JPH09121892A - 還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬および測定方法 - Google Patents
還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬および測定方法Info
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 液体試料中に共存する目的物以外の還元性物
質による不所望のブランク値の発生を防止し、試料中の
測定対象成分である還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドおよび／または還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフェートを選択性よく測定する。 【解決手段】 電子伝達体の存在下、スチリル色素を、
液体試料に含まれる還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドおよび／または還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフェートと反応させてスチリル色
素を発色させ、可視部の吸光度の変化を測定することに
より、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドお
よび／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドホスフェートを測定する。
質による不所望のブランク値の発生を防止し、試料中の
測定対象成分である還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドおよび／または還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフェートを選択性よく測定する。 【解決手段】 電子伝達体の存在下、スチリル色素を、
液体試料に含まれる還元型ニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドおよび／または還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドホスフェートと反応させてスチリル色
素を発色させ、可視部の吸光度の変化を測定することに
より、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドお
よび／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオ
チドホスフェートを測定する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、還元型ニコチンア
ミド補酵素、すなわち還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤ
ＰＨ）の測定用試薬および測定方法に関し、更に詳しく
は、電子伝達体の存在下で、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを
含む液体試料にスチリル色素を反応させて、可視部の吸
光度の変化を測定することを特徴とするＮＡＤＨおよび
／またはＮＡＤＰＨ並びにこれらに関連する酵素や基質
の測定方法およびこの測定方法に用いる試薬に関する。
ミド補酵素、すなわち還元型ニコチンアミドアデニンジ
ヌクレオチド（ＮＡＤＨ）および／または還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤ
ＰＨ）の測定用試薬および測定方法に関し、更に詳しく
は、電子伝達体の存在下で、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨを
含む液体試料にスチリル色素を反応させて、可視部の吸
光度の変化を測定することを特徴とするＮＡＤＨおよび
／またはＮＡＤＰＨ並びにこれらに関連する酵素や基質
の測定方法およびこの測定方法に用いる試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの測定方法と
しては、以下のような方法が知られている： (１)ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの有する紫外部の吸収ま
たは蛍光を直接測定する方法、(２)触媒の存在下、ＮＡ
ＤＨおよびＮＡＤＰＨとレサズリンの反応によって生成
したレゾルフィンの蛍光を測定する方法、(３)電子伝達
