施例で得られた本発明の各種ポリペプ
チド変異体の等電点及び細胞障害活性値を下記表４中に
示す． 細胞障害活性は，マウスＬ−Ｍ細胞（ATCC,CCL1.2）
を用い，山田らの方法［J.Biotechnology,3,141（198
5）］に従って評価した．本試験に用いたポリペプチド
変異体はいずれもSDS-PAGEにて不純タンパクの混在を認
めない精製品である． （３） 後記の実施例記載の各種ポリペプチド変異体の
インビボにおける抗腫瘍活性を下記表５に示す． 抗腫瘍活性の評価は次のようにして行った． メスＡ肉腫細胞２×105個をBALB/C雌性マウス（８週
令）の腹部皮内に移植し，移植後７日目に本ポリペプチ
ド変異体を静脈内に１個投与した．腫瘍壊死惹起作用は
投与後24時間目にカーズウエルらの判定基準［Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,72,3666（1975）］に従って評価した． 表５に示すごとく，腫瘍を選択的に障害させる因子と
して特徴づけられているTNFのインビトロにおける細胞
障害活性とインビボにおける移植腫瘍に対する抗腫瘍活
性との間の相関性は乏しい．例えば,TNF-131IはヒトTNF
の有するインビトロ細胞障害活性及びインビボ抗腫瘍活
性とほぼ同様の活性を有している．しかしながら，その
他のポリペプチド変異体，例えば,N末端から第32番目，
第115番目及び第143番目のアミノ酸を変換したポリペプ
チド変異体は，それらのインビトロ細胞障害活性に比し
て強いインビボ抗腫瘍活性を示し，かつ致死毒性の低い
特徴を示した． （４） 本発明のポリペプチド変異体の数例について，
発熱誘発作用を試験した．それらの結果を下記表６に示
す． この発熱性試験はウサギに静脈内投与し，投与後の直
腸温の変化を観察した．観察は投与後４時間目迄行い，
その結果を0.4℃以下の体温上昇を（−）,0.5〜0.9℃の
体温上昇を（＋），及び1.0℃以上の体温上昇を（）
と表示した． （５） TNF-115Lの血圧に及ぼす影響を試験した．血圧
降下作用試験はSHR/NCrj雄性ラット（体重264〜304g,日
本チャールズ・リバー株式会社）の尾静脈内にTNF-115L
を投与し，ラット用尾動脈圧測定装置（KN-209型，夏目
製作所）を用い，無麻酔下で収縮期血圧を測定した．結
果を下記表７に示す． 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に具体的
に説明するが，本発明はこの実施例に限定されるもので
はない． 実施例１ ヒトTNFポリペプチド変異体TNF-32Yの製造 （１） 形質発現プラスミドの構築 表９中のアミノ酸番号第１〜155番までの配列に相当
する155残基のアミノ酸からなるポリペプチド（以下,TN
F-32Yという）生産用の形質発現プラスミド（pHNY-32）
を第２図及び第３図に示すように構築した． ヒトTNFをコードするクローン化cDNAは，ヨーロッパ
公開特許155549に記載された方法に従って作製された組
み換え体プラスミドpHTNF 13より，制限酵素PstＩを用
いた消化により切り出し，単離した． このクローン化cDNAを更に制限酵素AvaＩ及びHindIII
により消化し，ヒトTNFポリペプチドをコードする領域
の大部分を含むDNA断片（fragment）を単離した．この
単離されたDNA断片を以下TNF-DNA断片という．このTNF-
DNA断片は，表８中の塩基番号第250番目から下流側の配
列に相当する塩基配列を含む約600bp長の断片である．
その全塩基配列は山田らの報告［J.Biotechnology,3,14
1（1985）］に記載されている． このTNF-DNA断片を制限酵素HpaII及びBg1IIにより消
化し，表８中，塩基番号第250〜321番に相当するDNA断
片［DNA−１断片という］，塩基番号第322〜337番に相
当するDNA断片［DNA−２断片という］及び第338番目か
ら下流側に相当するDNA断片［DNA−３断片という］の３
つのDNA断片に切断し,DNA−１断片及びDNA−３断片を分
離精製した．これらDNA−１断片及びDNA−３断片を，常
法に従って合成した次式 ５′−CGGGCCTATGCCCTCC−３′ ［ａ］ ３−CCGGATACGGG−５′ で示されるオリゴヌクレオチド アダプターを介して,T
4DNAリガーゼ（ligase）を用いて結合させた．得られた
DNA断片をNY-DNA断片という．このNY-DNA断片に，常法
により合成した次式 ５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTATC−３′
［ｂ］ ３′−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAATAGCTA−５′ 及び ５′−GATTATGTCATCTTCTCGAACC−３′ ［ｃ］ ３′−ATACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT−５′ で示されるオリゴヌクレオチドアダプターをT4DNAリガ
ーゼを用いて順次結合させた．得られたDNA断片を，以
下ペプチド領域DNA断片という． 一方、プラスミドpCT−１［M.Ikehara et al.,Proc.N
atl.Acad.Sci.,USA,81,5956（1984）］に制限酵素HpaＩ
とAatIIを作用させtrpプロモーター領域の一部を含む約
380bpのDNA断片［このDNA断片trpプロモーター領域の塩
基配列は，ベネットらの報告（J.Mol.Boil.,121,113,19
78年）に示されている］を切り出し，これを上記のペプ
チド領域DNA断片にT4DNAリガーゼを用いて結合させた．
得られたDNA断片を，以下プロモーター・ペプチドDNA断
片という． 別途に，プラスミドpBR322に制限酵素AvaＩとPvuIIを
作用させ，大きなDNA断片（約3.7kbp）を0.7％アガロー
スゲル電気泳動により分離した．このDNA断片の両端をD
NAポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）及びdGTP,d
ATP,dCTP,dTTPを用いて平滑末端とし，その両端をT4DNA
リガーゼを用いて結合させた．このプラスミドベクター
をpBRS6という．更に，このベクター（pBRS6）に制限酵
素AatIIとHindIIIを作用させ大きなDNA断片（約3.6Kb
p）を単離精製した．このDNA断片に先に調整したプロモ
ーター・ペプチド領域DNA断片をT4DNAリガーゼを用いて
結合させることにより，形質発現プラスミドpHNY−32を
構築した． （２） TNF-32Yの製造 （１）項で得た形質発現プラスミドpHNY-32を常法
［S.N.Cohen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,69,2110
（1972）］に従って大腸菌HB101に導入し，形質転換体
を作製した．この形質転換体をLBブロス（組成;1％バク
トトリプトン,0.5％酵母エキス,1％NaCl,pH7.5）中で一
夜培養し，その培養液を10倍容量の改良M9培地（組成;
0.45％カザミノ酸,0.4％グリセロール,25μg/mlアンピ
シリン）に接触し,37℃で１時間培養し，次いでインド
ールアクリル酸を最終濃度20μm/mlになるように加え，
更に24時間培養を継続したのち，遠心分離により菌体を
集めた．菌体を培地容量の1/10容量の0.1％リゾチーム
と30mM NaClを含む50mM Tris-HCl緩衝液（pH8）に懸濁
させ，氷水中で30分間静置した．更にドライアイス／エ
タノール浴での凍結と37℃での融解を繰り返した後，遠
心分離により菌体残渣を除いた抽出液を得た． この抽出液を20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.8）に対して
透析したのち，遠心分離しその上清液を採取した．この
上清液を，予め同緩衝液で平衡化したDEAE-Sepharose C
L-6B（ファルマシア社）カラムに負荷し，非吸着成分を
同緩衝液により十分洗浄除去した．次いで同緩衝液中,N
aCl濃度を０〜0.3Mまで連続的に上昇させ,TNF-32Yを溶
出した．該ペプチドの溶出位置はSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動分析にて約17KDの位置に検出されるタ
ンパクを指標として求めた． この画分を集め，再び20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.8）
に対して透析脱塩したのち，上記のDEAE-Sepharose CL-
6Bカラム クロマトグラフィーを，ゆるやかなNaCL濃度
勾配による溶出にて繰り返した． 該ペプチド溶出画分を集め，限外ろ過（分子篩膜YM1
0,アミコン社）にて濃縮した． この濃縮液をBio-Gel P−６（バイオラッド社）のカ
ラムにて，溶出液に5mMリン酸塩緩衝化生理食塩液を用
いてゲルろ過し，精製TNF-32Yを得た． 精製TNF−32YのＮ末端部アミノ酸配列はプロテインシ
ークエンサー（アプライド バイオシステムス社,470A
型）による自動エドマン分解法により決定した． その結果,TNF-32YのＮ末端アミノ酸はSerであった．
即ち，この最終精製品のＮ末端から翻訳開始コドン（AT
G）に由来するMetは除かれていた． 実施例２ ヒトTNFポリペプチド変異体TNF-115Lの製造 （１） 形質発現プラスミドの構築 表10中のアミノ酸番号第１〜155番までの配列に相当
する155残基のアミノ酸からなるポリペプチド（以下,TN
F-115Lという）生産用の形質発現プラスミドpHPL-115）
を第４図に示すように構築した． 実施例１−（１）項に記載の方法により調整したTNF-
DNA断片を制限酵素PvuII及びTaqＩにて消化し，表８
中，塩基番号第250〜369番目に相当するDNA断片［DNA−
４断片という］，塩基番号第370〜603番に相当するDNA
断片［DNA−５断片という］，塩基番号第604〜653番に
相当するDNA断片［DNA−６断片という］及び塩基番号第
654番から下流側に相当するDNA断片［DNA−７断片とい
う］の４つのDNA断片に切断し，それぞれを分離精製し
た.DNA−５断片を更に，制限酵素DdeＩにて切断し，表
８中塩基番号第370〜554番に相当するDNA断片［DNA−８
断片という］を分離精製した.DNA−４断片とDNA−８断
片をT4DNAリガーゼを用いて結合させ，更に常法にて合
成した次式 ５′−TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCTCAT−３′ ［ｄ］ ３′−CCGGTTCGGGACCATACTCAGA−５′ 及び ５′−CTATCTGGGAGGGGTCTTCCAG−３′ ［ｅ］ ３′−GTAGATAGACCCTCCCCAGAAGGTC−５′ で示されるオリゴヌクレオチドアダプターをT4DNAリガ
ーゼを用いて順次結合させた． 得られたDNAに更にDNA−６断片及びDNA−７断片を結
合させた．得られたDNA断片をPL-DNA断片という． 以下，実施例１−（１）記載の方法に従い，ただし,N
Y-DNA断片の代わりに上記PL-DNA断片を用いて，形質発
現プラスミドpHPL-115を構築した． （２） TNF-115Lの製造 （１）項で構築した形質発現プラスミドpHPL-115を用
い，実施例１−（２）記載の方法に従って，形質転換体
を作製し，培養した． その菌体抽出液から実施例１−（２）項に記載の方法
に準じて精製を行い精製TNF-115Lを得た． （３） アミノ酸配列決定 精製TNF-115L及びそのペプチド断片のアミノ酸配列
を，プロテインシークエンサーを用いる自動エドマン分
解法により決定した． ペプチド断片は次のように調整した．即ち，精製TNF-
115Lの500μｇを4M尿素を含む5mM Tris-HCl緩衝液（pH
8）の0.1ml中,10μｇのリジルエンドペプチターゼ（EC
3.4.21.50:和光純薬）と反応させた.35℃にて15時間反
応させた後，消化産物（ペプチド）をSyn Chropak RP-P
300カラム（250X4.6mm;シンクロム社）を用いる高速液
体クロマトグラフィにより単離した．その溶出は,0.1％
トリフルオロ酢酸中0.07％トリフルオロ酢酸を含むアセ
トニトリルの10％から50％までの直線的濃度勾配にて,1
ml/分の流速で60分間行った． その溶出図を第５図に示す．第５図中のNo.1からNo.7
の各分画から単離したペプチド断片のＮ末端部分のアミ
ノ酸配列を自動エドマン分解法により決定した．その結
果，分画No.6のペプチド断片の部分アミノ酸配列は,Pro
−Ｘ−Tyr-Glu-Leu-Ile-Tyr-Leu-Gly-Gly-Val-Phe-Gln-
Leu-Gluであった．配列中のＸは，不確定のアミノ酸を
意味する． 上記のアミノ酸配列は，表10中のアミノ酸番号第111
〜125番の配列と一致した． この結果より,TNF-115LのＮ末端から第115番目のアミ
