JPH08252092A - バチルス チュウリンゲンシス エンドトキシンをコードするｄｎａ断片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 植物体中でＢ． チュウリンゲンシス由来の
エンドトキシンを発現できるＤＮＡ断片の提供 【解決手段】 Ｂ． チュウリンゲンシスのトキシンを
コードするＤＮＡ断片を単離し、このＤＮＡ断片をクロ
ーニングし、前記エンドトキシンを産生する細菌クロー
ンを選択し、同クローンよりＤＮＡ断片を単離し、得ら
れたＤＮＡ断片から必要に応じて不要なＤＮＡ断片を除
去して植物体中において発現できるＤＮＡ断片を得る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、植物の改良における遺
伝子工学技術の利用に関する。さらに詳細にいえば、植
物細胞中でバチルス・チュウリンゲンシス（Ｂａｃｉｌ
ｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）により生産され
るポリペプチド毒をコードするか、又は、以下に述べる
毒性の遺伝子と実質的な配列相同性を有するキメラ遺伝
子の導入及び統合並びに形質転換した及びその子孫によ
り前記ポリペプチド毒の殺虫しうる水準での発現を実現
することに関する。

【０００２】

【従来の技術】組換えＤＮＡ工学は、現在特定の蛋白を
合成するために、細菌や酵母のような遺伝学的に操作さ
れたある種の微生物に対して利用されている。現在の技
術水準では高等生物に関する遺伝子操作には、完全な生
物体を形成しうる遺伝学的に操作された１つ又は数個の
細胞を必要とする。高等生物の中でも、ある植物の細胞
は、すぐれた再生能力を示し、それ故、そのような植物
の遺伝子操作にとっては、潜在的に良い材料と考えられ
ている。さらに、高等植物では、植物ゲノムへ外来ＤＮ
Ａを導入する既知の系が得られている。この系は、グラ
ム陰性土壌細菌アグロバクテリウム・テュメファシェン
ス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅ
ｎｓ）の腫瘍導入プラスミドにより提供される。アグロ
バクテリウムは、Ｔｉプラスミドのよく知られている断
片であるＴ−ＤＮＡを植物細胞ゲノムに安定的に組込む
ことにより、遺伝学的に植物細胞を形質転換できる。最
近植物の遺伝子操作のベクターとしてＴｉプラスミドを
利用するのを容易にするような重要な進歩があった。Ｔ
−ＤＮＡ（の端の配列）に隣接する小さな同方向反復配
列が、Ｔ−ＤＮＡの組込みに重要な役割を果すことが発
見された。非腫瘍化ＴｉプラスミドベクターがＴ−ＤＮ
Ａの内部欠失により腫瘍遺伝子が削除されたものから構
築された。これらのＴｉプラスミドは、境界の配列を含
んでおり、それ故、腫瘍の導入なしにＴ−ＤＮＡを移
す。植物の遺伝子操作のそのようなＴｉプラスミド由来
のベクターの例が、通常使用されているクローニングベ
クターｐＢＲ３２２によりＴ−ＤＮＡの内部の遺伝子が
置き換えられているｐＧＶ３８５０である。ｐＧＶ３８
５０を含む感染植物を再生させるいくつかの方法が開発
された。Ｔ−ＤＮＡの中にｐＢＲ３２２の配列をもつｐ
ＧＶ３８５０は、植物細胞での遺伝子移送実験の効率的
な受容体プラスミドである。実際に、ｐＢＲ３２２様プ
ラスミドにクローニングされた遺伝子は、アグロバクテ
リウムに移され、一工程で、ｐＧＶ３８５０Ｔ−ＤＮＡ
の中に相同的組換えを経て挿入される。

【０００３】植物の操作技術の開発における別の主たる
進歩は、植物でキメラ遺伝子を発現させるための植物の
調節配列の利用である。一般的に、これらのキメラ遺伝
子は、植物細胞で自然に発現される遺伝子由来のプロモ
ーター領域、発現されるべき配列、及び、優先的には、
植物細胞で自然に発現される遺伝子のポリアデニレーシ
ョンに部位を含む３′の未翻訳領域を含む。例えば、ノ
パリン合成酵素プロモーターと細菌の抗生物質耐性遺伝
子を用いて、植物細胞の優性選択マーカーが構築され
た。あるキメラ遺伝子が現在、形質転換した植物細胞で
うまく発現するのだが、そのような発現には、紆余曲折
がある。非植物起源の外来遺伝子の発現のレベルは、異
なる形質転換組織で非常にかわるだけでなく、一般に
は、非常に低いということが各種の証明により明らかに
されている。遺伝子発現がそのように低レベルであるこ
とはいくつかの理由によるものである。第１に、偶然の
転写終止信号による遺伝子の不完全な転写。第２に、効
率の悪いｍＲＮＡのプロセシング。第３に、核から細胞
質へのｍＲＮＡの移動の減少。第４に、細胞質ｍＲＮＡ
の不安定性。第５に、効率の悪い細胞質ｍＲＮＡの翻
訳。そして第６に、植物の特異的な蛋白に対する感受性
による蛋白の不安定性。従って、上述のようなベクター
を利用した植物細胞の好結果をもたらす形質転換は、必
ずしも所望の形質転換を試みる前に予測しうるものでは
ない。

【０００４】Ｂｔ２ポリペプチド及び（又は）その短く
なったもの及び（又は）Ｂｔ２と相当の配列相同性を有
するポリペプチドを発現させるための植物の分化細胞及
びその子孫の操作は、以下の事項の１つ又はそれ以上の
理由により、抗生物質耐性遺伝子のような他の遺伝子や
タウマチンのような他の植物遺伝子の場合よりもかなり
難しい。（１）短くなった場合でさえもＢｔ２毒素のサ
イズが大きい。（２）（例えば、これに限られるわけで
はないが、ポリペプチドの可溶性のような）Ｂｔ２ポリ
ペプチドの特有の性質。（３）植物細胞に対するＢｔ２
ポリペプチドの潜在的な毒性。あるいは（４）植物細胞
及びその子孫で合成されるＢｔ２ポリペプチドは、実質
的に、細菌で合成される結晶蛋白とほぼ同一の性質を保
有していなければならない。

【０００５】バチルス・チュウリンゲンシス菌（以下
Ｂ．ｔ．と称すこともある）は、胞子形成期に擬似胞子
結晶を形成するポリペプチド毒を産生するおよそ１９の
既知の変種を含んでいる。Ｂ．ｔ．によりつくられる結
晶蛋白は、ある昆虫の幼虫には毒性がある。特定の種に
より産生される毒は、ある種の鱗翅類、甲虫類、双翅類
の幼虫に対して、強い殺虫活性を示す。例えば、タイレ
ル、Ｄ．Ｊ．等、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（８１年）第１４５巻（第２号）１０５２から１０６２
ページ参照されたい。昆虫の幼虫にとりこまれると、結
晶は、可溶化し、昆虫の中腸において、変化して中腸の
細胞壁に作用すると信じられている少なくとも１つの活
性のあるポリペプチド毒を生成する。個々の結晶ポリペ
プチドが殺虫活性を示すことが研究により明らかにされ
ている。ヤマモト、Ｔ．等、カレント・マイクロバイオ
ロジー、（８３年）第９巻、２７９から２８４ページ；
ヤマモト、Ｔ．等、アチーブス・オブ・バイオケミスト
リー・アンド・バイオフイジクス、（８３年）、第２２
７巻（第１号）、２３３から２４１ページ；リリー、
Ｍ、等、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイ
オロジー、（８０年）、第１１８巻、１から１１ペー
ジ；ブラ、Ｌ．Ａ．等、ジャーナル・オブ・バイオロジ
カルケミストリー、（８１年）、第２５６巻（第６
号）、３０００から３００４ページ。

【０００６】バチルス・チュウリンゲンシスの変種の産
生する結晶ポリペプチドの毒性は、特定の昆虫類に非常
に特異的で、高等脊椎動物には安全なものとして認識さ
れる。結晶を含む製剤が、生物学的殺虫剤として、商業
的に使用されている。例えば、バイオケム・プロダクト
Ｌｔｄ、ダイペルアボット・ラボラトリーズより市販さ
れている，バクトスペイン、及び、サンドＡＧのチュウ
リサイドなどである。細菌宿主から得られる製剤の効力
は、しかしながら、害虫の適当な駆除には、繰り返しの
しかも正確な時期の使用が必要なので、限られている。
さらに、そのような製品の生産に伴う価格は、ピレスロ
イド誘導体のような他の市販製品と有効に競合すること
を困難にしている。分子遺伝学の研究により、バチルス
・チュウリンゲンシスの産生する少くとも数種のポリペ
プチド毒は、プラスミドにより暗号化されていることが
示された。Ｄ．Ｐ．スターリー等（１９７８年）、バイ
オケミカル・アンド・バイオフイジカル・リサーチ・コ
ミュニケーション、第８４巻、５８１から５８８ペー
ジ；Ｖ．Ｇ．デバボック等（１９７７年）、ジェネティ
カ、第１３巻、４９６から５０１ページ参照。種々の
Ｂ．ｔ．菌株由来の毒性結晶ポリペプチドを暗号化する
遺伝子がクローニングされ、他の細菌宿主で発現され
た。シェネフとホウイトレイ、フロシーディングス・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ
ＵＳＡ、（８１年）、第７８巻、２９９３から２９９７
ページ。Ａ．クリエ等、エンボ・ジャーナル、（８２
年）、第１巻（第７号）、７９１から７９９ページ。ア
ダン等、ジーン（３６）、２８９ページ、１９８５年。
シェネフ等ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー、（２０）、６２６４ページ、１９８５年。シバ
ノ等、ジーン（３４）、１９８５年参照。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】バチルス・チュウリン
ゲンシスの産生するポリペプチド毒又は、この中に述べ
られている毒遺伝子と実質的な配列相同性を有するポリ
ペプチド毒をコードする先例のないキメラ遺伝子を提供
することが本発明の１つの目的である。キメラ遺伝子の
植物調節配列が形質転換細胞での発現を支配している。
本発明の他の目的、性質及び利点は、図面及び以下の説
明から、この分野において通常の技術を有する者には明
らかとなるであろう。本発明によれば、Ｂｔ２蛋白又は
殺虫活性のあるサイズが小さくなったＢｔ２蛋白をコー
ドしているＤＮＡ断片、又はＢｔ２又は前記のサイズが
小さくなったＢｔ２と実質的な配列の相同性を有するＤ
ＮＡ断片が提供される。

【０００８】

【発明の実施の形態】本願明細書に添付した図面につい
て以下に説明する。図１はクマジー・ブルーで染色した
７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果
である。 トラック１：Ｂ．ｔ．クルスタキの結晶蛋白調製物 トラック２：Ｂ．ｔ．ベルリナーの結晶蛋白調製物 トラック３：分子量マーカー ａ：ホスフォリラーゼＢ
（９２５００ダルトン） ｂ：牛血清アルブミン（６６
２００ダルトン） ｃ：オブアルブミン（４５０００ダ
ルトン） ｄ：炭酸脱水酵素（３１０００ダルトン） 図２はプラスミドｐＥｃｏＲ２５１の模式図である。Ｅ
ｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ遺伝子（ＥｎｄＲＩ）がＰ
_R プロモーター（Ｐ_R ）に融合され、単一のＢｇｌＩＩ
クローニング部位を含んでいる。Ａｍｐ：β−ラクタマ
ーゼ遺伝子。図３はｐＥｃｏＲ２５１にクローニングさ
れたＢ．ｔ．ベルライナー１７１５プラスミドＤＮＡの
４個の免疫学的に陽性のＳａｕ３Ａによる部分消化クロ
ーンに存在する挿入の制限酵素地図を示す。

【０００９】図４はクマジー・ブルーで染色した７．５
％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル運動泳動の結果を示
す。 トラック１：Ｂ．ｔ．クルスタキの結晶蛋白調製物（図
１、トラック１と同一） トラック２：Ｂ．ｔ．ベルライナーの結晶蛋白調製物
（図１、トラック２と同一） トラック３：Ｂｔ２００プラスミドを含む大腸菌Ｋ５１
４の全溶菌物 トラック４：対照（Ｂｔ２００プラスミドなしの大腸菌
Ｋ５１４の全溶菌物） 図５は、ウサギ抗Ｂ．ｔ．クルスタキ結晶血清を用いた
イムノブロッティニグ実験の結果を示す。 トラック１：Ｂ．ｔ．ベルライナーの結晶蛋白調製物 トラック２：Ｂ．ｔ．クルスタキの結晶蛋白調製物 トラック３：ｐＢｔ２００プラスミドを含む大腸菌Ｋ５
１４の全溶菌物 トラック４：対照（ｐＢｔ２００なしの大腸菌Ｋ５１４
の全溶菌物）

【００１０】図６は、ウサギ抗クルスタキ結晶血清
（Ａ）及びウサギ抗ベルライナー結晶血清（Ｂ）を用い
たイムノブロッティング実験の結果を示す。Ｃは、ブロ
ッティング法のあとの７．５％ＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（Ａで示されたブロッティングに用いら
れたのと同一のゲル）のクマジーブルー染色を示す。 トラック１：（５−１節に述べられているように精製さ
れた）Ｂｔ２蛋白 トラック２：Ｂ．ｔ．ベルライナーの結晶蛋白 トラック３：Ｂ．ｔ．クルスタキの結晶蛋白 図７は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動のクマ
ジー染色結果を示す。 トラック１：ｐＢｔ２００をもつ大腸菌Ｋ５１４の全溶
菌物 トラック２：ｐＢｔ２００をもつ大腸菌Ｋ５１４から調
製された精製Ｂｔ２蛋白 図８は、ＥＬＩＳＡ実験の結果を示すグラフである。ヤ
ギ抗体としてヤギ抗Ｂ．ｔ．結晶及び１次抗体としてマ
ウス抗Ｂｔ２血清を用いたＢｔ２蛋白および可溶化Ｂ．
ｔ．結晶蛋白の結合曲線。

【００１１】図９は、図９Ａが全ベルライナー結晶蛋白
の、図９Ｂが精製Ｂｔ２蛋白での種々の抗ベルライナー
結晶単クローン抗体の反応性を示すＥＬＩＳＡ実験の結
果のグラフである。図１０は、１３０Ｋｄ結晶蛋白のＮ
末端アミノ酸配列の比較を示す。１３０Ｋｄ蛋白は、 １） ウォン等（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・
ケミストリー、第２５８巻、１９６０から１９６７ペー
ジ、１９８３年）により報告されたＤＮＡ配列から推測
され（Ｂ．ｔ．Ｗと命名された）， ２） ｂｔ２蛋白から決定された。 図１１は、ウサギ抗体Ｂ．ｔ．ベルライナー結晶血清で
のウエスタン・ブロッティングを用いたポリペプチドの
免疫学的検出の要約である。ポリペプチドは、本図に示
したような制限酵素切断により生じた各種の欠失を含む
ｐＢｔ２００誘導体により暗号化されている。図１２中
Ａは、箱で示した完全なＢｔ２遺伝子を含むＨｐａＩ−
ＮｄｅＩ断片の制限地図を示す。同Ｂは、Ｂｔ２遺伝子
の配列領域を示す。箱はそれぞれの鎖から配列された範
囲を表わす。同Ｃは、配列決定方法を示す。制限断片が
ポリヌクレオチド・キナーゼで末端標識され、鎖ごとに
分離され、マキサムとギルバートの方法を用いて配列が
決定された。矢印は、それぞれの実験で配列が決定され
た領域の長さを示す。

【００１２】図１３Ａ〜図１３Ｃは、読み取り枠（２１
番目から３６０５番目）を示す完全なＢｔ２遺伝子のＤ
ＮＡ配列とその推測されるアミノ酸配列（１１５５アミ
ノ酸）を示す。実験的に決定されたＢｔ２蛋白のアミノ
酸配列は、相当するアミノ酸の上に示されている。図１
４Ａ〜図１４Ｃは、Ｂｔ２遺伝子（ベルライナー）から
推測されるアミノ酸配列と、他の３株からクローニング
されたＢ．ｔ．結晶蛋白遺伝子から推測される配列との
比較を示す。他の３株は、 Ｂ．ｔ．クルスタキＨＤ７３（アダン等、ジーン第３６
巻２８９ページ１９８５年） Ｂ．ｔ．クルスタキＨＤ１（シェネフ等、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２０巻、６２
６４ページ、１９８５年） Ｂ．ｔ．ソット（シバノ等、ジーン、第３４巻、２４３
ページ、１９８５年） 後３者の配列では、同じ位置でＢｔ２配列とは異なるア
ミノ酸配列のみが表わされている。実際に、配列を整え
たために、ギャップが導入された（“−”で印されてい
る）。図１５は、Ｂｔ２遺伝子カセットのｐＨＤ１６０
の構築の模式的な概略である。図１６は、異なるＢｔ２
遺伝子カセットの模式図である。

【００１３】図１７は、プラスミドｐＬＢ１０の構築に
用いられた実験手法を示す。ここには、又、Ｊ．ボッタ
ーマン等が述べている（投稿準備中）プラスミドｐＬＫ
５４及びｐＬＫ５７の構造も示されている。図１８は、
トキシンの最少暗号化断片の３′末端の地図作成に用い
た異なるＢｔ２ ３′末端欠失変種株の模式図である。
矢印は、３′末端の位置を表わす。図１９は、ウサギ抗
ベルライナー結晶血清を用いたイムノブロッティング実
験の結果を示す。分析した試料は、第２０図と７節で特
定したＢｔ２欠失クローンの全抽出物である。図２０
は、活性のある毒を暗号化している最小の遺伝子断片の
輪郭を見るために用いたＢｔ２配列上の欠失クローンｐ
ＬＢ８３４とｐＬＢ８７９の３′末端を示す。推測され
るアミノ酸配列と、推定上のトリプシン切断部位の位置
も又示されている。