体の存在下、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨとＮＴＢやＭＴ
Ｔなどのテトラゾリウム塩とを反応させてホルマザン色
素を生成し、その可視部の吸収を測定する方法。
しては、以下のような方法が知られている： (１)ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの有する紫外部の吸収ま
たは蛍光を直接測定する方法、(２)触媒の存在下、ＮＡ
ＤＨおよびＮＡＤＰＨとレサズリンの反応によって生成
したレゾルフィンの蛍光を測定する方法、(３)電子伝達
体の存在下、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨとＮＴＢやＭＴ
Ｔなどのテトラゾリウム塩とを反応させてホルマザン色
素を生成し、その可視部の吸収を測定する方法。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】上記測定方法の内、紫
外部の吸収及び蛍光を測定する方法(１)は、尿などを測
定対象とする場合には、紫外部に吸収を有するまたは蛍
光を有する共存物質、たとえば、リボフラビンなどのビ
タミンＢ2剤、フルオレッセインナトリウムなどの蛍光
造影剤によって妨害を受けるという欠点を有している。
また、上記テトラゾリウム塩を発色剤として用いる方法
は、試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビンなど
の還元性物質の影響で、不所望のブランク発色を生じる
という欠点を有している。
外部の吸収及び蛍光を測定する方法(１)は、尿などを測
定対象とする場合には、紫外部に吸収を有するまたは蛍
光を有する共存物質、たとえば、リボフラビンなどのビ
タミンＢ2剤、フルオレッセインナトリウムなどの蛍光
造影剤によって妨害を受けるという欠点を有している。
また、上記テトラゾリウム塩を発色剤として用いる方法
は、試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビンなど
の還元性物質の影響で、不所望のブランク発色を生じる
という欠点を有している。
【０００４】また、ＮＡＤＨを用いずに生体試料中の成
分を測定する方法として、酸化酵素を用いる方法がある
が、テトラゾリウム塩を用いる方法と同様に、試料中に
共存するアスコルビン酸、ビリルビンなどの還元性物質
による影響を受けて発色が阻害されるという欠点を有し
ている。
分を測定する方法として、酸化酵素を用いる方法がある
が、テトラゾリウム塩を用いる方法と同様に、試料中に
共存するアスコルビン酸、ビリルビンなどの還元性物質
による影響を受けて発色が阻害されるという欠点を有し
ている。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、前記課題を解
決すべく鋭意研究に取り組んだ結果、ある種のスチリル
色素を電子伝達体の存在下で、ＮＡＤＨおよび／または
ＮＡＤＰＨと作用させると、アスコルビン酸、ビリルビ
ンなどの還元性物質による影響を受けずに、ＮＡＤＨお
よび／またはＮＡＤＰＨを、高い選択性で測定できるこ
とを見い出し、本発明を完成するに至った。
決すべく鋭意研究に取り組んだ結果、ある種のスチリル
色素を電子伝達体の存在下で、ＮＡＤＨおよび／または
ＮＡＤＰＨと作用させると、アスコルビン酸、ビリルビ
ンなどの還元性物質による影響を受けずに、ＮＡＤＨお
よび／またはＮＡＤＰＨを、高い選択性で測定できるこ
とを見い出し、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、式：
【化２】
【０００７】［式中、ｍは、０または１を表し、ｎは、
２〜４の数を表す。Ｚは、５員または６員複素環を形成
する基を表す。ただし、該複素環は置換基を有していて
もよく、該複素環には飽和または不飽和の５員または６
員環が縮合されてもよく、この縮合する５員または６員
環は置換基を有していてもよい。Ｒ1は、置換されてい
てもよい炭素数１〜１０のアルキル基を表し、Ｒ2およ
びＲ3は、それぞれ独立に水素、炭素数１〜１０のアル
キル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、ヒドロキシ
基、ハロゲン原子、スルホン酸基、カルボン酸基または
式：ＮＲ4Ｒ5で表される置換アミノ基を表す。ここで、
Ｒ4およびＲ5は、それぞれ独立にハロゲン原子、ヒドロ
キシ基、炭素数１〜１０のアルキルカルボニルオキシ
基、フェニル基で置換されていてもよい炭素数１〜５の
アルキル基またはアリル基を表し、あるいはＲ4とＲ5で
共同して含窒素５員環または６員環を形成してもよく、