ノ酸がLeuであることが確認された．また,TNF-115LのＮ
末端アミノ酸はSerであり，翻訳開始コドン（ATG）に由
来するMetは除かれていた． 実施例３ ヒトTNFポリペプチド変異体TNF-115LΔN8の製造 （１） 形質発現プラスミドの構築 表10に示したアミノ酸配列の第９番目のアミノ酸（Ly
s）から第155番目のアミノ酸（Leu）に相当する147残基
のアミノ酸によりなるポリペプチド（以下,TNF-115LΔN
8という）生産用の形質発現プラスミド（pHPL-147）
を，第６図に示すように構築した． 実施例２−（１）項で得た形質発現プラスミドpHPL-1
15を制限酵素ClaＩとBstEIIで消化し，表10の塩基番号
第380番より下流側（TNF-115LのＣ末端部分をコードす
る領域），テトラサイクリン耐性遺伝子，アンピシリン
耐性遺伝子及びtrpプロモーター領域の部分を含む大き
なDNA断片（以下，ベクターDNA断片という）と表10の塩
基番号第１〜379番目に相当する塩基配列を含む小さなD
NA断片を分離精製した．この小さなDNA断片も更に制限
酵素HgiAIで消化切断したのち，塩基番号第219〜379番
目に相当するDNA断片を単離した．このDNA断片を以下,H
gi-DNAという． 別途に参考例２に記載した方法に従って構築した形質
発現プラスミドpHT147を制限酵素ClaＩとHgiAIで消化
し，表10の塩基番号第25〜218番目に相当する塩基配列
を含む約200bpのDNA断片を単離した．このDNA断片を以
下，ΔN8-DNA断片という． このΔN8-DNA断片と上記のHgi-DNA断片をT4DNAリガー
ゼを用いて結合させ，得られたDNA断片を先に調整し
た．エクターDNA断片に組み込むことにより，形質発現
プラスミドpHPL-147を構築した． （２） TNF-115LΔN8の製造 形質発現プラスミドpHPL-147を用い，実施例１−
（２）項記載の方法に従って，形質転換体を作製し，培
養した．その菌体抽出液より，実施例１−（２）項記載
の方法に準じて，精製し，精製TNF-115LΔN8を得た． 精製TNF−115LΔN8のＮ末端アミノ酸として翻訳開始
コドン（ATG）に由来するMetが自動エドマン分解法によ
り検出された． 実施例４ ヒトTNFポリペプチド変異体TNF-115L-Ser67の製造 （１） 形質発現プラスミドの構築 表10に示したアミノ酸配列の第１〜115番に相当する
アミノ酸配列のうち第67番目のアミノ酸であるCysがSer
に置き換えられたポリペプチド（TNF-115L-Ser67とい
う）生産用の形質発現プラスミドを第７図に示すように
構築した． 参考例３に記載の方法に構築された形質発現プラスミ
ドpHTP392を制限酵素ClaI,HgiAI及びHpaＩで消化し，表
10の塩基番号第１〜218番目に相当する塩基配列，但し
第200番と第201番目の塩基GCがCTに置換された塩基配列
を含む約226bpのDNA断片を単離した．このDNA断片を以
下,Ser67-DNA断片という． このSer67-DNA断片と，実施例３−（１）項記載の方
法で調整されたHgi-DNA断片をT4DNAリガーゼを用いて結
合させ，得られたDNA断片を，実施例３−（１）項記載
の方法で得たベクターDNA断片に組み込むことにより，
形質発現プラスミドpHPL-Ser67を構築した． （２） TNF-115L-Ser67の製造 形質発現プラスミドpHPL-Ser67を用い，実施例１−
（２）項記載の方法に従って形質転換体を作製し，培養
した．その菌体抽出液より，実施例１−（２）項の記載
の方法に準じて精製し，精製TNF-115L-Ser67を得た． 精製TNF-115L-Ser67のＮ末端部分アミノ酸配列を自動
エドマン分解法により決定したところ,Serであり，翻訳
開始コドン（ATG）に由来するMetは除去されていた． 実施例５ ヒトTNFポリペプチド変異体TNF-115LΔN8-Ser67の製
造 （１） 形質発現プラスミドの構築 表10に示したアミノ酸配列の第９〜115番に相当する1
47残基からなる配列中Ｎ末端から第67番目のアミノ酸で
あるCysがSerに置換されたポリペプチド（以下,TNF−11
5LΔN8-Ser67という）生産用の形質発現プラスミド（pH
PL147S67）を第８図に示すように構築した． 実施例４−（１）項記載の方法で得た形質発現プラス
ミドpHPL-Ser67を制限酵素ClaＩ及びBstEIIによる消化
にて２つのDNA断片とした．大きなDNA断片は実施例３で
作製したベクターDNA断片と同じ断片である．小さなDNA
断片を更に制限酵素RsaＩで消化したのち，表10の塩基
番号第161〜379番に相当する塩基配列を含むDNA断片を
単離した．以下，この断片をRsa-DNA断片という． 一方，実施例３−（１）項記載の方法で得た形質発現
プラスミドpHPL-147を，制限酵素ClaＩ及びRsaＩで消化
し，表10中の塩基番号第25〜160番に相当する塩基配列
を含む約144bpのDNA断片を単離した． このDNA断片と上記のRsa-DNA断片をT4DNAリガーゼを
用いて結合させ，得られたDNA断片を先に作製したベク
ターDNA断片に組み込むことにより,TNF-115LΔN8-Ser67
生産用の形質発現プラスミドpHPL147S67を構築した． （２） TNF-115LΔN8-Ser67の製造 形質発現プラスミドpHPL147S67を用い実施例１−
（２）項記載の方法に従って形質転換体を作製し，培養
した．その菌体抽出液より実施例１−（２）項記載の方
法に準じて精製し，精製TNF-115LΔN8-Ser67を得た．精
製TNF-115LΔN8-Ser67のＮ末端アミノ酸として，翻訳開
始コドン（ATG）に由来するMetが検出された． 実施例６ その他のヒトTNFポリペプチド変異体の製造−１ （１） 形質発現プラスミドの構築 表１の式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列の第１〜155
番に相当する155残基からなる配列中,N末端から第32番
目のアミノ酸であるAsnが他のアミノ酸，例えばHis,Asp
又はSerに変換されたポリペプチド生産用の形質発現プ
ラスミドを実施例１−（１）項記載の方法に従い，但し
合成アダプター［ａ］の代わりに下式で示される化学合
成オリゴヌクレオチド アダプターのいずれかを用いる
ことにより構築した． ５′−CGGGCCCACGCCCTCC−３′ ３′−CCGGGTGCGGG−５′ （Hisへの変換の場合） ５′−CGGGCCGATGCCCTCC−３′ ３′−CCGGCTACGGG−５′ （Aspへの変換の場合） 又は， ５′−CGGGCCAGCGCCCTCC−３′ ３′−CCGGTCGCGGG−５′ （Serへの変換の場合） （２） ヒトTNFポリペプチド変異体の製造 前記（１）項で作製した各形質発現プラスミドを常法
に従って大腸菌HB101株に尊入し，形質転換体を作製し
た．形質転換体を実施例１−（２）項記載の方法にて培
養し，その菌体抽出液から実施例１−（２）項記載の方
法に準じて精製することにより，下記のヒトTNFポリペ
プチド変異体を得た． TNF-32H:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のアミノ
酸であるAsnがHisに変換されたポリペプチド TNF-32D:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のアミノ
酸であるAsnがAspに変換されたポリペプチド TNF-32S:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のアミノ
酸であるAsnがSerに変換されたポリペプチド 実施例７ その他のヒトTNFポリペプチド変異体の製造−２ （１） 形質発現プラスミドの構築 表１の式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列の第１〜155
番に相当する155残基からなる配列中,N末端から第115番
目のアミノ酸であるProが他のアミノ酸，例えば,Ser,As
p又はGlyに変換されたポリペプチド生産用の形質発現プ
ラスミドを実施例２−（１）項記載の方法に従い，但し
合成アダプター［ｄ］の代わりに下式で示される化学合
成オリゴヌクレオチドアダプターのいずれかを用いるこ
とにより構築した． ５′−TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGTCCAT−３′ ３′−CCGGTTCGGGACCATACTCAG−５′ （Serへの変換の場合） ５′−TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGGACAT−３′ ３′−CCGGTTCGGGACCATACTCCT−５′ （Aspへの変換の場合） 又は， ５′−TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGGGCAT−３′ ３′−CCGGTTCGGGACCATACTCCC−５′ （Glyへの変換の場合） （２） ヒトTNFポリペプチド変異体の製造 前記（１）項で作製した各形質転換プラスミドを常法
に従って大腸菌HB101株に導入し，形質転換体を作製し
た．形質転換体を実施例１−（２）項記載の方法に従っ
て培養し，その菌体抽出液から実施例１−（２）項記載
の方法に準じて精製することにより，下記のヒトTNFポ
リペプチド変異体を得た． TNS-115S:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のアミ
ノ酸であるProがSerに変換されたポリペプチド TNS-115D:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のアミ
ノ酸であるProがAspに変換されたポリペプチド TNF-115G:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のアミ
ノ酸であるProがGlyに変換されたポリペプチド 実施例８ ヒトTNFポリペプチド変異体TNF-117Hの製造 （１） 形質発現プラスミドの構築 表１の［Ｉ］で示されるアミノ酸配列の第１〜155番
に相当する155残基からなる配列中,N末端から第117番目
のアミノ酸であるTyrが他のアミノ酸，例えばHisに変換
されたポリペプチド（以下,TNF-117Hという）生産用形
質発現プラスミドを実施例２−（１）項記載の方法に従
い，但し合成アダプター［ｅ］の代わりに下式で表わさ
れる化学合成オリゴヌクレオチドアダプターを用いて構
築した． ５′−CCATCTGGGAGGGGTCTTCCAG−３′ ３′−GTAGGTAGACCCTCCCCAGAAGGTC−５′ （２） TNF-117Hの製造 前記（１）項で作製した形質発現プラスミドを常法に
従って大腸菌HB101株に導入し，形質転換体を作製し
た．形質転換体を実施例１−（２）項記載の方法に従っ
て培養し，その菌体抽出液から実施例１−（２）項記載
の方法に準じて精製することにより,TNF-117Hを得た． 実施例９ その他のヒトTNFポリペプチド変異体の製造−３ 実施例１に記載の方法に準じて，下記ポリペプチド生
産用の形質発現プラスミドを構築し，大腸菌に導入して
形質転換体を作製した．形質転換体を培養し，その菌体
抽出液から下記のポリペプチドを単離精製した． TNF-16V:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第16番目のアミノ
酸であるAlaがValに変換されたポリペプチド TNF-31T:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第31番目のアミノ
酸であるAlaがThrに変換されたポリペプチド TNF-32G:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のアミノ
酸であるAsnがGlyに変換されたポリペプチド TNF-32L:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のアミノ
酸であるAsnがLeuに変換されたポリペプチド TNF-36V:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第36番目のアミノ
酸であるAlaがValに変換されたポリペプチド TNF-73P:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第73番目のアミノ
酸であるLeuがProに変換されたポリペプチド TNF-82D:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第82番目のアミノ
酸であるAlaがAspに変換されたポリペプチド（等電点5.
3） TNF-85H:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第85番目のアミノ
酸であるTyrがHisに変換されたポリペプチド（等電点6.
