JPH0851990A

JPH0851990A - マレイン酸の異性化方法

Info

Publication number: JPH0851990A
Application number: JP19043994A
Authority: JP
Inventors: Makoto Goto; 誠後藤; Masato Terasawa; 真人寺沢; Hideaki Yugawa; 英明湯川
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1994-08-12
Filing date: 1994-08-12
Publication date: 1996-02-27

Abstract

(57)【要約】【構成】マレイン酸イソメラーゼ含有菌体又はその処
理物を、マレイン酸とフマル酸の混合物に作用させてフ
マル酸を生成せしめることを特徴とするマレイン酸の異
性化方法。【効果】本発明の方法によれば、酵素法により、効率
よく、かつ高収率でマレイン酸を異性化し、フマル酸を
製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、マレイン酸の異性化法
に関し、さらに詳しくは、マレイン酸とフマル酸の混合
物に、マレイン酸イソメラーゼを含有する微生物又はそ
の処理物を作用させることにより効率よくマレイン酸を
異性化する方法に関する。マレイン酸の異性化物である
フマル酸は、アスパラギン酸、リンゴ酸等ファインケミ
カルズの原料として有用な有機酸である。

【０００２】

【従来の技術】マレイン酸の異性化方法としては、主に
化学的方法が提案されている（米国特許第 2,816,923
号、同第 2,955,136号、同第 2,332,992号）が、反応平
衡によりフマル酸への変換率が制約を受けること、高温
反応であるためにマレイン酸あるいはフマル酸の劣化が
起こり、副生成物を生成し、収量が低くなるなどの問題
点を有している。

【０００３】一方、酵素法による異性化に関しては、マ
レイン酸イソメラーゼがマレイン酸を異性化してフマル
酸を生成することが知られている〔K.Otsuka Agric.Bio
l.Chem. 、25、（9 ）、726 (1961) 〕ものの、酵素学
的性質について検討されているに過ぎず、産業上の応用
の観点からの検討はまったくなされていない。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、あらたな観
点から効率よくマレイン酸を異性化する方法の提案を目
的としてなされたものである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を達成すべく、鋭意研究を重ねた結果、マレイン酸イソ
メラーゼ含有微生物又はその処理物を、マレイン酸とフ
マル酸の混合物を含有する水溶液に作用させることによ
り高濃度のマレイン酸でも効率よく異性化できることを
見いだし、本発明を完成するに至った。

【０００６】すなわち、本発明は、マレイン酸イソメラ
ーゼ含有菌体又はその処理物を、マレイン酸とフマル酸
の混合物を含有する水性溶液に作用させてフマル酸を生
成せしめることを特徴とするマレイン酸の異性化方法で
ある。以下、本発明を詳細に説明する。

【０００７】本発明の方法に用いられる微生物は、マレ
イン酸を異性化してフマル酸を生成しうる能力を有する
微生物、すなわちマレイン酸イソメラーゼを含有する微
生物（以下これを「マレイン酸イソメラーゼ含有微生
物」と略称することがある）であれば特に制限はなく、
例えば、マレイン酸イソメラーゼを含有するアルカリゲ
ネス属、シュードモナス属、キサントモナス属に属する
微生物が挙げられる。具体的には、アルカリゲネス・フ
ェカリス（Alcaligenes faecalis）IFO 12669 、同IFO
13111 、同IAM 1473、アルカリゲネス・ユウトロフス
（Alcaligeneseutrophus ）IAM 12305 、シュードモナ
ス・フルオレッセンス（Pseudomonas fluolescens ）AT
CC 23728、キサントモナス・マルトモナス（Xanthomona
s marutomonas ）ATCC 13270等を例示することができ
る。これらの微生物は、財団法人発酵研究所（ＩＦ
Ｏ）、東京大学分子細胞生物学研究所細胞・機能高分子
総合センターＩＡＭカルチャーコレクション、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）等
から入手可能である。

【０００８】さらに、上記微生物由来のマレイン酸イソ
メラーゼ遺伝子を組換えし、マレイン酸イソメラーゼ活
性を増強させた遺伝子組換え微生物を用いる事もでき
る。上記マレイン酸イソメラーゼ含有微生物の培養は、
それ自体既知の通常用いられる、肉エキス、酵母エキ
ス、ペプトン等の天然栄養源を添加した培地で行うこと
ができる。該培地には、必要に応じ、窒素源として、塩
化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウ
ム等のアンモニウム塩、硝酸ナトリウム、硝酸カリウ
ム、硝酸アンモニウム等の硝酸塩、アンモニア；無機物
としては、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄、マ
ンガン、亜鉛、銅等を添加することもできる。

【０００９】また、マレイン酸異性化能を高めるために
は、培地中にマレイン酸、又はマロン酸を添加すること
が望ましい。マレイン酸及びマロン酸の添加濃度は１０
〜２００ｍＭ、好ましくは５０〜１００ｍＭの範囲内
が適当である。上記マレイン酸イソメラーゼ含有微生物
の培養は、通気攪拌、振盪等の好気的条件下で行い、培
養温度は２５〜４０℃、好ましくは２８〜３５℃が適当
である。培養途中のｐＨは６〜９付近とすることがで
き、培養中のｐＨの調整は、酸又はアルカリを添加して
行うことができる。

【００１０】本発明の方法は、上記の如く微生物を培養
することにより得られる培養物から遠心分離等により回
収された菌体又は菌体を必要により固定化、破砕処理、
部分精製等した処理物を用いて行うことができる。ま
た、菌体は、培養物から回収されたまま、あるいは適当
な緩衝液、例えば０．０５Ｍ〜０．２Ｍ程度のリン酸緩
衝液（ｐＨ６〜９）で洗浄された洗浄菌体であってもよ
い。菌体等の固定化は、アクリルアミドモノマー、アル
ギン酸又はカラギーナン等の適当な担体に固定化させる
方法により行うことができる。