Ｒ4とＲ5の少なくとも一方が、該置換アミノ基の窒素原
子と結合する炭素の隣の炭素と共同して６員環を形成し
てもよい。Ｘは、アニオンを表す。］で示されるスチリ
ル色素の少なくとも１種と、電子伝達体を含んでなる、
ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの測定用試薬、並び
に電子伝達体の存在下、上記スチリル色素を、液体試料
中のＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨと反応させ、可
視部の吸光度の変化を測定することからなる、還元型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／または還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
トの測定方法を提供する。
２〜４の数を表す。Ｚは、５員または６員複素環を形成
する基を表す。ただし、該複素環は置換基を有していて
もよく、該複素環には飽和または不飽和の５員または６
員環が縮合されてもよく、この縮合する５員または６員
環は置換基を有していてもよい。Ｒ1は、置換されてい
てもよい炭素数１〜１０のアルキル基を表し、Ｒ2およ
びＲ3は、それぞれ独立に水素、炭素数１〜１０のアル
キル基、炭素数１〜１０のアルコキシ基、ヒドロキシ
基、ハロゲン原子、スルホン酸基、カルボン酸基または
式：ＮＲ4Ｒ5で表される置換アミノ基を表す。ここで、
Ｒ4およびＲ5は、それぞれ独立にハロゲン原子、ヒドロ
キシ基、炭素数１〜１０のアルキルカルボニルオキシ
基、フェニル基で置換されていてもよい炭素数１〜５の
アルキル基またはアリル基を表し、あるいはＲ4とＲ5で
共同して含窒素５員環または６員環を形成してもよく、
Ｒ4とＲ5の少なくとも一方が、該置換アミノ基の窒素原
子と結合する炭素の隣の炭素と共同して６員環を形成し
てもよい。Ｘは、アニオンを表す。］で示されるスチリ
ル色素の少なくとも１種と、電子伝達体を含んでなる、
ＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨの測定用試薬、並び
に電子伝達体の存在下、上記スチリル色素を、液体試料
中のＮＡＤＨおよび／またはＮＡＤＰＨと反応させ、可
視部の吸光度の変化を測定することからなる、還元型ニ
コチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／または還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
トの測定方法を提供する。
【０００８】スチリル色素を示す上記式（Ｉ）におい
て、Ｚによって形成される複素環の具体例としては、チ
アゾール系の環（例えば、チアゾール、４−メチルチア
ゾール、４−フェニルチアゾール、４,５−ジフェニル
チアゾール）、ベンゾチアゾール系の環（例えば、ベン
ゾチアゾール、５−クロロベンゾチアゾール、６−メト
キシベンゾチアゾール、５−トリフルオロメチルベンゾ
チアゾール、５−カルボキシベンゾチアゾール、５,６
−ジヒドロキシベンゾチアゾール）、ナフトチアゾール
系の環（例えば、α−ナフトチアゾール、β−ナフトチ
アゾール、５−ヒドキシ−β−ナフトチアゾール）、オ
キサゾール系の環（例えば、４−メチルオキサゾール、
４,５−ジフェニルオキサゾール）、ベンゾオキサゾー
ル系の環（例えば、ベンゾオキサゾール、６−ヒドキシ
ベンゾオキサゾール、５−クロロベンゾオキサゾール、
５−フェニルベンゾオキサゾール）、ナフトオキサゾー
ル系の環（例えば、α−ナフトオキサゾール、β−ナフ
トオキサゾール）、セレナゾール系の環（例えば、４−
メチルセレナゾール）、ベンゾセレナゾール系の環（例
えば、ベンゾセレナゾール、５−ヒドキシベンゾセレナ
ゾール、５−クロロベンゾセレナゾール）、チアゾリン
系の環（例えば、チアゾリン）、２−ピリジン系の環
（例えば、２−ピリジン、５−メトキシ−２−ピリジ
ン）、４−ピリジン系の環（例えば４−ピリジン、３−
クロロ−４−ピリジン）、２−キノリン系の環（例え
ば、２−キノリン、６−ヒドロキシ−２−キノリン、６
−エトキシ−２−キノリン）、４−キノリン系の環（例
えば、４−キノリン、６−メトキシ−４−キノリン、６
−クロロ−４−キノリン）、１−イソキノリン系の環
（１−イソキノリン）、３,３−ジアルキルインドレニ
ン系の環(例えば、３,３−ジメチルインドレニン、５−
クロロ−３,３−ジメチルインドレニン、５−カルボキ
シ−３,３−ジメチルインドレニン、５−スルホキシ−
３,３−ジメチルインドレニン、３−シクロヘキシルイ
ンドレニン、５−メチルスルホニル−３,３−ジメチル