4） TNF-98H:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第98番目のアミノ
酸であるProがHisに変換されたポリペプチド TNF-103P:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第103番目のアミ
ノ酸であるThrがProに変換されたポリペプチド TNF-115T:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のアミ
ノ酸であるProがThrに変換されたポリペプチド TNF-115H:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のアミ
ノ酸であるProがHisに変換されたポリペプチド TNF-115R:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のアミ
ノ酸であるProがArgに変換されたポリペプチド TNF-131l:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第131番目のアミ
ノ酸であるSerがIleに変換されたポリペプチド TNF-141Y:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第141番目のアミ
ノ酸であるAspがTyrに変換されたポリペプチド TNF-143V:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第143番目のアミ
ノ酸であるAlaがValに変換されたポリペプチド TNF-144K:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第144番目のアミ
ノ酸であるGluがLysに変換されたポリペプチド TNF-146E:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第146番目のアミ
ノ酸であるGlyがGluに変換されたポリペプチド 実施例10 その他のヒトTNFポリペプチド変異体の製造−４ 実施例１に記載の方法に準じて，下記ポリペプチド生
産用の形質発現プラスミドを構築し，大腸菌に導入して
形質転換体を作製した．形質転換体を培養し，その菌体
抽出液から下記のポリペプチドを単離精製した． TNF-32A:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のAsnがA
laに変換されたポリペプチド TNF-32C:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のAsnがC
ysに変換されたポリペプチド TNF-32I:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のAsnがI
leに変換されたポリペプチド TNF-32R:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のAsnがA
rgに変換されたポリペプチド TNF-32T:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のAsnがT
hrに変換されたポリペプチド TNF-32V:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のAsnがV
alに変換されたポリペプチド TNF-34I:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第34番目のLeuがI
leに変換されたポリペプチド TNF-48M:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第48番目のValがM
etに変換されたポリペプチド TNF-89I:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第89番目のValがI
leに変換されたポリペプチド TNF-94T:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第94番目のAlaがT
hrに変換されたポリペプチド TNF-97N:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第97番目のSerがA
snに変換されたポリペプチド TNF-98L:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第98番目のProがL
euに変換されたポリペプチド TNF-113C:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第113番目のTyr
がCysに変換されたポリペプチド TNF-115Q:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がGlnに変換されたポリペプチド TNF-115A:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がAlaに変換されたポリペプチド TNF-115F:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がPheに変換されたポリペプチド TNF-115N:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がAsnに変換されたポリペプチド TNF-115Y:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がTyrに変換されたポリペプチド TNF-115V:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がValに変換されたポリペプチド TNF-115E:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がGluに変換されたポリペプチド TNF-115M:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がMetに変換されたポリペプチド TNF-115I:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がIleに変換されたポリペプチド TNF-115W:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がTrpに変換されたポリペプチド TNF-115K:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がLysに変換されたポリペプチド TNF-118Q:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第118番目のLeu
がGlnに変換されたポリペプチド TNF-132T:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第132番目のAla
がThrに変換されたポリペプチド TNF-145C:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第145番目のSer
がCysに変換されたポリペプチド TNF-153L:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第153番目のIle
がLeuに変換されたポリペプチド 参考例１ ヒトTNF生産用形質発現プラスミドの構築 ヒトTNFをコードするクローン化cDNAを，ヨーロッパ
公開特許155549に記載の方法に従って調製した組み換え
体プラスミドpHTNF13から，制限酵素PstIにより切り出
し，単離した． このクローン化cDNAを更に，制限酵素EcoRIによる消
化にて,TNF翻訳領域の下流側の非翻訳領域の一部を切断
除去し，約1.1kbpのDNA断片を得た．このDNA断片をプラ
スミドpBR322の制限酵素EcoRI及びPstＩによる切断断片
（約3.6kbp）に組み込むことにより,TNFcDNA及びテトラ
サイクリン耐性遺伝子を含む新しい組み換え体プラスミ
ドを構築した．この組換え体プラスミドをpHT113と名づ
けた． このプラスミドpHT113に制限酵素AvaＩとSalＩを作用
させ３種のDNA断片（それぞれ約0.8kbp,1.3kbp及び2.6k
bp）に切断した．これらのDNA断片のうち，ヒトTNFをコ
ードする領域の大部分とプラスミドpBR322のテトラサイ
クリン耐性遺伝子の一部を含む約1.3kbpのDNA断片を分
離精製した（このDNA断片をAvaI-SalI断片という）． このAvaI-SalI断片に，次式で示される合成オリゴヌ
クレオチドアダプター［ｆ］を結合させた． ５′−CGATATGTCATCTTCTCGAACC−３′ ［ｆ］ ３′−TATACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT−５′ 得られたDNA断片を，以下HTNF−アダプター断片とい
う． 別途，trpプロモーター（promoter）領域の一部を含
むDNA断片（35bp長）を，プラスミドpDR720［Ｐ−L Bio
chemicals;D.R.Russell,et al.,Gene,20, 231（198
3）］から制限酵素EcoRI及びHpaＩにより切り出し，単
離した． このDNA断片の塩基配列は次式に示す通りである． ５′−AATTCCCCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTT ３′−GGGGACAACTGTTAATTAGTAGCTTGATCAA これに，常法により合成した次式 ５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAAT ［ｇ］ ３′−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCCATTAGC で示されるオリゴヌクレオチド アダプター［ｇ］をT4
DNAリガーゼを用いて結合させた．ここに得られたDNA断
片を，以下trpプロモーター断片という． 一方、プラスミドpBR322に制限酵素EcoRI及びSalＩを
作用させ，大きなDNA断片（約3.7kbp長）を切り出し
た．これに，先に調整したHTNF−アダプター断片とtrp
プロモーター断片を,T4DNAリガーゼを用いて結合させる
ことにより，表８のアミノ酸配列中，アミノ酸番号第79
〜233番に相当する155残基のアミノ酸からなるヒトTNF
生産用の形質発現プラスミドを構築した（第９図参
照）． この形質発現プラスミドをpHTR91と名づけた． 参考例２ ヒトTNFポリペプチド誘導体TNF（147）生産用形質発
現プラスミドの構築 表８に示したアミノ酸配列中，第84〜233番の配列に
相当する147残基のアミノ酸からなるヒトTNF誘導体［以
下,TNF（147）という］生産用の形質発現プラスミド（p
HT147）を構築した（第10図参照）． 参考例１に記載した方法で得た組み換え体プラスミド
pHTR91を制限酵素ClaＩ及びBalＩにより消化し,4種のDN
A断片とした．それらのうち２種の小さな断片（それぞ
れ113bpと0.6kbp）を５％ポリアクリルアミド電気泳動
にて分離精製した．このうち小さな断片（113BP）を，
更に制限酵素DdeＩにて２つのDNA断片（47bpと66bp）に
切断し,47bpのDNA断片を単離した．このDNA断片を，以
下47bp断片という． この断片に，常法によりそれぞれ合成した次式 ５′−CGATTATGAAGCCTGTAG−３′ ［ｈ］ ３′−TAATACTTCGGACATCGGG−５′ 及び ５′−CCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGC−３′ ［ｉ］ ３′−TACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT−５′ で示される２種類のオリゴヌクレオチド アダプター
［ｈ］及び［ｉ］をT4DNAリガーゼを用いて結合させ
た． 更に化学合成した次式 ５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTAT−３′［ｊ］ ３′−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAATAGC−５′ で示されるオリゴヌクレオチド アダプター［ｊ］を結
合させた．ここで得たDNA断片を，以下５′−DNA断片と
いう． 一方，プラスミドpCT−１［M.Ikehara et al.,Proc.N
atl.Acad.Sci., USA,81,5956（1984）］に制限酵素Hpa
Ｉ及びAatIIを作用させ，trpプロモーター領域の一部を
含む約380bpのDNA断片を切り出し，これに上記の５′−
DNA断片を結合させた．得られたDNA断片を，以下，プロ
モーター５′−DNA断片という． 別途，参考例１に記載の方法で作製した組み換え体プ
ラスミドpHTR91に制限酵素BalＩ及びHindIIIを作用さ
せ，ヒトTNFポリペプチドのＣ末端部分をコードする領
域を含むDNA断片（487bp）を切り出し分離精製した．こ
のDNA断片に先に調整したプロモーター５′−DNA断片を
T4DNAリガーゼを用いて結合させた．得られたDNA断片
を，以下，プロモーターTNF（147）‐DNA断片という． 一方、実施例１−（１）項に記載したプラスミドpBRS
6に制限酵素AatII及びHindIIIを作用させ，切り出され
た大きなDNA断片（約3.6kbp）を単離した． このDNA断片に先に調整したプロモーターTNF（147）‐D
NA断片を結合させることにより，形質発現プラスミドpH
T147を構築した． 参考例３ ヒトTNFポリペプチド変異体TNF-67S生産用形質発現プ
ラスミドの構築 表１の式［Ｉ］で示したアミノ酸配列中,N末端から第
67番目のアミノ酸であるCysがSerに変換されたポリペプ
チド（以下,TNF-67Sという）生産用形質発現プラスミド
（pHTP392）を構築した（第11図参照）． 参考例１に記載した方法で得た組み換え体pHTR91を制
限酵素AvaI及びHindIIIにより消化し，表８に示した塩
基配列中，塩基番号第250番より下流側の領域に相当す
る約600bp長のDNA断片を単離した． このDNA断片を，更に制限酵素AvaII及びHgiAIにて３
つのDNA断片（約162bp,41bp及び375bp）に切断し，ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にて,162bpと375bp長のDNA
断片を単離した． これらのDNA断片を，次式で示される化学合成オリゴ
ヌクレオチド アダプター［ｋ］及び［ｌ］， ５′−GTCCTCTTCAAGGGCCAA−３′ ３′−GAGAAGTTCCCGGTTCCGA−５′ ［ｋ］ 及び ５′−GGCTCTCCCTCCACCCATGTGCT−３′ ［ｌ］ ３′−GAGGGAGGTGGGTAC−５′ をT4DNAリガーゼを用いて結合させた． 更に，得られたDNA断片に，次式で示される化学合成
オリゴヌクレオチド アダプター［ｊ］及び［ｍ］， ５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTAT−３′［ｊ］ ３′−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAATAGC−５′ 及び ５′−CGATTATGTCATCTTCTCGAACC−３′ ［ｍ］ ３′−TAATACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT−５′ を,T4DNAリガーゼを用いて順次結合させた．ここで得ら
れたDNA断片を，以下TNF（Ser67）‐DNA断片という． 一方，trpプロモーター領域を含むDNA断片（約380b
p）は，参考例２に記載したごとくプラスミドpCT−１か
ら制限酵素HpaＩ及びAatIIにより切り出し，単離した．
このDNA断片を先に調製したTNF（Ser67）‐DNA断片を結
合させた．このDNA断片を，以下プロモーターTNF（Ser6
7）‐DNA断片という． 別途に，実施例１−（１）項に記載した方法にて得た
プラスミドベクターpBRS6を，制限酵素AatII及びHindII
Iにて切断し，大きなDNA断片（約3.6kbp）を単離した．
このDNA断片に上記のプロモーターTNF（Ser67）‐DNA断