【００１４】図２１は、異なる操作されたＴｉプラスミ
ドに存在しているプロモーター領域とＢｔ遺伝子カセッ
トのコード配列の間の連結部分のＤＮＡ配列を示す。元
来のプロモーター領域由来の配列とＢｔ２遺伝子のコー
ド配列の配列には下線が付されている。キメラ遺伝子の
組立てに含まれるいくつかの適当な制限酵素部位が示さ
れている。ＡＴＧ開始コドンは箱で囲まれている。図２
２は、８節実施例２で述べられているようにｐＨＤ２０
８の構築の模式図である。尚、図中の符号は以下の意味
を有する。 Ｂ：ＢａｍＨＩ、Ｈｐ：ＨｐａＩ、Ｈ：ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｂｇ：ＢｇｌＩＩ 図２３は、ｐＧＶ８３１の構築の模式図である：ｐＧＶ
８３１は、ベルギーのブリュッセル自由大学遺伝ウイル
ス研究室のＲ．デブラエレにより構築された。これは、
欧州特許出願第８３１１２９８５．３．に述べられてい
るように、ｐＧＶ７００の誘導体である。組換えＤＮＡ
技術は、マニアティス等、モレキュラー・クローニング
（１９８２年）コールド・スプリング・ハーバー研究所
に従った。ｐＧＶ７００に存在するＨｉｎｄＩＩＩ断片
がｐＧＶ６００（リーマンズ等、ジャーナル・オブ・モ
レキュラー・アンド・アプライド・ジェネティクス、第
１巻、１４９から１６４ページ、１９８１年）にサブク
ローニングされた。組換え体プラスミドｐＧＶ７４２
が、Ｃｂ^R Ｃｍ^S Ｔｓ^S 組換え体として単離された。Ｂ
ａｍＨＩによる消化と再環状化によりｐＧＶ７４２に内
部欠失がつくり出された。これがｐＧＶ７４４である。
ｐＧＶ７４９を得るために、ＥｃｏＲＩ消化と再環状化
によるｐＧＶ７４４に内部欠失がつくられた。ｐＧＶ７
４９のＨｉｎｄＩＩＩ−ＮｒｕＩ断片がｐＧＶ７１０に
クローニングされた。ｐＧＶ７１０はＥｃｏＲＩで切断
され、５′末端側の突出端がＤＮＡポリメラーゼを用い
てうめられ、そしてさらにＨｉｎｄＩＩＩで切断され
た。得られたプラスミドｐＧＶ８１５はＳｍ^R 、Ｃｂ^R
組換え体として単離された。ｐＧＶ８１５のＥｃｏＲＩ
部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位の両部位は、これらによる消
化と突出端ＤＮＡポリメラーゼによる穴うめと再環状化
によって除去された。最終的に、ノパリン合成酵素プロ
モーターにＴｎ５のネオマイシン・ホスフォトランス・
フェラーゼ遺伝子を含むキメラ遺伝子が、ｐＫＣ７１：
ｎｏｓのＢｃｌＩ−ＢａｍＨＩ断片として単離され、ｐ
ＧＶ８２５のＢｇｌＩＩ部位にクローニングされた。Ｓ
ｐ^R 、Ｋｍ^R 組換え体プラスミドｐＧＶ８３１が得られ
た。

【００１５】図２４は、ＴｉプラスミドｐＧＶ３８５０
及び中間体ベクターｐＨＤ２０５のＴ領域の模式図であ
る。交叉線は、ｐＨＤ１０５０をつくるために、ｐＧＶ
３８５０のｐＨＤ２０５との共同化に含まれる領域を示
す。ハイブリッドＴｉプラスミドｐＨＤ１０５０のＴ領
域があらわされている。 Ｈ：ＨｉｎｄＩＩＩ Ｂｔ：ノパリン合成酵素プロモー
ター支配下のキメラＢｔ２遺伝子 ｎｏｓ：ノパリン合成酵素遺伝子 Ａｐ，Ｋｍ：アンピ
シリン及びカナマイシン耐性を暗号化する遺伝子 図２５は、ＴｉプラスミドｐＧＶ２２６０及び中間体ベ
クターｐＨＤ２０８のＴ領域の模式図である。交叉線
は、ｐＨＤ１０７６をつくるためにｐＧＶ２２６０のｐ
ＨＤ２０８との共同化に含まれる領域を示す。ハイブリ
ッドＴｉプラスミドｐＨＤ１０７６のＴ領域が表わされ
ている。 １：ベクター断片 ２：Ｔ−ＤＮＡ境界領域 ３：Ｂｔ
２遺伝子カセット ４：Ｐｓｓｕプロモーター断片
５：Ｐｎｏｓプロモーター断片 ６：ネオマイシン・ホ
スフォトランスフェラーゼ遺伝子カセット ７：Ｔ−Ｄ
ＮＡ境界領域８：ベクター断片 黒三角はＴ−ＤＮＡ境界領域を表わす。 Ａｐ，Ｓｐ，Ｋｎ：各々、アンピシリン、スペクチノマ
イシン及びカナマイシン耐性を暗号化する遺伝子 Ｐｎｏｓ：ノパリン合成酵素プロモーター Ｐｓｓｕ：リブロース ２−リン酸カルボキシラーゼ・
プロモーターの小サブユ ニット Ｂ．ｔ．：Ｂｔ２遺伝子カセット

【００１６】図２６Ａ〜図２６Ｊは、種々の異なる中間
体発現ベクターの模式図を示す。図２７は、第１１節実
施例１で述べるようにＣ５８Ｃｌ Ｒｉｆ^R ｐＨＤ１０
７６で形質転換したタバコ・カルス組織のＥＬＩＳＡ試
験の結果を示すグラフである。外被抗体はヤギ抗−Ｂ．
ｔ．結晶血清である。ウサギ抗−Ｂｔ２が１次抗体とし
て使用された。１から１４番は形質転換したカルスであ
る。再構築実験で決定された組織１ｇあたり４ｎｇのＢ
ｔ蛋白のレベルに相当する吸光度（Ｏ．Ｄ．）が図に示
されている。図２８は、第１１節実施例１で述べるよう
に、Ｃ５８Ｃｌ Ｒｉｆ^R ｐＨＤ１０７６で形質転換し
たタバコ・カルス組織のＥＬＩＳＡ試験の結果を示すグ
ラフである。外被抗体はヤギ抗−Ｂ．ｔ．結晶血清であ
る。ウサギ抗−Ｂｔ２が１次抗体として使用された。１
から２１番は形質転換したカルスである。再構築実験で
決定された、組織１ｇあたりＢｔ２蛋白４ｎｇの水準に
相当するＯ．Ｄ．値が図に示されている。図２９は、１
１．２節実施例１に述べるように、Ｃ５８Ｃｌ Ｒｉｆ
^R ｐＨＤ１０７６で形質転換したタバコ・カルス組織の
ＥＬＩＳＡ試験の結果を示すグラフである。外被抗体
は、ヤギ抗−Ｂ．ｔ．結晶血清である。異なる単クロー
ン抗体が１次抗体として使用された。形質転換していな
いＳＲ１カルス組織の反応性（負の対照として用いられ
た）も又示されている。

【００１７】図３０Ａ及び図３０Ｂは、カルス組織抽出
物の調製及びこのカルスの中で発現されるＢｔ２の免疫
学的検出に使用された実験手順の説明である。図３１は
カリフラワー・モザイク・ウイルスＣｍ４−１８４（ガ
ードナー等、１９８１年、ヌクレイック・アシド・リサ
ーチ、第９巻、２８７１から２８８８ページ）由来のＰ
３５Ｓ−１及びＰ３５Ｓ−２プロモーター断片のＤＮＡ
配列を示す。図３２は、ｐＧＳＨ５０の構築の模式図で
ある。図３３は、ｐＧＶ１５００の構築の模式図であ
る。図３４は、Ｐｓｓｕ３０１野生株遺伝子ｐＡＧＳ０
０７の構築の模式図である。

【００１８】この中で用いられているように、“ポリペ
プチド”という用語は、完全な蛋白又は、その断片を意
味すると理解されるべきである。“植物細胞”とは、被
子植物（単子葉及び双子葉）と裸子植物を含む植物に由
来する１個又はそれ以上の細胞をいう。“植物細胞子
孫”とは、カルスを含む植物細胞由来の全ての細胞又は
組織をいう。“キメラ遺伝子”とは、特定のポリペプチ
ドをコードする少なくとも１個の構造遺伝子配列に融合
した、プロモーターと呼ばれる転写に必須の調節信号を
含むハイブリッドＤＮＡ部分である。“実質的な配列相
同性”とは、類似の性質をもつ蛋白を産生する別のＤＮ
Ａ断片に十分に類似したヌクレオチド配列を有するＤＮ
Ａ断片、あるいは類似の性質を示す別のポリペプチドに
十分に類似したアミノ酸配列をもつポリペプチドを意味
するものとして理解されるべきである。“同定”とは、
望む遺伝子をもち発現する細胞を選択または評価するこ
とをいう。選択マーカーとは、カナマイシン耐性（Ｋｍ
^R ）のような、他の状態では致死的条件下で生育（選
択）を容認する。識別マーカーは非形質転換細胞とは異
質な同定の特性（評価）を加える。“自然に発現される
遺伝子”とは、本来植物のゲノムの部分としてのＤＮＡ
断片あるいは、ヒトの介入なしに植物の中でＲＮＡ、蛋
白又はその両方を生産する細菌やウイルスのような要因
により導入されるＤＮＡ断片を意味する。

【００１９】キメラ遺伝子は又、構造遺伝子配列の３′
端（下流）に位置する翻訳されないＤＮＡ断片を含み、
そして又、ポリアデニレーション信号と呼ばれる、好ま
しくは自然に植物で発現される遺伝子由来の調節信号を
含む。自然に発現される遺伝子は、ポリアデニレーショ
ン信号を又含んでいる３′−非翻訳領域を含み、そして
両者はそれに相当するメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）領域をコードしている。これらの対応するｍＲＮＡ
領域は、単一のシストロンのｍＲＮＡの停止コドンの
３′端に位置している。ｍＲＮＡの３′−非翻訳領域
は、ｍＲＮＡのプロセシング、安定性及び／あるいは移
送に含まれていると信じられている。ｍＲＮＡの３′−
非翻訳領域は又、細胞内で酵素に認識されるポリアデニ
レーション信号と呼ばれる塩基配列を含むと信じられて
いる。この酵素は、ｍＲＮＡのポリＡ“尾部”を形成す
るために、ｍＲＮＡ分子に多くのアデノシン残基を付加
する。

【００２０】一般的に、本発明を達成するのに使用され
た方法は、“植物細胞ゲノムとこの過程に役立つハイブ
リッドＴｉプラスミドベクターをもつアグロバクテリウ
ム菌株への発現できる遺伝子の導入の方法”と題された
欧州特許出願公開公報第０１１６７１８号に述べられて
いる。バチルス・チュウリンゲンシスの産生するポリペ
プチド毒をコードするか、又は、Ｂｔ２（図１３参照）
とかなりの配列相同性を有する１個又はそれ以上のキメ
ラ遺伝子の植物細胞ゲノムへの導入と組込みは以下のよ
うに実行される： （１） 細胞ＤＮＡの消化によるポリペプチド毒をコー
ドするバチルス・チュウリンゲンシスの少なくとも１個
のＤＮＡ断片の単離と得られたＤＮＡ断片の混合物の細
菌宿主のもつクローニング媒体への挿入；及び（２）
前記ポリペプチド毒をコードするＤＮＡ断片をもつ細菌
クローンの同定；及び（３） 前記ポリペプチド毒をコ
ードするＤＮＡ断片の構造の特徴づけ；及び（４） 望
むＤＮＡ断片に隣接する不要のＤＮＡ断片の除去；ある
いは（５） Ｂｔ２をコードするＤＮＡ断片にかなり配
列相同性をもち類似の構造を示すＤＮＡ断片の合成；又
は（６） 融合ポリペプチドを産生するために、同ポリ
ペプチドを暗号化したＤＮＡ断片に融合された（４）の
ＤＮＡ断片を含むＤＮＡ断片の構築；及び（７） 細菌
宿主に存在する植物調節配列の支配化のあるプラスミド
・ベクターへの前記（４）又は（５）又は（６）のＤＮ
Ａ断片の挿入；及び（８） 適当な補助プラスミドをも
った細菌宿主への接合（あるいは、起動）による（７）
のプラスミドの導入；及び（９） 受容体Ｔｉプラスミ
ド・ベクターをもつアグロバクテリウム・テュメファシ
ェンスへの（８）の細菌クローンの接合；及び（１０）
所望のキメラ遺伝子を含むアグロバクテリウム・テュ
メファシェンスの同定；及び（１１） （１０）のアグ
ロバクテリウム・テュメファシェンスと植物細胞の接
触；及び（１２） 適当な培養培地からの形質転換した
植物細胞の同定；及び（１３） 形質転換した植物細胞
の抽出物に存在するＢｔ２抗原の免疫学的検出

【００２１】以下の例に述べられているのとは別のクロ
ーニング・ベクターと細菌宿主菌株が用いられることが
予期される。植物細胞に移す前に組換え体プラスミドが
組込まれるｐＧＶ３８５０のようなＴｉ様ベクターはシ
ス型ベクターとして知られている。組換え体プラスミド
が存在するＴｉプラスミドに組込まれなかったり、ある
いは、天然に存在するＴｉプラスミドの大部分が欠失し
ているＴｉに基づくベクター系も又存在している。これ
らの２元型の系、（ヘケマ等、ネイチャー、第３０３
巻、１７９ページ（１９８３年））又は、ミニＴｉプラ
スミド、（フラモニド等、バイオテクノロジー、第１
巻、２６２ページ（１９８３年））も又、植物細胞へＤ
ＮＡを導入することが明らかにされている。これらのプ
ラスミドは、植物に導入される遺伝子に隣接して（少な
くとも１個、好ましくは２個）境界配列を含む。植物細
胞で選択できるあるいは、識別できるマーカーは有効で
あるが、必須ではない。そのようなプラスミドは、Ａ．
テュメファシェンスで自己複製でき、存在するＴｉプ
ラスミドへの組込みは必要ない。本発明のキメラ遺伝子
のようなＤＮＡを植物細胞へ移行するのに必要な毒性の
機能がトランスに供給される。（ヘケマ等、ネイチャ
ー、第３０３巻、１７９ページ（１９８３年））Ｒ．
Ｔ．フレーリー等、バイオテクノロジー、第３巻、６２
９ページ（１９８５年）及びクリー等、バイオテクノロ
ジー、第３巻、６３７ページ（１９８５年）を又参照さ
れたい。Ａ． テュメファシェンスは、植物へ遺伝子を
導入する唯一の方法ではない。ＤＮＡは電気細孔のよう
な物理的手段あるいはポリエチレン・グリコール（ＰＥ
Ｇ）融合のような化学的手段により導入される。本発明
のキメラ遺伝子のようなＤＮＡを導入する全ての技術が
用いうると信じられている。さらに殺虫キメラ遺伝子の
ＲＮＡコピーを導入するＲＮＡウイルスベクターも又用
いられる。さらに、以下の例に述べられているのとは別
の植物調節配列を含むプラスミド・ベクターが使用され
る。例えば、エンハンサーがキメラ遺伝子の機能を発揮
するために、その前後、あるいはそれに近接して含まれ
ていても良い。本発明の新規プラスミド・ベクターで形
質転換した植物細胞は適当な培地、望ましくは選択的生
育培地で培養され、そして、ポリペプチド毒を発現する
植物は、得られたカルスから再生される。次世代の植物
細胞及びその子孫は又、ポリペプチド毒の発現しなけれ
ばならない。形質転換した植物細胞とその子孫はバチル
ス・チュウリンゲンシスの産生するポリペプチド毒に実
質的に類似したポリペプチド毒あるいは、Ｂｔ２と実質
的な配列相同性を有するＤＮＡ断片を発現する。

【００２２】これに限定されるものではないが例えば、
形質転換された植物細胞及びその子孫は、単独であるい
は１個の構成成分として、製剤又は組成物中で使用され
る。実際の施用には、植物細胞とその子孫は、慣行殺虫
組成物及び製剤に活性物質として、あるいは固体の担体
として使用される。そのような組成物及び製剤は又、界
面活性剤及び安定剤のような助剤を含む。そのような組
成物や製剤の例には、ペースト、粉剤、水和剤、粒剤、
毒餌（ベイト）及びエアゾール組成物が含まれる。組成
物及び製剤は既知の方法で調製される。使用される形質
転換された植物体の量は、各種の要因例えば、害虫の種
類、使用された組成物又は製剤、害虫に寄生された作物
の状態、及び一般的天候条件に依存する。一般に、形質
転換された植物細胞及びその子孫は、組成物又は製剤中
の重量で約０．１から約１００％まで、好ましくは重量
で約１．０から約９９％までを構成する。ポリペプチド
毒と混用可能な既知の殺虫剤、殺菌剤、殺生物剤、除草
剤及び化学肥料などの化合物又は組成物は、付加的利益
及び利点を提供するべく、上述の組成物及び製剤中に成
分として含まれても差支えない。実際に、製剤あるいは
組成物中において単独又は１つの成分として使用する
と、ある種の鱗翅類及び／又は甲虫類の幼虫が前記の製
剤あるいは組成物で処理された植物を餌としようとす
る。その結果、少量の処理された植物体が摂取される。
製剤あるいは組成物を含む摂取物質は、害虫を殺滅する
か又はその生育を阻害するように中腸細胞膜で作用する
ポリペプチド毒を得ることのできるものに昆虫の中腸で
変化する。

【００２３】本発明の技術は一般的に以下のように遂行
された： １．Ｂ．ｔ．結晶ポリペプチドに特異的な抗体の単離と
調製 Ａ．バチルス・チュウリンゲンシス（Ｂ．ｔ．）結晶ポ
リペプチドの単離 Ｂ．Ｂ．ｔ．結晶ポリペプチドに対する（ポリクローン
及び単クローン）抗体の調製 ２．Ｂ．ｔ．ジーンバンクの作成 Ａ．Ｂ．ｔ．の全ＤＮＡ又はプラスミドＤＮＡ、好まし
くはプラスミドＤＮＡの調製 Ｂ．適当な制限酵素を用いた精製ＤＮＡの部分消化 Ｃ．適当な大腸菌プラスミド発現ベクターへのＤＮＡ断
片のクローニング ３．Ｂ．ｔ．ポリペプチド遺伝子を含む組換えプラスミ
ドの単離 Ａ．抗−Ｂ．ｔ．結晶蛋白血清を用いた大腸菌形質転換
細胞のスクリーニング Ｂ．ポリペプチドを発現する細菌クローンの同定と単離 ４．Ｂｔ２蛋白の特徴づけ Ａ．クローニングされたＢ．ｔ．遺伝子により暗号化さ
れるポリペプチドの精製 Ｂ．クローンにより発現されるポリペプチドが免疫学的
にＢ．ｔ．結晶ポリペプチドと同一であることを確認す
るための試験 Ｃ．クローンにより発現されるポリペプチドが殺虫性で
あることを確認するための試験 ５．制限酵素解析、サブクローニング及びＤＮＡ配列決
定を含むＢｔ２の地図作成とサブクローニング ６．開始ＡＴＧに先立ってある所望しない隣接するＡＴ
Ｇ３つ組暗号の除去と合成オリゴヌクレオチド・リンカ
ーを使用した適当な制限酵素切断部位の付加を含む毒遺
伝子カセットの構築 ７．中間体ベクターの構築 ８．ハイブリッドＴｉプラスミドの構築 ９．植物の操作−イムノアッセイを用いた毒を産生する
形質転換された植物組織の同定と産生された毒のレベル
の定量化

【００２４】種々の型のキメラ遺伝子（プロモーター−
遺伝子融合）が、植物細胞を遺伝子学的に形質転換をす
るのに用いられており、そして基本的には３つの異なる
型の植物特異的なプロモーターが識別される： プロモーター： １．Ｔｉプラスミド由来のプロモーター（Ｐｎｏｓ、時
々この中でＰＴＲ２として引かれているＰＴＲ） ２．植物プロモーター（Ｐｓｓｕ ｐｅａ、Ｐｓｓｕ３
０１） ３．植物ウイルスプロモーター（カリフラワーモザイク
ウイルスのＰ３５Ｓ）