インドレニン）、３,３−ジアルキルベンゾインドレニ
ン系の環（例えば３,３−ジメチル−α−ベンゾインド
レニン、３,３−ジメチル−β−ベンゾインドレニ
ン）、ベンゾイミダゾール系の環（例えば、ベンゾイミ
ダゾール、１−アルキル−５,６−ジクロロベンゾイミ
ダゾール、１−アルキル−５−スルホニルベンゾイミダ
ゾール、１−アルキル−５−トリフルオロメチルベンゾ
イミダゾール）の核含有環を含む環などの、５員及び６
員のヘテロ環が挙げられる。
て、Ｚによって形成される複素環の具体例としては、チ
アゾール系の環（例えば、チアゾール、４−メチルチア
ゾール、４−フェニルチアゾール、４,５−ジフェニル
チアゾール）、ベンゾチアゾール系の環（例えば、ベン
ゾチアゾール、５−クロロベンゾチアゾール、６−メト
キシベンゾチアゾール、５−トリフルオロメチルベンゾ
チアゾール、５−カルボキシベンゾチアゾール、５,６
−ジヒドロキシベンゾチアゾール）、ナフトチアゾール
系の環（例えば、α−ナフトチアゾール、β−ナフトチ
アゾール、５−ヒドキシ−β−ナフトチアゾール）、オ
キサゾール系の環（例えば、４−メチルオキサゾール、
４,５−ジフェニルオキサゾール）、ベンゾオキサゾー
ル系の環（例えば、ベンゾオキサゾール、６−ヒドキシ
ベンゾオキサゾール、５−クロロベンゾオキサゾール、
５−フェニルベンゾオキサゾール）、ナフトオキサゾー
ル系の環（例えば、α−ナフトオキサゾール、β−ナフ
トオキサゾール）、セレナゾール系の環（例えば、４−
メチルセレナゾール）、ベンゾセレナゾール系の環（例
えば、ベンゾセレナゾール、５−ヒドキシベンゾセレナ
ゾール、５−クロロベンゾセレナゾール）、チアゾリン
系の環（例えば、チアゾリン）、２−ピリジン系の環
（例えば、２−ピリジン、５−メトキシ−２−ピリジ
ン）、４−ピリジン系の環（例えば４−ピリジン、３−
クロロ−４−ピリジン）、２−キノリン系の環（例え
ば、２−キノリン、６−ヒドロキシ−２−キノリン、６
−エトキシ−２−キノリン）、４−キノリン系の環（例
えば、４−キノリン、６−メトキシ−４−キノリン、６
−クロロ−４−キノリン）、１−イソキノリン系の環
（１−イソキノリン）、３,３−ジアルキルインドレニ
ン系の環(例えば、３,３−ジメチルインドレニン、５−
クロロ−３,３−ジメチルインドレニン、５−カルボキ
シ−３,３−ジメチルインドレニン、５−スルホキシ−
３,３−ジメチルインドレニン、３−シクロヘキシルイ
ンドレニン、５−メチルスルホニル−３,３−ジメチル
インドレニン）、３,３−ジアルキルベンゾインドレニ
ン系の環（例えば３,３−ジメチル−α−ベンゾインド
レニン、３,３−ジメチル−β−ベンゾインドレニ
ン）、ベンゾイミダゾール系の環（例えば、ベンゾイミ
ダゾール、１−アルキル−５,６−ジクロロベンゾイミ
ダゾール、１−アルキル−５−スルホニルベンゾイミダ
ゾール、１−アルキル−５−トリフルオロメチルベンゾ
イミダゾール）の核含有環を含む環などの、５員及び６
員のヘテロ環が挙げられる。
【０００９】Ｒ1の具体例としては、メチル基、エチル
基、イソプロピル基、ブチル基、イソアミル基、オクチ
ル基、２−エチルヘキシル基、ドデシル基などのアルキ
ル基、これらの置換アルキル基が挙げられる。置換アル
キル基の置換基の具体例としては、塩素、臭素、フッ素
及びヨウ素などのハロゲン原子、アリール基（例えば、
フェニル基、ナフチル基）、アルコキシ基、水酸基、カ
ルボン酸基、スルホン酸基などが挙げられる。
基、イソプロピル基、ブチル基、イソアミル基、オクチ
ル基、２−エチルヘキシル基、ドデシル基などのアルキ
ル基、これらの置換アルキル基が挙げられる。置換アル
キル基の置換基の具体例としては、塩素、臭素、フッ素
及びヨウ素などのハロゲン原子、アリール基（例えば、
フェニル基、ナフチル基）、アルコキシ基、水酸基、カ
ルボン酸基、スルホン酸基などが挙げられる。
【００１０】Ｒ2およびＲ3によって置換されたベンゼン
環の具体的例としては、４−ジメチルアミノベンゼン、
１,２,３,４−テトラヒドロキノリン、ユロリジンなど
が挙げられる。
環の具体的例としては、４−ジメチルアミノベンゼン、
１,２,３,４−テトラヒドロキノリン、ユロリジンなど
が挙げられる。
【００１１】Ｘの具体例としては、塩素イオン、臭素イ
オン、フッ素イオン及びヨウ素イオンなどのハロゲンイ
オン；メタンスルホン酸イオン、p-トルエンスルホン酸
イオンなどのスルホン酸イオン；メチル硫酸イオン及び
エチル硫酸イオンなどの硫酸イオンが挙げられ、その
他、過塩素酸イオン、硝酸イオンなどのイオンも例示で
きる。
オン、フッ素イオン及びヨウ素イオンなどのハロゲンイ
オン；メタンスルホン酸イオン、p-トルエンスルホン酸
イオンなどのスルホン酸イオン；メチル硫酸イオン及び
