JPH08508101A - 免疫検定法の信号対ノイズ比の改善方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ナトリウムおよびマグネシウムからなる群から選ばれるカチオンと、臭化物、硝酸塩および過塩素酸塩からなる群から選ばれるアニオンとを有する少なくとも一つの塩を、信号対ノイズ比を改善するに十分でかつ当該塩が被検体の抗原性を増加しない量だけ、試料に添加することにより、免疫検定法の性能を改善する方法。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫検定法の信号対ノイズ比の改善方法 発明の技術分野 本発明は、検定法（アッセイ）の性能改善に関し、より詳細には、ナトリウム およびマグネシウムからなる群から選ばれるカチオンと、臭化物、硝酸塩および 過塩素酸塩からなる群から選ばれるアニオンとを有する少なくとも一つの塩を、 免疫検定法（イムノアッセイ）の信号対ノイズ比を改善するに十分でかつ当該塩 が被検体の抗原性（免疫原性）を増加しない量だけ、試料に添加することにより 、免疫検定法の信号対ノイズ比を改善することに関する。 発明の背景 検定法、特に免疫検定法は、世界中で主要な健康問題を構成するAIDS等の感染 病はもとより、細菌性、ウイルス性および寄生的な病気の診断手段として広く用 いられている。 免疫検定法は、一般的には、血清または他の生物学的流体中の被検体を検出し および／または定量のために用いられ、主に、抗体などの特異的結合物質の、試 料中に存在するかもしれない特異的被検体への結合に基づいている。 免疫検定法などの検定の感度は、特定の発生信号の、その系のバックグラウン ドノイズに対する比により決定される。検定のノイズが増加する要因には、検定 の種々の成分に対する抗体などの反応物の非特異的な結合、および検定マトリッ クスのいくつかの内因性の成分の反応性が含まれる。いくつかの内因性の成分は 、酵素基質と反応して、例えば、標識抗体−抗原複合体である標識複合体により 形成される生成物の正確な検出を妨害する反応生成物を生じるものである。典型 的には、添加剤を検定マトリックスに添加して、酵素−抗体複合体の非特異的結 合または検定マトリックスの他の潜在的な阻害成分を減少することによって、 検定ノイズを低下する。 下記に示すように、被検体の検出および／または定量を改善するために、感度 および検出システムの特異性を増加する試みがなされてきた： 1992年10月１日に公開されたＰＣＴ国際公開No.WO92/16846には、試料をカオ トロピックイオン類（chaotropic ions）で前処理するコラーゲン免疫検定法が 開示されている。かかるイオン類は、第５頁および第６頁に、チオシアン酸イオ ン、硝酸イオン、塩素イオン、サリチル酸イオンなどで代表される、タンパク変 性作用および大きいイオン半径を有する一価のアニオンとして、開示されている 。さらに、第27頁には、ここに開示された発明は、コラーゲン検出に限定されず 、免疫反応を用いて部分変性抗原によりその抗原性が促進されている物質を検出 するのに有用であろうという指摘がある。 上記WO92/16846に開示されているカオトロピックイオン類は、一般的には、部 分的変性により抗原性が破壊されている場合の検定には有益ではない。 1989年３月７日にクライグ（Craig）らに発行された米国特許第4,810,630号に は、検定バッファ中にポリエチレンエーテル洗剤を含有させることによって、ペ ルオキシダーゼ結合を用いた酵素免疫検定法の信号対ノイズ比を改善することが 開示されている。 1987年５月26日にアルメンタ（Armenta）らに発行された米国特許第4,668,620 号には、酵素免疫検定法におけるバックグラウンド阻害活性を低下させる方法が 開示されている。この方法は、試料中の抗酵素成分を酵素標識（ラベル）に対し て非反応性とするために、検定を実行する前に、試料中に、過酸などの試薬を、 阻害を実質的に最小限とするに十分な量および条件で混合することを含んでいる 。 1988年７月19日にシュナベル（Schnabel）らに発行された米国特許第4,758,50 8号には、ある種の塩を用いてエステル切断酵素の作用を促進することが開示さ れている。 1988年３月30日に公開された欧州特許出願公開第261,493号には、IgG抗体およ びリューマチ性要因を亜鉛イオンで沈澱して残りの液から分離して除去すること によって、これらIgG抗体およびリューマチ性要因を除去し、それにより、 IgMおよびIgA抗体を検出する方法が開示されている。 