【００２５】キメラ遺伝子の型： １．Ｉ型：完全なＢｔ２をコードする配列がプロモータ
ー断片の後ろに挿入されているところの直線的なプロモ
ーター−遺伝子の融合。例は、Ｐｎｏｓ−Ｂｔ２（ｐＨ
Ｄ１０５０、ｐＨＤ１０６０）、Ｐｓｓｕ ｐｅａ−Ｂ
ｔ２（ｐＨＤ１０７６）、ＰＴＲ２−Ｂｔ２（ｐＧＳ１
１６１）、Ｐｓｓｕ３０１−Ｂｔ２（ｐＧＳ１１８
１）、Ｐ３５Ｓ−１−Ｂｔ２（ｐＧＳ１２６１）、Ｐ３
５８−２−Ｂｔ２（ｐＧＳ１２７１）である。構築物の
いくつかは本来の転写物の完全な５′非翻訳領域を含ま
ない（Ｐｎｏｓ、Ｐｓｓｕ ｐｅａ）が、他は含む（Ｐ
ＴＲ、Ｐｓｓｕ３０１）。

【００２６】２．ＩＩ型：Ｂｔ２遺伝子がＲｕＢｉｓｃ
ｏの小サブユニット輸送ペプチド（Ｔｐ）配列に融合さ
れており、Ｐｓｓｕプロモーターの支配下で発現される
ところのＰｓｓｕ−Ｔｐ−Ｂｔ２キメラ遺伝子。この場
合、融合蛋白はおそらく、ｓｓｕ遺伝子の本来の翻訳開
始信号からつくられる。ヴァン・デン・ブロック等（１
９８５年）は、ＲｕＢｉｓｃｏのｓｓｕの輸送ペプチド
とＮＰＴＩＩをコードする領域との融合を用いて、植物
クロロプラストの中へ細菌のＮＰＴＩＩ蛋白が移動する
ことを示した。これらの結果から、我々はキメラ遺伝子
Ｐｓｓｕ−Ｔｐ：Ｂｔ２を構築した。Ｐｓｓｕプロモー
ターと輸送ペプチド（Ｔｐ）断片の両者は、ヴァン・デ
ン・ブロック等（１９８５年）により用いられたｐｅａ
遺伝子由来であった。連結部位のＤＮＡ配列が図２１に
示されている。ｐｅａ ｍＲＮＡの本来の５′非翻訳領
域がＰｓｓｕ−Ｔｐ：Ｂｔ２に保持されており、その結
果として、キメラ遺伝子が本当のｓｓｕ翻訳開始部位か
ら翻訳されていることは注目に値する。（ｐＨＤ１０８
０）

【００２７】ここで述べられている望み形質転換ベクタ
ーの代替の構築が又予期される。例えば、この中で明ら
かにされたのとは別の植物に特異的な異種プロモーター
が使用される。異なる異種プロモーター配列の利用は、
調節された様式での挿入された異種ＤＮＡの直接的な発
現に役に立つ。更に、バチルス チュウリンゲンシスに
よって産生されるポリペプチド・エンドトキシンをコー
ドするＤＮＡ配列データが与えられれば、ここで述べら
れているＢｔ２ＤＮＡ断片にかなり類似した人工的につ
くられたＤＮＡ断片を含む形質転換ベクターが構築でき
る。以下の実施例を挙げて説明するが、そして本発明の
技術的範囲を限定するものではないことは勿論である。

【００２８】実験 １．バチルス・チュウリンゲンシス（Ｂ．ｔ．）結晶蛋
白分離 マヒロンとデルコールにより述べられたように（ジャー
ナル・オブ・マイクロバイオロジカル・メソッド、第３
巻、第２号、６９から７６ページ、１９８４年）、結晶
は、菌株Ｂ．ｔ．ベルライナー１７１５（Ａ．クリエ博
士から受け取った、エンボ・ジャーナル第１巻、第７
号、７９１から７９９ページ、１９８２年参照）及び
Ｂ．ｔ．変種クルスタキ（ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジー、第１４５巻、第２号、１０５２ページ、１９
８１年参照）の胞子調製物から分離精製された。結晶蛋
白は、精製結晶を３７℃で２時間０．２Ｍチオグリコレ
ート、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ 、ｐＨ９．５の中でイン
キュベートすることにより可溶化され、その後、不溶物
質が低速遠心で除去された。この方法は結晶中に存在す
る蛋白の８０％以上を可溶化する。可溶化された結晶蛋
白は７．５％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミ
ドゲル（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）で分析された。Ｂｔベルラ
イナーの結晶蛋白調製物は、クマジーブリリアントブル
ーでゲルを染色した結果（図１参照）から高分子量領域
に少なくとも２つの主たる蛋白（分子量１４０Ｋｄと１
３０Ｋｄ）と約１２０Ｋｄの少量の蛋白を含んでいた。
可溶化されたクルスタキ株の結晶蛋白は１本の主たる１
３０Ｋｄ蛋白のバンドと弱い６０Ｋｄバンドを示した
（図１参照）。これらの可溶化された結晶蛋白は、以下
の５．２節に述べられた毒性試験を用いると、ピエリス
・ブラシカ（Ｐｉｅｒｉｓ ｂｒａｓｓｉｃａｅ）の第
３齢幼虫に対して強い毒性を示した（クルスタキの幼虫
に対し０．５ｎｇのＬＤ５０値及びベルライナーの幼虫
に対し０．６５ｎｇのＬＤ５０値）。

【００２９】２．Ｂ．ｔ．結晶蛋白に特異的な抗体調製 ２．１．ポリクローナル抗血清 Ｂ．ｔ．結晶蛋白（ベルライナー１７１５及びクルスタ
キ）に対する抗血清がウサギとマウスで個々に調製され
た。ヤギで調製されたＢ．ｔ．結晶蛋白（クルスタキ）
に対する抗血清は、アイダホ大学Ｌ．ブラ博士の好意に
より譲り受けた。出願人の知るかぎりでは、抗血清は、
ウサギとマウスで述べられたのと実質的に類似の既知の
方法で調製された。ウサギに等量の完全フロイントのア
ジュバント（ＣＦＡ）と混合した０．５ｍｇの可溶化さ
れた結晶蛋白調製物（ＰＢＳ ｐＨ７．４に透析した。
２５ｍｌ）が皮下注射された。３ヶ月後、ウサギは、同
じ型の調製物の別の注射を受けた、そして、３週間後、
血液試料が採取された。ＢＡＬＢｃマウスは、ＣＦＡ
（１／１容）を混合した１００μｇの結晶蛋白溶液を皮
下注射された。４から６週間後、マウスは、５０μｇの
結晶蛋白ＰＢＳの追加抗原刺激の注射を受けた、そして
４日後、血液試料が採取された。血清の抗原反応性は、
免疫拡散試験（オクタロニー試験）により確認された。
ベルライナー１７１５とクルスタキの結晶蛋白調製物の
間に強い交叉反応が観察され、これは、それらが抗原性
で関連のある成分を含んでいることを示している。マウ
スを数匹を屠殺し、細胞融合実験のために脾臓を摘出し
た。（第２．２節参照）

【００３０】２．２．モノクローナル抗体 ここに述べられている毒を発現するクローンの同定には
必須ではないが、Ｂ．ｔ．結晶蛋白に対するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマは、本来はコーラー
とミルスタインにより述べられた方法（ネイチャー、第
２５６巻、４９５から４９７ページ、１９７５年参照）
に従って生成された。免役されたＢＡＬＢｃマウスの脾
臓細胞（２．１参照）は、ＳＰ２／０ミエローマ細胞系
と融合された（Ｍ．シュルマン等、ネイチャー、第２７
６巻、２６９ページ、１９７８年）。細胞はマイクロタ
イタープレートに１穴あたり３×１０ ⁵ でまかれた、そ
して、１０から１４日後、上清２次抗体としてアルカリ
ホスファターゼで標識したヤギ抗マウス免疫グロブリン
（シグマ、Ａ−５１５３）を用いた酵素免疫測定法を用
いて抗結晶蛋白抗体の存在が検索された（エングヴァル
とペッセ、スカンジナビアン・ジャーナル・オブ・イム
ノロジー、・補遣７，１９７８年参照）。約４％のウエ
ルが抗原（結晶蛋白）に対して陽性であった。陽性クロ
ーンは限界希釈法により２度サブクローニングされた。
陽性のサブクローンが選択、生育されてモノクローナル
抗体を含むその培養上清が集められた。Ｂ．ｔ．ベルラ
イナー結晶蛋白と反応するモノクローナル抗体を産生す
る合計１７のハイブリドーマ細胞系列が生成された。

【００３１】３．Ｂ．ｔ．ベルライナー１７１５株のプ
ラスミドＤＮＡのジーンバンクの構築 Ｂ．ｔ．ベルライナー１７１５株は、共にプラスミド上
に位置する２個の関連す毒性の遺伝子を含むことをクロ
ンスタッド等（ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、
第５４巻、４１９から４２８ページ（１９８３年））が
報告した。完全なエンドトキシン遺伝子が、プラスミド
ＤＮＡのＳａｕ３Ａによる部分消化を用いて、Ｂ．ｔ．
ベルライナー１７１５株の全プラスミドＤＮＡのジーン
バンクから単離された。Ｂ．ｔ．ベルライナー１７１５
細胞がＬＢ培地（ミラー、エクスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジュネティクス（１９７２年）、コールド
・スプリング・ハーバー研究所、ニューヨーク）で、１
晩、３７℃で生育された。プラスミドＤＮＡがＢ．ｔ．
ベルライナー１７１５株から、クロンスタッド等により
述べられた変性−復元法（ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジー、第５４巻、４１９から４２８ページ（１９８
３年））を用いて単離された。０．５％アガロースゲル
でのプラスミドＤＮＡの分析は、このプラスミドＤＮＡ
の調製品が異なる分子濃度で存在する数種類の異なるプ
ラスミドを含むことを示した。ジーンバンクを構築する
ために、プラスミドＤＮＡ３０μｇが総量５００μｌで
３７℃でＳａｕ３Ａを用いて部分消化された。１００μ
ｌの試料がインキュベーションのそれぞれ１０、２０、
３０、４５及び６０分後に回収されて、フェノール−ク
ロロホルムで抽出された。

【００３２】Ｓａｕ３Ａで消化したＤＮＡは、１０から
４０％ショ糖密度勾配で大きさにより分画された、そし
て異なる分画のＤＮＡ断片の大きさが０．８％アガロー
スゲルで算出された。６から１０Ｋｄの大きさの範囲の
ＤＮＡを含む画分が回収され、ＢｇｌＩＩで消化された
ｐＥｃｏＲ２５１ベクターＤＮＡに連結された。ｐＥｃ
ｏＲ２５１プラスミドは、図２にあらわしたようにプラ
スミドｐＬＫ５（ザベアウとスタンレー、エンボ・ジャ
ーナル第１巻、１２１７から１２２４ページ（１９８２
年））由来のＰ_R プロモーター断片に融合されたキメラ
のＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼ遺伝子によりＥｃｏＲ
Ｉ−ＰｖｕＩＩ断片が置き換えられているプラスミドｐ
ＢＲ３２２の誘導体である。ｐＥｃｏＲ２５１はＥｃｏ
ＲＩエンドヌクレアーゼ遺伝子の中に１ケ所ＢｇｌＩＩ
部位を含み、そこへの挿入は遺伝子を不活化する。ｐＥ
ｃｏＲ２５１ベクターは、チエンとモードリッチにより
述べられた陽性選択クローニング媒体ｐＳＣＣ３１（ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１５４巻、１０
０５から１００８ページ、１９８３年参照）に類似した
自殺ベクターである。Ｓａｕ３ＡＤＮＡ断片がＢｇｌＩ
Ｉで消化されたｐＥｃｏＲ２５１に連結された。組換え
体プラスミドは、ダジエートとエーリッヒ（ジーン、第
６巻、（１９８０年）２３から２８ページ参照）により
述べられているように、大腸菌Ｋ５１４株感応細胞（コ
ールソン等、ジェネティクス第５２巻、１０４３から１
０５０ページ、１９６５年参照）に連結混合物を形質転
換することにより選択された。細胞は、アンピシリン
（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地（ミラー、エ
クスペリメンツ イン・モレキュラー・ジェネティクス
（１９７２年）、コールド・スプリング・ハーバー研究
所、ニューヨーク）にひろげられた。６００から１５０
０の組換え体クローンをそれぞれ含むいくつかのジーン
バングが構築された。１２個のでたらめに選んだクロー
ンに存在する組換え体プラスミドの解析は、１２クロー
ンのうち少なくとも１０個のジーンバンクそれぞれに５
から１５Ｋｂの範囲の大きさをもつ挿入断片が含まれる
ことを確認した。

【００３３】４．Ｂ．ｔ．結晶蛋白遺伝子を含む組換え
体プラスミドの単離 ジーンバンクのコロニーが、精製されたＢ．ｔ．ベルラ
イナー結晶蛋白に対して生じたウサギ血清を用いて、結
晶蛋白を産生する細菌について検索された（上記２．１
節を参照）。使用された方法は、ヘルフマン等（プロシ
ーデングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス・オブ・ＵＳＡ 第８０巻、３１から３５ペー
ジ、１９８３年参照）のものをわずかに修正したもので
ある。１５０ｍｍ平方のペトリ皿で生育した細菌コロニ
ーは、ニトロセルロースシート（シュライヒャー＆シュ
エル製０．４５μｍ、Ｎｏ．４０１１９６）上にレプリ
カされた。シートはコロニーが溶出するまで０．１Ｍ
ＮａＯＨに浸された。シートはそれから風乾され、３０
分間リン酸緩衝食塩水（ＰＭＳ）ｐＨ７．４で洗浄さ
れ、そして、１％粗オブアルブミン（シグマ、Ａ−５２
５３）を含むＰＢＳ中でゆっくり攪拌しながら、４℃で
１晩あるいは室温で２時間インキュベートされた。ニト
ロセルロースシートは、ＰＢＳで洗浄されて、ＰＢＳ、
１％オブアルブミン、０．２％トリトンＸ−１００で希
釈したウサギ抗結晶血清中で、ゆっくり攪拌しながら室
温で２時間インキュベートされた。さらにシートを洗浄
した後、パーオキシダーゼで標識したヤギ抗−ウサギ抗
体（シグマ、Ａ−６１５４）で（室温、２時間）インキ
ュベートされた。充分にＰＢＳ／０．２％トリトンで洗
浄した後、シートは、基質溶液で反応された（基質は４
−クロロ−１−ナフトール、シグマ、Ｃ−８８９０であ
った）。陽性コロニーは暗青色の点として現像された。
精製された結晶蛋白溶液の一連の希釈を用いて、この試
験の検出限界は１から１０ｎｇの蛋白／ｍｌと算出され
た。結局、４個の異なる免疫陽性クローンがジーンバン
ク（遺伝子銀行）１２５０クローンから単離された。プ
ラスミドＤＮＡがザベアウとスタンレー、エンボ・ジャ
ーナル、第１巻、１２１７から１２２４ページ、１９８
２年の方法に従ってそれぞれのクローンから調製され
た。最初の制限酵素地図が、単一及び同時の制限酵素消
化をおこなうことにより構築された。酵素ＥｃｏＲＩ、
ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＳａｃＩ、ＭｌｕＩ及びＰｓ
ｔＩの制限酵素地図の比較（図３参照）から、４個のプ
ラスミド全てが、明らかな領域の重複を示した異なる大
きさのＤＮＡ断片をもっていることが明らかとなった。
これらの結果は、Ｂｔ２遺伝子が４個の異なる組換え体
プラスミドに共通の４．２Ｋｂの領域により暗号化され
ることを示す。続く研究で、Ｂ１２クローンの７．５ｋ
ｂＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片（図３参照）をプラスミド
ｐＵＣ８（Ｊ．ビエラとＪ．メッシング、ジーン、第１
９巻、２５９から２６８ページ、１９８２年参照）にサ
ブクローニングし、この組換え体プラスミドをｐＢｔ２
００と命名した。

【００３４】５．Ｂｔ２蛋白の特徴づけ ５．１．ｐＢｔ２００により暗号化される１３０ｋｄ結
晶蛋白の同定 ｐＢｔ２００プラスミドを含む大腸菌Ｋ５１４株（第４
節参照）は、コロニー試験に強い陽性反応を示した。こ
のことはさらに、酵素免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ）（エ
ングバルとペッセ、１９７８年、スカンジナビアン・ジ
ャーナル・オブ・イムノロジー、付録７参照）を用いて
確認された。ＥＬＩＳＡ検索で以下の方法が用いられ
た：ヤギ抗Ｂｔ結晶蛋白抗体でコートした柔軟なポリビ
ニルのマイクロタイター・プレートが、細菌コロニーの
無細胞抽出液と共にインキュベートされた（無細胞抽出
液は、細胞のかたまりを凍結−融解し、続いて、０．１
ＭＮａＯＨ中での１５分間のインキュベーションと続く
０．１Ｍ ＨＣｌでの中和により得られた）。洗浄後、
希釈したウサギ又はマウスの抗Ｂ．ｔ．結晶蛋白血清が
添加された。１から２時間のインキュベーションの後、
プレートを洗浄し、（適当に希釈した）ウサギ又はマウ
スの抗Ｂ．ｔ．結晶血清でインキュベートした。１から
２時間のインキュベーションの後、プレートを洗浄し、
アルカルホスファターゼ標識したヤギ抗ウサギ又は抗マ
ウスＩｇＧ（シグマＡ−８０２５、Ａ−５１５３）でイ
ンキュベーションをおこなった。インキュベーションと
洗浄の後、基質（ｐ−ニトロフェニルホスフェート、シ
グマ１０４−１０５）を添加し、反応を４０５ｎｍで吸
光度（Ｏ．Ｄ．）を測定することでモニターした。精製
された可溶化結晶蛋白の試験の検出限界は１ｍｌあたり
０．１から１ｎｇの範囲であると算出された。