エチル硫酸イオンなどの硫酸イオンが挙げられ、その
他、過塩素酸イオン、硝酸イオンなどのイオンも例示で
きる。
【００１２】又、Ｒ1の置換基がカルボン酸基またはス
ルホン酸基などの酸基を含んでおり、スチリル色素が分
子内塩を形成する場合には、Ｘは必要でない。
ルホン酸基などの酸基を含んでおり、スチリル色素が分
子内塩を形成する場合には、Ｘは必要でない。
【００１３】電子伝達体は、メルドラブルー、１−メト
キシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート
(１−ｍＰＭＳ)、ジアホラーゼなどがあげられるが、ジ
アホラーゼが好ましい。
キシ−５−メチルフェナジニウムメチルサルフェート
(１−ｍＰＭＳ)、ジアホラーゼなどがあげられるが、ジ
アホラーゼが好ましい。
【００１４】スチリル色素は、ＮＡＤＨおよび／または
ＮＡＤＰＨ１モルに対して好ましくは０．１〜１０．０
モル、より好ましくは、０．５〜２．０モル用いればよ
い。電子伝達体、たとえばジアホラーゼは、触媒として
作用するので、その量は触媒量でよい。たとえば、０．
１〜１．０mＫat／lのような割合で用いるとよい。ま
た、色素の選択、例えば式（Ｉ）中のｎの選択により測
定波長を４００〜９００nmまで任意に選択することが可
能である。その他の測定パラメーターは、主として電子
伝達体によって制約を受けるので、例えば電子伝達体が
ジアホラーゼの場合、測定可能なｐＨ域は５〜９（好ま
しくは７〜８）、温度は２０〜４０℃（好ましくは３０
〜３７℃）、測定時間は１〜３０分の間で選択が可能で
ある。
ＮＡＤＰＨ１モルに対して好ましくは０．１〜１０．０
モル、より好ましくは、０．５〜２．０モル用いればよ
い。電子伝達体、たとえばジアホラーゼは、触媒として
作用するので、その量は触媒量でよい。たとえば、０．
１〜１．０mＫat／lのような割合で用いるとよい。ま
た、色素の選択、例えば式（Ｉ）中のｎの選択により測
定波長を４００〜９００nmまで任意に選択することが可
能である。その他の測定パラメーターは、主として電子
伝達体によって制約を受けるので、例えば電子伝達体が
ジアホラーゼの場合、測定可能なｐＨ域は５〜９（好ま
しくは７〜８）、温度は２０〜４０℃（好ましくは３０
〜３７℃）、測定時間は１〜３０分の間で選択が可能で
ある。
【００１５】本発明の測定方法が対象とする液体試料
は、典型的には体液、たとえば血液またはその成分（血
漿、血清など）、尿、髄液などであるが、ＮＡＤＨおよ
び／またはＮＡＤＰＨを含む液体試料ならいずれも本発
明の測定方法の対象となる。
は、典型的には体液、たとえば血液またはその成分（血
漿、血清など）、尿、髄液などであるが、ＮＡＤＨおよ
び／またはＮＡＤＰＨを含む液体試料ならいずれも本発
明の測定方法の対象となる。
【００１６】これらの試料中に含まれる酵素または酵素
の基質などの成分を測定しようとする場合、その酵素と
基質によって生成する物質を還元酵素及び酸化型ニコチ
ンアミド補酵素とともに反応させ、生成する還元型ニコ
チンアミド補酵素の量を本発明の方法により測定する。
これにより、液体試料中の成分の量、濃度を測定するこ
とが出来る。
の基質などの成分を測定しようとする場合、その酵素と
基質によって生成する物質を還元酵素及び酸化型ニコチ
ンアミド補酵素とともに反応させ、生成する還元型ニコ
チンアミド補酵素の量を本発明の方法により測定する。
これにより、液体試料中の成分の量、濃度を測定するこ
とが出来る。
【００１７】また、これらの試薬を吸収可能な担体に含
浸する、または担体に塗布、印刷、噴霧することにより
試験片を作製し、試料中に含まれる酵素又は酵素の基質
などの成分を測定することもできる。担体としては、濾
紙、布、不織布、ポリエチレンテレフタレートフィル
ム、ポリスチレンフィルム、ガラス、セラミックなどが
あげられるが、吸収可能な担体としては、濾紙が好適で
あり、一般的な担体としては、ポリエチレンテレフタレ
ートフイルムが好適である。
浸する、または担体に塗布、印刷、噴霧することにより
試験片を作製し、試料中に含まれる酵素又は酵素の基質
などの成分を測定することもできる。担体としては、濾
紙、布、不織布、ポリエチレンテレフタレートフィル
ム、ポリスチレンフィルム、ガラス、セラミックなどが
あげられるが、吸収可能な担体としては、濾紙が好適で
あり、一般的な担体としては、ポリエチレンテレフタレ
ートフイルムが好適である。
【００１８】
【発明の効果】本発明の測定方法を用いれば、試料中に
共存する目的物以外の還元性物質による不所望のブラン
ク値の発生を防止することが可能となり、試料中の測定
対象成分の測定の選択性を向上させることができる。
共存する目的物以外の還元性物質による不所望のブラン