1979年12月25日にキム（Kim）らに発行された米国特許第4,180,556号には、過 塩素酸で前処理して、結合タンパクからがん胎児性抗原（CEA）を解離し、過塩 素酸カリウムを沈殿除去することにより、CEAを測定する方法が開示されている 。 発明の要旨 本発明は、試料中の被検体の改善された免疫検定法に関し、 a）少なくとも一つの被検体特異的試薬とともに試料をインキュベートするス テップ；および b）ステップ（a）の生成物を検出するステップ を具備し、 ナトリウムおよびマグネシウムからなる群から選ばれるカチオンと、臭化物、 硝酸塩および過塩素酸塩からなる群から選ばれるアニオンとを有する少なくとも 一つの塩を、免疫検定法の信号対ノイズ比を改善するに十分でかつ当該塩が被検 体の抗原性を増加しない量だけ、試料に添加することからなる改善点を有する。 本発明の他の実施例は、試料中の被検体の改善された免疫検定法に関し、 a）固体相に固定化された捕獲試薬とともに試料をインキュベートするステッ プ； b）ステップ（a）の生成物を検出試薬と反応させるステップ；および c）存在する被検体を検出および／または定量するステップ を具備し、 ナトリウムおよびマグネシウムからなる群から選ばれるカチオンと、臭化物、 硝酸塩および過塩素酸塩からなる群から選ばれるアニオンとを有する少なくとも 一つの塩を、免疫検定法の信号対ノイズ比を改善するに十分でかつ当該塩が被検 体の抗原性（免疫原性）を増加しない量だけ、試料に添加することからなる改善 点を有する。 発明の詳細な説明 本発明の方法は、ナトリウムおよびマグネシウムからなる群から選ばれるカチ オンと、臭化物、硝酸塩および過塩素酸塩からなる群から選ばれるアニオンとを 有する少なくとも一つの塩を試料に添加するものであって、この少なくとも一つ の塩は、免疫検定法の信号対ノイズ比を改善するに十分でさらに当該塩が被検体 の抗原性を増加しない量であることにより、免疫検定法の信号対ノイズ比を改善 するものである。 上述したPCT国際公開No.WO92/16846に開示されたようないくつかの例によると 、ある種のカオトロピックイオンの添加による部分的変性により、抗原性が増加 している。抗原性が増加すると、被検体（コラーゲン）と用いられた抗体との間 の相互作用が増加することになる。 これに対し、本発明方法で用いられた塩は、被検体の抗原性を増加させない、 すなわち、下記の試験例でデータとともに説明するように、被検体と抗原との間 の相互作用が増加しない。 本発明によれば、従来のあらゆる免疫検定法の感度および特異性を改善するこ とができる。 「被検体特異性試薬」という語句は、ここでは、捕獲試薬および／または検出 試薬を示す。捕獲および検出試薬は、免疫特異的結合対の一員である。免疫特異 的結合対は、抗原／抗体系またはハプテン／アンチハプテン系により例示される 。当業者が理解するように、被検体特異的試薬は、捕獲と、被検体上の異なるエ ピトープと結合する検出抗体との両者、または検出抗体のみであり得る。これら の抗体は、ポリクローナルおよび／またはモノクローナルであり得る。ポリクロ ーナルであろうとモノクローナルであろうと、抗体の調製技術は、当業者によく 知られており、したがって、これ以上の説明は必要ない。 加えて、本発明方法は、特定の検定処方に限定されない。本発明の免疫検定法 は、不均一（分離）または均一（非分離）であり得る。それらは、同時にまたは 連続的に実行し得る。 本発明方法を用いて評価し得る被検体の例には、ウイルス性のタンパク類、細 菌性のタンパク類、ホルモン類、薬類などが含まれる。特に、ヒト免疫不全ウイ ルス（Human Immunodeficiency Virus;HIV）、肝炎、エプスタイン−バールウイ ルス（Epstein-Barr virus）、唾液腺ウイルス（シトメガロウイルス）、HTLV-1 、HTLV-IIなどの血液由来の感染作用因を挙げることができる。 本発明方法を用いて感度および特異性を改善し得る商業的に入手可能な免疫検 定の例は、低pHおよび熱の組合せを用いて血清およびプラズマ（血漿）中で抗原 ／抗体複合体を解離するように設計されたDuPont HIV-1 p24 Acid Disruption D ifference Immune Complex Disruption Kitと複合して用いられるDuPont HIV-1 p24 Core Profile ELISAである。この検定は、下記試験例で詳しく説明する。 本発明の重要な態様は、ナトリウムおよびマグネシウムからなる群から選ばれ るカチオンと、臭化物、硝酸塩および過塩素酸塩からなる群から選ばれるアニオ ンとを有する少なくとも一つの塩を、免疫検定法の信号対ノイズ比を改善する効 果がありかつ当該塩が被検体の抗原性を増加しない量だけ、試料に添加すること にある。 本発明の実施のために好適な塩は、臭化ナトリウムである。また、臭化マグネ シウム、硝酸ナトリウム、硝酸マグネシウム、および過塩素酸ナトリウムにも言 及することができる。効果的な濃度は、一般的には、0.05Mおよび0.5Mの間にあ る。 最適の、または好ましい濃度の選択は、多くの方法で行うことができる。これ らの方法は、免疫検定法を開発する当業者にとって自明であり、免疫検定の他の 成分を最適化するために用いられる方法である。 試験例１ 上述したDuPont HIV-1 p24 Acid Disruction Disruption（ADD）キットと複合 したDuPont HIV-1 p24 Core Profile ELISA抗原検定を、試料を検定するために 用いた。ADDキットは、低pHおよび熱の組合せを用いて血清およびプラズマ（血 漿）中で抗原／抗体複合体を解離するために用いられる。1.5Mグリシン試薬を用 いて各試料を酸性に、すなわちpH1.85にし、37℃で１時間インキュベート した。１時間後、各試料を1.5Mのトリス（TRIS）で中和してpH11とし、DuPont H IV-1 p24 Core Profile ELISAで検定した。 DuPont HIV-1 p24 Core Profile ELISA抗原検定は、マイクロタイター・プレ ート・ウエルに固定化された抗HIV p24マウスモノクローナル抗体を、利用する 。次いで、固定されたモノクローナル抗体は、試料中のウイルスの溶菌（lysis 上に遊離されたHIV-1 p24抗原を捕獲する。捕獲された抗原は、HIV-1 p24コア抗 原に対するビオチニル化（biotinylated）ポリクローナル抗体と複合され、スト レプタビジン（streptavidin）−HRP（ホルセラディッシュ（horseradish）ペル オキシダーゼ）複合体として試験（probe）される。次に、複合体を、捕獲され たHIV-1 p24コア抗原の量に直接比例する黄色を生成するオルトフェニレンジア ミン-HCl（OPD）とのインキュベーションにより検出する。各ウエルの吸光度を マイクロプレート・リーダ（microplate reader）を用いて決定し、HIV-1 p24コ ア抗原標準曲線の吸光度に対応して検定する。 １．試薬 グリシン試薬 これは、試料を酸性にして約pH2.0にするために用いられる。グリシン試薬は 、1.5MグリシンでpHl.85である。 成分％ グリシン 11.3％ HCl 9.6％ 蒸留水 79.1％ NaBr添加グリシン グリシン試薬 30％ 5MのNaBr水溶液 15％ 蒸留水 55％ トリス（Tris）試薬 これは1.5Mのトリスで、pH11であり、解離後の試料を中和するために用いられ る。 成分％ トリス塩基 17.0％ 蒸留水 83.0％ ２．試料調製 16個のHIV陰性血清／プラズマ（血漿）試料、およびADDキット陽性コントロー ルを評価した。 下記のものをブランクのマイクロタイター・プレートのウエルに添加した： a）20μｌの５％Triton X-100、 b）90μｌの試料または陽性コントロール、 c）90μｌのグリシン試薬、または臭化ナトリウム塩を添加したグリシン試 薬。 これらを37℃で１時間インキュベートした。１時間後、90μｌの1.5MトリスpH 11を各ウエルに添加し、室温で10分間インキュベートした。 ３．検定 次いで、試料混合物（150μｌ）をHIV-1 p24 Core Profile ELISAプレートに 移し、37℃で２時間インキュベートした。次に、マイクロタイター・プレートの ウエルを洗浄し、100μｌのビオチニル化検出抗体を各ウエルに添加し、37℃で １時間インキュベートした。次いで、各ウエルを洗浄し、ストレプタビジン-HRP 複合体の1:25希釈液を添加して37℃で15分間インキュベートし、続いてウエルを 再度洗浄した。OPD基体を添加して室温で30分間インキュベートし、キットスト ップ溶液（4N硫酸）で反応を停止し、490-650nmの吸光度を決定した。 ４．結果 結果は下記表１に示す。16個の試料および陽性コントロールのそれぞれの吸光 度を、グリシン試薬のみを用いて、およびグリシンと臭化ナトリウム塩とを用い て示した。結果は、本発明を用いて劇的な改善が得られたことを示している。結 果はまた、被検体の抗原性が、検定の信号対ノイズ比を改善するに十分な量の塩 の添加により増加しなかったことを示している。試料（陰性９）に関連して、バ ックグラウンドが非常に低いので、信号対ノイズ比を改善する余地が非常に小さ いことに注目すべきである。 