【００３５】ｐＢｔ２００をもつ大腸菌の全細胞蛋白抽
出物は、ＳＤＳ ＰＡＧＥで分析された。強く新しい蛋
白のバンドが、分子量約１３０ｋｄに相当する高分子量
範囲で見られるようになった。このバンドは、挿入をも
たないｐＵＣ８ベクタープラスミドを含むＫ５１４細胞
には存在しなかった。この新しい蛋白は又、ＳＤＳＰＡ
ＧＥで、Ｂ．ｔ．ベルライナーの主たる結晶蛋白の１つ
及び、Ｂ．ｔ．クルスタキの主たる結晶蛋白と共に移動
した（図４参照）。Ｂｔ２と呼ばれるこの蛋白とＢ．
ｔ．結晶蛋白との関係は、イムノブロッティングにより
確認された。ウエスタン・ブロッティング実験が、ウサ
ギ抗Ｂｔクルスタキ結晶血清とウサギ抗Ｂｔベルライナ
ー結晶血清の両方を用いておこなわれた。両方の抗血清
でＢｔ２蛋白の強い反応が観察された（図５及び図６参
照）。これらの結果は、クローニングされたＢｔ２遺伝
子が、Ｂ．ｔ．クルスタキの１３０ｋｄ結晶蛋白と免疫
学的に関連するＢ．ｔ．ベルライナーの結晶蛋白の１個
をコードすることを示す。細菌抽出物の陽性反応物質の
量は、ＥＬＩＳＡ試験で定量された。標準物質として精
製した結晶蛋白を用いて、ｐＢｔ２００をもつ大腸菌で
産生される結晶蛋白の量は、全細胞蛋白含量の５から１
０％の範囲と概算された。この概算は、クマジーブルー
で染色した後のＳＤＳ ＰＡＧＥのＢｔ２蛋白バンドの
バンドの強さとよく一致する。（Ｂｔ２蛋白と命名され
た）ｐＢｔ２００プラスミドにより暗号化される１３０
Ｋｄ蛋白をさらに特徴づけるために、蛋白の相対的な不
溶性を利用した迅速な精製方法を開発した。Ｋ５１４
（ｐＢｔ２００）の２リットル１晩培養から得られる５
ｇの細胞を５０ｍｌの５０ｍＭ ＴＲＩＳ ｐＨ７．
９、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、１５％ショ糖に懸濁し、リゾ
チーム（１００μｇ／ｍｌ）で処理し、超音波処理（ラ
ブソニック１５１０、４００ワットで３０分）し、２０
０ｍｌの２％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳ ｐＨ７
と混合して、３０分間氷中でインキュベートした。無細
胞抽出液を１５０００ｇで遠心し、上清を除去した。Ｂ
ｔ２蛋白を含む沈澱を同じ緩衝液に再懸濁し、方法をく
り返した。その後、沈澱を２度、２００ｍｌのＰＢＳで
洗浄した。Ｂｔ２蛋白を可溶化するために、沈澱を５０
ｍｌの抽出緩衝液０．２Ｎチオグリコレート及び０．１
Ｍ ＮａＨＣＯ₃ 、ｐＨ９．５に２時間３７℃で再懸濁
した。この方法で、Ｂｔ２蛋白の効率の良い（＞９０
％）そして選択的な可溶化が達成された（図７）。

【００３６】これらの準精製された蛋白標品が続く研究
に利用された。２．１節で述べたような類似の免疫手順
を用いて、ウサギとマウスでＢｔ２蛋白に対する抗血清
を作成した。これらの抗血清は、上述のＥＬＩＳＡ試験
で、Ｂｔ２自身同様Ｂｔベルライナーとクルスタキの可
溶化された結晶蛋白と等しく十分に反応した（図８はマ
ウス血清での結果を示す）。類似の陽性反応が、Ｂｔ２
の免疫吸着剤（ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ、（フ
ァルマシア製）に共役させたＢｔ２蛋白）のアフィニテ
ィークロマトグラフィーで抗Ｂｔ結晶血清から生成され
た抗体を用いて観察された。これらの抗体は又、Ｂ．
ｔ．ベルライナーとクルスタキの結晶両方に存在する１
３０Ｋｄ蛋白でのウエスタン・ブロッティングで反応し
た。最終的に、ＥＬＩＳＡで、全Ｂ．ｔ．ベルライナー
結晶蛋白に対してつくられた１７個のモノクロナール
（単クローン）抗体のうち９個が又、Ｂｔ２蛋白と反応
した。（コード番号：１Ｆ６、１６７、４Ｄ６、４Ｆ
３、８Ｇ１０、１０Ｅ３、１．７、４．８、Ｃ７３）
（図９）同じ９個の抗体は又、Ｂ．ｔ．クルスタキ結晶
蛋白と反応した。一般に、Ｂｔ２蛋白とＢ．ｔ．の主た
る１３０Ｋｄ結晶蛋白の両者は、完全に可溶化するため
に、アルカリ性ｐＨと還元剤の存在を必要とする。又、
両者は、ｐＨ４から５で沈澱する。それ故、クローニン
グした遺伝子産物Ｂｔ２は、Ｂ．ｔ．ベルライナーと
Ｂ．ｔ．クルスタキの主たる１３０Ｋｄ結晶蛋白の生化
学的性質と類似の性質を示し、免疫学的にこれらの結晶
蛋白と関連している。

【００３７】Ｂｔ２蛋白はさらに、ＤＥＡＥイオン交換
クロマトグラフィーとセファクリルゲル濾過により精製
された。この精製蛋白のアミノ末端配列がヘウイック等
による操作方法で（ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー、第２５６巻、７９９０から７９９７ペ
ージ、１９８１年参照）気相シーケンサー（アプライド
・バイオシステムズ）を用いて決定された。最初の２０
個のＮ末端アミノ酸配列は、クローニングされたＢ．
ｔ．クルスタキ遺伝子のＤＮＡ配列から推定されるＮ末
端の配列と実質的に同一であることがわかった（ウォン
等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第２５８巻、（第３号）１９６０から１９６７ペー
ジ（１９８３年）参照）（図１０）。

【００３８】５．２ Ｂｔ２蛋白の昆虫毒性 Ｂ．ｔ．の結晶は、ある種の鱗翅目の幼虫に対して著し
い毒であることが知られている。Ｂｔ２蛋白が類似の毒
性を示すかを試験するために、毒性試験がキャベツ蝶ピ
エリス・ブラシカの幼虫におこなわれた。ｐｐｍ（１ｐ
ｐｍ＝１μｇ／ｍｌ）であらわされる既知濃度の蛋白溶
液が水で連続的に希釈された。新鮮なキャベツの葉から
小さなディスク（０．２５ｃｍ² ）が切り取られ、それ
ぞれのディスクに、試験溶液５μｌが添加された。ディ
スクを風乾し、それぞれのディスクを１匹の幼虫が入っ
ているバイアルの中に入れた。第３齢幼虫は、Ｐ．ブラ
シカの同調培養から得られた。脱皮前の１０時間、これ
らの幼虫は、食物抜きで個個のバイアルで培養された。
脱皮後直ちに幼虫は１枚の葉のディスクを与えられる。
第１のディスクが消費されると、幼虫は試料のついてい
ない新鮮なディスクを与えられる。それぞれの試料希釈
について、５０匹の幼虫が試験された。２４時間ごと１
２０時間まで食物摂取と生存率がモニターされた。表１
に見られるように、Ｂｔ２試料標品は、Ｂ．ｔ．ベルラ
イナー１７１５の可溶化した結晶と同程度のＰ．ブラシ
カ幼虫に対する毒性を示した。

【００３９】Ｐ．ブラシカの幼虫の生育に対するＢｔ２
トキシンの半致死投与量の効果を試験するために、次の
実験計画が使用された：キャベツの葉を既知の濃度Ｂｔ
２蛋白（０．０１から１ｐｐｍ）を含む溶液に浸し、そ
して乾燥された。同調培養した１００匹の第３齢幼虫の
グループにＢｔ２をコートした葉が餌として与えられ
た。葉は定期的に同じ方法で処理された新しい葉に置き
換えられた。幼虫の生育は、３から５齢進むのに必要な
時間に相当する７日間にわたって追跡された。表２にあ
らわされている結果から見られるように、Ｂｔ２蛋白
は、半致死の投与量でＰ．ブラシカ幼虫の生育をかなり
阻害した。生育の阻害は、１ｇ葉あたり２．６７ｎｇ蛋
白に相当する０．０１ｐｐｍの濃度で明らかであった。
最初の４８時間に、０．０１ｐｐｍでコートした葉を与
えられた幼虫は、３．６ｃｍ² の葉（８３ｍｇ）を食
べ、その結果として、Ｂｔ２蛋白０．２２ｎｇを摂取し
た。この時点で、９３％の幼虫が今だに第３齢段階であ
った、一方、対照の幼虫では３３％だけがこの段階であ
った。それ故、生育に対する阻害効果はＬＤ₅₀値（１．
６５ｎｇ／幼虫、表１を見よ）をかなり下回る毒投与量
で観察される。これらの結果は、Ｐ．ブラシカに対して
昆虫耐性を発現するために、形質転換した植物細胞で、
どれほどのレベルのＢｔ２蛋白合成に達しなければなら
ないかを示す。組織１ｇ当り２．７ｎｇ Ｂｔ２蛋白の
レベルが幼虫の生育を遅らせるのに十分である。これは
すでに、それ自体で野外での幼虫の破壊的な拡がりを止
めるのに適当である。Ｂｔ２蛋白を用いた毒性試験は
又、スズメガ科のガの幼虫（マンデュカ・セクスタ）に
もおこなわれた。表３に示したように、Ｂｔ２蛋白は、
全ベルライナー結晶蛋白よりわずかに毒性が強かった
（１２．５ｎｇ／ｃｍ ² で１００％死亡）。さらに、か
なりの生育阻害が半致死投与量（２．５ｎｇ／ｃｍ² ）
で観察される：対照の幼虫が３０．５ｍｇというのに比
較して、７日後４．４ｍｇの体重。マンデュカは人工飼
料を与えられているという事実のため（参照：Ｒ．Ａ．
ベルとＦ．Ｇ．ヨアヒム（１９７６年）アニュアル・エ
ントモロジー・オブ・ソサイエティ・オブ・アメリカ第
６９巻、３６５から３７３ページ）、結果はいくらか異
なって、即ち寒天培地１ｃｍ² あたりに添加されたｎｇ
毒としてあらわされている。

【００４０】６．Ｂｔ２遺伝子の特徴づけ ｐＢｔ２００プラスミドの７．２Ｋｂ ＢａｍＨＩ−Ｐ
ｓｔＩ断片上のＢｔ２毒遺伝子の位置を決定するため
に、一連の欠失が７．２Ｋｂ ＤＮＡ断片にそれぞれＨ
ｐａＩ、ＫｐｎＩ、及びＩｂａＩを用いてつくられた。
これらの欠失プラスミドにより暗号化される蛋白は、Ｅ
ＬＩＳＡ技術とウエスタン・ブロッティング（又、ここ
ではイムノブロッティングと称す）（トービン等、プロ
シーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ
・サイエンス・オブ・ＵＳＡ、第７６巻、４３５０から
４３５４ページ、１９７９年とＷ．Ｎ．バーネット、Ａ
ｎ．バイオケミストリー、第１１２巻、１９５から２０
３ページ、１９８１年参照）を用いて、免疫学的に分析
された。（図１１に示してある）結果は、以下のように
要約される：（１）ＨｐａＩ断片の欠失により、完全な
Ｂｔ２蛋白の合成がより低レベルとなる。この発見は、
欠失が調節領域影響を与えるだけで、構造遺伝子には影
響を与えないことを示す。（２）Ｋｐｎ断片の欠失は、
イムノブロッティングにより検出することのできる±７
０Ｋｄ蛋白断片を生成する。（３）５′端近くのＸｂａ
欠失は、ウエスタン・ブロッティング法で検出できる蛋
白断片を生じない。これらの結果は、１３０Ｋｄ蛋白を
暗号化する完全な遺伝子は、４．３ＫｂのＨｐａＩ−Ｐ
ｓｔＩ断片に位置していることを示す（図１１を参
照）。Ｂｔ２遺伝子の正確な構造を決定するために、４
０６０塩基対（ｂｐ）のＨｐａＩ−ＮｄｅＩ断片の完全
なヌクレオチド配列をマキサムとギルバートの配列決定
法で決定した。用いたシーケンシングの手順は図１２に
あらわされている。提案ヌクレオチド配列は、相補鎖を
シーケンシングすることにより主として確定された。配
列を調べると、１４１番目の位置から始まって３６０５
番目で終わる分子量１２７Ｋｄをもつ１１５５アミノ酸
の蛋白をコードすることができる単一の大きさな読み取
り枠の存在が明らかとなった。これは、ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電暗号化することがわかった。

【００４１】７．“トキシン遺伝子”カセットの構築 ７．１．完全なＢｔ２遺伝子をもつカセットの構築 Ｂｔ２遺伝子のＤＮＡ配列を調べて、ＡＴＧ翻訳開始コ
ドンのすぐ上流１６０ｂｐ領域には、５個のＡＴＧ３つ
組暗号を含むことが明らかとなった。通常真核生物遺伝
子の翻訳は、メッセージの最初のＡＵＧから始まる（Ｒ
ＮＡではＵがＴに置き換わる）。これらのＡＵＧ３つ組
暗号は、開始ＡＵＧとして作用し、そして、本物のＢｔ
２開始コドンとして優先的に認識され、それ故、形質転
換された植物細胞で発現のレベルを減じることができ
る。さらに、これらのＡＵＧは、他の読み取り枠の中で
あり、ナンセンス・ポリペプチドを生じる。これらのＡ
ＵＧ３つ組暗号からの翻訳の開始を妨げるためにＢｔ２
遺伝子の配列上流は、Ｔｉ発現ベクターへｐＢｔ２遺伝
子を挿入する前に、エンドヌクレアーゼ処理をすること
で、削除された。この結果、開始ＡＴＧまで上流配列が
欠失したｐＢｔ２００プラスミドの欠失誘導体が構築さ
れた。ｐＢｔ２００ＤＮＡ３５μｇをＨｐａＩで消化
し、１２ｍＭ ＭｇＣｌ₂ 、１２ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、
０．６Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−ｐＨ８．０ ３００μｌの中で、６
単位のＢａｌ３１エキソヌクレアーゼ（バイオラボ、ニ
ューイングランド）処理を１、１．３０、２、２．３０
及び３分間、３０℃でおこなった。それぞれの反応のＢ
ａｌ３１処理分子１μｇを０．１３μｇのリン酸化Ｂａ
ｍＨＩリンカー（バイオラボ、ニューイングランド）に
４℃でＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位を用いて合計２０μｌ
にて連結した。

【００４２】Ｔ４リガーゼを６８℃１０分間不活性した
後、それぞれの連結混合物を２０単位のＢａｍＨＩで３
７℃１時間消化した。続いて、５０ｎｇ ＤＮＡを合計
１００μｌの中で０．１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用
いて４℃２０時間再環状化した。この連結混合物の１／
５が大腸菌Ｋ５１４株の感応細胞（コールソン等、ジェ
ネティクス、第５２巻（１９６５年）１０４３から１０
５０ページ）にタジェートとエーリッヒが述べたように
（ジーン、第６巻（１９８０年）、２３から２８ペー
ジ）形質転換された。この大腸菌を、カルベニシリン
（１００μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地（ミラー、エ
クスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティク
ス、（１９７２年）コールドスプリング・ハーバー研究
所、（ニューヨーク）を用いて平板培養した。プラスミ
ドの欠失の端の点が最初に、新しく生成した組換え体プ
ラスミドのＥｃｏＲＩ断片の大きさを２％アガロースゲ
ル上で測定することにより分析された。Ｂｔ２遺伝子の
開始点直前で終わっている欠失をもつプラスミドの正確
な欠失の端の点のヌクレオチド配列が決定された。クロ
ーニングされたｐＨＤ１００は、開始ＡＴＧの前８ｂｐ
で終わる欠失をもち、全ての上流にある非開始ＡＴＧを
削除してある。クローニングされたｐＢａ３．３は、コ
ーディング配列の４番目の塩基対に融合されたＢａｍＨ
Ｉリンカーを含み、そして、クローニングされたｐＢａ
２３−３は、−３３の塩基対に融合されたＢａｍリンカ
ーを含む。

【００４３】第２の操作段階で、トキシン遺伝子の３′
末端の非コーディング配列がＢａｌ３１エキソヌクレア
ーゼ（バイオラボ、ニュー・イングランド）を用いて削
除された。ｐＨＤ１００プラスミドＤＮＡ３０μｇをＮ
ｄｅＩで消化し、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼで３０
℃、３、４、５、６、及び８分間緩衝液中で処理した。
それぞれの時間間隔のところで、（それぞれ、Ｂａｌ３
１処理したＤＮＡ分子６μｇを含む）６０μｌを取り出
した。リン酸化ＢｇｌＩＩリンカー（バイオラボ、ニュ
ーイングランド）をＢａｌ３１処理したＤＮＡ分子に加
えた後、ＤＮＡ分子は、０．１単位Ｔ４リガーゼで４℃
１晩再環状化された。連結混合物は、大腸菌Ｋ５１４株
感応細胞（コールソン等、ジェネティクス、第５２巻
（１９６５年）、１０４３から１０５０ページ）に、ダ
ジエートとエーリッヒが述べたように（ジーン、第６
巻、（１９８０年）２３から２８ページ）、形質転換さ
れた。大腸菌は、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）
を添加したＬＢ培地（ミラー、エクスペリメンツ・イン
・モレキュラー・ジェネティクス（１９７３年）コール
ド・スプリング・ハーバー研究所、ニューヨーク）を用
いて平板培養した。制限酵素消化とアガロースゲル電気
泳動を用いた数種のプラスミドの欠失の大きさの決定の
後、ｐＨＤ１６０、ｐＨＤ１６２、ｐＨＤ１６３が続く
研究のために維持された。ｐＨＤ１６０では、ＢｇｌＩ
Ｉ部位が、Ｂｔ２遺伝子のＴＡＡ停止コドンのうしろ約
３００ｂｐの位置にある；ｐＨＤ１６２では、ＢｇｌＩ
Ｉは、ＴＡＡのうしろ±２５０ｂｐであり、ｐＨＤ１６
３では、ＢｇｌＩＩはＢｔ２コーディング配列の３３４
２（ｂｐ）の位置にある。ｐＨＤ１６０の構築が模式的
に図１５にあらわされている。この様にして、Ｔｉ発現
ベクターのＢａｍＨＩ部位に削除され挿入されるＢａｍ
ＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片上にＢｔ２遺伝子をもつトキシン
遺伝子カセットを構築した。ｐＨＤ１６４を構築するた
めに、コーディング配列の５′端を含むｐＨＤ１６０の
ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片が、ｐＢａ３．３の相当する
ＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断片と置き換えられた。ｐＨＤ１
５９を構築するために、ｐＨＤ１６３のＢａｍＨＩ−Ｓ
ａｃＩ断片が、ｐＢａ３．３のＢａｍＨＩ−ＳａｃＩ断
片に置き換えられた（図１６）。プラスミドｐＤＣ３を
作出するために（図１６）、プラスミドｐＨＤ１６４を
ＤｒａＩで消化し、ＢｇｌＩＩリンカーに連結し、Ｂｔ
２遺伝子を含む断片がｐＬＫ５７のＢｇｌＩＩ部位にク
ローニングされた（図１７）。この様にして、ＢａｍＨ
Ｉ−ＢｇｌＩＩカセットのＢｇｌＩＩ部位が、Ｂｔ２の
ＴＡＡ停止コドンの近接した位置に置かれた。

【００４４】７．２．操作されたＢｔ２遺伝子を含むカ
セットの構築 ７．２．１ 理由づけ Ｂ．ｔ．結晶蛋白の機能的性質に関する基礎的研究の結
果は、±１３０Ｋｄの大きさの結晶蛋白は相対的に不溶
性で、さらに、昆虫に対して毒性効果を発揮することの
できる低分子量の活性毒に変換するためは昆虫の中腸で
プロセシングを必要とする前駆毒である（Ｌ．Ａ．ブラ
・ジュニア、Ｄ．Ｂ．ベクテル、Ｋ．Ｊ．クラマー、
Ｙ．Ｉ．シェトナ、Ａ．Ｉ．アロンソン及びＰ．Ｃ．フ
ィッツージェームス、１９８０年、レビュー・オブ・マ
イクロバイオロジー、第８巻、１４７から２０３ペー
ジ；Ｌ．Ａ．ブラ・ジュニア、Ｋ．Ｊ．クラマー、Ｄ．
Ｊ．コックス、Ｂ．Ｌ．ジョーンズ、Ｌ．Ｉ．ダビッド
ソン及びＧ．Ｌ．ロックハート、１９８１年ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５６巻、
３０００から３００４ページ；Ｔ．Ａ．アングス、カナ
ディアン・ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジー、
第２巻、４１６ページ（１９５６年）；Ｍ．Ｍ．レカデ
ット、“マイクロバイアル・トキシンズ”第ＩＩ巻、
Ｔ．Ｃ．モンティー＆Ｓ．カディス編、アカデミック・
プレスＩｎｃ．ニューヨーク＆ロンドン、１９７０年、
４３７から４７１ページ参照）。操作された植物体の構
成物の部分として昆虫に摂取されたときのＢｔ毒の比活
性は、存在する毒の総量によるだけでなく、中腸に放出
される活性毒の利用の程度により決定された。ある昆虫
が、Ｂ．ｔ．前駆毒を可溶化し／又は“プロセシング
（酵素的分解）することについて、他よりもより有効で
あることが示されている（“第２回ワークショップ、細
菌蛋白毒素”でのＰ．ルーシー博士の発表、ウエピオ
ン、ベルギー：１９８５年６月３０日から７月４日；会
議録として刊行される）。それ故、１）充分な毒活性を
示すすでにプロセシングされたか、部分的にプロセシン
グをうけた毒及び２）本来のＢｔ２蛋白よりも可溶であ
る性質をもつＢｔ２由来のサイズの小さい毒を構築する
ための昆虫耐性植物の操作に有利である。そのようなサ
イズの小さいポリペプチドを発現する植物は、同レベル
で完全なＢｔ２を発現する植物より昆虫に対して高い特
異的な毒性を示す。

【００４５】７．２．１ 欠失変異体の構築 １．Ｐ_L プロモーターのうしろのトキシン遺伝子の位置 Ｂ．ｔ．ベルライナー１７１５の１３０Ｋｄ結晶蛋白毒
をコードする遺伝子が、ｐＢｔ２００を生ずるようにｐ
ＵＣ８（ヴィエラとメッシング、ジーン、第１巻、２５
９から２６８ページ、１９８２年）にクローニングされ
た。Ｂｔ２と呼ばれるこの遺伝子と得られたトキシン
（Ｂｔ２蛋白）の特性が５節及び６節に述べられてい
る。大腸菌で調節できる、高レベルの発現を確約するた
めに、Ｂｔ２遺伝子がＰ_Lプロモーターのうしろに置か
れた（図１７）。７．７Ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断
片上にＢｔ２遺伝子をもつプラスミドｐＢｔ２００が、
ＨｐａＩで切断され、Ｂａｌ３１で処理され、ＢａｍＨ
Ｉリンカーに連結され、ＢａｍＨＩで切断され、（７．
１節に述べられているように）自己連結された。得られ
たクローンから、各種の長さの上流配列をもつ欠失誘導
体が選択され、発現プラスミドｐＬＫ５４（図１７及び
ボッターマン等、ジーン、１９８６年（印刷中）参照）
のＰ_Lプロモーターのうしろに、制限酵素ＢａｍＨＩと
ＰｓｔＩを用いて挿入された。得られたプラスミドは、
Ｂｔ２蛋白の生産が評価されて、ｐＬＢ１０と命名され
たＢｔ２を高産生するプラスミドの１個が続く研究のた
めに選択された。プラスミドｐＬＢ１０はｐＢａ２３−
３から始まる（図１７、７．１節参照）。

【００４６】２．欠失の構築 以前ｐＢｔ２００にＸｂａＩとＫｐｎＩでつくられた内
部欠失から、ＫｐｎＩ欠失のみが、免疫学的に検出でき
るＢｔ由来蛋白を生ずる（第６節参照）。欠失がｐＬＢ
１０に制限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩを用いてつく
られた。ウエスタンブロッティング分析とＥＬＩＳＡ
は、Ｂｔ２遺伝子の最初から２１６７の位置にひろがる
大きな断片を含むＫｐｎＩ欠失変異体のみ安定な約８０
Ｋｄのポリペプチドを産生することを示した。Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ欠失誘導体により暗号化されているポリペプチド
はおそらく大腸菌プロテアーゼに高感受性である。興味
深いことに、ポリペプチドを暗号化するＫｐｎＩ欠失変
異体は、完全なＢｔ２蛋白と等価の殺虫活性を示した：
１つの実験において、第３齢のＰ．ブラシカ幼虫に対す
るＬＤ₅₀値は、完全なＢｔ２での２ｎｇ／幼虫と比較し
て、Ｋｐｎ欠失変異体で２．５ｎｇ／幼虫と決定され
た。この結果は、ＫｐｎＩ欠失から生ずるサイズの小さ
いＢｔ２遺伝子産物が完全な活性トキシン単位を含むこ
とを示している。以前のデータは、活性トキシンを暗号
化するＢｔ２の小さな遺伝子断片は、ＫｐｎＩ欠失断片
の中に含まれるが、ＨｉｎｄＩＩＩ部位よりさらに拡が
っていることを示している。活性トキシンをコードする
最小の断片の正確な端点をマップするために、大きさを
減じたＮ末端断片を含む欠失変異体が構築された。これ
を達成するために、欠失変異体を構築できるような方策
を用いた。その結果、図１９に表わしており、コーディ
ング領域の端点がＨｉｎｄＩＩＩ部位により近くなると
徐々に安定なポリペプチドの検出が減じることを示して
いる。

【００４７】依然としてＨｉｎｄＩＩＩの下流のある位
置から、Ｂｔ２様蛋白がほとんど検出できなくなった。
さらに、これらのクローンの抽出物質の毒性は、３′末
端がＨｉｎｄＩＩＩとＫｐｎＩの間の特定の位置を通り
過ぎると突然おちる。最少毒性ポリペプチド（ｐＬＢ８
７９）と最大非毒性ポリペプチドとで特徴づけられる２
つのクローンがＤＮＡ配列分析により証明された。この
分析は安定な活性トキシンの正確な端点は、Ｂｔ２遺伝
子の１７９７と１８２０の間に位置することを示した
（図２０参照）。それ故、１８２０（ｂｐ）の下流でお
わるＢｔ２の全てのＮ末端の遺伝子断片は、活性トキシ
ンを暗号化する遺伝子断片を含む。興味深いことに、あ
るクローン（ｐＬＢ８２０）の全細胞抽出物は、ポリク
ローン抗血清と単クローン抗体を用いたウエスタン・ブ
ロッティングでより強い反応を示した。さらに、このク
ローンにより産生される蛋白は、ＫｐｎＩ欠失遺伝子産
物より大腸菌でより可溶性で、充分の毒性活性を示し
た。

【００４８】８．毒素遺伝子を含む中間体発現ベクター
の構築 ８．１．概略 構築されて、植物形質転換実験に用いられた操作プラス
ミドのあらましを表５に示した。それぞれの操作された
Ｔｉプラスミドは、中間体ベクターを伴った受容体Ｔｉ
プラスミドの組込みの結果である。それぞれの中間体ベ
クターは、支持された発現ベクター由来の植物プロモー
ター配列とＢｔ遺伝子カセットから成るキメラの毒素遺
伝子を含む。キメラ遺伝子の組み立て 表５には、Ｂｔ遺伝子カセットが分離されるプラスミド
を示す。これらのプラスミドの構築は前部分に述べられ
ている。表５にあげられている発現ベクターの詳細な地
図が図２６（ＡからＪ）に示されている。ｐＨＤ２０５
とｐＨＤ２０８に存在する２個のキメラ遺伝子の詳細な
構築が例として述べられている。実験方法は、標準的な
組替えＤＮＡ技術を利用し、実験手順は、マニアティス
（コールド・スプリング・ハーバー、１９８２年）に従
っておこなった。 使用された異なる植物プロモーターは（表５）： Ｐｎｏｓ：ノパリン合成酵素遺伝子を暗号化するＴ−Ｄ
ＮＡ由来の構成的で比較的弱いプロモーター。 Ｐｓｓｕ−ｐｅａ：エンドウマメのリブロース２リン酸
カルボキシラーゼ遺伝子の小サブユニットのグループの
弱く発現されるメンバー由来。発現は緑組織でわずかに
誘導的である。 ＰＴＲ２：オクトパインＴｉプラスミドのＴ_R −ＤＮＡ
由来の構成的プロモーター（ベルテン等、１９８４年、
エンボ・ジャーナル、第３巻、２７２３ページ）。発現
ベクターｐＧＳＨ１５０とｐＧＳＨ１６０では、２元的
プロモーター断片はｐｏｐ４４３由来である（ベルテン
等、１９８４年、エンボ・ジャーナル、第３巻、２７２
３ページ）。２′プロモーターの５′非翻訳領域は、配
列 をつくるためにＢａｍＨＩリンカーを加えることにより
完成された。ＢａｍＨＩ部位へのクローニングはそれ
故、２′遺伝子の５′非翻訳領域を完全に残しており、
２′遺伝子の開始ＡＴＧのところでＢｔ遺伝子カセット
を融合する。

【００４９】キメラ遺伝子の高レベルの発現を得るため
の完全な５′非翻訳領域の重要性が示されている（ジョ
ーンズ等、エンボ・ジャーナル、第４巻、２４１１ペー
ジ、１９８５年）。Ｐｓｓｕ３０１：はペチュニア・ｒ
ｂｓ ｍＲＮＡの約５０％が転写されるペチュニアのｒ
ｂｓ（リブロース２リン酸カルボキシラーゼ小サブユニ
ット）遺伝子のプロモーターである（ディーン等、エン
ボ・ジャーナル、１９８４年、第４巻、第１２号参
照）。部位特異的突然変異誘発により、開始コドン周辺
の配列（ＴＡＡＣＴＡＴＧＧＣＴＴ）は、開始コドン上
にＮｃｏＩ部位をつくるようにＴＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴ
Ｔに変えられた。同様に、ＧＧＣＴＴＣＴＡＡＧＴＴか
ら へのＴＡＡ停止コドン周辺の修飾はＢｇｌＩＩ部位をつ
くった。結果として、ｓｓｕ−３０１遺伝子のコーディ
ング領域は、正確にＮｃｏＩ−ＢｇｌＩＩ消化により除
去され、７．２節に述べられているようにＢｔ遺伝子カ
セットにより置き換えられた。プロモーター断片（Ｐｓ
ｓｕＰＥＴ）と３′端（ｓｓｕ−ＰＥＴ）の分離と特徴
づけは、ディーン等、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ＵＳ
Ａ、第８２巻、４９６４ページ（１９８５年）に述べら
れている。ｐＡＧＳ００７（図２６Ｈ）の構築は図３４
に述べられている。Ｐ３５Ｓ：は、カリフラワーモザイ
クウイルス（ＣＡＭＶ）由来の強力な構成的プロモータ
ーである。Ｐ３５Ｓ−１プロモーター断片は、ＣＡＭＶ
分離Ｃｍ４−１８４由来である。これは、ＣＡＭＶゲノ
ムの断片（ｎｔ６４９２から７４５４）（ガードナー
等、１９８１年、ヌクレイック・アシド・リサーチ、第
９巻、２８７１から２８８８ページ参照）とクローニン
グのためのＢａｍＨＩ部位下流（図３１）を含む。Ｐ３
５Ｓ−２は、ＣｌａＩ部位に続く６４９２から７４６６
のＣＡＭＶ配列を含む。Ｐ３５Ｓ−１とＰ３５Ｓ−２は
それ故、３５Ｓ ＣＡＭＶ転写物の５′非翻訳配列の長
さだけが異なる。

【００５０】プロモーター・Ｂｔ遺伝子連結 図２１は、異なる遺伝子操作されたＴｉプラスミドに存
在するような、プロモーター領域とＢｔ遺伝子カセット
のコーディング配列の間の連結部のＤＮＡ配列を与え
る。本来のプロモーター領域及びＢｔ２遺伝子のコーデ
ィング配列由来の配列には下線が付されている。キメラ
遺伝子の集合に含まれるいくつかの適切な制限酵素の部
位が示されている。ＡＴＧ開始コドンは箱で囲んであ
る。Ｂｔ遺伝子カセットと３′末端の間の連結 全てのキメラ遺伝子は、天然には植物細胞で発現される
遺伝子のポリアデニレーション部位を含む３′非翻訳領
域を含む配列を伴う３′末端を備える。次の配列が使用
された：３′ＯＣＳ（ｐＨＤ１０６０、ｐＨＤ１０７６、ｐＨＤ
１０８０で） オクトパイン合成酵素遺伝子の３′非翻訳領域を含む７
０６ｂｐのＰｖｕＩＩ断片（ギーレン等によれば１１９
３９から１１２３３エーボ・ジャーナル、第４巻、８３
５ページ、１９８４年）。３′ｔ７（ｐＧＳ１１６１、ｐＧＳ１２６１、ｐＧＳ１
２７１） ｐＵＣ８のＳｍａＩ部位にクローニングされ、ＥｃｏＲ
Ｉ−ＳａｌＩ断片として再分離されたＴ−ＤＮＡ遺伝子
７の３′非翻訳領域を含む２１２ｂｐのＥｃｏＲＶ−Ｃ
ｌａＩ断片（ギーレン等によれば位置は２３１７から２
１０５である、エンボ・ジャーナル、第４巻、８３５ペ
ージ、１９８４年参照）。３′ＳＳＵ３０１（ｐＧＳ１１８１） ｓｓｕ ３０１遺伝子の３′末端由来の±１．２ｋｂのＢ
ｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片が以下のように、部位特異的
突然異変誘発により構築された： 停止コドン領域（それはＴＡＡである） ｓｓｕ３０１ …ＴＴＣＴＡＡＧＴＴＡＴＡ コード化配列 …ＴＴＣＴＡＡＧＡＴＣＴＡＴＡ 部位特異的突然変異 ＢｇｌＩＩ 誘発によるＢｇｌＩＩ 部位の構築

【００５１】実施例８．１ ノパリン合成酵素プロモーター、ｐＨＤ１６０のＢｔ２
毒素遺伝子カセット及びポリアデニレーション部位を含
むノパリン合成酵素遺伝子の３′非翻訳領域を含むＤＮ
Ａ断片から成るキメラのＢｔ２毒素遺伝子を含む中間体
ベクター、ｐＨＤ２０５の構築についてこの実施例では
述べる。キメラ遺伝子で、Ｂｔ２蛋白の発現がノパリン
合成酵素のプロモーターから得られるようにＢｔ２遺伝
子カセットはつながれている。Ｂｔ２遺伝子カセット
は、ＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩでｐＨＤ１６０から切り出
されて、ｐＬＧＶ２３８２（ヘレラーエストレラ等、エ
ンボ・ジャーナル、第２巻、９８７から９９５ページ、
１９８３年参照）のＢａｍＨＩ部位に挿入された。２μ
ｇのｐＨＤ１６０ＤＮＡが、それぞれ２単位のＢｇｌＩ
ＩとＢａｍＨＩ（ベーリンガー・マンハイム）で３７℃
１時間、マニアティス等により述べられたインキュベー
ションの緩衝液（モレキュラー・クローニング（１９８
２年）コールド・スプリング・ハーバー研究所、１３３
から１３４ページ参照）を用いて最終量２０μｌ中で消
化された。５μｇのｐＬＧＶ２３８２ＤＮＡが同一条件
下でＢａｍＨＩで消化された。続いて、末端の５′リン
酸がＤＮＡから、マニアティス等により述べられた条件
を用いて（モレキュラー・クローニング、（１９８２
年）コールド・スプリング・ハーバー研究所、１３３か
ら１３４ページ参照）子ウシ腸アルカリホスファターゼ
（ＣＩＰ）（ベーリンガー・マンハイム）の処理により
除去された。

【００５２】ＢａｍＨＩ消化し、ＣＩＰ処理したｐＬＧ
Ｖ２３８２ＤＮＡの１／５を最終量２０μｌ中で、０．
０１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー・マンハ
イム）を用いて、０．１μｇのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ
消化ｐＨＤ１００ ＤＮＡに連結した。連結緩衝液とイ
ンキュベーションは、ベーリンガー・マンハイムにより
推せんされる通りにした（パンフレット“Ｔ４リガー
ゼ”、ベーリンガー・マンハイム、１９８０年８月、１
０Ｍ．８８０．４８６）。連結混合物は、ダジエートと
エーリッヒ、ジーン、第６巻、（１９８０年）２３から
２８ページに従って、大腸菌Ｋ５１４の感応細胞（コー
ルソン等、ジェネティクス、第５２巻、（１９６５年）
１０４３から１０５０ページ参照）に形質転換された。
細胞は、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添加し
たＬＢ平板培地（ミラー、エクスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジェネティクス（１９７２年）コールド・
スプリング・ハーバー研究所、ニューヨーク）に塗付さ
れた。形質転換体が、バーンボイムとドリーに従ってお
こなわれた微小規模のＤＮＡ調製により（ヌクレイック
・アシド・リサーチ、第７巻（１９７９年）１５１３か
ら１５２３ページ参照）組換え体プラスミドの存在が検
索された。ｐＬＧＶ２３８２のＢａｍＨＩ部位のＢａｍ
ＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片の方向性がＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ
の２重消化により決定された。組換え体プラスミドの２
重消化のパターンは、アガロースゲル電気泳動後、４個
の断片を示す。α方向では、約５７００ｂｐ、３０００
ｂｐ、２３００ｂｐ及び９２０ｂｐの断片、一方、β方
向では、およそ６２００ｂｐ、３０００ｂｐ、１８００
ｂｐ及び９２０ｂｐの断片がある。α方向をもつ組換え
体プラスミド（ノパリン合成酵素のプロモーター支配下
の毒素遺伝子）が次の実験に用いられ、ｐＨＤ２０５と
命名された。

【００５３】実施例８．２ この実施例では、ｐＨＤ２０８の構築について述べる。
中間体ベクターｐＨＤ２０８は、リブロース２リン酸カ
ルボキシラーゼの小サブユニットを暗号化するエンドウ
の遺伝子のプロモーター（Ｐｓｓｕ）、ｐＨＤ１６０の
Ｂｔ２毒素遺伝子カセット及びポリアデニレーション部
位を含むオクトパイン合成酵素遺伝子の３′非翻訳領域
から成るキメラのＢｔ２毒素遺伝子を含む。キメラ遺伝
子の断片はこの実施例に述べられ、図２２に示されてい
るようにクローニング・ベクターｐＧＶ８３１に集めら
れた。ｐＧＶ８３１の構築は図２３に要約されている。段階１ ｐＧＶ８５８を得るための、ｐＧＶ８３１へのオクトパ
イン合成酵素遺伝子の３′非翻訳領域を含む７０６ｂｐ
のＰｖｕＩＩ断片の挿入。５μｇのｐＧＶ８３１ＤＮＡ
は、マニアティス等により述べられたインキュベーショ
ンの緩衝液（モレキュラー・クローニング（１９８２
年））を用いて５単位のＨｐａＩで３７℃、１時間消化
された。続いて、マニアティス等、モレキュラー・クロ
ーニング、１９８２年により述べられているような、条
件を用いて、末端の５′リン酸がＤＮＡからＣＩＰ処理
により除去された。２０μｇのｐＧＶ９９ＤＮＡ（デ・
グレーブ等、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド
・アプライド・ジェネティクス、第１巻、４９９から５
１２ページ、１９８２年）が２０単位のＰｖｕＩＩで３
７℃で１時間消化された。