ク値の発生を防止することが可能となり、試料中の測定
対象成分の測定の選択性を向上させることができる。
【００１９】
【実施例】以下に、実施例を示し、本発明を具体的に説
明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるも
のではない。
明するが、本発明はこれら実施例によって制限されるも
のではない。
【００２０】実施例１および比較例１〜２ 以下の組成の試薬を調製した： 色素： ０.０５ mmol／l ジアホラーゼ ０.８３ mkat／l トリス-ＨＣl(pＨ８.０)：０.２０ mol／l 色素として、実施例１では、Ｚ＝３,３'−ジメチル−５
−カルボキシ−インドレニン、Ｒ1＝ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、
Ｒ2＝Ｎ(ＣＨ3)2、Ｒ3＝Ｈ、Ｘ＝Ｂr-である上記式で示
されるスチリル色素を使用し、比較例１では、テトラゾ
リウム塩（ＩＮＴ:２−(４−インドフェニル)−３−(４
−ニトロフェニル)−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリ
ウムクロリド)を使用し、比較例２では、シアニン色素
(９−エチル−５,５'−ジメトキシ−３,３'−ジスルホ
プロピル−２,２'−チアカルボシアニンヒドロキシドト
リエチルアミン塩を使用した。
−カルボキシ−インドレニン、Ｒ1＝ＣＨ2ＣＨ2ＯＨ、
Ｒ2＝Ｎ(ＣＨ3)2、Ｒ3＝Ｈ、Ｘ＝Ｂr-である上記式で示
されるスチリル色素を使用し、比較例１では、テトラゾ
リウム塩（ＩＮＴ:２−(４−インドフェニル)−３−(４
−ニトロフェニル)−５−フェニル−２Ｈ−テトラゾリ
ウムクロリド)を使用し、比較例２では、シアニン色素
(９−エチル−５,５'−ジメトキシ−３,３'−ジスルホ
プロピル−２,２'−チアカルボシアニンヒドロキシドト
リエチルアミン塩を使用した。
【００２１】検体 測定用検体として、以下の４種を用いた： (１)蒸留水 (２)β−ＮＡＤＨ(２５ μmol／l)［蒸留水中] (３)アスコルビン酸(０．５g／l) (４)β−ＮＡＤＨ(２５μmol／l)＋アスコルビン酸
(０．５g／l)測定手順 以上の試薬と検体を用い、以下の手順で、測定を行っ
た： (１)反応セルにトリス−ＨＣl(pＨ８.０)を２．６５ml
量りとる。 (２)色素液０．１０ml、ジアホラーゼ０．１５mlを反応
セルに加え撹拌した後３０℃で５分間インキュベートす
る。 (３)検体を０．１０ml反応セルに加え３０℃でインキュ
ベートしながら、２分後及び５分後の吸光度を測定す
る。
(０．５g／l)測定手順 以上の試薬と検体を用い、以下の手順で、測定を行っ
た： (１)反応セルにトリス−ＨＣl(pＨ８.０)を２．６５ml
量りとる。 (２)色素液０．１０ml、ジアホラーゼ０．１５mlを反応
セルに加え撹拌した後３０℃で５分間インキュベートす
る。 (３)検体を０．１０ml反応セルに加え３０℃でインキュ
ベートしながら、２分後及び５分後の吸光度を測定す
る。
【００２２】結果 試薬液と検体(１)〜(４)それぞれとの反応について得ら
れた吸光極大波長での吸光度値を表１に示す。
れた吸光極大波長での吸光度値を表１に示す。
【００２３】
【表１】
【００２４】試薬液と蒸留水を混合して得られた液の吸
光極大波長における吸光度値をあらかじめ測定し、この
値と、試薬液と上記検体(２)〜(４)を混合して得られた
液の同波長での吸光度値との差(△ＯＤ)を求めた。結果
を表２に示す。
光極大波長における吸光度値をあらかじめ測定し、この
値と、試薬液と上記検体(２)〜(４)を混合して得られた
液の同波長での吸光度値との差(△ＯＤ)を求めた。結果
を表２に示す。
【００２５】
【表２】 表１および表２の結果から、本発明による測定法はアス
コルビン酸、ビリルビンなどの還元性物質による影響を
受けること無く基質の濃度に比例して特異的に吸光度の
変化を示し、その値から基質の濃度を定量的に求めるこ
とができることが分かる。
コルビン酸、ビリルビンなどの還元性物質による影響を
受けること無く基質の濃度に比例して特異的に吸光度の
変化を示し、その値から基質の濃度を定量的に求めるこ
とができることが分かる。
Claims (6)
- 【請求項１】 式： 【化１】 ［式中、ｍは、０または１を表し、ｎは、２〜４の数を
表す。Ｚは、５員または６員複素環を形成する基を表
す。ただし、該複素環は置換基を有していてもよく、該
複素環には飽和または不飽和の５員または６員環が縮合
されてもよく、この縮合する５員または６員環は置換基
を有していてもよい。Ｒ1は、置換されていてもよい炭
素数１〜１０のアルキル基を表し、Ｒ2およびＲ3は、そ
