JPH0824571B2 - 耐熱性制限酵素の調製法 - Google Patents
耐熱性制限酵素の調製法Info
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- JPH0824571B2 JPH0824571B2 JP3291848A JP29184891A JPH0824571B2 JP H0824571 B2 JPH0824571 B2 JP H0824571B2 JP 3291848 A JP3291848 A JP 3291848A JP 29184891 A JP29184891 A JP 29184891A JP H0824571 B2 JPH0824571 B2 JP H0824571B2
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- restriction enzyme
- sel
- preparation
- present
- enzyme
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Description
【産業上の利用分野】本発明は、耐熱性酵素の調製法に
関する。
関する。
【従来の技術】制限酵素の調製法は現在までに様々な方
法が報告されているが、それらはいずれもイオン交換カ
ラムクロマトグラフィー等による分離操作を２回以上行
うために複雑な操作を必要とするほか、最終的な酵素の
収量も少ないものであった。このように、生物から微量
にしか分離できない制限酵素は遺伝子工学的に重要なも
のであっても経済的な分離・調製法が存在せず、商業化
できなかった。
法が報告されているが、それらはいずれもイオン交換カ
ラムクロマトグラフィー等による分離操作を２回以上行
うために複雑な操作を必要とするほか、最終的な酵素の
収量も少ないものであった。このように、生物から微量
にしか分離できない制限酵素は遺伝子工学的に重要なも
のであっても経済的な分離・調製法が存在せず、商業化
できなかった。
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、特に
耐熱性の制限酵素の調製法に関し、簡便な操作で、高い
活性純度を有する上記酵素を高収率で得ることのできる
新規な調製法を提供しようとするものである。
耐熱性の制限酵素の調製法に関し、簡便な操作で、高い
活性純度を有する上記酵素を高収率で得ることのできる
新規な調製法を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】そこで本発明者等は、鋭
意研究の結果、目的とする耐熱性制限酵素が失活しはじ
める最低温度で、夾雑するエンドヌクレアーゼが実質的
に失活する時間加熱処理することにより、簡便な操作
で、高い活性純度を有する耐熱性制限酵素を高収率で調
製できることを見い出し本発明を完成するに至った。す
なわち、本発明は、耐熱性制限酵素が失活しはじめる最
低温度で、夾雑するエキソヌクレアーゼが実質的に失活
するまで加熱処理することを特徴とする耐熱性制限酵素
の調製法にある。耐熱性制限酵素としては好熱性藍藻シ
ネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）由来の耐熱性制限酵素Ｓｅ
ｌ Ｉが用いられる。また、加熱処理は６０℃で１０分
間行われる。以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
調製法は、Ｂｓｔ Ｉ、Ｓｐｌ Ｉ等種々の耐熱性制限
酵素の調製に適用できるが、以下においては、好熱性藍
藻シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）（ＦＥＲＭ Ｐ−１２
３９３）の菌体中に存在する耐熱性制限酵素Ｓｅｌ Ｉ
の調製を例にとり、本発明を具体的に説明する。このＳ
ｅｌ Ｉは、本発明者等が始めて単離に成功した新規な
酵素であり、以下表１に示す酵素学的性質を有する。 本発明により、耐熱性の制限酵素Ｓｅｌ Ｉを得るに
は、まず、培養した好熱性藍藻を集菌し、超音波破砕
後、３０，０００Ｇ ３０分間の遠心分離操作により制
限酵素含有可溶性タンパク質画分を得る。次いで、陰イ
オン交換カラムとしてＱ−セファロースファーストフロ
ーゲルカラムを用い、０ｍＭ ＮａＣｌ条件で前述の制
限酵素含有溶性タンパク質画分をカラムに吸着させる。