【００１１】かくして得られるマレイン酸イソメラーゼ
含有微生物又はその処理物を、マレイン酸とフマル酸の
混合物を含有する水性溶液に作用させることにより、効
率的にマレイン酸が異性化せしめられてフマル酸が生成
する。上記の如く調整された菌体又はその処理物の使用
量は特に制限されるものではなく、水性溶液の容量を基
準として１〜３０％（ｗｔ／ｖｏｌ）が適当である。

【００１２】反応に用いる水性溶液は、マレイン酸とフ
マル酸の混合物を含有する水溶液又は適当な緩衝液、例
えば０．０５〜０．２Ｍ程度のリン酸緩衝液（ｐＨ６〜
１０）とすることができる。水性溶液には、菌体の透過
性を向上させる目的で、トルエン、キシレン、非イオン
性界面活性剤等を０．０５〜２％（ｗｔ／ｖｏｌ）程度
添加することができる。

【００１３】水性溶液中のマレイン酸とフマル酸の混合
物の重量比は、９８：２〜７０：３０好ましくは９０：
１０〜７５：２５の範囲内が適当である。また、添加す
るマレイン酸とフマル酸の混合物の濃度は０．１〜２ｍ
ｏｌ／Ｌ、好ましくは０．５〜１．５ｍｏｌ／Ｌの範囲
内が適当である。上記した水性溶液における酵素反応温
度は、通常２０〜４５℃、好ましくは２５〜３５℃の範
囲内が適当であり、反応中の水性溶液のｐＨは６〜１
０、好ましくは７〜９付近とすることができ、ｐＨの調
整は、酸又はアルカリを水性溶液に添加して行うことが
できる。通常、マレイン酸とフマル酸の混合物は酸の形
態で用いられるので、ｐＨの調整はアルカリを添加して
行うことができ、その際に用いられるアルカリとして
は、例えば、アンモニア、苛性ソーダ、苛性カリ等を挙
げることができる。また、反応時間は、通常１０〜７２
時間とすることができる。

【００１４】原料として用いられるマレイン酸とフマル
酸の混合物は、酸の形態のみならず、それらの無水物又
は塩も原料として用いることができる。マレイン酸及び
フマル酸の無水物は、水に溶解すると容易に酸の形態に
変換する。また、マレイン酸及びフマル酸の塩として
は、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等を挙げること
ができる。

【００１５】かくして得られる高濃度のフマル酸を含有
する水溶液は、そのままＬ−リンゴ酸やＬ−アスパラギ
ン酸の製造原料として用いることができる。また該水溶
液を硫酸等でｐＨ２〜３の酸性に調整することにより、
フマル酸を結晶として回収することができる。

【００１６】

【実施例】以下のに本発明を説明してきたが、下記の実
施例により本発明を更に具体的に説明する。しかしなが
ら、下記の実施例は本発明の具体的認識を得る一助とみ
なすべきものであり、本発明の範囲を何等制限するもの
ではない。

【００１７】

【実施例１】（１）マレイン酸イソメラーゼ含有微生物の培養肉エキス１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ及び
マレイン酸１０ｇを、蒸留水で溶解し、１０００ｍｌと
した培地（苛性ソーダでｐＨ７．０に調整）１００ｍｌ
を５００ｍｌ容の三角フラスコに分注し、１２０℃、２
０分間滅菌処理したものに、アルカリゲネス・フェカリ
ス IFO 12669菌株を植菌し、３０℃にて２４時間振盪培
養した。また、上記と同様の培地１０００ｍｌを３Ｌ容
のジャーファーメンターに入れ、１２０℃、２０分間滅
菌処理したものに、上記振盪培養液３０ｍｌを接種し、
これを３０℃にて２４時間培養した。得られた培養液を
遠心分離（８０００ｒｐｍ、１５分、４℃）して集菌し
た菌体を、０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で１回
洗浄し、以下の反応に供した。

【００１８】（２）マレイン酸イソメラーゼによるマレ
イン酸の異性化ついで上清のｐＨをアンモニアで７．０に調整し、各上
清に上記方法で回収したマレイン酸イソメラーゼ菌体
（全量１５ｇ）を添加し、３０℃で１時間反応させた。
各試験区の反応液中のマレイン酸及びフマル酸を高速液
体クロマトグラフィー（島津製、ＬＣ−５Ａ）で定量
し、単位時間当たりのマレイン酸からのフマル酸の生成
量を求めた。その結果を第１表に、フマル酸が存在しな
い区（マレイン酸：フマル酸＝１００：０）の生成量を
１００とする相対値で示す。

【００１９】

【表１】第１表マレイン酸：フマル酸（混合比）時間当りのマレイン酸から（総量；１．５mole／Ｌ）のフマル酸生成量１００：０１００９８：２１０６９５：５１１０９０：１０１２８８０：２０１２７７５：２５１１５７０：３０１０８６０：４０９５５０：５０９０

【００２０】

【発明の効果】本発明の方法によれば、酵素法により、
効率よく、かつ高収率でマレイン酸を異性化し、フマル
酸を製造することができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】マレイン酸イソメラーゼ含有微生物又は
その処理物を、マレイン酸とフマル酸の混合物を含有す
る水性溶液に作用させてフマル酸を生成せしめることを
特徴とするマレイン酸の異性化方法。
【請求項２】マレイン酸とフマル酸の混合物のマレイ
ン酸とフマル酸の重量比が９８：２〜７０：３０の範囲
内である請求項１記載の方法。