れぞれ独立に水素、炭素数１〜１０のアルキル基、炭素
数１〜１０のアルコキシ基、ヒドロキシ基、ハロゲン原
子、スルホン酸基、カルボン酸基または式：ＮＲ4Ｒ5で
表される置換アミノ基を表す。ここで、Ｒ4およびＲ
5は、それぞれ独立にハロゲン原子、ヒドロキシ基、炭
素数１〜１０のアルキルカルボニルオキシ基、フェニル
基で置換されていてもよい炭素数１〜５のアルキル基ま
たはアリル基を表し、あるいはＲ4とＲ5で共同して含窒
素５員環または６員環を形成してもよく、Ｒ4とＲ5の少
なくとも一方が、該置換アミノ基の窒素原子と結合する
炭素の隣の炭素と共同して６員環を形成してもよい。Ｘ
は、アニオンを表す。］で示されるスチリル色素の少な
くとも１種と、電子伝達体を含んでなる、還元型ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／または還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの
測定用試薬。 - 【請求項２】 電子伝達体としてジアホラーゼを用いる
ことを特徴とする請求項１に記載の測定用試薬。 - 【請求項３】 電子伝達体の存在下、請求項１に記載の
式（Ｉ）で示されるスチリル色素を、液体試料に含まれ
る還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび
／または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
ホスフェートと反応させて該スチリル色素を発色させ、
可視部の吸光度の変化を測定することからなる、還元型
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび／または
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェ
ートの測定方法。 - 【請求項４】 液体試料が、血液、尿、髄液または唾液
である請求項３に記載の測定方法。 - 【請求項５】 電子伝達体としてジアホラーゼを用いる
ことを特徴とする請求項３に記載の測定方法。 - 【請求項６】 請求項１に記載の試薬を含む分析用試薬
を吸収可能な担体に含浸する、もしくは担体に塗布、印
刷または噴霧することからなる試験片。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22484996A JP3980683B2 (ja) | 1995-08-29 | 1996-08-27 | 還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬および測定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7-220183 | 1995-08-29 | ||
| JP22018395 | 1995-08-29 | ||
| JP22484996A JP3980683B2 (ja) | 1995-08-29 | 1996-08-27 | 還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬および測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09121892A true JPH09121892A (ja) | 1997-05-13 |
| JP3980683B2 JP3980683B2 (ja) | 2007-09-26 |
Family
ID=26523573
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22484996A Expired - Lifetime JP3980683B2 (ja) | 1995-08-29 | 1996-08-27 | 還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬および測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3980683B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007537745A (ja) * | 2004-05-20 | 2007-12-27 | ジェントロニックス リミテッド | 遺伝子毒性試験 |
| US8969008B2 (en) | 2004-05-20 | 2015-03-03 | Gentronix Limited | Genotoxic testing |