【００５４】得られたＤＮＡ断片は水平型のアガロース
ゲル（ＴＢＥ緩衝液中で０．８％アガロース）での電気
泳動により分離された。７０６ｂｐのＰｖｕＩＩ断片を
含むアガロースのバンドが切り出されて、ＤＮＡが電気
的溶出により回収された。フェノール及びエーテル抽出
の後、ＤＮＡをエッペンドルフ遠心機で１０分間遠心す
ることによりエタノールで沈澱させ、７０％エタノール
で洗浄し、乾燥させ、２０μｌ Ｈ₂ Ｏに再懸濁した。
０．０３μｇのＨｐａＩ消化し、ＣＩＰ処理したｐＧＶ
８３１は、最終量１０μｌで、１単位のＴ４リガーゼを
用いて、０．１μｇの精製された７０６ｂｐの断片に連
結された。連結混合物は、ダジエートとエーリッヒによ
り述べられたように（ジーン、第６巻、（１９８０年）
２３から２８ページ）、大腸菌Ｋ５１４の感応（コンピ
テント）細胞（コールソン等、ジェネティクス、第５２
巻（１９６５年）、１０４３から１０５０ページ）に形
質転換された。細胞はカルベニシリン（１００μｇ／ｍ
ｌ）を添加したＬＢ平板培地（ミラー、エクスペリメン
ツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス（１９７２
年）コールド・スプリング・ハーバー研究所、ニューヨ
ーク）にとふした。得られた組換え体プラスミドは、Ｐ
ｓｔＩとＡｐａＩの２重消化により特徴づけがなされ
た。得られたプラスミドの１つｐＧＶ８５８から、おお
よそ５３００ｂｐ、１７００ｂｐ、１５００ｂｐ及び９
００ｂｐの所望の消化断片が得られ、さらに用いられ
た。

【００５５】段階２： ｐＨ５０３を得るための、修飾
されたＰｓｓｕ断片の構築及びｐＧＶ８５８のこの断片
の挿入。ｐＵＣ８（ビエラとメッシング、ジーン、第１
９巻、２５９から２６６ページ、１９８２年）のＨｉｎ
ｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩのポリリンカーをｐＫＣ７：：Ｐ
ｓｓｕに挿入することにより、ＢａｍＨＩ部位をＰｓｓ
ｕプロモーターのすぐ下流に位置させる。ｐＫＣ７：：
Ｐｓｓｕはベルギー国ゲント州立大学遺伝学研究室で調
製された。ベクターｐＫＣ７（ラオとロジャース、ジー
ン、第７巻、１９７９年）にクローニングされたリブロ
ース２リン酸カルボキシラーゼ（ＲＵＤＰ−ｃａｓｅ）
の小サブユニット（ｓｓｕ）を暗号化するエンドウの遺
伝子の１つのプロモーター（ヘレラーエストレラ、ネイ
チャー第３１０巻、１１５から１２０ページ、１９８４
年）を含むＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含む。ｐ
ＫＣ７：：Ｐｓｓｕ １μｇが１単位のＨｉｎｄＩＩＩ
と１単位のＢａｍＨＩで消化された。１μｇのｐＵＣ８
ＤＮＡが１単位のＨｉｎｄＩＩＩと１単位のＢａｍＨＩ
で３７℃、１時間消化された。それぞれの消化されたＤ
ＮＡ０．１μｇが混合され、最終量２０μｌで０．０１
単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結された。連結混
合物は、大腸菌Ｋ５１４の感応細胞（ダジエートとエー
リッヒ、ジーン、第６巻、（１９８０年）２３から２８
ページ）に形質転換された。細胞は、１００μｇ／ｍｌ
のカルベニシリンを添加したＬＢ平板培地（ミラー、エ
クスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス
（１９７２年）コールド・スプリング・ハーバー研究
所、ニューヨーク）にとふした。得られた組換え体プラ
スミドの１つ、ｐＧＶ８６１で、ｐＫＣ７のＫｍ^R 遺伝
子を含むＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片は、２０ｂｐ
のｐＵＣ８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩポリリンカー
に置き換えられた。

【００５６】マニアティス等、モレキュラー・クローニ
ング、コールド・スプリング・ハーバー研究所、１３３
から１３４ページ（１９８２年）により述べられインキ
ュベーションバッファーを用い最終液量２０μｌで、５
μｇのｐＧＶ８５８が５単位のＢａｍＨＩで３７℃、１
時間消化された。次いで、マニアティス等、モレキュラ
ー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバー研
究所、１３３〜１３４頁（１９８２）により記載された
条件を用いたＣＩＰ処理によりＤＮＡから末端の５′リ
ン酸が除去された。マニアティス等、モレキュラー・ク
ローニング、コールド・スプリング・ハーバー研究所、
１９８２年に述べられているインキュベーションの緩衝
液を用いて最終量２０μｌで２μｇのｐＧＶ８６１が２
単位のＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ及びＲｖｕＩで３７℃、
１時間消化された。０．２μｇのＢａｍＨＩで消化し、
ＣＩＰ処理したｐＧＶ８５８が、０．０５μｇのＢａｍ
ＨＩ−ＢｇｌＩＩ−ＲｖｕＩ消化のｐＧＶ８６１に最終
量２０μｌで０．０１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベー
リンガー・マンハイム）で連結された。連結混合物は、
ダジエートとエーリッヒ、ジーン、第６巻、（１９８０
年）２３から２８ページに従って、大腸菌Ｋ５１４のコ
ンピテント細胞（コールソン等、ジェネティクス、第５
２巻、（１９６５年）１０４３から１０５０ページ）に
形質転換された。細胞は、カルベニシリン（１００μｇ
／ｍｌ）を添加したＬＢ平板培地（ミラー、エクスペリ
メンツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス（１９７
２年）、コールド・スプリング・ハーバー研究所、ニュ
ーヨーク）に塗布された。カルベニシリン耐性クローン
について、バーンボイムとドリーにより述べられた微小
規模の技術（ヌクレイック・アシド・リサーチ、第７
巻、（１９７９年）１５１３から１５２３ページ）によ
り調製されたＤＮＡの制限酵素の消化によって、組換え
体プラスミドの存在が検索された。組換え体プラスミド
の１つ、ｐＨＤ５０３で、ｐｅａ ｓｓｕプロモーター
を含むＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨＩ断片が、オクトパイン合
成酵素遺伝子の３′端の前に正しい方向で挿入される。
ｐＨＤ５０３は、Ｐｓｓｕプロモーターとオクトパイン
合成酵素遺伝子の３′端の間に１ヶ所ＢａｍＨＩ部位を
含んでいる。

【００５７】段階３：中間体発現ベクターｐＨＤ２０８
を得るための、ｐＨＤ５０３のＢａｍＨＩ部位へのＢａ
ｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ Ｂｔ２遺伝子カセットの挿入。２
μｇのｐＨＤ１６０ＤＮＡが、最終量２０μｌ中で、３
７℃、１時間、２単位のＢｇｌＩＩ及び単位のＢａｍＨ
Ｉで完全に消化された。５μｇのｐＨＤ５０３ＤＮＡが
同一条件下で完全に５単位のＢａｍＨＩで消化され、Ｄ
ＮＡから末端の５′リン酸を除去するために、マニアテ
ィス等によりモレキュラー・クローニング（１９８２
年）（コールド・スプリング・ハーバー研究所、１３３
から１３４ページ）に述べられている条件を用いてＣＩ
Ｐで処理された。０．１μｇのＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ
消化ｐＨＤ１６０ＤＮＡが、０．２μｇのＢａｍＨＩ消
化しＣＩＰ処理したｐＨＤ５０３ＤＮＡに最終量２０μ
ｌで０．０１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結さ
れた。連結混合物は、大腸菌Ｋ５１４の感応細胞（コン
ピテント）に形質転換された（ダイジエートとエーリッ
ヒ、ジーン、第６巻（１９８０年）２３から２８ページ
参照）。細胞は、ストレプトマイシン（２０μｇ／ｍ
ｌ）とスペクチノマイシン（５０ｍｇ／ｍｌ）を添加し
たＬＢ平板培地（ミラー、エクスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジェネティクス（１９７２年）、コールド
・スプリング・ハーバー研究所、ニューヨーク）に塗付
された。ストレプトマイシン・スペクチノマイシン耐性
クローンが、バーンボイムとドリー（ヌクレイック・ア
ンド・リサーチ、第７巻、１５１３から１５２３ペー
ジ、１９７９年参照）により述べられた微小規模技術に
よりこれらのクローンから調製されたＤＮＡの制限酵素
消化により、組換え体プラスミドの存在に関して検索さ
れた。Ｐｓｓｕプロモーターに関して正しい方向でＢｔ
２遺伝子のカセットを含む組換え体プラスミド、ｐＨＤ
２０８が分離され、次の実験に使用された。

【００５８】９．アクグロバクテリウムへのトキシン遺
伝子を含む中間体発現ベクターの導入 アグロバクテリウム の受容体Ｔｉプラスミドへの中間体
発現ベクターの導入が２段階でおこなわれる：第１に、
中間体発現ベクターが２個の補助プラスミド：ｔｒａ機
能を含むＲ６４ｄｒｄ１１とｍｏｄ機能を含むｐＧＪ２
８をもつ大腸菌のＧＪ２３株に形質転換される（フィネ
ガン等、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネテ
ィクス第１８５巻（１９８２年）、３４４から３５１ペ
ージ）。第２に、全ての３種のプラスミドをもつ大腸菌
の株が、ヴァン・ハウテ等（エンボ・ジャーナル、第２
巻、４１１から４１８ページ、１９８３年）により述べ
られているように必ず中間体発現ベクターと相同の領域
をもつ受容体Ｔｉプラスミドを含むアグロバクテリウム
の菌株に接合される。単一の交叉現象から得られる組換
え体Ｔｉプラスミドが、中間体発現ベクターによりもち
込まれた抗生物質耐性マーカーを選択することにより分
離される。例として、ｐＨＤ２０５のｐＧＶ３８５０と
の共統合及びｐＨＤ２０８のｐＧＶ２２６０との共統合
が述べられている。使用された中間体ベクター及び受容
体Ｔｉプラスミドは、表５にあげられ、図２４から図２
６に示されている。

【００５９】実施例９．１ 雑種ＴｉプラスミドｐＨＤ１０５０を得るために、中間
体発現ベクターｐＨＤ２０５が、受容体Ｔｉプラスミド
ｐＧＶ３８５０に挿入された。図２４に示したように、
ｐＨＤ１０５０は、Ｔ−ＤＮＡ境界断片の間に位置する
ノパリン合成酵素遺伝子同様Ｐｎｏｓプロモーターの支
配下にあるキメラのＢｔ２遺伝子を含む。プラスミドｐ
ＨＤ２０５がダジエートとエーリッヒによる形質転換
（ジーン、第６巻、１９８１年、２３から２８ページ）
で大腸菌ＧＪ２３株の感応細胞に導入された。ｐＨＤ２
０５で形質転換された大腸菌ＧＪ２３細胞を選択するた
めに、細胞がカルバニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を添
加したＬＢ培地（ミラー、エクスペリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジェネティクス、（１９７２年）、コール
ド・スプリング・ハーバー研究所、ニューヨーク）に塗
布された。１回の交叉から得られた雑種Ｔｉプラスミド
を含むアグロバクテリウムの菌株は、ネオマイシン（４
００μｇ／ｍｌ）を添加した最少Ａ培地（ミラー、エク
スペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス
（１９７２年）、コールド・スプリング・ハーバー研究
所、ニューヨーク）上で、ｐＨＤ２０５プラスミドによ
り持ち込まれたカナマイシン・ネオマイシンマーカーを
選択することにより、分離された。被接合体の１つ、ｐ
ＨＤ１０５０のＴ−領域の物理的構造が、ダエス等（ヌ
クレイック・アンド・リサーチ、第７巻、（１９７９
年）１８３７から１８４９ページ）が述べている方法に
従って、Ｃ５８Ｃ１ Ｒｉｆ^R ｐＨＰ１０５０の全ＰＮ
ＡをＨｉｎｄＩＩＩ消化したものに対する³²Ｐ標識した
ｐＨＤ２０５のハイブリダイゼーションにより決定され
た。ｐＨＤ１０５０のＴ領域の構造は、図２４に示され
ている。

【００６０】実施例９．２ 雑種ＴｉプラスミドｐＨＤ１０７６を得るために、中間
体発現ベクターｐＨＰ２０８が受容体Ｔｉプラスミドｐ
ＧＶ２２６０に挿入された。図２５に示したように、ｐ
ＨＤ１０７６は、Ｐｎｏｓプロモーターの支配下にある
ネオマイシン・ホスフォトランスフェラーゼを含むキメ
ラ遺伝子と同様に、Ｔ−ＤＮＡ境界断片の間に位置する
Ｐｓｓｕプロモーターの支配下にあるキメラのＢｔ２遺
伝子を含む。ＴｉプラスミドｐＧＶ２２６０は、欧州特
許出願番号８３１１２９８５．３（公開番号０１１６７
１８）に述べられている。プラスミドｐＨＤ２０８はダ
ジエートとエーリッヒ（ジーン、第６巻、（１９８０
年）２３から２８ページ）による形質転換によって、大
腸菌ＧＪ２３株の感応細胞に導入された。ｐＨＤ２０８
で形質転換された。大腸菌ＧＪ２３の細胞を選択するた
めに、形質転換混合物が、カルベニシリン（１００μｇ
／ｍｌ）を添加したＬＢ平板培地（ミラー、エクスペリ
メンツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス（１９７
２年）、コールド・スプリング・ハーバー研究所、ニュ
ーヨーク）に塗布された。

【００６１】形質転換された大腸菌コロニーの１つが液
体ＬＢ培地に接種され、１晩培養された。３種類全ての
プラスミドをもつ大腸菌の１晩培養液０．１ｍｌが、Ｃ
５８Ｃｌ Ｒｉｆ^R （ｐＧＶ２２６０）の１晩培養液と
２８℃で１晩ＬＢ培地（ミラー、エクスペリメンツ・イ
ン・モレキュラー・ジェネティクス（１９７２年）、コ
ールド・スプリング・ハーバー研究所、ニューヨーク）
上で接合された。ｐＧＶ２２６０とｐＨＤ２０８の間の
１回の交叉から得られた雑種Ｔｉプラスミドを含むアグ
ロバクテリウムの株が、スペクチノマイシン（３００μ
ｇ／ｍｌ）とストレプトマイシン（３００μｇ／ｍｌ）
及びストレプトマイシン（１μｇ／ｍｌ）を添加した最
少Ａ培地（ミラー、エクスペリメンツ・イン・モレキュ
ラー・ジェネティクス（１９７２年）、コールド・スプ
リング・ハーバー研究所、ニューヨーク）上でｐＨＤ２
０８プラスミドによりもち込まれたストレプトマイシン
−スペクチノマイシンのマーカーを選択することにより
分離された。被接合体は、リファンピシン（１００μｇ
／ｍｌ）、スペクチノマイシン（１００μｇ／ｍｌ）及
びストレプトマイシン（３００μｇ／ｍｌ）を添加した
ＬＢ培地（ミラー、エクスペリメンツ・イン・モレキュ
ラー・ジェネティクス（１９７２年）コールド・スプリ
ング・ハーバー研究所、ニューヨーク）上で純化され
た。被接合体の１つ、ｐＨＤ１０７６の物理的構造が、
ダエス等（ヌクレイック・アミド・リサーチ、第７巻
（１９７９年）、１８３７から１８４９ページ）により
述べられた方法に従って、Ｃ５８Ｃｌ Ｒｉｆ^R ｐＨＤ
１０７６のＰｓｔ消化した全ＤＮＡに対して、³²Ｐ標識
したｐＨＤ２０８をハイブリダイズすることにより決定
された。ｐＨＤ１０７６の物理的構造は図２５に示され
ている。

【００６２】１０．ゲノムに挿入されたキメラの毒素遺
伝子を含む植物細胞及び植物の分離方法：第９節で述べ
られているような形質転換ベクターを用いたタバコ植物
細胞の形質転換及び、この形質転換細胞からのカルス組
織及び／又は分化植物の再生についての２つの異なる方
法がここでは述べられている。方法１ ：プロトプラスの共培養 タバコプロトプラストのアグロバクテリウムＣ５８Ｃｌ
Ｒｉｆ^R との共培養及び、ノパリンのような判定マー
カーの存在あるいはカナマイシン耐性のような選択マー
カーの発現を検索することによる形質転換されたタバコ
の細胞系列の分離及び形質転換カルス系からの全植物体
の再生についてこの方法では述べる。段階１ ：プロトプラストの調製 ａ） ニコチアナ・タバクムｃｖ．ペティ・ハバナＳＲ
−１の無菌植物を４週間試験管内で１０から１２ｃｍの
高さまでムラシゲとスクーグの培地の１／２のビタミン
とショ糖及び１／２の無機組成物を含む培地で生育す
る。（ムラシゲとスクーグ、フィジオロジー・オブ・プ
ラント、第１５巻、４７３から４９７ページ（１９６２
年）参照）。 ｂ） ３枚のよく開いた若葉の葉の部分を、１．４％セ
ルラーゼ・オノヅカＲ−１０と０．４％マセロザイム・
オノヅカ（両者共ヤクルト薬品工業株式会社、日本）を
含む以下の溶液２０ｍｌでインキュベートする。ＫＣｌ
２．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ １ｇ／ｌ、Ｋ
Ｈ₂ ＰＯ₄ ０．１３６ｇ／ｌ、ソルビトール７３ｇ／
ｌ、ポリビニル・ピロリドン１００．３ｇ／ｌ ｃ） 暗所で、２４℃１晩インキュベートする。 ｄ） メッシュの大きさが５０μｍのナイロンフィルタ
ーで濾過する。 ｅ） １５ｍｌチューブで８０ｇ１０分間遠心し、上清
を除去して、沈澱を酵素のはいっていない２０ｍｌの同
じ緩衝液に再懸濁する。 ｆ） 過剰の酵素を除去するために、１０分間８０ｇで
遠心し、上清を除去する。 ｇ） 沈澱を、０．２２％ＣａＣｌ₂ ・２Ｈ₂ Ｏと０．
４Ｍマンニトール、ｐＨ５．６を添加した１／２のムラ
シゲ−スクーグ培地２０ｍｌに再懸濁する。 ｈ） １０分間、８０ｇで遠心し、上清を除去する。 ｉ） 沈澱を２０ｍｌの培地５５（以下を見よ）に再懸
濁する。 ｊ） プロトプラストを数え、１０⁵ ｐｐ／ｍｌになる
ように希釈する。約４日間暗所にて、５ｃｍペトリ皿中
で（ペトリ皿あたり２．５ｍｌ）インキュベートする。