試験例２ この実験では、同様に、DuPont HIV-1 p24 Core Profile ELISAをDuPont HIV- 1 p24 Acid Disruction Disruption（ADD）キットに複合して用い、信号対ノイ ズ比の改善を評価した。加えて、DuPont ELAST（商標）ELISA増幅システムを用 いた。陽性および陰性コントロールキットは、試験した各試薬に対して二通りに 実行した。 １．試薬 グリシン試薬 成分％ グリシン 11.3％ HCl 9.6％ 蒸留水 79.1％ NaBr添加グリシン 成分％ グリシン試薬 30％ 5MのNaBr水溶液 15％ 蒸留水 55％ MgBr₂添加グリシン 成分％ グリシン試薬 30％ 2.5MのMgBr₂水溶液 15％ 蒸留水 55％ NaNO₃添加グリシン 成分％ グリシン試薬 30％ 2.5MのNaNO₃水溶液 20％ 蒸留水 50％ Mg（NO₃）₂添加グリシン 成分％ グリシン試薬 30％ 2.5MのMg（NO₃）₂水溶液 10％ 蒸留水 60％ NaClO₄添加グリシン 成分％ グリシン試薬 30％ 2.5MのNaClO₄水溶液 5％ 蒸留水 65％ ２．試料調製 下記のものをブランクのマイクロタイター・プレートのウエルに添加した： a）20μｌの５％Triton X-100、 b）90μｌの陽性または陰性コントロール、 c）90μｌのグリシン試薬、または塩を添加したグリシン試薬。 これらを37℃で１時間インキュベートした。１時間後、90μｌの1.5MトリスpH 11を各ウエルに添加し、室温で10分間インキュベートした。 ３．検査 次いで、試料混合物（150μｌ）をHIV-1 p24 Core Profile ELISAプレートに 移し、37℃で２時間インキュベートした。次に、マイクロタイター・プレートの ウエルを洗浄し、100μｌのビオチニル化検出抗体を各ウエルに添加し、37℃で １時間インキュベートした。次いで、各ウエルを洗浄し、ストレプタビジン-HRP 複合体の1:400希釈液を添加して37℃で15分間インキュベートし、続いてウエル を再度洗浄した。検定のこの時点で、ELASTキット試薬を用いた。ビオチニル− チラミド（biotinyl-tyramide）試薬を10μl/ml希釈剤に調製し、各ウエルに添 加し、室温で15分間インキュベートした。次いで、各ウエルを洗浄し、ストレプ タビジン-HRP複合体の1:500希釈液を添加して室温で30分間インキュベートし、 続いてウエルを再度洗浄した。HIV-1 p24 Core Profile ELISAキットのOPD基体 を添加して室温で30分間インキュベートし、キットストップ溶液（4N硫酸）で反 応を停止し、490-650nmの吸光度を決定した。 ４．結果 各試薬の結果は下記表２に示す。これらの結果は、臭化物、硝酸塩または過塩 素酸塩の少なくとも一つの塩が存在すると、信号対ノイズ比が改善され、被検体 の抗原性が増加しないことを示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．試料中の被検体の改善された免疫検定法において、 a）少なくとも一つの被検体特異的試薬とともに試料をインキュベートするス テップ；および b）ステップ（a）の生成物を検出するステップ を具備し、 ナトリウムおよびマグネシウムからなる群から選ばれるカチオンと、臭化物、 硝酸塩および過塩素酸塩からなる群から選ばれるアニオンとを有する少なくとも 一つの塩を、前記免疫検定法の信号対ノイズ比を改善するに十分でかつ当該塩が 被検体の抗原性を増加しない量だけ、試料に添加することを特徴とする免疫検定 法。 ２．請求項１において、前記塩が臭化ナトリウムである免疫検定法。 ３．請求項１において、前記被検体がHIVである免疫検定法。 ４．試料中の被検体の改善された免疫検定法において、 a）固体相に固定化された捕獲試薬とともに試料をインキュベートするステッ プ； b）ステップ（a）の生成物を検出試薬と反応させるステップ；および c）存在する被検体を検出および／または定量するステップ を具備し、 ナトリウムおよびマグネシウムからなる群から選ばれるカチオンと、臭化物、 硝酸塩および過塩素酸塩からなる群から選ばれるアニオンとを有する少なくとも 一つの塩を、前記免疫検定法の信号対ノイズ比を改善するに十分でかつ当該塩が 被検体の抗原性を増加しない量だけ、試料に添加することを特徴とする免疫検定 法。 ５．請求項４において、前記塩が臭化ナトリウムである免疫検定法。 ６．請求項４において、前記被検体がHIVである免疫検定法。