次に、０ｍＭから１００ｍＭまでの濃度勾配をつけたＴ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，ｐＨ８．０，０ｍＭ−１００ｍＭ ＮａＣｌ）で
吸着物質を溶出させると、ＮａＣｌ濃度８５ｍＭのＴＥ
緩衝液で制限酵素Ｓｅｌ Ｉは溶出される。この溶液中
にはわずかにエキソヌクレアーゼが混入している。そこ
でこのエキソヌクレアーゼ除去の手段として、Ｓｅｌ
Ｉが失活しはじめる最低温度で、このエキソヌクレアー
ゼが実質的に失活するまで加熱処理する。具体的には６
０℃で１０分間加熱処理する。このようにして高い活性
純度を有するＳｅｌＩを得ることができる。本発明の調
製法の特徴を以下に説明する。カラムによる分離操作は
手間と時間がかかり、従来法のようにこれを繰り返すこ
とは目的物の損失を大きくする。本発明の調製法は、カ
ラムによる分離操作は１回しか用いていない。その結
果、操作が簡素化され、目的物である制限酵素の損失は
きわめて少ない。陰イオン交換カラムによって分離され
た制限酵素試料中には微量のエキソヌクレアーゼが混入
している。これを除去するために用いた熱処理は本発明
を特徴づけている。すなわち本発明は、陰イオン交換カ
ラムによる分離と熱処理を組み合わせることで、精製品
と同等の活性純度のＳｅｌ Ｉ溶液を得るものであり、
上記したＳｅｌ Ｉの調製における具体的加熱温度であ
る６０℃という温度は、Ｓｅｌ Ｉが失活しはじめる最
低温度である。エキソヌクレアーゼについても同様であ
る。そこで、この温度による熱処理を適当な時間だけ試
料に施せば、エキソヌクレアーゼを失活させ、しかも、
Ｓｅｌ Ｉの失活を最小限に抑えることができる。その
時間が１０分間である。このことはＳｅｌ Ｉとエキソ
ヌクレアーゼの６０℃に対する失活速度が等しく、今、
Ｓｅｌ Ｉとエキソヌクレアーゼが９：１の割合で存在
すると仮定するとＳｅｌ Ｉが１減ると、エキソヌクレ
アーゼも１減り、この時、Ｓｅｌ Ｉ活性は純化された
ことになる。実際のサンプル（カラムで分画したもの）
中にはＳｅｌ Ｉはエキソヌクレアーゼに比べて圧倒的
に優先して存在している。これはＳｅｌ Ｉサンプルを
用いて１時間、４時間、ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔでＤＮＡ
を消化させたとき、アガロースゲル電気泳動のパターン
に差が認められなかったことで確認できた。実験的に熱
によるＳｅｌ Ｉ活性の純化効果を調べてみると、６０
℃、１０分以上の熱処理でエキソヌクレアーゼは無視で
きるレベルにまで活性を低下させることができた。この
定性評価法として、Ｃｕｔｔｉｎｇ−Ｌｉｇａｔｉｏｎ
−Ｒｅｃｕｔｔｉｎｇ法を用いた。定量法としては、反
応液量５０μＬ、反応温度５０℃、反応時間１時間なる
条件で、λ−ＤＮＡをＳｅｌ Ｉで消化したときに生ず
るＯＤ２６０ｎｍの変化からユニットを算出する方法を
用いた。式は、ΔＯＤ２６０ｎｍ×５０μｇ〔Ｕ：ユニ
ット〕（１Ｕ：１時間に１μｇのλＤＮＡを完全消化す
るにちょうど足りる活性）である。こうして分離された
Ｓｅｌ Ｉ試料は、３段階のカラムによって精製された
Ｓｅｌ Ｉ試料と同等の活性純度であった。即ち、我々
が発明した方法によって分離されたＳｅｌ Ｉ試料によ
って切断されたＤＮＡはリガーゼによって再び接合で
き、接合されたＤＮＡはまたＳｅｌ Ｉによって切断す
ることができた。これは一般的な、制限酵素の活性純度
の定性評価法である。以上、本発明について、耐熱性藍
藻シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏ−ｃ
ｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）由来のＳｅｌ Ｉを
例に説明したが、加熱に対する酵素の失活条件の差異を
利用する本発明の調製法は、このＳｅｌ Ｉのみにとど
まらず、夾雑酵素と加熱に対する失活条件に差異を有す
る種々の耐熱性の制限酵素の調製にも適用できる。
意研究の結果、目的とする耐熱性制限酵素が失活しはじ
める最低温度で、夾雑するエンドヌクレアーゼが実質的
に失活する時間加熱処理することにより、簡便な操作
で、高い活性純度を有する耐熱性制限酵素を高収率で調
製できることを見い出し本発明を完成するに至った。す
なわち、本発明は、耐熱性制限酵素が失活しはじめる最
低温度で、夾雑するエキソヌクレアーゼが実質的に失活
するまで加熱処理することを特徴とする耐熱性制限酵素