片を,T4DNAリガーゼを用いて結合させることにより，形
質発現プラスミドpHTP392を構築した． この形質発現プラスミドを，実施例１−（２）項記載
の方法に従って，大腸菌に導入し，その形質転換体を培
養することによりTNF-67Sを生産させた． 参考例４ 下記のポリペプチド生産用の形質発現プラスミドを実
施例１記載の方法に準じて構築した． その形質発現プラスミドで形質転換した大腸菌を培養
することにより下記のポリペプチドを製造した． TNF-70Y:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第70番目のThrがT
yrに変換されたポリペプチド TNF-99S:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第99番目のCysがS
erに変換されたポリペプチド 参考例５ 下記のポリペプチド生産用の形質発現プラスミドを実
施例１記載の方法に準じて構築した． これらの形質発現プラスミドで形質転換した大腸菌を
培養することにより，下記のポリペプチドを製造した
が，これらのポリペプチドは可溶性タンパクとして殆ん
ど若しくは全く抽出されなかった． TNF-12T:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第12番目のAlaがT
hrに変換されたポリペプチド TNF-13Y:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第13番目のHisがT
yrに変換されたポリペプチド TNF-14A:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第14番目のValがA
laに変換されたポリペプチド TNF-17T:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第17番目のAsnがT
hrに変換されたポリペプチド TNF-24F:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第24番目のLeuがP
heに変換されたポリペプチド TNF-26R:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第26番目のTrpがA
rgに変換されたポリペプチド TNF-35P:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第35番目のLeuがP
roに変換されたポリペプチド TNF-44D:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第44番目のAsnがA
spに変換されたポリペプチド TNF-45P:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第45番目のGlnがP
roに変換されたポリペプチド TNF-50P:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第50番目のSerがP
roに変換されたポリペプチド TNF-54C:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第54番目のTyrがC
ysに変換されたポリペプチド TNF-58P:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第58番目のSerがP
roに変換されたポリペプチド TNF-59L:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第59番目のGlnがL
euに変換されたポリペプチド TNF-60D:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第60番目のValがA
spに変換されたポリペプチド TNF-60G:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第60番目のValがG
lyに変換されたポリペプチド TNF-62S:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第62番目のPheがS
erに変換されたポリペプチド TNF-93P:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第93番目のSerがP
roに変換されたポリペプチド TNF-121G:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第121番目のVal
がGlyに変換されたポリペプチド TNF-124Q:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第124番目のLeu
がGlnに変換されたポリペプチド TNF-128A:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第128番目のAsp
がAlaに変換されたポリペプチド TNF-128N:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第128番目のAsp
がAsnに変換されたポリペプチド TNF-135D:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第135番目のAsn
がAspに変換されたポリペプチド TNF-138Y:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第138番目のAsp
がTyrに変換されたポリペプチド TNF-148D:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第148番目のVal
がAspに変換されたポリペプチド TNF-148G:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第148番目のVal
がGlyに変換されたポリペプチド TNF-150L:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第150番目のPhe
がLeuに変換されたポリペプチド TNF-151E:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第151番目のGly
がGluに変換されたポリペプチド
法及びその変異体をコードするDNA等に関する． TNF（tumor necrosis factor）は,1975年カーズウェ
ルら［Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,72,3666（1975）］に
より見い出された生理活性物質であり，インビトロの細
胞培養系で強い細胞障害活性を示し，かつインビボで移
植腫瘍に壊死を生ぜしめる物質として特徴づけられてい
る［L.J.Old,Cancer Res.,41,361（1981）］． 1984年〜1985年に，ウサギ，ヒト及びマウスTNFをコ
ードする遺伝子が単離され［特開昭60-120990，特開昭6
0-185799,L.Fransenら,Nucleic Acids Res.,13,44117
（1985）］，それぞれのTNFポリペプチドの全一次構造
が明らかにされた． TNF遺伝子，特にヒトTNF遺伝子が単離されたことによ
り，遺伝子工学的手法を用いて微生物中でヒトTNFを生
産させることが可能となり，ヒトTNFの諸性質について
更に詳細な検討が加えられ，インビトロにおける強い細
胞障害活性とインビボにおける抗腫瘍活性が確認された
［D.Pennicaら,Nature,312,724（1984）;T.Shiraiら,Na
ture,313,803（1985）,M.Yamadaら,J.Biotechnology,3,
141（1985）］． ヒトTNFポリペプチドの修飾体についての研究もなさ
れており，いくつかの特許出願が公開されている（PCT
国際特許出願公開番号WO 86/02381,同公開番号WO 86/04
606,ヨーロッパ公開特許168214,同公開特許155549,特開
昭62-48632）．このうち前３者の特許出願は主に157の
アミノ酸残基から構成されているヒトTNFポリペプチド
の修飾について言及するか或は特定の修飾体について開
示しているに過ぎない．残りの２者の特許出願は155の
アミノ酸残基から構成されているヒトTNFポリペプチド
の修飾体について開示或いは言及しているが，本発明の
ヒトTNFポリペプチド変異体は，これらの出願明細書に
具体的に開示されている修飾体とアミノ酸配列が異なっ
ている． 本発明者らは,155のアミノ酸残基からなるヒトTNFポ
リペプチド又はそのポリペプチドのＮ末端側からのいく
つかのアミノ酸を欠失させたポリペプチドにおいて，そ
のアミノ酸配列におけるアミノ酸の変換を具体的に遂行
し，得られた種々のポリペプチド変異体の性質を検討し
た結果，特定箇所のアミノ酸の変換を行った場合に限
り，可溶性タンパクとして得られることが判明した．従
って，本発明の目的は，可溶性ヒトTNFポリペプチド変
異体群を提供することにある． 本発明者らは，上記のポリペプチド変異体群の中で，
特定の変異体がインビトロ及びインビボにおいて，ヒト
TNFに匹敵する細胞障害活性，抗腫瘍活性を有すること
を見い出した．従って，本発明の他の目的は，インビト
ロ，インビボにおいて，優れた細胞障害活性，抗腫瘍活
性を有するヒトTNFポリペプチド変異体を提供すること
にある． また，上記ポリペプチド変異体群のうち，別の特定の
変異体が，全く驚くべきことに，インビトロにおける細
胞障害活性が極めて低いにも拘らず，インビボにおいて
は優れた抗腫瘍活性を示すことを見い出した．そしてこ
のポリペプチド変異体においては，医薬として用いる場
合好ましからざる作用である発熱作用等が相当軽減され
ることも併せて見い出した．従って，本発明の更なる他
の目的はインビトロでは極めて低い細胞障害活性しか示
さないが，インビボで優れた抗腫瘍効果を発揮し，かつ
副作用が軽減されたヒトTNFポリペプチド変異体を提供
することにある．この変異体のように，インビトロでは
活性が低いにも拘らず，インビボでは優れた活性を示す
という事実は,TNFの有する代表的な生物活性である細胞
障害活性と抗腫瘍活性を発現するのに必須な構造（活性
中心）が、TNFポリペプチド分子内で同一部位ではない
ことを示すものである．更にTNFの有する多様な生物活
性の活性中心もそれぞれ異なっているものと推察され
る． 本発明の他の目的は以下の記述から明かとなるであろ
う． 本明細書では記載の簡略化のために以下の略号を用い
ることにする． A アデニン C シトシン G グアニン T チミン Ala アラニン Arg アルギニン Asn アスパラギン Asp アスパラギン酸 Cys システイン Gln グルタミン Glu グルタミン酸 Gly グリシン His ヒスチジン Ile イソロイシン Leu ロイシン Lys リジン Met メチオニン Phe フェニルアラニン Pro プロリン Ser セリン Thr スレオニン Trp トリプトファン Tyr チロシン Val バリン DNA デオキシリボ核酸 cDNA 相補DNA dATP デオキシアデノシン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸 bP 塩基対 SDS ドデシル硫酸ナトリウム MW 分子量 KD キロダルトン SD配列 シャイン−ダルガーノ配列 本明細書では，単鎖で示した塩基配列は正鎖（センス
ストランド）の塩基配列を，その左端は５′−末端，
右端は３′−末端を示す．アミノ酸配列の左端はＮ−末
端，右端はＣ−末端を示す． 本発明は表１の式［１］で示されるアミノ酸配列にお
いて，第16番目，第31〜34番目，第36番目，第48番目，
第73番目，第82番目，第85番目，第89番目，第94番目，
第97番目，第98番目，第103番目，第113番目，第115番
目，第117番目，第118番目，第131番目，第132番目，第
141〜146番目及び第153番目のアミノ酸残基の少くとも
１つが他のアミノ酸残基に変換されたアミノ酸配列を有
するポリペプチド（但し，第115番目のアミノ酸残基が
他のアミノ酸残基に変換されている場合は，第67番目及
び１又は第99番目のアミノ酸残基は他のアミノ酸残基に
変換されていてもよい．）又はそのポリペプチドのＮ末
端側のアミノ酸がＮ末端から順次最高８つ欠失したポリ
ペプチドに関する． 本発明のヒトTNFポリペプチド変異体を更に具体的に
例示すると， （Ａ） 表１の式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列におい
て， 第16番目のAlaがValに， 第31番目のAlaがThrに， 第32番目のAsnがAla,Cys,Asp,His,Ile,Arg,Ser,Thr,V
al,Tyrに， 第34番目のLeuがIleに， 第36番目のAlaがValに， 第48番目のValがMetに， 第73番目のLeuがProに， 第82番目のAlaがAspに， 第85番目のTyrがHisに， 第89番目のValがIleに， 第94番目のAlaがThrに， 第97番目のSerがAsnに， 第98番目のProがHis,Leuに， 第103番目のThrがProに， 第113番目のTyrがCysに， 第115番目のProがLeu,His,Gln,Ser,Ala,Phe,Asn,Thr,
Gly,Tyr,Val,Gln,Met,Ile,Asp,Trp,Lys,Arg,Thrに， 第117番目のTyrがHisに， 第118番目のLeuがGlnに， 第131番目のSerがIleに， 第132番目のAlaがThrに， 第141番目のAspがTyrに， 第143番目のAlaがValに， 第144番目のGluがLysに， 第145番目のSerがCysに， 第146番目のGlyがGluに， 第153番目のIleがLeuに変換されたアミノ酸配列を有
するヒトTNFポリペプチド， （Ｂ） 表１の式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列におい
て，第67番目及び／又は第99番目のCysがSerに変換さ
れ，かつ第115番目のProがPro以外の他のアミノ酸に変
換されたアミノ酸配列を有するヒトTNFポリペプチド変
異体， 及び（Ｃ）上記（Ａ）又は（Ｂ）のヒトTNFポリペプチ
ド変異体のＮ末端側から１〜８個のアミノ酸が順次欠失
したヒトTNFポリペプチド変異体が挙げられる． 上記ポリペプチド変異体（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）群の
中で，インビトロ，インビボにおいて優れた細胞障害活
性，抗腫瘍活性を示すポリペプチド変異体を例示すれば
次の通りである． 式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列において， 第16番目のAlaがValに， 第36番目のAlaがValに， 第73番目のLeuがProに， 第98番目のProがHis又はLeuに， 第103番目のThrがProに， 第115番目のProがHis又はGlnに， 第131番目のSerがIleに，又は 第143番目のAlaがValに変換されたアミノ酸配列を有
するポリペプチド． 上記変異体群の中で，インビトロの活性が低いが，イ
ンビボにおいて，優れた抗腫瘍活性を示すポリペプチド
変異体は次の通りである． 式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列において， 第31番目のAlaがThrに， 第32番目のAsnがAla,Cys,Asp,His,Ile,Arg,Ser,Thr,V
al,又はTyrに， 第115番目のProがSer,Ala,Phe,Asn,Thr,Gly,Tyr,Val,
Glu,Met,Ile,Asp,Trp,Leu,又はLysに，又は 第117番目のTyrがHisに変換されたアミノ酸配列を有
するポリペプチド． 特に好ましく変異体としては，式［Ｉ］で示されるア
ミノ酸配列において， 第32番目のAsnがTyr,His,Asp,又はSerに， 第115番目のProがLeu,Ser,Asp又はGlyに，又は 第117番目のTyrがHisに， 変換されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げら
れる． 本発明のヒトTNFポリペプチド変異体をコードするDNA
は，公知のヒトTNF又はその前駆体をコードするDNAを公
知の方法，例えばヨーロッパ公開特許155549に記載の方
法によるか或いは全合成等の方法にて作製し、ついでこ
れを例えばA.ワングらの方法［Science,224,1431（198
4）］に準じて目的とする塩基を点変異させたDNAを作製
するか，又は適当な制限酵素によりDNA断片を単離し，
目的とする個所の塩基配列を人為的に変えた合成オリゴ
デオキシヌクレオチドアダプターを用いること等によ
り，本発明のヒトTNFポリペプチド変異体をコードするD
NA,即ちヒトTNFポリペプチドの構成アミノ酸配列の特定
の個所（一ケ所又はそれ以上）を他のアミノ酸に変換し
た本発明のポリペプチド変異体をコードするDNA,或いは
かようなポリペプチド変異体でＮ末端から最高８個のア
ミノ酸が欠失したポリペプチドをコードするDNAを製造
することができる． 例えば，式［Ｉ］の第115番目のアミノ酸（Pro）がLe
uに変換されたポリペプチド変異体をコードするDNAは次
のように製造することができる． ヒトTNF前駆体をコードする塩基配列を含むDNAを，前
記ヨーロッパ公開特許に記載の方法に準じて単離する． このヒトTNF前駆体の塩基配列は表８に示されてお
り，その第235番目の塩基から第699番目の塩基までの塩
基配列がヒトTNFをコードする塩基配列に該当する．ヒ
トTNFのアミノ酸配列における第115番目のアミノ酸であ
るProをコードするコドンは，表８中の第577〜579番目
の塩基（CCC）に相当する． 従って，このコドンを含むDNA断片を適当な制限酵素
の組み合せにより切り出す．別途，このDNA断片中の上
記Proのコドン（CCC）をLeuに対応するコドン（CTC）に
変えられた塩基配列を含むDNA断片を化学的に合成し，
この合成DNA断片を，先に切り出したDNA断片と置換させ
ることにより，上記のポリペプチド変異体をコードする
DNAを製造することができる． より具体的に説明すると，例えば制限酵素DdeＩとPvu
IIを用いて表８中の第555〜603番目に相当するDNA断片
を切り出す． 次に，化学合成するオリゴデオキシリボヌクレオチド
の塩基配列は下式に示すごとくであり,2断片として下記
の２本のDNA断片の塩基配列を合成し，これを上記の切
り出した表８の第555〜603番目に相当するDNA断片と置
き換える． ５′−TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCTCAT−３′ ３′−CCGGTTCGGGACCATACTCGA−５′ 及び ５′−CTATCTGGGAGGGGTCTTCCAG−３′ ３′−GTAGATAGACCCTCCCCAGAAGGTC−５′ このようにして作製されたDNAを当該技術分野で公知
の技術により適当な形質発現ベクターに適切な配列を有
するように挿入し，これを宿主に導入した形質転換体を
培養することにより，本発明のポリペプチド変異体を産
生させることができる．更に詳しくは，例えば本発明の
ポリペプチド変異体それ自体をコードする塩基配列を有
するDNAの５′末端に開始コドンATGを，かつ３′末端に
は終止コドンを有するDNA断片を作製し，これを適当な
プロモーター及びSD配列に続いて結合させ，ついでベク
ターに組み込むことにより本発明のポリペプチド変異体
生産用の形質発現ベクターを製造することができる．プ
ロモーターとしては，例えばlac，trp，tac，phoS，pho
A，PL,SV40初期プロモーター等が挙げられる．ベクター
としては，例えばプラスミド（pBR322等），ファージ
（λファージ誘導体等），ウイルス（SV40等），ランナ
ウェイプラスミドが挙げられる．この本発明のポリペプ
チド変異体生産用の形質発現ベクターを適当な宿主に、
例えば大腸菌にコーエンらの方法［Proc.Natl.Acad.Sc
i.,USA,69,2110（1972）］により，導入することにより
形質転換体を得ることができる．ついでこの形質転換体
をそれに応じた適当な培養条件下で培養することによ
り，目的とするポリペプチド変異体或はそのＮ末端にMe
tが結合したポリペプチド変異体を産生させることがで
きる．この培養物を例えば，リゾチーム消化と凍結融解
や超音波破砕，フレンチプレス等により破壊したのち，
遠心分離又はろ過することにより本発明のポリペプチド
変異体含有抽出液を得ることができる．この抽出液を蛋
白質の一般的な精製法（限外ろ過，透析，イオン交換ク
ロマトグラフィー，ゲルろ過，電気泳動，アフイニティ
ークロマトグラフィー等）に従い精製することにより，
本発明のポリペプチド変異体を純粋な形で得ることがで
きる．また，本発明のポリペプチド変異体に有機酸，無
機酸又は塩基を常法に従い作用させることにより本発明
のポリペプチド変異体の塩を製造することができる． 以下に実験例を挙げて本発明のポリペプチド変異体に
ついて説明する．対照として用いたヒトTNFはヨーロッ
パ公開特許155549の実施例（５）に開示されている精製
ヒトTNFポリペプチドを用いた． （１） 後記実施例および参考例で製造した形質転換体
を培養することにより，各種のポリペプチド変異体を生
産し，その溶解性を,SDS-PAGE［Laemmli,U.K.,Nature
（London）227,680（1970）］及びEIAにより評価した． 即ち，各種のポリペプチド変異体生産用の形質転換体
を後記の実施例１に示した方法に従って培養し，その大
腸菌体内で生産された各ポリペプチド変異体を,0.1％リ
ゾチーム及び30mM Nacl含有50mMトリス−塩酸緩衝液（p
H8）中に抽出した． その抽出液中に回収された目的とするポリペプチド変
異体の量をSDS-PAGE及びEIAにより測定し，各ポリペプ
チド変異体の上記媒体中での溶解性を評価した． SDS-PAGEでは，目的とするポリペプチド変異体の計算
分子量に相当する位置に検出されるタンパクの有無を指
標として判定した． また,EIAでは抗ヒトTNF抗体と免疫学的に反応するポ
リペプチド変異体の量を定量した.EIAによるヒトTNFポ
リペプチド変異体の定量法は，次の原理に基づくもので
ある． 即ち，検体中のヒトTNFポリペプチド変異体とβ−ガ
ラクトシダーゼで標識されたヒトTNFとの間で，抗ヒトT
NFウサギ抗血清に対し競合的な結合反応をおこさせた．
次いで，細菌細胞壁を結合させ不溶化した抗ウサギIgG
ヤギ抗血清を添加することにより，酵素標識ヒトTNF−
抗ヒトTNFウサギ抗体−抗ウサギIgGヤギ抗体の複合体を
形成させた．反応液を遠心分離し，固相を得た．固相中
に回収された上記複合体中の酵素標識ヒトTNF量を，そ
の酵素活性を指標として定量した． 即ち，酵素基質として２−ニトロフェニル−β−Ｄ−
ガラクトピラノシドを加え，酵素反応により生じた基質
分解物（２−ニトロフェノール）量を，波長410nmにお
ける吸光度により求めた．この複合体中の酵素標識ヒト
TNF量は，検体中のヒトTNFポリペプチド変異体量を反映
する． 別途にヒトTNFを用いて作成した標準曲線を用いて，検
体中のヒトTNFポリペプチド変異体量をヒトTNF相当量と
して求めた． 抗ヒトTNFウサギ抗血清の作製には，山田ら［J.Biote
chnology,3,141（1985）］の方法で製造された純粋なヒ
トTNFを抗原として用いた． 結果を下記表３に示す． 各菌体抽出液中に検出された目的とするポリペプチド
変異体が対照としたヒトTNFの場合にほぼ比敵する場合
を（）と表示した．これは，該ポリペプチド変異体が
可溶性タンパクであることを意味している． 一方，その検出量がやや少ない場合を（＋）と表示
し，極めて少ないか若しくは認められない場合を（−）
と表示した． （−）で表示されたポリペプチド変異体は特定のアミ
ノ酸変換により，ポリペプチドの構造に変化が生じたた
め，溶解性が著しく低下したか或いは大腸菌体中で分解
されてしまったものと考えられる． （２） 後記の実施例で得られた本発明の各種ポリペプ
チド変異体の等電点及び細胞障害活性値を下記表４中に
示す． 細胞障害活性は，マウスＬ−Ｍ細胞（ATCC,CCL1.2）
を用い，山田らの方法［J.Biotechnology,3,141（198
5）］に従って評価した．本試験に用いたポリペプチド
変異体はいずれもSDS-PAGEにて不純タンパクの混在を認
めない精製品である． （３） 後記の実施例記載の各種ポリペプチド変異体の
インビボにおける抗腫瘍活性を下記表５に示す． 抗腫瘍活性の評価は次のようにして行った． メスＡ肉腫細胞２×105個をBALB/C雌性マウス（８週
令）の腹部皮内に移植し，移植後７日目に本ポリペプチ
ド変異体を静脈内に１個投与した．腫瘍壊死惹起作用は
投与後24時間目にカーズウエルらの判定基準［Proc.Nat
l.Acad.Sci.USA,72,3666（1975）］に従って評価した． 表５に示すごとく，腫瘍を選択的に障害させる因子と
して特徴づけられているTNFのインビトロにおける細胞
障害活性とインビボにおける移植腫瘍に対する抗腫瘍活
性との間の相関性は乏しい．例えば,TNF-131IはヒトTNF
の有するインビトロ細胞障害活性及びインビボ抗腫瘍活
性とほぼ同様の活性を有している．しかしながら，その
他のポリペプチド変異体，例えば,N末端から第32番目，
第115番目及び第143番目のアミノ酸を変換したポリペプ
チド変異体は，それらのインビトロ細胞障害活性に比し
て強いインビボ抗腫瘍活性を示し，かつ致死毒性の低い
特徴を示した． （４） 本発明のポリペプチド変異体の数例について，
発熱誘発作用を試験した．それらの結果を下記表６に示
す． この発熱性試験はウサギに静脈内投与し，投与後の直
腸温の変化を観察した．観察は投与後４時間目迄行い，
その結果を0.4℃以下の体温上昇を（−）,0.5〜0.9℃の
体温上昇を（＋），及び1.0℃以上の体温上昇を（）
と表示した． （５） TNF-115Lの血圧に及ぼす影響を試験した．血圧
降下作用試験はSHR/NCrj雄性ラット（体重264〜304g,日
本チャールズ・リバー株式会社）の尾静脈内にTNF-115L
を投与し，ラット用尾動脈圧測定装置（KN-209型，夏目
製作所）を用い，無麻酔下で収縮期血圧を測定した．結
果を下記表７に示す． 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に具体的
に説明するが，本発明はこの実施例に限定されるもので
はない． 実施例１ ヒトTNFポリペプチド変異体TNF-32Yの製造 （１） 形質発現プラスミドの構築 表９中のアミノ酸番号第１〜155番までの配列に相当
する155残基のアミノ酸からなるポリペプチド（以下,TN
F-32Yという）生産用の形質発現プラスミド（pHNY-32）
を第２図及び第３図に示すように構築した． ヒトTNFをコードするクローン化cDNAは，ヨーロッパ
公開特許155549に記載された方法に従って作製された組
み換え体プラスミドpHTNF 13より，制限酵素PstＩを用
いた消化により切り出し，単離した． このクローン化cDNAを更に制限酵素AvaＩ及びHindIII
により消化し，ヒトTNFポリペプチドをコードする領域
の大部分を含むDNA断片（fragment）を単離した．この
単離されたDNA断片を以下TNF-DNA断片という．このTNF-
DNA断片は，表８中の塩基番号第250番目から下流側の配
列に相当する塩基配列を含む約600bp長の断片である．
その全塩基配列は山田らの報告［J.Biotechnology,3,14
1（1985）］に記載されている． このTNF-DNA断片を制限酵素HpaII及びBg1IIにより消
化し，表８中，塩基番号第250〜321番に相当するDNA断
片［DNA−１断片という］，塩基番号第322〜337番に相
当するDNA断片［DNA−２断片という］及び第338番目か
ら下流側に相当するDNA断片［DNA−３断片という］の３
つのDNA断片に切断し,DNA−１断片及びDNA−３断片を分
離精製した．これらDNA−１断片及びDNA−３断片を，常
法に従って合成した次式 ５′−CGGGCCTATGCCCTCC−３′ ［ａ］ ３−CCGGATACGGG−５′ で示されるオリゴヌクレオチド アダプターを介して,T
4DNAリガーゼ（ligase）を用いて結合させた．得られた
DNA断片をNY-DNA断片という．このNY-DNA断片に，常法
により合成した次式 ５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTATC−３′
［ｂ］ ３′−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAATAGCTA−５′ 及び ５′−GATTATGTCATCTTCTCGAACC−３′ ［ｃ］ ３′−ATACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT−５′ で示されるオリゴヌクレオチドアダプターをT4DNAリガ
ーゼを用いて順次結合させた．得られたDNA断片を，以
下ペプチド領域DNA断片という． 一方、プラスミドpCT−１［M.Ikehara et al.,Proc.N
atl.Acad.Sci.,USA,81,5956（1984）］に制限酵素HpaＩ
とAatIIを作用させtrpプロモーター領域の一部を含む約
380bpのDNA断片［このDNA断片trpプロモーター領域の塩
基配列は，ベネットらの報告（J.Mol.Boil.,121,113,19
78年）に示されている］を切り出し，これを上記のペプ
チド領域DNA断片にT4DNAリガーゼを用いて結合させた．
得られたDNA断片を，以下プロモーター・ペプチドDNA断
片という． 別途に，プラスミドpBR322に制限酵素AvaＩとPvuIIを
作用させ，大きなDNA断片（約3.7kbp）を0.7％アガロー
スゲル電気泳動により分離した．このDNA断片の両端をD
NAポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）及びdGTP,d
ATP,dCTP,dTTPを用いて平滑末端とし，その両端をT4DNA
リガーゼを用いて結合させた．このプラスミドベクター
をpBRS6という．更に，このベクター（pBRS6）に制限酵
素AatIIとHindIIIを作用させ大きなDNA断片（約3.6Kb
p）を単離精製した．このDNA断片に先に調整したプロモ
ーター・ペプチド領域DNA断片をT4DNAリガーゼを用いて
結合させることにより，形質発現プラスミドpHNY−32を
構築した． （２） TNF-32Yの製造 （１）項で得た形質発現プラスミドpHNY-32を常法
［S.N.Cohen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,69,2110
（1972）］に従って大腸菌HB101に導入し，形質転換体
を作製した．この形質転換体をLBブロス（組成;1％バク
トトリプトン,0.5％酵母エキス,1％NaCl,pH7.5）中で一
夜培養し，その培養液を10倍容量の改良M9培地（組成;
0.45％カザミノ酸,0.4％グリセロール,25μg/mlアンピ
シリン）に接触し,37℃で１時間培養し，次いでインド
ールアクリル酸を最終濃度20μm/mlになるように加え，
更に24時間培養を継続したのち，遠心分離により菌体を
集めた．菌体を培地容量の1/10容量の0.1％リゾチーム
と30mM NaClを含む50mM Tris-HCl緩衝液（pH8）に懸濁
させ，氷水中で30分間静置した．更にドライアイス／エ
タノール浴での凍結と37℃での融解を繰り返した後，遠
心分離により菌体残渣を除いた抽出液を得た． この抽出液を20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.8）に対して
透析したのち，遠心分離しその上清液を採取した．この
上清液を，予め同緩衝液で平衡化したDEAE-Sepharose C
L-6B（ファルマシア社）カラムに負荷し，非吸着成分を
同緩衝液により十分洗浄除去した．次いで同緩衝液中,N
aCl濃度を０〜0.3Mまで連続的に上昇させ,TNF-32Yを溶
出した．該ペプチドの溶出位置はSDS−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動分析にて約17KDの位置に検出されるタ
ンパクを指標として求めた． この画分を集め，再び20mM Tris-HCl緩衝液（pH7.8）
に対して透析脱塩したのち，上記のDEAE-Sepharose CL-
6Bカラム クロマトグラフィーを，ゆるやかなNaCL濃度
勾配による溶出にて繰り返した． 該ペプチド溶出画分を集め，限外ろ過（分子篩膜YM1
0,アミコン社）にて濃縮した． この濃縮液をBio-Gel P−６（バイオラッド社）のカ
ラムにて，溶出液に5mMリン酸塩緩衝化生理食塩液を用
いてゲルろ過し，精製TNF-32Yを得た． 精製TNF−32YのＮ末端部アミノ酸配列はプロテインシ
ークエンサー（アプライド バイオシステムス社,470A
型）による自動エドマン分解法により決定した． その結果,TNF-32YのＮ末端アミノ酸はSerであった．
即ち，この最終精製品のＮ末端から翻訳開始コドン（AT
G）に由来するMetは除かれていた． 実施例２ ヒトTNFポリペプチド変異体TNF-115Lの製造 （１） 形質発現プラスミドの構築 表10中のアミノ酸番号第１〜155番までの配列に相当
する155残基のアミノ酸からなるポリペプチド（以下,TN
F-115Lという）生産用の形質発現プラスミドpHPL-115）
を第４図に示すように構築した． 実施例１−（１）項に記載の方法により調整したTNF-
DNA断片を制限酵素PvuII及びTaqＩにて消化し，表８
中，塩基番号第250〜369番目に相当するDNA断片［DNA−
４断片という］，塩基番号第370〜603番に相当するDNA
断片［DNA−５断片という］，塩基番号第604〜653番に
相当するDNA断片［DNA−６断片という］及び塩基番号第
654番から下流側に相当するDNA断片［DNA−７断片とい
う］の４つのDNA断片に切断し，それぞれを分離精製し
た.DNA−５断片を更に，制限酵素DdeＩにて切断し，表
８中塩基番号第370〜554番に相当するDNA断片［DNA−８
断片という］を分離精製した.DNA−４断片とDNA−８断
片をT4DNAリガーゼを用いて結合させ，更に常法にて合
成した次式 ５′−TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGCTCAT−３′ ［ｄ］ ３′−CCGGTTCGGGACCATACTCAGA−５′ 及び ５′−CTATCTGGGAGGGGTCTTCCAG−３′ ［ｅ］ ３′−GTAGATAGACCCTCCCCAGAAGGTC−５′ で示されるオリゴヌクレオチドアダプターをT4DNAリガ
ーゼを用いて順次結合させた． 得られたDNAに更にDNA−６断片及びDNA−７断片を結
合させた．得られたDNA断片をPL-DNA断片という． 以下，実施例１−（１）記載の方法に従い，ただし,N
Y-DNA断片の代わりに上記PL-DNA断片を用いて，形質発
現プラスミドpHPL-115を構築した． （２） TNF-115Lの製造 （１）項で構築した形質発現プラスミドpHPL-115を用
い，実施例１−（２）記載の方法に従って，形質転換体
を作製し，培養した． その菌体抽出液から実施例１−（２）項に記載の方法
に準じて精製を行い精製TNF-115Lを得た． （３） アミノ酸配列決定 精製TNF-115L及びそのペプチド断片のアミノ酸配列
を，プロテインシークエンサーを用いる自動エドマン分
解法により決定した． ペプチド断片は次のように調整した．即ち，精製TNF-
115Lの500μｇを4M尿素を含む5mM Tris-HCl緩衝液（pH
8）の0.1ml中,10μｇのリジルエンドペプチターゼ（EC
3.4.21.50:和光純薬）と反応させた.35℃にて15時間反
応させた後，消化産物（ペプチド）をSyn Chropak RP-P
300カラム（250X4.6mm;シンクロム社）を用いる高速液
体クロマトグラフィにより単離した．その溶出は,0.1％
トリフルオロ酢酸中0.07％トリフルオロ酢酸を含むアセ
トニトリルの10％から50％までの直線的濃度勾配にて,1
ml/分の流速で60分間行った． その溶出図を第５図に示す．第５図中のNo.1からNo.7
の各分画から単離したペプチド断片のＮ末端部分のアミ
ノ酸配列を自動エドマン分解法により決定した．その結
果，分画No.6のペプチド断片の部分アミノ酸配列は,Pro
−Ｘ−Tyr-Glu-Leu-Ile-Tyr-Leu-Gly-Gly-Val-Phe-Gln-
Leu-Gluであった．配列中のＸは，不確定のアミノ酸を
意味する． 上記のアミノ酸配列は，表10中のアミノ酸番号第111
〜125番の配列と一致した． この結果より,TNF-115LのＮ末端から第115番目のアミ
ノ酸がLeuであることが確認された．また,TNF-115LのＮ
末端アミノ酸はSerであり，翻訳開始コドン（ATG）に由
来するMetは除かれていた． 実施例３ ヒトTNFポリペプチド変異体TNF-115LΔN8の製造 （１） 形質発現プラスミドの構築 表10に示したアミノ酸配列の第９番目のアミノ酸（Ly
s）から第155番目のアミノ酸（Leu）に相当する147残基
のアミノ酸によりなるポリペプチド（以下,TNF-115LΔN
8という）生産用の形質発現プラスミド（pHPL-147）
を，第６図に示すように構築した． 実施例２−（１）項で得た形質発現プラスミドpHPL-1
15を制限酵素ClaＩとBstEIIで消化し，表10の塩基番号
第380番より下流側（TNF-115LのＣ末端部分をコードす
る領域），テトラサイクリン耐性遺伝子，アンピシリン
耐性遺伝子及びtrpプロモーター領域の部分を含む大き
なDNA断片（以下，ベクターDNA断片という）と表10の塩
基番号第１〜379番目に相当する塩基配列を含む小さなD
NA断片を分離精製した．この小さなDNA断片も更に制限
酵素HgiAIで消化切断したのち，塩基番号第219〜379番
目に相当するDNA断片を単離した．このDNA断片を以下,H
gi-DNAという． 別途に参考例２に記載した方法に従って構築した形質
発現プラスミドpHT147を制限酵素ClaＩとHgiAIで消化
し，表10の塩基番号第25〜218番目に相当する塩基配列
を含む約200bpのDNA断片を単離した．このDNA断片を以
下，ΔN8-DNA断片という． このΔN8-DNA断片と上記のHgi-DNA断片をT4DNAリガー
ゼを用いて結合させ，得られたDNA断片を先に調整し
た．エクターDNA断片に組み込むことにより，形質発現
プラスミドpHPL-147を構築した． （２） TNF-115LΔN8の製造 形質発現プラスミドpHPL-147を用い，実施例１−
（２）項記載の方法に従って，形質転換体を作製し，培
養した．その菌体抽出液より，実施例１−（２）項記載
の方法に準じて，精製し，精製TNF-115LΔN8を得た． 精製TNF−115LΔN8のＮ末端アミノ酸として翻訳開始
コドン（ATG）に由来するMetが自動エドマン分解法によ
り検出された． 実施例４ ヒトTNFポリペプチド変異体TNF-115L-Ser67の製造 （１） 形質発現プラスミドの構築 表10に示したアミノ酸配列の第１〜115番に相当する
アミノ酸配列のうち第67番目のアミノ酸であるCysがSer
に置き換えられたポリペプチド（TNF-115L-Ser67とい
う）生産用の形質発現プラスミドを第７図に示すように
構築した． 参考例３に記載の方法に構築された形質発現プラスミ
ドpHTP392を制限酵素ClaI,HgiAI及びHpaＩで消化し，表
10の塩基番号第１〜218番目に相当する塩基配列，但し
第200番と第201番目の塩基GCがCTに置換された塩基配列
を含む約226bpのDNA断片を単離した．このDNA断片を以
下,Ser67-DNA断片という． このSer67-DNA断片と，実施例３−（１）項記載の方
法で調整されたHgi-DNA断片をT4DNAリガーゼを用いて結
合させ，得られたDNA断片を，実施例３−（１）項記載
の方法で得たベクターDNA断片に組み込むことにより，
形質発現プラスミドpHPL-Ser67を構築した． （２） TNF-115L-Ser67の製造 形質発現プラスミドpHPL-Ser67を用い，実施例１−
（２）項記載の方法に従って形質転換体を作製し，培養
した．その菌体抽出液より，実施例１−（２）項の記載
の方法に準じて精製し，精製TNF-115L-Ser67を得た． 精製TNF-115L-Ser67のＮ末端部分アミノ酸配列を自動
エドマン分解法により決定したところ,Serであり，翻訳
開始コドン（ATG）に由来するMetは除去されていた． 実施例５ ヒトTNFポリペプチド変異体TNF-115LΔN8-Ser67の製
造 （１） 形質発現プラスミドの構築 表10に示したアミノ酸配列の第９〜115番に相当する1
47残基からなる配列中Ｎ末端から第67番目のアミノ酸で
あるCysがSerに置換されたポリペプチド（以下,TNF−11
5LΔN8-Ser67という）生産用の形質発現プラスミド（pH
PL147S67）を第８図に示すように構築した． 実施例４−（１）項記載の方法で得た形質発現プラス
ミドpHPL-Ser67を制限酵素ClaＩ及びBstEIIによる消化
にて２つのDNA断片とした．大きなDNA断片は実施例３で
作製したベクターDNA断片と同じ断片である．小さなDNA
断片を更に制限酵素RsaＩで消化したのち，表10の塩基
番号第161〜379番に相当する塩基配列を含むDNA断片を
単離した．以下，この断片をRsa-DNA断片という． 一方，実施例３−（１）項記載の方法で得た形質発現
プラスミドpHPL-147を，制限酵素ClaＩ及びRsaＩで消化
し，表10中の塩基番号第25〜160番に相当する塩基配列
を含む約144bpのDNA断片を単離した． このDNA断片と上記のRsa-DNA断片をT4DNAリガーゼを
用いて結合させ，得られたDNA断片を先に作製したベク
ターDNA断片に組み込むことにより,TNF-115LΔN8-Ser67
生産用の形質発現プラスミドpHPL147S67を構築した． （２） TNF-115LΔN8-Ser67の製造 形質発現プラスミドpHPL147S67を用い実施例１−
（２）項記載の方法に従って形質転換体を作製し，培養
した．その菌体抽出液より実施例１−（２）項記載の方
法に準じて精製し，精製TNF-115LΔN8-Ser67を得た．精
製TNF-115LΔN8-Ser67のＮ末端アミノ酸として，翻訳開
始コドン（ATG）に由来するMetが検出された． 実施例６ その他のヒトTNFポリペプチド変異体の製造−１ （１） 形質発現プラスミドの構築 表１の式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列の第１〜155
番に相当する155残基からなる配列中,N末端から第32番
目のアミノ酸であるAsnが他のアミノ酸，例えばHis,Asp
又はSerに変換されたポリペプチド生産用の形質発現プ
ラスミドを実施例１−（１）項記載の方法に従い，但し
合成アダプター［ａ］の代わりに下式で示される化学合
成オリゴヌクレオチド アダプターのいずれかを用いる
ことにより構築した． ５′−CGGGCCCACGCCCTCC−３′ ３′−CCGGGTGCGGG−５′ （Hisへの変換の場合） ５′−CGGGCCGATGCCCTCC−３′ ３′−CCGGCTACGGG−５′ （Aspへの変換の場合） 又は， ５′−CGGGCCAGCGCCCTCC−３′ ３′−CCGGTCGCGGG−５′ （Serへの変換の場合） （２） ヒトTNFポリペプチド変異体の製造 前記（１）項で作製した各形質発現プラスミドを常法
に従って大腸菌HB101株に尊入し，形質転換体を作製し
た．形質転換体を実施例１−（２）項記載の方法にて培
養し，その菌体抽出液から実施例１−（２）項記載の方
法に準じて精製することにより，下記のヒトTNFポリペ
プチド変異体を得た． TNF-32H:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のアミノ
酸であるAsnがHisに変換されたポリペプチド TNF-32D:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のアミノ
酸であるAsnがAspに変換されたポリペプチド TNF-32S:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のアミノ
酸であるAsnがSerに変換されたポリペプチド 実施例７ その他のヒトTNFポリペプチド変異体の製造−２ （１） 形質発現プラスミドの構築 表１の式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列の第１〜155
番に相当する155残基からなる配列中,N末端から第115番
目のアミノ酸であるProが他のアミノ酸，例えば,Ser,As
p又はGlyに変換されたポリペプチド生産用の形質発現プ
ラスミドを実施例２−（１）項記載の方法に従い，但し
合成アダプター［ｄ］の代わりに下式で示される化学合
成オリゴヌクレオチドアダプターのいずれかを用いるこ
とにより構築した． ５′−TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGTCCAT−３′ ３′−CCGGTTCGGGACCATACTCAG−５′ （Serへの変換の場合） ５′−TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGGACAT−３′ ３′−CCGGTTCGGGACCATACTCCT−５′ （Aspへの変換の場合） 又は， ５′−TGAGGCCAAGCCCTGGTATGAGGGCAT−３′ ３′−CCGGTTCGGGACCATACTCCC−５′ （Glyへの変換の場合） （２） ヒトTNFポリペプチド変異体の製造 前記（１）項で作製した各形質転換プラスミドを常法
に従って大腸菌HB101株に導入し，形質転換体を作製し
た．形質転換体を実施例１−（２）項記載の方法に従っ
て培養し，その菌体抽出液から実施例１−（２）項記載
の方法に準じて精製することにより，下記のヒトTNFポ
リペプチド変異体を得た． TNS-115S:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のアミ
ノ酸であるProがSerに変換されたポリペプチド TNS-115D:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のアミ
ノ酸であるProがAspに変換されたポリペプチド TNF-115G:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のアミ
ノ酸であるProがGlyに変換されたポリペプチド 実施例８ ヒトTNFポリペプチド変異体TNF-117Hの製造 （１） 形質発現プラスミドの構築 表１の［Ｉ］で示されるアミノ酸配列の第１〜155番
に相当する155残基からなる配列中,N末端から第117番目
のアミノ酸であるTyrが他のアミノ酸，例えばHisに変換
されたポリペプチド（以下,TNF-117Hという）生産用形
質発現プラスミドを実施例２−（１）項記載の方法に従
い，但し合成アダプター［ｅ］の代わりに下式で表わさ
れる化学合成オリゴヌクレオチドアダプターを用いて構
築した． ５′−CCATCTGGGAGGGGTCTTCCAG−３′ ３′−GTAGGTAGACCCTCCCCAGAAGGTC−５′ （２） TNF-117Hの製造 前記（１）項で作製した形質発現プラスミドを常法に
従って大腸菌HB101株に導入し，形質転換体を作製し
た．形質転換体を実施例１−（２）項記載の方法に従っ
て培養し，その菌体抽出液から実施例１−（２）項記載
の方法に準じて精製することにより,TNF-117Hを得た． 実施例９ その他のヒトTNFポリペプチド変異体の製造−３ 実施例１に記載の方法に準じて，下記ポリペプチド生
産用の形質発現プラスミドを構築し，大腸菌に導入して
形質転換体を作製した．形質転換体を培養し，その菌体
抽出液から下記のポリペプチドを単離精製した． TNF-16V:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第16番目のアミノ
酸であるAlaがValに変換されたポリペプチド TNF-31T:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第31番目のアミノ
酸であるAlaがThrに変換されたポリペプチド TNF-32G:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のアミノ
酸であるAsnがGlyに変換されたポリペプチド TNF-32L:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のアミノ
酸であるAsnがLeuに変換されたポリペプチド TNF-36V:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第36番目のアミノ
酸であるAlaがValに変換されたポリペプチド TNF-73P:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第73番目のアミノ
酸であるLeuがProに変換されたポリペプチド TNF-82D:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第82番目のアミノ
酸であるAlaがAspに変換されたポリペプチド（等電点5.