【００６３】段階２：雑種Ｔｉプラスミド（第９節）を
含むアグロバクテリウムＣ５８ＣｌＲｉｆ^R 株との共培
養 ａ） アグロバクテリウムＣ５８Ｃｌ Ｒｉｆ^R をＬＢ
培地で飽和するまで培養し、エッペンドルフ遠心機で１
分間遠心して上清を除去し、細胞を等量の０．０１Ｍ
ＭｇＣｌ₂ に再懸濁した。プロトプラストの約３０％が
最初の細胞分裂を始めたときに、５０μｌの細菌懸濁液
がプロトプラスト懸濁液２．５ｍｌに対して添加される
（これは、およそ、プロトプラストあたり１００から５
００の細菌である）。 ｂ） 暗所で４８時間培養する。 ｃ） 細胞懸濁液を遠心チューブに移し、クラフォラン
５００ｍｇ／ｌを添加した等量の培地５５でペトリ皿を
洗浄し、これを遠心チューブに加えた。１０分間８０ｇ
で遠心し、上清を除去し、沈澱を、クラフォラン５００
ｍｇ／ｌを添加した培地５５等量に再懸濁した。 ｄ） ５ｃｍのペトリ皿に移し（２．５ｍｌ／皿）、こ
のとき、細胞濃度は、約１０⁴ 細胞／ｍｌである。４か
ら８細胞の小さなかたまりが形成されるまで、４００ル
クス下、１日１６時間、２３℃で１から２週間インキュ
ベートする。 ｅ） 等量の培地５６（以下参照）を加える。 ｆ） ３から４週間後、０．７％アガロースで固めて、
マンニトール濃度を減じ（０．４４Ｍにかわり０．２
Ｍ）、クラフォラン（２５０ｍｇ／ｌ）を添加した培地
５６にコロニーがひろげられる。この段階で、１コロニ
ーあたり５０以上の細胞を含んでいなければならない。
選択マーカーとしてＫｍ^R が使用されている場合、５０
μｇ／ｍｌのカナマイシンが、選択剤として培地に添加
される。 ｇ） １日１６時間８００ルクスで、２３℃、２から３
週間インキュベートする。 ｈ） 分離したカルスを同一培地に移す。発芽する。こ
の段階で、ノパリンが識別マーカーとして用いられてい
る場合に、カルス組織が、アーツ等、プラント・サイエ
ンティフィック・レターズ 第１７巻、４３から５０ペ
ージ（１９７９年）により述べられているような方法を
用いてノパリンの存在を検索するのに取られる。ノパリ
ンの存在についての検索（ノパリン試験）は、Ｍ．アー
ツ、Ｍ．ジャコブ、Ｊ−Ｐ．ヘルナルスティーン、Ｍ．
ヴァンモンターギュ及びＪ．シェル、（１９７９年）プ
ラント・サイエンティフィック・レターズ、第１７巻、
４３から５０ページに述べられている方法に従い実施さ
れる。

【００６４】培地５５の組織： −ムラシゲとスクーグの塩のマイクロニュートリエント
の１／２の強さのもの −１０００倍の改良マイクロニュートリエント・ヘラー
１ｍｌ／ｌ −１０００倍のビタミン・モレル＆ウェットモア １ｍ
ｌ／ｌ −１００ｍｌ／ｌイノシトール −ＦｅＳＯ₄ ５．５７ｇ／ｌとＮａ₂ ＥＤＴＡ ７．
４５ｇ／ｌを含む保存溶液 １０ｍｌ／ｌ −ベンジルアミノプリン １ｍｌ／ｌ、ナフタリン酢酸
３ｍｇ／ｌ −マンニトール ８０ｇ／ｌ（０．４４Ｍ）、ショ糖
２０ｇ／ｌ１００ｍｌに対する１０００倍のビタミン・モレルとウ
ェットモア Ｃａ−パントテン酸１００ｍｇ；ビオチン１ｍｇ；ニア
シン１００ｍｇ；ピリドキシン１００ｍｇ；チアミン１
００ｍｇ改良マイクロニュートリエント、ヘラー（５００ｍｌ） ５００ｍｇ ＺｎＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ；５０ｍｇ Ｈ₃ Ｂ
Ｏ₃ ；５０ｍｇ ＭｎＳＯ₄ ・４Ｈ₂ Ｏ；５０ｍｇ Ｃ
ＵＳＯ₄ ・５Ｈ₂ Ｏ；１５ｍｇ ＡｌＣｌ₃ ；１５ｍｇ
ＮｉＣｌ₂ 培地５６の組成 ：培地５６は、ナフタリン酢酸０．２ｍ
ｇ／ｌとグルタミン１ｍＭを加えることを除いて、培地
５５と同一である。

【００６５】方法２：雑種Ｔｉプラスミドをもつアグロ
バクテリウムＣ５８Ｃｌ Ｒｉｆ^R 株の葉切片への感染 葉切片へのＣ５８Ｃｌ Ｒｉｆ^R の感染とカナマイシン
を含む培地での選択による形質転換細胞系列の分離につ
いてここでは述べる。無菌のニコチアナ・タバクムｃ
ｖ．ペティ・ハバナＳＲ−１が試験管内で、完全ムラシ
ゲとスクーグの培地（以下Ｍ＆Ｓ培地ということもあ
る）の１／２の有機栄養物とショ糖を補充した完全Ｍ＆
Ｓ塩混合物の１／２を含む植物栄養寒天で培養された。
約１ｃｍ² のＳＲ−１葉切片２０枚が、Ｃ５８Ｃｌ Ｒ
ｉｆ^R の洗浄細菌懸濁液０．１ｍｌを含む９ｃｍペトリ
皿の中の５ｍｌ液体Ｍ＆Ｓ培地（ホルモンなし）にうか
べられた。２５℃、４８時間暗所で６０ｒｐｍで振盪し
ながらインキュベートした。続いて、葉切片は５００ｍ
ｇ／ｌのクラフォランを含むＭ＆Ｓ（ホルモンなし）で
２度洗われ、それから、カルスと芽を形成させる培地上
に置かれた。この培地は、Ｍ＆Ｓのマクロ及びマイクロ
ニュートリエントとビタミン、３％ショ糖、５００ｍｇ
／ｌクラフォラン、５００ｍｇ／ｌ硫酸カナマイシン、
０．１ｍｇ／ｌ ＮＡＡ及び１．０ｍｇ／ｌ ＢＡＰを
含む。培地の最終ｐＨは５．８である。約３０ｍｌの培
地を含む９ｃｍのペトリ皿あたり６枚の葉ディスクが置
かれ、１日あたり１６時間、２０００ルクスの照明サイ
クルで２３℃（±１℃）３週間インキュベートされる。
３週間後、カルスと小さな芽を生じたディスク（切片）
は、もう３週間同一培地へ移される。この時点で、長さ
１ｃｍを越える芽は、ホルモンとカナマイシンをぬいて
あり、５００ｍｇ／ｌのグラフォランを含むＭ＆Ｓを培
地に移される。その後、芽は、だいたい３週間ごとにホ
ルモンをぬいた１／２のＭ＆Ｓに移される、そしてクラ
フォラン濃度は、順次減らされる（第１回の移行：２５
０μｇ／ｍｌ、２回目：１２５μｇ／ｌ、３回目：０μ
ｇ／ｍｌ）。最初の１／２ Ｍ＆Ｓへの移行の間に、葉
部からなる試料が、カナマイシン耐性を試験するために
取り除かれる。葉ディスクは、異なる濃度の硫酸カナマ
イシン（５０から５００ｍｇ／ｌ）を含むカルス誘導培
地（Ｍ＆Ｓマクロ及びマイクロニュートリエントとビタ
ミン、３％ショ糖、５００ｍｇ／ｌクラフォラン、１ｍ
ｇ／ｌ ＮＡＡと０．１ｍｇ／ｌ ＢＡＰ）の入ったペ
トリ皿に移される。試料がアグロバクテリウムを含んで
いないと証明されると、クラフォランをぬいた培地で植
物Ｋｍ耐性が再度試験される。

【００６６】実施例１０．１：ｐＨＤ１０５０で形質転
換されたカルス Ｔ−ＤＮＡ ：Ｐｎｏｓ−Ｂｔ２（Ｐｎｏｓに融合された
Ｂｔ２遺伝子）マーカー ：Ｂｔ遺伝子とｎｏｓ遺伝子の間の付加的境界
配列を伴うマーカー遺伝子としてノパリン合成酵素形質転換法 ：プロトプラスト感染 ノパリンについて、だいたい２５０個のカルスが調べら
れて、１９％が、高頻度の形質転換をあらわすＮｏｓ⁺
であった。全部で１８０個の異なるカルス系列で、これ
らの形質転換実験から生じたｎｏｓ⁺ とｎｏｓ^- の両方
が、Ｂｔ２の存在に関して、上述（５．１節）の感度の
良いＥＬＩＳＡを用いて調べられた。ほとんどのクロー
ンが、形質転換後すぐに、増殖の初期相の間に（直径が
ほんの５ｍｍのとき）試験され、いくつかは、サブカル
チャーの時期の後に（３ヶ月後）試験された。

【００６７】実施例１０．２：ｐＨＰ１０６０で形質転
換されたカルス組織 Ｔ−ＤＮＡ ：Ｐｎｏｓ−Ｂｔ２選択マーカー ：カナマイシン耐性（Ｋｍ）形質転換法 ：プロトプラスト感染（方法１）及び葉ディ
スク感染（方法２）。 方法１に従い、カナマイシン耐性プロトプラスト・クロ
ーンが得られ、カルスとして生育された。方法２に従
い、カナマイシン耐性カルス組織と芽が誘導された。ク
ローニングされていないカルス組織は、“試験管内”で
の継代培養で維持された。実施例１０．３ ：ｐＨＤ１０７６で形質転換されたカル
ス組織 Ｔ−ＤＮＡ ：Ｐｓｓｕ−Ｂｔ２（Ｐｓｓｕに融合された
Ｂｔ２遺伝子）選択マーカー ：カナマイシン耐性形質転換法 ：葉ディスク感染 方法２に述べられている条件を用いて、カルスの形質転
換が感染した葉ディスク上で実施された。カルス誘導法
を用いて、多くのカルスが部分精製により得られ、個々
のセミクローンとして維持された。陽性のイムノアッセ
イの結果に基づいて、これらの系列のうちの５つが、次
の増殖のために選択された（１０７６−４、１０、１
１、１２、１３）。実施例１０．４ ：ｐＨＤ１０８０で形質転換されたカル
ス組織 Ｔ−ＤＮＡ ：Ｐｓｓｕ−トランジットペプチド （Ｔｐ）Ｂｔ２選択マーカー ：カナマイシン耐性／（Ｎｏｓ）形質転換法 ：葉ディスク感染 カナマイシン耐性カルスが方法２に従って誘導された。
約２０のカナマイシン耐性カルス株（又は系列）が、ノ
パリンの発現に関して調べられて、全てが陽性であるこ
とがわかった。

【００６８】実施例５：ｐＧＳ１１１０で形質転換され
た植物 実施例１０．５ ：ｐＧＳ１１６１で形質転換された植物 Ｔ−ＤＮＡ ：ＰＴＲ２−Ｂｔ２選択マーカー ：カナマイシン耐性形質転換法 ：葉ディスク感染 “試験管内”で維持されたＳＲ−１植物の葉ディスク
が、アグロバクテリウム・テュメファシエンスＣ５８Ｃ
ｌ Ｒｉｆ^R ｐＧＳ１１６１の懸濁液と共に４８時間イ
ンキュベートされた。対照として、ｐＴＲ支配下にある
ＮＰＴＩＩを含むＡ．テュメファシエンスＣ５８Ｃｌ
Ｒｉｆ^R ｐＧＳ１１６０が含まれていた。２週間後、５
０ｍｇ／ｌ硫酸カナマイシンを含む培地上で芽の形成が
観察された。３週間後、ディスクは、新鮮な選択培地に
移され、さらに３週間後、最良の生育をしている芽が、
カナマイシンなしの培地に移された。カナマイシン耐性
のレベルは、系統的に、葉ディスク試験を用いて決定さ
れる。ほとんどの植物が高レベルの耐性（５００μｇ／
ｍｌＫｍ）でカルス形成を示した。 １１．操作された植物組織中のＢｔ２蛋白の免疫学的検
出 操作されたカルス組織中でのＢｔ２の発現が、第５節で
述べられ、そして植物抽出物を試験するために適応され
たＥＬＩＳＡを用いて追跡された。植物抽出物を調製
し、試験する条件は、純化されたＢｔ２蛋白が植物抽出
物と混合される再構築実験で確立された。再構築実験に
おいて、植物抽出物が存在することによるＢｔ２蛋白の
抗原活性のかなりの損失（２０％以下）は観察されなか
った。ＥＬＩＳＡでは、０．１ｍｇ／ｍｌ程度の少ない
精製されたＢｔ２蛋白でも検出可能であった。しかしな
がら、再構築実験では、おそらく抽出物に存在する植物
蛋白により引き起こされるある程度の可変状態がバック
グラウンドに生じる。それ故これらの条件での信頼でき
る検出限界は、植物組織１ｇあたり２ｎｇのＢｔ２蛋白
のレベルに相当する組織１ｇあたり１ｎｇのオーダであ
った。

【００６９】１１．１．個々のカルスの検索 個々のカルスの免疫学的検索のために、次の実験方法が
確立された：２００ｍｇのカルス組織が１５０から２０
０μｌの抽出用緩衝液と混合された。抽出用緩衝液は次
の組成を有していた：５００ｍＭ Ｎａ₂ ＣＯ₃ 溶液が
５０％、１００ｍＭ ＤＩＴ及び５０％ウシ胎児血清。
組織は、へらでつぶすことによりホモジネートされ、そ
れから細胞残渣が遠心された。述べられているような
Ｂ．ｔ．結晶蛋白に対するヤギの抗体でコートしたマイ
クロタイタープレートのウェルの中のＰＢＳ ｐＨ７．
４＋１０％ウシ胎児血清５０μｌに上清５０μｌが加え
られた。この方法の間中、試料は氷中に保持され、マイ
クロメータープレートは４℃で１．５から２時間インキ
ュベートされた。その後、５．１で述べられているよう
に、Ｂｔ２蛋白の検出のために、ウサギ抗Ｂｔ２血清又
は抗Ｂｔ２単クローン抗体４Ｄ６、１０Ｅ３ １．７及
び４．８の混合物のいずれかを用いてＥＬＩＳＡ法が
（培養上清の形成の下で）続けられた。

【００７０】実施例１１．１：Ｃ５８Ｃｌ Ｒｉｆ^R ｐＨＤ１０５０で形質転換された
カルスの分析 形質転換されたカルス・クローンが、第１０節の実施例
１に述べられているようなプロトプラスト共培養の方法
により得られた。１９％のクローンがノパリンを発現す
る（Ｎｏｓ⁺ ）ことがわかったので、少なくとも１９％
は形質転換された。しかしながら、中間体発現ベクター
（ｐ２ＧＶ２３８２）の付加的境界配列のために、ｎｏ
ｓ遺伝子とＢｔ２遺伝子は直線的にであると同時に独立
に挿入されている。それ故、Ｎｏｓ⁺ 及びＮｏｓ^- クロ
ーンの両者はＥＬＩＳＡ試験で調べられた。全部で１８
０個のカルスのクローン（１３０個のｎｏｓ^- 、５０個
のｎｏｓ⁺）が試験された。いくつかのクローンは、プ
ロトプラスト培養からの初期増殖の後、異なる時間間隔
で１度又は２度再試験された。明らかに陽性の信号が記
録された場合はなかった。測定における基質反応時間が
延ばされると（４℃で１晩インキュベーション）、いく
つかのクローン（ｎｏｓ⁺ 及びｎｏｓ^- 両者）で（Ｂｔ
２遺伝子なしの対照カルスである）バックグラウンド以
上の非常に弱い信号が産生された。しかし、得られた値
は明らかに試験系の信頼できる検出限界を下回っていた
ので、これらのカルスでのＢｔ２蛋白の発現に関しては
確実な結論は導かれなかった。

【００７１】実施例１１．２：Ｃ５８Ｃｌ Ｒｉｆ^R ｐＨＤ１０７６で形質転換された
タバコ・カルス組織のＢｔ２蛋白の検出 アグロバクテリウムＣ５８Ｃｌ Ｒｉｆ^R （ｐＨＤ１０
７６）を用いて感染した葉切片から得られた形質転換カ
ルス組織（第１０節実施例３参照）は、免疫学的に、Ｂ
ｔ２蛋白の存在について調べられた。初期増殖後、カル
スは２０日後第２代のために移された。最適生育に達し
たときに、それぞれのカルスの系列から２００ｍｇがＥ
ＬＩＳＡによる免疫学的検索のために用いられた。最初
の実験で、１４個の形質転換カルスのうちの９個が４個
の対照カルス（非形質転換ＳＲ−１カルス）で得られた
バックグラウンドよりも、明らかに陽性である信号を、
特異的なウサギ抗Ｂｔ２血清で反応させたときに示した
（図２７参照）。陽性対照（既知量のＢｔ２蛋白と混合
された対照のＳＲ−１）での比較で決定されたように、
３個の形質転換カルスが組織１ｇあたり約５ｎｇのＢｔ
２蛋白に相当する信号を生じた。負の対照として、正常
ウサギ血清と反応させると、全ての試料が、（ＳＲ−１
対照カルスで得られた）バックグラウンド・レベルに等
しい信号を生じた。第２の実験で、２１個の形質転換カ
ルスのうちの１３個から、バックグラウンドをかなり上
回る信号が得られた（図２８）。そのカルスの中の１個
は、組織１ｇあたりＢｔ ２４ｎｇに相当する信号を生
じた。これらの結果は、ｐＨＤ１０７６で形質転換され
たカルスの画分で、Ｂｔ２蛋白が検出可能なレベルで産
生されることを示す。

【００７２】最初のＥＬＩＳＡ実験の約５週間後、初期
検索で高度の陽性値を与えた４個の選択された系列（１
０７６−１０、１１、１２及び１３）は、ＥＬＩＳＡの
再試験をされた。それぞれの系列のいくつかの“サブク
ローン”が試験された（もとのカルスが、次の生育サイ
クルで独立に増殖される切片に分割された；それぞれの
新しい切片をここではサブクローンとする）。１０７６
−１０の１サブクローンが陽性、１サブクローンが陰
性、１０７６−１２の２サブクローンが陽性、１０７６
−１３の３サブクローンが陽性、２個が陰性であった。
これらの結果は、もともとＢ．ｔ．陽性と判定されるカ
ルス組織が、かなり増殖すると、Ｂ．ｔ．陰性カルスを
生ずることを示している。 １１．２．蓄積されたカルス抽出物のＢｔ２の検出 検出感度を上げた詳細なイムノアッセイ検索をおこなう
ために、かなりの量の形質転換カルス組織の濃縮抽出物
が調製された。Ｂｔ２蛋白に富む抽出物を得るためにこ
こで開発された方法は、ｐＨ４から５で沈澱するＢｔ２
の性質に基づいている。

【００７３】実施例１１．２．１：ｐＨＤ１０７６で形
質転換されたカルス ｐＨＤ１０７６を用いて形質転換されたカルスが０．０
５ｍｇ／ｍｌの硫酸カナマイシンを含む培地で生育さ
れ、クローニングされない形質転換カルス１４０ｇが集
められた（カルス系列１０７６−４、１０、１１、１
２、１３及び多くのスクリーニングされていない系列の
プール）。抽出物は、７０ｍｌの抽出用緩衝液（５００
ｍ Ｎａ₂ ＣＯ₃ 、ｐＨ１０、５ｍＭ ＤＩＴ、１７０
μｇ／ｍｌＰＭＦＳ）存在下でカルスをホモジネートす
ることで調製された。１５０００ｒｐｍの遠心後得られ
た上清は、５０ｍｌ ＰＢＳ、ｐＨ７．５を加えること
により稀釈された。続いて、稀釈された抽出液のｐＨが
１Ｍ ＨＣｌでｐＨ６まで下げられ、０℃で２０分間イ
ンキュベートされた、そして上清が遠心により分離さ
れ、０℃で保存された（画分ｐＨ６）。ｐＨが４．５ま
で下げられると、新しい沈澱が同様にして分離された
（画分ｐＨ４．５）。沈澱はＨ₂ Ｏで１度洗浄され、続
いて、２０分間室温で次の緩衝液：Ｎａ₂ ＣＯ₃ ５００
ｍＭｐＨ１０、ＤＴＴ５０ｍＭ、ＰＭＳＦ１７０μｇ／
ｍｌ中でインキュベートされた（沈澱ｐＨ６は１．５ｍ
ｌ及び沈澱ｐＨ４．５は２ｍｌ）。この条件で可溶化し
た物質は１５０００ｒｐｍの遠心後分離され、これらの
試料はそれぞれ、１０７６ｐＨ６と１０７６ｐＨ４．５
と呼ばれた。全く同一の方法が（ここで負の対照として
用いられている）正常のＳＲ−１カルスの物質の抽出液
を調製するのに使用されて、ＳＲ−１ ｐＨ４．５と呼
ばれる２個の標品が得られた。これらの試料の全蛋白含
量は： １０７６ ｐＨ６ ６００μｇ／ｍｌ １０７６ ｐＨ４．５ ６５６０μｇ／ｍｌ ＳＲ−１ ｐＨ６ ３８０μｇ／ｍｌ ＳＲ−１ ｐＨ４．５ ３８４０μｇ／ｍｌ 方法の効率を推定するために、試料ホモジネーションの
初期で、１μｇの精製Ｂｔ２が２０ｇのＳＲ−１対照カ
ルス組織に加えられる再構築実験がおこなわれた。これ
らの抽出物中のＢｔ２蛋白の存在は、（ヤギ抗Ｂｔ結晶
血清と、ウサギ抗Ｂｔ２の６００２）でのＥＬＩＳＡに
より決定された。負の対照（ＳＲ−１）に比べて画分１
０７６ｐＨ４．５で強い反応が記録された。画分１０７
６ｐＨ６は、ＳＲ−１ ｐＨ６よりもわずかに高いだけ
の信号を与え、これは、この画分が、Ｂｔ２蛋白含量の
わずかな部分のみを含むことを示している。

【００７４】ＥＬＩＳＡで、画分１０７６ｐＨ４．５又
は、Ｂｔ２蛋白に特異的な、５種の異なる単クローン抗
体、すなわち、１．７、４Ｄ６、４．８、１０Ｅ３及び
１Ｆ６と著しい反応を示した（図２９参照）。このこと
は、画分１０７６ｐＨ４．５が、細菌のＢｔ２と同一の
形状をしているＢｔ２蛋白を含むことを強く示してい
る。次に、免疫沈澱法を用いて、抽出物からＢｔ２蛋白
を取り除くことを試みた。５％容のウサギ抗Ｂｔ２血清
が、４℃で１時間インキュベートされた抽出物に加えら
れた。続いて、５％容のヤギ抗−ウサギＩｇ血清が加え
られ、４℃で１．５時間インキュベートされた。沈澱を
遠心により除去し、上清がＥＬＩＳＡで試験された。こ
の上清には、もとの１０７６ｐＨ４．５画分の少なくと
も１／１０のＢｔ２活性が含まれ、これは、ＥＬＩＳＡ
で陽性の信号を生ずる物質が特異的に抗Ｂｔ２抗体で除
去されたことを示し、さらに、ＥＬＩＳＡで陽性反応す
る基質がＢｔ２であることを確かなものとした。次の実
験で、上記試料が炭酸塩緩衝液（ｐＨ１０）に対して透
析された。１０７６ｐＨ４．５抽出物のＢｔ２含量の定
量が、ＥＬＩＳＡで抽出物の希釈液と標準として精製Ｂ
ｔ２蛋白の溶液を試験することにより実施された。定量
値は１２２ｎｇ Ｂｔ２／ｍｌ抽出液（総量２ｍｌ）で
あった。（抽出初期のＳＲ−１対照カルスにＢｔ２を加
える）再構築実験により、Ｂｔ２蛋白のほんの２０％が
抽出中に失われ、８０％がｐＨ４．５画分に含まれてい
ることが示された。これらの結果に基づいて、元の１４
０ｇのカルスに存在するＢｔ２蛋白の総量は３０５ｎｇ
と計算でき、２．２ｎｇ／ｇは、個々のカルスの検索で
出された元の概算とよく一致する結果である。（図２７
及び図２８参照）。これらのデータは、形質転換カルス
の抽出液に存在するＢｔ２蛋白が、上述したように、ｐ
Ｈ４．５での沈澱法で特異的に濃縮され、これらの植物
組織で産生されるＢｔ２蛋白の量をより正確に定量でき
るようになることを示している。

【００７５】実施例１１．２．２：ｐＨＤ１０５０で形
質転換されたカルス 選択されたカルスのクローン（個々のカルスについての
以前のＥＬＩＳＡ試験の結果に基づいて、バックグラウ
ンド以上の値を与える２５前後のカルスの系列が選択さ
れた）の５００ｇのプールが、例１で述べられたのと同
じ方法を用いて、１０００ｍｌの抽出用緩衝液存在下で
ホモジネートされた。ｐＨ６では可溶性のままではある
が、ｐＨ４．５で沈澱する物質が遠心により分離され、
続いて、少量の炭酸塩緩衝液、ｐＨ１０（実施例１参
照）に再溶解された。ＥＬＩＳＡによる物質の分析か
ら、１ｍｌあたり６０ｎｇ又はカルス組織１ｇあたり
１．２ｎｇのＢｔ２に相当する陽性の信号であることが
わかった（表６）。

【００７６】実施例１１．２．３：ｐＨＤ１０６０及び
ｐＨＤ１０８０で形質転換されたカルス この例では、操作された植物体からのＢｔ２蛋白の分離
上、わずかに異なり、より広範囲の抽出方法が使用され
ている。実施例１及び２の方法で使用されたような１回
の抽出段階では可溶化されないで、結果としてそのまま
残っているＢｔ２蛋白を回収するために手法が開発され
た。Ｂｔ２蛋白が植物細胞膜構造と相互作用が可能ない
くつかの高度な疎水性領域を含み、それ故、界面活性剤
なしでは可溶化されにくいような場合がこれである。こ
こで使用されている着実な方法が、不溶性の植物細胞構
造についている付加的蛋白の回収を可能にする。手法の
模式図が図３０に示されている。第１の蛋白画分が、炭
酸塩緩衝液ｐＨ１０＋ＤＴＴによる抽出と、酸沈澱（ｐ
Ｈ４．５）によって得られた（画分Ｉ）。この画分は実
施例１及び２の方法を用いて得られたｐＨ４．５抽出液
に相当する。この最初の抽出段階で可溶化されないで沈
澱に残っている物質は、それから、１％トリトンＸ−１
００を含む同じ抽出用緩衝液で処理される。これらの条
件で可溶化され、ｐＨ４．５で沈澱する蛋白が画分ＩＩ
に含まれる。最後の段階は、２％ＳＤＳによる可溶化と
アセトン沈澱を含み画分ＩＩＩが得られる。画分Ｉ及び
ＩＩは、ＥＬＩＳＡとウエスタン・ブロッティングで解
析された；ＳＤＳを含む画分ＩＩＩは、ウエスタン・ブ
ロッティングだけで解析される。

【００７７】ＥＬＩＳＡの結果が表６にあげられてい
る：もとの組織１ｇあたりそれぞれ１．９ｎｇと１．４
ｎｇ（画分Ｉ）及び０．２７ｎｇと０．２９ｎｇ（画分
ＩＩ）のＢｔ２レベルに相当する陽性信号が１０６０及
び１０８０両プラスミドの画分Ｉ及びＩＩで検出され
た。ＳＤＳで可溶化した物質（画分ＩＩＩ）のウエスタ
ン・ブロッティングから（ウサギ抗Ｂｔ２血清を用い
て）１０６０と１０８０のカルス物質両方にわずかな１
３０ｋｄバンドの存在が明らかとなった。ウエスタン・
ブロッティングの検出限界はレーンあたり１０ｎｇであ
った。それ故、これらの画分は少なくとも１０６０で
０．３９ｎｇ／ｇ、１０８０で０．５ｎｇ／ｇを含んで
いた。１０５０、１０６０及び１０８０の画分Ｉのウエ
スタン・ブロッティングでは、おそらくＢｔ２蛋白の濃
度がこれらの画分ではあまり低いために、１３０ｋｄの
存在がわからなかった。この結果は、低レベルのＢｔ２
蛋白が実際にｐＨＤ１０６０とｐＨＤ１０８０で形質転
換されたカルスで発現されたことを示す。個々のカルス
の小規模での分析では、これらの構築物の免疫陽性クロ
ーンの検出はできないけれども、選択カルスのプールに
対するより厳密な抽出と濃縮の方法は結果として、Ｂｔ
２蛋白の信頼できる定量的な検出を可能とする。Ｂｔ２
の本質的な画分は強く不溶性の植物の物質に結合され
る。そして、トリトンやＳＤＳのような界面活性剤の使
用下でのみ遊離する。

【００７８】１２．操作されたカルスで産生されるＢｔ
２蛋白の殺虫活性 方法 ：毒性測定は、人工飼料を与えられたマンデュカ・
セクスタの第１令の幼虫に対しておこなわれた。３から
４ｍｌの液体人工飼料（Ｒ．Ａ．ベルとＦ．Ｇ．ヨアヒ
ム、（１９７６年）、Ａｎｎ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．Ｓｏ
ｃ．Ａｎｎ．第６９巻、３６５から３７３ページ参照）
が、四角のペトリ皿のそれぞれの区画（４ｃｍ²）に分
配された。ホルムアルデヒドは飼料から除かれた。飼料
を固形にした後、２００μｌの既知の希釈試料が、飼料
表面に添加され、冷気流で乾かされた。４匹の新生幼虫
がそれぞれの区画に置かれた。生育と死亡が３から５日
の期間にわたって追跡された。実施例 ：ｐＨＤ１０７６で形質転換されたカルスのカル
ス抽出物 ｐＨＤ１０７６で形質転換されたカルスのプールの濃縮
抽出物が、第１１．２節実施例１に述べられているよう
に調製された。希釈抽出液が、飼料表面に添加されて、
毒性が評価された。抽出物質１０７６ｐＨ４．５は明ら
かに、マンデュカ・セクスタ幼虫に対して毒性効果を有
していた：１２．５μｌ／ｃｍ² で全ての幼虫が生育阻
害を示し、５０μｌ／ｃｍ² で１００％死亡した（表
７）。この物質の毒性活性は、免疫沈降の後、著しく低
下した（１２．５及び２５μｌ／ｃｍ² で１００％正常
生育そして、５０μｌ／ｃｍ² でたったの３７％死
亡）、そしてこのことは、毒性活性が抗Ｂｔ２抗体によ
り枯褐させられたことを示している。負の対照である非
形質転換ＳＲ−１カルス組織の抽出物は、完全に非毒性
であった。抽出物中のＢｔ２蛋白の存在が免疫学的に定
量されたので、観察された毒性と、決められたＢｔ２濃
度を相関させることができた。イムノアッセイの値は、
１０７６ｐＨ４が１２２ｎｇ／ｍｌ Ｂｔ２含むことを
示していた。それ故、１ｃｍ² あたり５０μｌの抽出液
は、６．１ｎｇ Ｂｔ２蛋白／ｃｍ² に相当する。Ｂｔ
２を用いたマンデュカに対する前の毒性測定（５．２
節、表３）は、１２ｎｇ Ｂｔ２／ｃｍ² は１００％致
死で一方、２．５ｎｇ／ｃｍ² は生育阻害を誘導するこ
とを示していた。これらの結果全ては、操作された植物
で発現するＢｔ２は、機能的毒素で、細菌のＢｔ２遺伝
子の産物と同じ範囲の効力の毒性を示すことを提示して
いる。

【００７９】中間体クローニング・ベクターと雑種プラ
スミドベクターを含む細胞の培養は、ドイツ連邦共和
国、ゲッチンゲン、グリスバッハ通り、８Ｄ−３４０
０、バイオテクノロジー研究有限責任会社、微生物のド
イツ・コレクションに寄託され次の様な寄託番号が割り
当られている：

【００８０】

【表１】 大腸菌Ｋ５１４の培養体は市販されている。特許請求の
範囲より定義される本発明の思想と技術的範囲からはず
れることなしに変更及び修飾はならしうるものであり、
これも本発明の範囲に属すると理解されている。

【００８１】

【表２】

【００８２】

【表３】

【００８３】

【表４】

【００８４】

【表５】

【００８５】

【表６】

【００８６】

【表７】

【００８７】

【表８】

【図面の簡単な説明】

【図１】結晶蛋白のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を示す。

【図２】プラスミドｐＥｃｏＲ２５１を模式的に示す。

【図３】Ｂ．ｔ．ｂｅｒｌｉｎｅｒ １７１５プラスミ
ドの挿入断片の制限酵素地図を示す。

【図４】大腸菌Ｋ５１４（Ｂｔ２００）のリセートのＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

【図５】イムノブロッティングの結果を示す。

【図６】異なる血清を用いたイムノブロッティングの結
果を示す。

【図７】Ｂｔ２蛋白のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

【図８】ＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図９Ａ】Ｂ．ｔ．ベルライナー結晶についての異なる
抗原蛋白でのＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図９Ｂ】Ｂ．ｔ２についての異なる抗原蛋白でのＥＬ
ＩＳＡの結果を示す。

【図１０】１３０Ｋｄ蛋白のＮ未アミノ酸配列の比較を
示す。

【図１１】免疫学的なポリペプチドの検出法を示す。

【図１２】Ｂｔ２遺伝子断片及び配列領域の制限酵素地
図を示す。

【図１３Ａ】Ｂｔ２遺伝子のＤＮＡ配列とアミノ酸配列
の一部を示す。

【図１３Ｂ】Ｂｔ２遺伝子のＤＮＡ配列とアミノ酸配列
の一部を示す。

【図１３Ｃ】Ｂｔ２遺伝子のＤＮＡ配列とアミノ酸配列
の一部を示す。

【図１４Ａ】Ｂｔ２と他のＢｔ蛋白の一部のアミノ酸配
列の比較を示す。

【図１４Ｂ】Ｂｔ２と他のＢｔ蛋白の一部のアミノ酸配
列の比較を示す。

【図１４Ｃ】Ｂｔ２と他のＢｔ蛋白の一部のアミノ酸配
列の比較を示す。

【図１５】ｐＨＤ１６０の構築を示す。

【図１６】他のＢｔ２遺伝子カセットを示す。

【図１７】プラスミドｐＬＢ１０の構築を示す。

【図１８】Ｂｔ２ ３′端欠失株を示す。

【図１９】イムノブロッティングの結果を示す。

【図２０】ｐＬＢ８３４とｐＬＢ８７９の３′末端を示
す。

【図２１】プロモーターとカセットの連結部のＤＮＡ配
列を示す。

【図２２】ｐＨＤ２０８の構築を示す。

【図２３】ｐＧＶ８３１の構築を示す。

【図２４】ｐＧＶ３８５０とｐＨＤ２０５のＴ領域を示
す。

【図２５】ｐＧＶ２２６０とｐＨＤ２０８のＴ領域を示
す。

【図２６Ａ】一つの中間体発現ベクターを示す。

【図２６Ｂ】一つの中間体発現ベクターを示す。

【図２６Ｃ】一つの中間体発現ベクターを示す。

【図２６Ｄ】一つの中間体発現ベクターを示す。

【図２６Ｅ】一つの中間体発現ベクターを示す。

【図２６Ｆ】一つの中間体発現ベクターを示す。

【図２６Ｇ】一つの中間体発現ベクターを示す。

【図２６Ｈ】一つの中間体発現ベクターを示す。

【図２６Ｉ】一つの中間体発現ベクターを示す。

【図２６Ｊ】一つの中間体発現ベクターを示す。

【図２７】タバコカルスのＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図２８】タバコカルスのＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図２９】タバコカルスのＥＬＩＳＡの結果を示す。

【図３０Ａ】Ｂｔ２の免疫学的検出法の一部を示す。

【図３０Ｂ】Ｂｔ２の免疫学的検出法の残りの一部を示
す。

【図３１】Ｐ３５Ｓ−１とＰ３５Ｓ−２プロモーターの
ＤＮＡ配列を示す。

【図３２】ｐＧＳＨ５０の構築を示す。

【図３３】ｐＧＶ１５００の構築を示す。

【図３４】ｐＡＧＳ００７の構築を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 マルク チヤールズ エルネスト バン モンタグ ベルギー国ブリユツセル，デ ストラサル トストラート 120 (72)発明者 マルク アルベルト バエツク ベルギー国ゼムスト，アールスコトセバー ン ４ (72)発明者 マルクス フローレント オスカー ザボ ウ ベルギー国ジエント，エルペルステーグ 70 (72)発明者 ヤン ヨゼフ アウグスト レーマンズ ベルギー国ヘウスデン，エレボホテン 38 (72)発明者 ヘルマヌス フランシスカス パウルス ホフテ ベルギー国ジエント，ロゼマリユンストラ ート 34

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記配列図により示される蛋白質をコー
   ドするＤＮＡ断片よりなる組み換えＤＮＡ： 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 【化６】
2. 【請求項２】 該ＤＮＡ断片が上記配列図に示される第
   １位のアミノ酸から第７５０のアミノ酸までのアミノ酸
   配列よりなる蛋白をコードしているＤＮＡである請求項
   第１項に記載の組み換えＤＮＡ。
3. 【請求項３】 該ＤＮＡ断片が上記配列図で示されるＤ
   ＮＡである請求項第１項に記載の組み換えＤＮＡ。
4. 【請求項４】 該ＤＮＡ断片が上記配列図で示される第
   １４１位のヌクレオチドから第２３１４位のヌクレオチ
   ドよりなるＤＮＡである請求項第１項に記載の組み換え
   ＤＮＡ。
5. 【請求項５】 下記配列図により示される蛋白質をコー
   ドするＤＮＡ断片： 【化７】 【化８】 【化９】 【化１０】 【化１１】 【化１２】
6. 【請求項６】 該ＤＮＡが上記配列図の第１位のアミノ
   酸から第７２５位までのアミノ酸配列よりなる蛋白質を
   コードしているＤＮＡである請求項第５項のＤＮＡ断
   片。