の調製法にある。耐熱性制限酵素としては好熱性藍藻シ
ネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃ
ｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）由来の耐熱性制限酵素Ｓｅ
ｌ Ｉが用いられる。また、加熱処理は６０℃で１０分
間行われる。以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
調製法は、Ｂｓｔ Ｉ、Ｓｐｌ Ｉ等種々の耐熱性制限
酵素の調製に適用できるが、以下においては、好熱性藍
藻シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏ
ｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）（ＦＥＲＭ Ｐ−１２
３９３）の菌体中に存在する耐熱性制限酵素Ｓｅｌ Ｉ
の調製を例にとり、本発明を具体的に説明する。このＳ
ｅｌ Ｉは、本発明者等が始めて単離に成功した新規な
酵素であり、以下表１に示す酵素学的性質を有する。 本発明により、耐熱性の制限酵素Ｓｅｌ Ｉを得るに
は、まず、培養した好熱性藍藻を集菌し、超音波破砕
後、３０，０００Ｇ ３０分間の遠心分離操作により制
限酵素含有可溶性タンパク質画分を得る。次いで、陰イ
オン交換カラムとしてＱ−セファロースファーストフロ
ーゲルカラムを用い、０ｍＭ ＮａＣｌ条件で前述の制
限酵素含有溶性タンパク質画分をカラムに吸着させる。
次に、０ｍＭから１００ｍＭまでの濃度勾配をつけたＴ
Ｅ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ，ｐＨ８．０，０ｍＭ−１００ｍＭ ＮａＣｌ）で
吸着物質を溶出させると、ＮａＣｌ濃度８５ｍＭのＴＥ
緩衝液で制限酵素Ｓｅｌ Ｉは溶出される。この溶液中
にはわずかにエキソヌクレアーゼが混入している。そこ
でこのエキソヌクレアーゼ除去の手段として、Ｓｅｌ
Ｉが失活しはじめる最低温度で、このエキソヌクレアー
ゼが実質的に失活するまで加熱処理する。具体的には６
０℃で１０分間加熱処理する。このようにして高い活性
純度を有するＳｅｌＩを得ることができる。本発明の調
製法の特徴を以下に説明する。カラムによる分離操作は
手間と時間がかかり、従来法のようにこれを繰り返すこ
とは目的物の損失を大きくする。本発明の調製法は、カ
ラムによる分離操作は１回しか用いていない。その結
果、操作が簡素化され、目的物である制限酵素の損失は
きわめて少ない。陰イオン交換カラムによって分離され
た制限酵素試料中には微量のエキソヌクレアーゼが混入
している。これを除去するために用いた熱処理は本発明
を特徴づけている。すなわち本発明は、陰イオン交換カ
ラムによる分離と熱処理を組み合わせることで、精製品
と同等の活性純度のＳｅｌ Ｉ溶液を得るものであり、
上記したＳｅｌ Ｉの調製における具体的加熱温度であ
る６０℃という温度は、Ｓｅｌ Ｉが失活しはじめる最
低温度である。エキソヌクレアーゼについても同様であ
る。そこで、この温度による熱処理を適当な時間だけ試
料に施せば、エキソヌクレアーゼを失活させ、しかも、
Ｓｅｌ Ｉの失活を最小限に抑えることができる。その
時間が１０分間である。このことはＳｅｌ Ｉとエキソ
ヌクレアーゼの６０℃に対する失活速度が等しく、今、
Ｓｅｌ Ｉとエキソヌクレアーゼが９：１の割合で存在
すると仮定するとＳｅｌ Ｉが１減ると、エキソヌクレ
アーゼも１減り、この時、Ｓｅｌ Ｉ活性は純化された
ことになる。実際のサンプル（カラムで分画したもの）
中にはＳｅｌ Ｉはエキソヌクレアーゼに比べて圧倒的
に優先して存在している。これはＳｅｌ Ｉサンプルを
用いて１時間、４時間、ｏｖｅｒ ｎｉｇｈｔでＤＮＡ
を消化させたとき、アガロースゲル電気泳動のパターン
に差が認められなかったことで確認できた。実験的に熱
によるＳｅｌ Ｉ活性の純化効果を調べてみると、６０
℃、１０分以上の熱処理でエキソヌクレアーゼは無視で
きるレベルにまで活性を低下させることができた。この
定性評価法として、Ｃｕｔｔｉｎｇ−Ｌｉｇａｔｉｏｎ
−Ｒｅｃｕｔｔｉｎｇ法を用いた。定量法としては、反
応液量５０μＬ、反応温度５０℃、反応時間１時間なる
条件で、λ−ＤＮＡをＳｅｌ Ｉで消化したときに生ず
るＯＤ２６０ｎｍの変化からユニットを算出する方法を
用いた。式は、ΔＯＤ２６０ｎｍ×５０μｇ〔Ｕ：ユニ
ット〕（１Ｕ：１時間に１μｇのλＤＮＡを完全消化す