3） TNF-85H:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第85番目のアミノ
酸であるTyrがHisに変換されたポリペプチド（等電点6.
4） TNF-98H:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第98番目のアミノ
酸であるProがHisに変換されたポリペプチド TNF-103P:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第103番目のアミ
ノ酸であるThrがProに変換されたポリペプチド TNF-115T:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のアミ
ノ酸であるProがThrに変換されたポリペプチド TNF-115H:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のアミ
ノ酸であるProがHisに変換されたポリペプチド TNF-115R:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のアミ
ノ酸であるProがArgに変換されたポリペプチド TNF-131l:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第131番目のアミ
ノ酸であるSerがIleに変換されたポリペプチド TNF-141Y:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第141番目のアミ
ノ酸であるAspがTyrに変換されたポリペプチド TNF-143V:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第143番目のアミ
ノ酸であるAlaがValに変換されたポリペプチド TNF-144K:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第144番目のアミ
ノ酸であるGluがLysに変換されたポリペプチド TNF-146E:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第146番目のアミ
ノ酸であるGlyがGluに変換されたポリペプチド 実施例10 その他のヒトTNFポリペプチド変異体の製造−４ 実施例１に記載の方法に準じて，下記ポリペプチド生
産用の形質発現プラスミドを構築し，大腸菌に導入して
形質転換体を作製した．形質転換体を培養し，その菌体
抽出液から下記のポリペプチドを単離精製した． TNF-32A:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のAsnがA
laに変換されたポリペプチド TNF-32C:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のAsnがC
ysに変換されたポリペプチド TNF-32I:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のAsnがI
leに変換されたポリペプチド TNF-32R:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のAsnがA
rgに変換されたポリペプチド TNF-32T:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のAsnがT
hrに変換されたポリペプチド TNF-32V:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第32番目のAsnがV
alに変換されたポリペプチド TNF-34I:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第34番目のLeuがI
leに変換されたポリペプチド TNF-48M:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第48番目のValがM
etに変換されたポリペプチド TNF-89I:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第89番目のValがI
leに変換されたポリペプチド TNF-94T:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第94番目のAlaがT
hrに変換されたポリペプチド TNF-97N:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第97番目のSerがA
snに変換されたポリペプチド TNF-98L:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第98番目のProがL
euに変換されたポリペプチド TNF-113C:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第113番目のTyr
がCysに変換されたポリペプチド TNF-115Q:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がGlnに変換されたポリペプチド TNF-115A:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がAlaに変換されたポリペプチド TNF-115F:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がPheに変換されたポリペプチド TNF-115N:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がAsnに変換されたポリペプチド TNF-115Y:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がTyrに変換されたポリペプチド TNF-115V:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がValに変換されたポリペプチド TNF-115E:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がGluに変換されたポリペプチド TNF-115M:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がMetに変換されたポリペプチド TNF-115I:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がIleに変換されたポリペプチド TNF-115W:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がTrpに変換されたポリペプチド TNF-115K:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第115番目のPro
がLysに変換されたポリペプチド TNF-118Q:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第118番目のLeu
がGlnに変換されたポリペプチド TNF-132T:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第132番目のAla
がThrに変換されたポリペプチド TNF-145C:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第145番目のSer
がCysに変換されたポリペプチド TNF-153L:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第153番目のIle
がLeuに変換されたポリペプチド 参考例１ ヒトTNF生産用形質発現プラスミドの構築 ヒトTNFをコードするクローン化cDNAを，ヨーロッパ
公開特許155549に記載の方法に従って調製した組み換え
体プラスミドpHTNF13から，制限酵素PstIにより切り出
し，単離した． このクローン化cDNAを更に，制限酵素EcoRIによる消
化にて,TNF翻訳領域の下流側の非翻訳領域の一部を切断
除去し，約1.1kbpのDNA断片を得た．このDNA断片をプラ
スミドpBR322の制限酵素EcoRI及びPstＩによる切断断片
（約3.6kbp）に組み込むことにより,TNFcDNA及びテトラ
サイクリン耐性遺伝子を含む新しい組み換え体プラスミ
ドを構築した．この組換え体プラスミドをpHT113と名づ
けた． このプラスミドpHT113に制限酵素AvaＩとSalＩを作用
させ３種のDNA断片（それぞれ約0.8kbp,1.3kbp及び2.6k
bp）に切断した．これらのDNA断片のうち，ヒトTNFをコ
ードする領域の大部分とプラスミドpBR322のテトラサイ
クリン耐性遺伝子の一部を含む約1.3kbpのDNA断片を分
離精製した（このDNA断片をAvaI-SalI断片という）． このAvaI-SalI断片に，次式で示される合成オリゴヌ
クレオチドアダプター［ｆ］を結合させた． ５′−CGATATGTCATCTTCTCGAACC−３′ ［ｆ］ ３′−TATACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT−５′ 得られたDNA断片を，以下HTNF−アダプター断片とい
う． 別途，trpプロモーター（promoter）領域の一部を含
むDNA断片（35bp長）を，プラスミドpDR720［Ｐ−L Bio
chemicals;D.R.Russell,et al.,Gene,20, 231（198
3）］から制限酵素EcoRI及びHpaＩにより切り出し，単
離した． このDNA断片の塩基配列は次式に示す通りである． ５′−AATTCCCCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTT ３′−GGGGACAACTGTTAATTAGTAGCTTGATCAA これに，常法により合成した次式 ５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTAAT ［ｇ］ ３′−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCCATTAGC で示されるオリゴヌクレオチド アダプター［ｇ］をT4
DNAリガーゼを用いて結合させた．ここに得られたDNA断
片を，以下trpプロモーター断片という． 一方、プラスミドpBR322に制限酵素EcoRI及びSalＩを
作用させ，大きなDNA断片（約3.7kbp長）を切り出し
た．これに，先に調整したHTNF−アダプター断片とtrp
プロモーター断片を,T4DNAリガーゼを用いて結合させる
ことにより，表８のアミノ酸配列中，アミノ酸番号第79
〜233番に相当する155残基のアミノ酸からなるヒトTNF
生産用の形質発現プラスミドを構築した（第９図参
照）． この形質発現プラスミドをpHTR91と名づけた． 参考例２ ヒトTNFポリペプチド誘導体TNF（147）生産用形質発
現プラスミドの構築 表８に示したアミノ酸配列中，第84〜233番の配列に
相当する147残基のアミノ酸からなるヒトTNF誘導体［以
下,TNF（147）という］生産用の形質発現プラスミド（p
HT147）を構築した（第10図参照）． 参考例１に記載した方法で得た組み換え体プラスミド
pHTR91を制限酵素ClaＩ及びBalＩにより消化し,4種のDN
A断片とした．それらのうち２種の小さな断片（それぞ
れ113bpと0.6kbp）を５％ポリアクリルアミド電気泳動
にて分離精製した．このうち小さな断片（113BP）を，
更に制限酵素DdeＩにて２つのDNA断片（47bpと66bp）に
切断し,47bpのDNA断片を単離した．このDNA断片を，以
下47bp断片という． この断片に，常法によりそれぞれ合成した次式 ５′−CGATTATGAAGCCTGTAG−３′ ［ｈ］ ３′−TAATACTTCGGACATCGGG−５′ 及び ５′−CCCATGTTGTAGCAAACCCTCAAGC−３′ ［ｉ］ ３′−TACAACATCGTTTGGGAGTTCGACT−５′ で示される２種類のオリゴヌクレオチド アダプター
［ｈ］及び［ｉ］をT4DNAリガーゼを用いて結合させ
た． 更に化学合成した次式 ５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTAT−３′［ｊ］ ３′−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAATAGC−５′ で示されるオリゴヌクレオチド アダプター［ｊ］を結
合させた．ここで得たDNA断片を，以下５′−DNA断片と
いう． 一方，プラスミドpCT−１［M.Ikehara et al.,Proc.N
atl.Acad.Sci., USA,81,5956（1984）］に制限酵素Hpa
Ｉ及びAatIIを作用させ，trpプロモーター領域の一部を
含む約380bpのDNA断片を切り出し，これに上記の５′−
DNA断片を結合させた．得られたDNA断片を，以下，プロ
モーター５′−DNA断片という． 別途，参考例１に記載の方法で作製した組み換え体プ
ラスミドpHTR91に制限酵素BalＩ及びHindIIIを作用さ
せ，ヒトTNFポリペプチドのＣ末端部分をコードする領
域を含むDNA断片（487bp）を切り出し分離精製した．こ
のDNA断片に先に調整したプロモーター５′−DNA断片を
T4DNAリガーゼを用いて結合させた．得られたDNA断片
を，以下，プロモーターTNF（147）‐DNA断片という． 一方、実施例１−（１）項に記載したプラスミドpBRS
6に制限酵素AatII及びHindIIIを作用させ，切り出され
た大きなDNA断片（約3.6kbp）を単離した． このDNA断片に先に調整したプロモーターTNF（147）‐D
NA断片を結合させることにより，形質発現プラスミドpH
T147を構築した． 参考例３ ヒトTNFポリペプチド変異体TNF-67S生産用形質発現プ
ラスミドの構築 表１の式［Ｉ］で示したアミノ酸配列中,N末端から第
67番目のアミノ酸であるCysがSerに変換されたポリペプ
チド（以下,TNF-67Sという）生産用形質発現プラスミド
（pHTP392）を構築した（第11図参照）． 参考例１に記載した方法で得た組み換え体pHTR91を制
限酵素AvaI及びHindIIIにより消化し，表８に示した塩
基配列中，塩基番号第250番より下流側の領域に相当す
る約600bp長のDNA断片を単離した． このDNA断片を，更に制限酵素AvaII及びHgiAIにて３
つのDNA断片（約162bp,41bp及び375bp）に切断し，ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動にて,162bpと375bp長のDNA
断片を単離した． これらのDNA断片を，次式で示される化学合成オリゴ
ヌクレオチド アダプター［ｋ］及び［ｌ］， ５′−GTCCTCTTCAAGGGCCAA−３′ ３′−GAGAAGTTCCCGGTTCCGA−５′ ［ｋ］ 及び ５′−GGCTCTCCCTCCACCCATGTGCT−３′ ［ｌ］ ３′−GAGGGAGGTGGGTAC−５′ をT4DNAリガーゼを用いて結合させた． 更に，得られたDNA断片に，次式で示される化学合成
オリゴヌクレオチド アダプター［ｊ］及び［ｍ］， ５′−AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAGGAGGTTAT−３′［ｊ］ ３′−TTGATCATGCGTTCAAGTGCATTCCTCCAATAGC−５′ 及び ５′−CGATTATGTCATCTTCTCGAACC−３′ ［ｍ］ ３′−TAATACAGTAGAAGAGCTTGGGGCT−５′ を,T4DNAリガーゼを用いて順次結合させた．ここで得ら
れたDNA断片を，以下TNF（Ser67）‐DNA断片という． 一方，trpプロモーター領域を含むDNA断片（約380b
p）は，参考例２に記載したごとくプラスミドpCT−１か
ら制限酵素HpaＩ及びAatIIにより切り出し，単離した．
このDNA断片を先に調製したTNF（Ser67）‐DNA断片を結
合させた．このDNA断片を，以下プロモーターTNF（Ser6
7）‐DNA断片という． 別途に，実施例１−（１）項に記載した方法にて得た
プラスミドベクターpBRS6を，制限酵素AatII及びHindII
Iにて切断し，大きなDNA断片（約3.6kbp）を単離した．
このDNA断片に上記のプロモーターTNF（Ser67）‐DNA断
片を,T4DNAリガーゼを用いて結合させることにより，形
質発現プラスミドpHTP392を構築した． この形質発現プラスミドを，実施例１−（２）項記載
の方法に従って，大腸菌に導入し，その形質転換体を培
養することによりTNF-67Sを生産させた． 参考例４ 下記のポリペプチド生産用の形質発現プラスミドを実
施例１記載の方法に準じて構築した． その形質発現プラスミドで形質転換した大腸菌を培養
することにより下記のポリペプチドを製造した． TNF-70Y:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第70番目のThrがT
yrに変換されたポリペプチド TNF-99S:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第99番目のCysがS
erに変換されたポリペプチド 参考例５ 下記のポリペプチド生産用の形質発現プラスミドを実
施例１記載の方法に準じて構築した． これらの形質発現プラスミドで形質転換した大腸菌を
培養することにより，下記のポリペプチドを製造した
が，これらのポリペプチドは可溶性タンパクとして殆ん
ど若しくは全く抽出されなかった． TNF-12T:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第12番目のAlaがT
hrに変換されたポリペプチド TNF-13Y:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第13番目のHisがT
yrに変換されたポリペプチド TNF-14A:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第14番目のValがA
laに変換されたポリペプチド TNF-17T:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第17番目のAsnがT
hrに変換されたポリペプチド TNF-24F:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第24番目のLeuがP
heに変換されたポリペプチド TNF-26R:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第26番目のTrpがA
rgに変換されたポリペプチド TNF-35P:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第35番目のLeuがP
roに変換されたポリペプチド TNF-44D:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第44番目のAsnがA
spに変換されたポリペプチド TNF-45P:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第45番目のGlnがP
roに変換されたポリペプチド TNF-50P:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第50番目のSerがP
roに変換されたポリペプチド TNF-54C:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第54番目のTyrがC
ysに変換されたポリペプチド TNF-58P:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第58番目のSerがP
roに変換されたポリペプチド TNF-59L:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第59番目のGlnがL
euに変換されたポリペプチド TNF-60D:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第60番目のValがA
spに変換されたポリペプチド TNF-60G:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第60番目のValがG
lyに変換されたポリペプチド TNF-62S:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第62番目のPheがS
erに変換されたポリペプチド TNF-93P:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第93番目のSerがP
roに変換されたポリペプチド TNF-121G:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第121番目のVal
がGlyに変換されたポリペプチド TNF-124Q:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第124番目のLeu
がGlnに変換されたポリペプチド TNF-128A:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第128番目のAsp
がAlaに変換されたポリペプチド TNF-128N:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第128番目のAsp
がAsnに変換されたポリペプチド TNF-135D:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第135番目のAsn
がAspに変換されたポリペプチド TNF-138Y:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第138番目のAsp
がTyrに変換されたポリペプチド TNF-148D:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第148番目のVal
がAspに変換されたポリペプチド TNF-148G:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第148番目のVal
がGlyに変換されたポリペプチド TNF-150L:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第150番目のPhe
がLeuに変換されたポリペプチド TNF-151E:式［Ｉ］のアミノ酸配列中，第151番目のGly
がGluに変換されたポリペプチド
第１図はヒトTNFポリペプチドをコードするDNAの制限酵
素切断認識部位の例を示す．図中 はヒトTNFをコードする領域を示す。 第２〜３図はTNF-32Y生産用の形質発現プラスミドの構
築工程を示す。図中，合成オリゴヌクレオチド［ａ］，
［ｂ］及び［ｃ］はそれぞれ実施例１−（１）に記載の
合成DNAアダプターを意味する。 第４図はTNF-115L生産用の形質発現プラスミドの構築に
用いたPL-DNA断片の作製工程を示す。図中，合成オリゴ
ヌクレオチド［ｄ］及び［ｅ］は実施例２−（１）に記
載の合成DNAアダプターを意味する。 第５図はTNF-115Lのリジルエンドペプチダーゼによる消
化産物（ペプチド断片）の高速液体クロマトグラフィー
による溶出パターンを示す。 第６図は形質発現プラスミドpHPL-147の構築工程を示す
（実施例３）。 第７図は形質発現プラスミドpHPL-Ser67の構築工程を示
す（実施例４）。 第８図は形質発現プラスミドpHPL147S67の構築工程を示
す（実施例５）。 第９図は成熟ヒトTNF生産用の形質発現プラスミドpHTR9
1の構築工程を示す。図中，合成オリゴヌクレオチド
［ｆ］及び［ｇ］はそれぞれ参考例１に記載の合成DNA
アダプターを意味する。 第10図は147残基をアミノ酸配列よりなるポリペプチド
生産用の形質発現プラスミドpHT147の構築工程を示す。
図中、合成オリゴヌクレオチド［ｈ］，［ｉ］及び
［ｊ］はそれぞれ参考例２に記載の合成DNAアダプター
を意味する。 第11図はTNF（Ser67）生産用の形質発現プラスミドpHTP
392の構築工程を示す。図中、合成オリゴヌクレオチド
［ｋ］，［ｌ］，［ｊ］及び［ｍ］はそれぞれ参考例３
に記載の合成DNAアダプターを意味する。
素切断認識部位の例を示す．図中 はヒトTNFをコードする領域を示す。 第２〜３図はTNF-32Y生産用の形質発現プラスミドの構
築工程を示す。図中，合成オリゴヌクレオチド［ａ］，
［ｂ］及び［ｃ］はそれぞれ実施例１−（１）に記載の
合成DNAアダプターを意味する。 第４図はTNF-115L生産用の形質発現プラスミドの構築に
用いたPL-DNA断片の作製工程を示す。図中，合成オリゴ
ヌクレオチド［ｄ］及び［ｅ］は実施例２−（１）に記
載の合成DNAアダプターを意味する。 第５図はTNF-115Lのリジルエンドペプチダーゼによる消
化産物（ペプチド断片）の高速液体クロマトグラフィー
による溶出パターンを示す。 第６図は形質発現プラスミドpHPL-147の構築工程を示す
（実施例３）。 第７図は形質発現プラスミドpHPL-Ser67の構築工程を示
す（実施例４）。 第８図は形質発現プラスミドpHPL147S67の構築工程を示
す（実施例５）。 第９図は成熟ヒトTNF生産用の形質発現プラスミドpHTR9
1の構築工程を示す。図中，合成オリゴヌクレオチド
［ｆ］及び［ｇ］はそれぞれ参考例１に記載の合成DNA
アダプターを意味する。 第10図は147残基をアミノ酸配列よりなるポリペプチド
生産用の形質発現プラスミドpHT147の構築工程を示す。
図中、合成オリゴヌクレオチド［ｈ］，［ｉ］及び
［ｊ］はそれぞれ参考例２に記載の合成DNAアダプター
を意味する。 第11図はTNF（Ser67）生産用の形質発現プラスミドpHTP
392の構築工程を示す。図中、合成オリゴヌクレオチド
［ｋ］，［ｌ］，［ｊ］及び［ｍ］はそれぞれ参考例３
に記載の合成DNAアダプターを意味する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (3)
- 【請求項１】下記式〔Ｉ〕で示されるアミノ酸配列にお
いて、 第16番目のAlaをValに， 第31番目のAlaをThrに， 第32番目のAsnをAla,Cys,Asp,His,Ile,Arg,Ser,Thr,Val
若しくはTyrに， 第34番目のLeuをIleに， 第36番目のAlaをValに， 第48番目のValをMetに， 第73番目のLeuをProに， 第82番目のAlaをAspに， 第85番目のTyrをHisに， 第89番目のValをIleに， 第94番目のAlaをThrに， 第97番目のSerをAsnに， 第98番目のProをHis若しくはLeuに， 第103番目のThrをProに， 第113番目のTyrをCysに， 第115番目のProをLeu,His,Gln,Ser,Ala,Phe,Asn,Thr,Gl
y,Tyr,Val,Gln,Met,Ile,Asp,Trp,Lys,Arg若しくはThr
に， 第117番目のTyrをHisに， 第118番目のLeuをGlnに， 第131番目のSerをIleに， 第132番目のAlaをThrに， 第141番目のAspをTyrに， 第143番目のAlaをValに， 第144番目のGluをLysに， 第145番目のSerをCysに， 第146番目のGlyをGluに又は 第153番目のIleをLeuに 変換したアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのポ
リペプチドのＮ末端側のアミノ酸残基がＮ末端から順次
最高８つ欠失したポリペプチド。 - 【請求項２】特許請求の範囲第１項の式〔Ｉ〕で示され
るアミノ酸配列において第32番目のAsnをTyrに変換した
特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 - 【請求項３】特許請求の範囲第１項の式〔Ｉ〕で示され
るアミノ酸配列において第115番目のProをLeuに変換し
た特許請求第１項記載のポリペプチド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62154239A JPH0817712B2 (ja) | 1986-06-20 | 1987-06-19 | 新規ヒトｔｎｆポリペプチド変異体 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14557586 | 1986-06-20 | ||
| JP61-145575 | 1986-06-20 | ||
| JP62154239A JPH0817712B2 (ja) | 1986-06-20 | 1987-06-19 | 新規ヒトｔｎｆポリペプチド変異体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63119692A JPS63119692A (ja) | 1988-05-24 |
| JPH0817712B2 true JPH0817712B2 (ja) | 1996-02-28 |
Family
ID=26476651
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62154239A Expired - Lifetime JPH0817712B2 (ja) | 1986-06-20 | 1987-06-19 | 新規ヒトｔｎｆポリペプチド変異体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0817712B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2958578A1 (en) * | 2014-08-21 | 2016-02-25 | The General Hospital Corporation | Tumor necrosis factor superfamily and tnf-like ligand muteins and methods of preparing and using the same |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GR851626B (ja) * | 1984-07-05 | 1985-11-26 | Genentech Inc |
-
1987
- 1987-06-19 JP JP62154239A patent/JPH0817712B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63119692A (ja) | 1988-05-24 |
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