| JP2016512891A (ja) * | 2013-03-15 | 2016-05-09 | シーダーズ−サイナイ メディカル センター | 時間分解レーザ誘起蛍光分光システム及びその使用 |
| US10656089B2 (en) | 2016-04-01 | 2020-05-19 | Black Light Surgical, Inc. | Systems, devices, and methods for time-resolved fluorescent spectroscopy |
-
1996
- 1996-08-27 JP JP22484996A patent/JP3980683B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007537745A (ja) * | 2004-05-20 | 2007-12-27 | ジェントロニックス リミテッド | 遺伝子毒性試験 |
| US8969008B2 (en) | 2004-05-20 | 2015-03-03 | Gentronix Limited | Genotoxic testing |
| US10983060B2 (en) | 2013-03-15 | 2021-04-20 | Cedars-Sinai Medical Center | Time-resolved laser-induced fluorescence spectroscopy systems and uses thereof |
| US10288567B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-05-14 | Cedars-Sinai Medical Center | Time-resolved laser-induced fluorescence spectroscopy systems and uses thereof |
| JP2019215373A (ja) * | 2013-03-15 | 2019-12-19 | シーダーズ−サイナイ メディカル センター | 時間分解レーザ誘起蛍光分光システム及びその使用 |
| JP2016512891A (ja) * | 2013-03-15 | 2016-05-09 | シーダーズ−サイナイ メディカル センター | 時間分解レーザ誘起蛍光分光システム及びその使用 |
| JP2021105609A (ja) * | 2013-03-15 | 2021-07-26 | シーダーズ−サイナイ メディカル センター | 時間分解レーザ誘起蛍光分光システム及びその使用 |
| US11428636B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-08-30 | Cedars-Sinai Medical Center | Time-resolved laser-induced fluorescence spectroscopy systems and uses thereof |
| JP2023106381A (ja) * | 2013-03-15 | 2023-08-01 | シーダーズ－サイナイ メディカル センター | 時間分解レーザ誘起蛍光分光システム及びその使用 |
| US12152991B2 (en) | 2013-03-15 | 2024-11-26 | Cedars-Sinai Medical Center | Time-resolved laser-induced fluorescence spectroscopy systems and uses thereof |
| US10656089B2 (en) | 2016-04-01 | 2020-05-19 | Black Light Surgical, Inc. | Systems, devices, and methods for time-resolved fluorescent spectroscopy |
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| US12025557B2 (en) | 2016-04-01 | 2024-07-02 | Black Light Surgical, Inc. | Systems, devices, and methods for time-resolved fluorescent spectroscopy |
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|---|---|
| JP3980683B2 (ja) | 2007-09-26 |
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