るにちょうど足りる活性）である。こうして分離された
Ｓｅｌ Ｉ試料は、３段階のカラムによって精製された
Ｓｅｌ Ｉ試料と同等の活性純度であった。即ち、我々
が発明した方法によって分離されたＳｅｌ Ｉ試料によ
って切断されたＤＮＡはリガーゼによって再び接合で
き、接合されたＤＮＡはまたＳｅｌ Ｉによって切断す
ることができた。これは一般的な、制限酵素の活性純度
の定性評価法である。以上、本発明について、耐熱性藍
藻シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏ−ｃ
ｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）由来のＳｅｌ Ｉを
例に説明したが、加熱に対する酵素の失活条件の差異を
利用する本発明の調製法は、このＳｅｌ Ｉのみにとど
まらず、夾雑酵素と加熱に対する失活条件に差異を有す
る種々の耐熱性の制限酵素の調製にも適用できる。
【発明の効果】従来から行われている制限酵素分離法を
用いてＳｅｌ Ｉを調製する場合においては、湿菌体２
０ｇから得られる制限酵素量は１００ｕｎｉｔｓ程度で
あった。この方法はイオン交換カラムによる分離操作を
３回も行うために酵素の損失が大きかったものと考えら
れる。これに対し、本発明の調製によれば、カラムによ
る分離が１回のみのため操作が簡便な上に、従来からの
方法の１０倍以上の収量が得られるものである。したが
って、本発明の調製法は遺伝子操作技術において重要な
位置を占める耐熱性の制限酵素を提供する手段として極
めて有用なものである。
用いてＳｅｌ Ｉを調製する場合においては、湿菌体２
０ｇから得られる制限酵素量は１００ｕｎｉｔｓ程度で
あった。この方法はイオン交換カラムによる分離操作を
３回も行うために酵素の損失が大きかったものと考えら
れる。これに対し、本発明の調製によれば、カラムによ
る分離が１回のみのため操作が簡便な上に、従来からの
方法の１０倍以上の収量が得られるものである。したが
って、本発明の調製法は遺伝子操作技術において重要な
位置を占める耐熱性の制限酵素を提供する手段として極
めて有用なものである。
【実施例】好熱性藍藻シネココッカス・エロンガタス
（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２３９３）の菌体０．０１ｇを以下
表２の培地に接種し、温度５０℃で１６８時間培養を行
った。 得られたシネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）の湿菌体２０ｇ
をＴＥ緩衝液４０ｍｌに懸濁し、超音波破砕後、３０，
０００Ｇ ３０分間遠心分離を行い、その上清を制限酵
素含有可溶タンパク質画分（１）とした。次に、内径２
０ｍｍ，高さ６０ｍｍのカラムに充填されたＱ−セファ
ロースファーストフローゲルに上記画分（１）を吸着さ
せた。非吸着成分をＴＥ緩衝液（０ｍＭ ＮａＣｌ）で
洗い流したのち、流速２．５ｍｌ／分、２時間、０ｍＭ
から２００ｍＭまでのＮａＣｌ濃度勾配をつけたＴＥ緩
衝液で吸着成分を流出させた。その結果、６０ｍＭから
８０ｍＭのＮａＣｌ濃度で制限酵素Ｓｅｌ Ｉは溶出さ
れた。ここで得られた酵素溶液（２）１５ｍｌ中には微
量のエキソヌクレアーゼが含まれていた。そこで、これ
を失活させるために熱処理を行った。酵素溶液（２）１
５ｍｌを入れた試験管を６０℃の湯に１０分間浸した。
得られた酵素液（３）中の制限酵素量は１０００ｕｎｉ
ｔｓ以上であった。ただし、１ｕｎｉｔｓとは、酵素反
応液５０μｌ中、５０℃で１時間に１μｇのλＤＮＡを
完全に分解する酵素量を意味する。また、λＤＮＡ，ｐ
ＢＲ３２２，φ×１７４をこの酵素液（３）で消化後電
気泳動し、得られたバンドパターンを検討したところ、
アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ
由来の制限酵素ＡｃｃＩＩ（至適ｐＨ７．５，至適温度
３７℃／６０ｍＭ ＮａＣｌ）と一致した。
（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）
（ＦＥＲＭ Ｐ−１２３９３）の菌体０．０１ｇを以下
表２の培地に接種し、温度５０℃で１６８時間培養を行
った。 得られたシネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈ
ｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）の湿菌体２０ｇ
をＴＥ緩衝液４０ｍｌに懸濁し、超音波破砕後、３０，
０００Ｇ ３０分間遠心分離を行い、その上清を制限酵
素含有可溶タンパク質画分（１）とした。次に、内径２
０ｍｍ，高さ６０ｍｍのカラムに充填されたＱ−セファ
ロースファーストフローゲルに上記画分（１）を吸着さ
せた。非吸着成分をＴＥ緩衝液（０ｍＭ ＮａＣｌ）で
洗い流したのち、流速２．５ｍｌ／分、２時間、０ｍＭ
から２００ｍＭまでのＮａＣｌ濃度勾配をつけたＴＥ緩
衝液で吸着成分を流出させた。その結果、６０ｍＭから
８０ｍＭのＮａＣｌ濃度で制限酵素Ｓｅｌ Ｉは溶出さ
れた。ここで得られた酵素溶液（２）１５ｍｌ中には微
量のエキソヌクレアーゼが含まれていた。そこで、これ
を失活させるために熱処理を行った。酵素溶液（２）１
５ｍｌを入れた試験管を６０℃の湯に１０分間浸した。
得られた酵素液（３）中の制限酵素量は１０００ｕｎｉ
ｔｓ以上であった。ただし、１ｕｎｉｔｓとは、酵素反
応液５０μｌ中、５０℃で１時間に１μｇのλＤＮＡを
完全に分解する酵素量を意味する。また、λＤＮＡ，ｐ
ＢＲ３２２，φ×１７４をこの酵素液（３）で消化後電
気泳動し、得られたバンドパターンを検討したところ、
アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）ｓｐ
由来の制限酵素ＡｃｃＩＩ（至適ｐＨ７．５，至適温度
３７℃／６０ｍＭ ＮａＣｌ）と一致した。
Claims (1)
- 【請求項１】 好熱性藍藻シネココッカス・エロンガタ
ス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｅｌｏｎｇａｔｕ
ｓ）を培養し、集菌し、超音波破砕後、遠心分離により
得たタンパク質画分を陰イオン交換カラムに吸着させ、
ＮａＣｌ濃度８５ｍＭのＴＥ緩衝液で溶出した制限酵素
ＳｅｌＩを、６０℃で１０分間加熱処理することを特徴
とする、下記の酵素学的性質を有する耐熱性制限酵素Ｓ
ｅｌＩの高収量調製法。作用 ：ＤＮＡの塩基配列ＣＧＣＧの５’側を切断 基質特異性：ＣＧＣＧ 至適ｐＨ ：ｐＨ６．５ 至適温度 ：５０〜５５℃ 金属イオンの要求：Ｍｇ ２＋ のみ要求 失活温度 ：７０℃、１０分
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3291848A JPH0824571B2 (ja) | 1991-08-20 | 1991-08-20 | 耐熱性制限酵素の調製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3291848A JPH0824571B2 (ja) | 1991-08-20 | 1991-08-20 | 耐熱性制限酵素の調製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0549475A JPH0549475A (ja) | 1993-03-02 |
| JPH0824571B2 true JPH0824571B2 (ja) | 1996-03-13 |
Family
ID=17774204
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3291848A Expired - Lifetime JPH0824571B2 (ja) | 1991-08-20 | 1991-08-20 | 耐熱性制限酵素の調製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0824571B2 (ja) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU627809B2 (en) * | 1988-12-16 | 1992-09-03 | Abbott Laboratories | Isolating thermostable enzymes from engineered mesophiles |
-
1991
- 1991-08-20 JP JP3291848A patent/JPH0824571B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0549475A (ja) | 1993-03-02 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |