JPH1031018A - 還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬およびそれを用いた測定方法並びに測定用試験片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 紫外部に蛍光等を有する共存物質の影響を受
けず、乾式測定が可能な還元型ニコチンアミド補酵素の
測定用試薬を提供する。 【解決手段】 特定のスチリル色素を含有する還元型ニ
コチンアミド補酵素の測定用試薬である。電子伝達体の
存在下、この還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬
中のスチリル色素と液体試料に含まれる還元型ニコチン
アミド補酵素とを反応させて前記スチリル色素を褪色さ
せ、可視部の吸光度の変化を測定することにより還元型
ニコチンアミド補酵素の測定ができる。前記スチリル色
素の具体例としては２−［１−シアノ−４−（４−ジメ
チルアミノフェニル）−１，３−ブタジエニル］−３−
エチルベンゾチアゾリウム アイオダイドがあり、電子
伝達体としてはジアホラーゼがある。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、還元型ニコチンア
ミド補酵素の測定用試薬およびそれを用いた測定方法並
びに測定用試験片に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】還元型ニコチンアミド補酵素、すなわ
ち、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤＨ）および還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）は、生体内での酸化
還元反応に関与する補酵素である。したがって、還元型
ニコチンアミド補酵素を測定することにより、これに関
連する酵素または基質の測定ができる。

【０００３】従来から、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの測
定方法としては、以下のような方法が知られている。 （１）ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの有する紫外部の吸収
または蛍光を直接測定する方法。

【０００４】（２）触媒の存在下、ＮＡＤＨおよびＮＡ
ＤＰＨとレサズリンの反応によって生成したレゾルフィ
ンの蛍光を測定する方法。 （３）電子伝達体の存在下、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ
とＮＴＢやＭＴＴ等のテトラゾリウム塩とを反応させて
ホルマザン色素を生成し、その可視部の吸収を測定する
方法。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
測定方法は、以下の問題を有する。まず、前記紫外部の
吸収および蛍光を測定する方法（１）は、尿等を測定対
象とする場合には、紫外部に吸収を有するまたは蛍光を
有する共存物質、例えば、リボフラビン等のビタミンＢ
₂ 剤、フルオレッセインナトリウム等の蛍光造影剤によ
って妨害を受ける。この問題は、前記（２）の方法も同
様である。

【０００６】また、前記テトラゾリウム塩を発色剤とし
て用いる方法（３）は、試料中に共存するアスコルビン
酸、ビリルビン等の還元性物質による影響で、ブランク
発色を生じるという欠点がある。

【０００７】この他に、ＮＡＤＨを用いずに生体試料中
の成分を測定する方法として、酸化酵素を用いる方法が
あるが、前記テトラゾリウム塩を用いる方法（３）と同
様に、試料中に共存するアスコルビン酸、ビリルビン等
の還元性物質の影響を受けて発色が阻害されるという欠
点がある。

【０００８】さらに、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの測定
方法において、測定操作等の観点から乾式測定の実現が
求められている。本発明は、前記従来の問題を解決し、
紫外部に吸収若しくは蛍光を有する共存物質および還元
性物質の影響を受けず、乾式測定が可能な還元型ニコチ
ンアミド補酵素の測定用試薬およびそれを用いた測定方
法並びに測定用試験片の提供を目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明の還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬
は、前記の式［化１］で示されるスチリル色素を含有す
る。

【００１０】この特殊なスチリル色素は、電子伝達体の
存在下で、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの少なくとも一方
と作用させると、紫外部に蛍光等を有する共存物質およ
びアスコルビン酸、ビリルビン等の影響を受けず、高い
選択性でＮＡＤＨ等を測定できる。具体的には、１０^-6
Ｍ以下の微量のＮＡＤＨ等の測定が可能である。さら
に、この特殊なスチリル色素は、乾式測定に供しても高
い反応性を失うことがない。このように、本発明にかか
るスチリル色素は、高い反応性を有し、乾式測定に適用
できるが、これは、スチリル色素の分子構造中のメチン
鎖に酸性官能基が付加されているためと推察される。

【００１１】本発明の測定用試薬において、電子伝達体
を含有してもよい。また、この電子伝達体として、ジア
ホラーゼを用いることが好ましい。また、本発明の測定
方法において、還元型ニコチンアミド補酵素は、通常、
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還
元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェー
トの少なくとも一方の補酵素である。

【００１２】つぎに、本発明の還元型ニコチンアミド補
酵素の測定方法は、電子伝達体の存在下、前記本発明の
還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬中のスチリル
色素と液体試料に含まれる還元型ニコチンアミド補酵素
とを反応させて前記スチリル色素を褪色させ、可視部の
吸光度の変化を測定する。

【００１３】本発明の測定方法において、前記液体試料
としては、例えば、血液、尿、骨髄液、リコール、胸
水、腹水、汗、涙または唾液があげられる。本発明の測
定方法において、電子伝達体としてジアホラーゼを用い
ることが好ましく、この場合、通常、前記スチリル色素
０．１〜１０．０ｍｏｌに対しジアホラーゼ０．１２〜
１．２０ｍｋａｔの割合で用いる。

【００１４】本発明の測定方法において、還元型ニコチ
ンアミド補酵素は、通常、還元型ニコチンアミドアデニ
ンジヌクレオチドおよび還元型ニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチドホスフェートの少なくとも一方の補酵素
である。

【００１５】つぎに、本発明の還元型ニコチンアミド補
酵素の測定用試験片は、前記本発明の電子伝達体を含有
する還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬を担体に
付着させたものである。この測定用試験片は、例えば、
前記本発明の電子伝達体を含有する測定用試薬を担体に
含浸する方法、若しくは、前記試薬を担体に塗布、印刷
または噴霧することにより作製できる。

【００１６】

【発明の実施の形態】前記の式［化１］で表されるスチ
リル色素において、Ｚによって形成される複素環の具体
例としては、チアゾール系の環（例えば、チアゾール、
４−メチルチアゾール、４−フェニルチアゾール、４，
５−ジフェニルチアゾール）、ベンゾチアゾール系の環
（例えば、ベンゾチアゾール、５−クロロベンゾチアゾ
ール、６−メトキシベンゾチアゾール、５−トリフルオ
ロメチルベンゾチアゾール、５−カルボキシベンゾチア
ゾール、５，６−ジヒドロキシベンゾチアゾール）、ナ
フトチアゾール系の環（例えば、α−ナフトチアゾー
ル、β−ナフトチアゾール、５−ヒドロキシ−β−ナフ
トチアゾール）、オキサゾール系の環（例えば、４−メ
チルオキサゾール、４，５−ジフェニルオキサゾー
ル）、ベンゾオキサゾール系の環（例えば、ベンゾオキ
サゾール、６−ヒドロキシベンゾオキサゾール、５−ク
ロロベンゾオキサゾール、５−フェニルベンゾオキサゾ
ール）、ナフトオキサゾール系の環（例えば、α−ナフ
トオキサゾール、β−ナフトオキサゾール）、セレナゾ
ール系の環（例えば、４−メチルセレナゾール）、ベン
ゾセレナゾール系の環（例えば、ベンゾセレナゾール、
５−ヒドロキシベンゾセレナゾール、５−クロロベンゾ
セレナゾール）、チアゾリン系の環（例えば、チアゾリ
ン）、２−ピリジン系の環（例えば、２−ピリジン、５
−メトキシ−２−ピリジン）、４−ピリジン系の環（例
えば、４−ピリジン、３−クロロ−４−ピリジン）、２
−キノリン系の環（例えば、２−キノリン、６−ヒドロ
キシ−２−キノリン、６−エトキシ−２−キノリン）、
４−キノリン系の環（例えば、４−キノリン、６−メト
キシ−４−キノリン、６−クロロ−４−キノリン）、１
−イソキノリン系の環（１−イソキノリン）、３，３−
ジアルキルインドレニン系の環（例えば、３，３−ジメ
チルインドレニン、５−クロロ−３，３−ジメチルイン
ドレニン、５−カルボキシ−３，３−ジメチルインドレ
ニン、５−スルホキシ−３，３−ジメチルインドレニ
ン、３−シクロヘキシルインドレニン、５−メチルスル
ホニル−３，３−ジメチルインドレニン）、３，３−ジ
アルキルベンゾインドレニン系の環（例えば、３，３−
ジメチル−α−ベンゾインドレニン、３，３−ジメチル
−β−ベンゾインドレニン）、ベンゾイミダゾール系の
環（例えば、ベンゾイミダゾール、１−アルキル−５，
６−ジクロロベンゾイミダゾール、１−アルキル−５−
スルホニルベンゾイミダゾール、１−アルキル−５−ト
リフルオロメチルベンゾイミダゾール）の核含有環を含
む環等の、５員および６員のヘテロ環が挙げられる。

【００１７】Ｒ₁ の具体例としては、メチル基、エチル
基、イソプロピル基、ブチル基、イソアミル基、オクチ
ル基、２−エチルヘキシル基、ドデシル基等のアルキル
基、これらの置換アルキル基が挙げられる。置換アルキ
ル基の置換基の具体例としては、塩素、臭素、フッ素及
びヨウ素等のハロゲン原子、アリール基（例えば、フェ
ニル基、ナフチル基）、アルコキシ基、水酸基、カルボ
ン酸基、スルホン酸基等が挙げられる。

【００１８】Ｒ´、Ｒ´´によって置換されたベンゼン
環の具体例としては、４−ジメチルアミノベンゼン、
１，２，３，４−テトラヒドロキノリン、ユロリジン等
が挙げられる。

【００１９】Ｘの具体例としては、塩化物、臭素化物、
フッ素化物およびヨウ素化物等のハロゲン化物があり、
例えば、メタンスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホ
ン酸イオン等のスルホン酸イオン、メチル硫酸イオンお
よびエチル硫酸イオン等の硫酸イオンが挙げられ、その
他、過塩素酸イオン、硝酸イオン等のイオンも例示でき
る。なお、Ｒ₁ の置換基がカルボン酸基またはスルホン
酸基等の酸基を含んでおり、スチリル色素が分子内塩を
形成する場合には、Ｘは必要でない。

【００２０】本発明にかかるスチリル色素の具体例とし
ては、下記の式（化２）に示す２−［１−シアノ−４−
（４−ジメチルアミノフェニル）−１，３−ブタジエニ
ル］−３−エチルベンゾチアゾリウム アイオダイドが
あげられる。

【００２１】

【化２】

【００２２】つぎに、本発明にかかるスチリル色素の製
造の一例について説明する。スチリル色素として、２−
［４−（４−ジメチルアミノ）フェニル−１，３−ブタ
ジエニル−１−シアノ］−３−エチルベンゾチアゾリウ
ム アイオダイドを合成した。

【００２３】すなわち、まず、２−シアノメチル−３−
エチルベンゾチアゾリウム アイオダイド１．２ｇおよ
び４−ジメチルアミノシンナムアルデヒド０．７ｇを１
０ｍｌの無水酢酸に加え混合する。この混合物を、８０
℃のウオーターバスで２〜３分間加熱すると、針状結晶
が析出する。さらに、２０分間加熱し、析出した針状結
晶を吸引ろ過して分離し、メタノールで洗浄して、つい
でメタノールから再結晶すると前記スチリル色素が１ｇ
得られる。

【００２４】本発明において、電子伝達体としては、メ
ルドラブルー、１−メトキシ−５−メチルフェナジニウ
ムメチルサルフェート（１−ｍＰＭＳ）、ジアホラーゼ
等が挙げられるが、ジアホラーゼが好ましい。

【００２５】本発明にかかるスチリル色素は、ＮＡＤＨ
およびＮＡＤＰＨの合計１モルに対して、好ましくは
０．１〜１０．０モル、より好ましくは０．５〜２．０
モル用いればよい。電子伝達体、例えばジアホラーゼ
は、触媒として作用するので、その量は触媒量でよい。
先に述べたように、通常、０．１〜１．０ｍｋａｔ／ｌ
のような割合で用いる。

【００２６】また、本発明の測定用試薬は、前記スチリ
ル色素の選択、例えば前記の式（化１）中のｎの選択に
より測定波長を４００〜９００ｎｍまで任意に選択する
ことが可能である。

【００２７】その他の測定パラメーターは、主として電
子伝達体によって制約を受けるので、例えば電子伝達体
がジアホラーゼの場合、通常のｐＨの範囲は５〜９、好
ましくはｐＨ７〜８であり、温度は通常２０〜４０℃、
好ましくは３０〜３７℃である。なお、本発明にかかる
スチリル色素は、反応性が高いため、反応に要する時間
は瞬時に近い極めて短い時間である。

【００２８】本発明が対象とする液体試料は、通常、体
液、例えば血液またはその成分（血漿、血清等）、尿、
髄液または細胞抽出液等であるが、ＮＡＤＨおよびＮＡ
ＤＰＨの少なくとも一方を含む液体試料ならいずれも本
発明の対象となる。

【００２９】これらの試料中に含まれる酵素または酵素
の基質等の成分を測定しようとする場合、その酵素と基
質によって生成する物質を還元酵素及び酸化型ニコチン
アミド補酵素とともに反応させ、生成する還元型ニコチ
ンアミド補酵素の量を本発明の方法により測定する。こ
れにより、目的とする液体試料中の成分の量、濃度を測
定することができる。下記の式（化３）に本発明の測定
用試薬の反応の一例を示す。

【００３０】

【化３】

【００３１】前記の式（化３）の右側の反応式におい
て、ジアホラーゼ（Ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）存在下、Ｎ
ＡＤＨにより、本発明にかかるスチリル色素（ｂｌｕｅ
ｄｙｅ）が褪色する（ｄｉｓｃｏｌｏｒ）するととも
に、前記ＮＡＤＨがＮＡＤとなる。また、前記の式（化
３）の左側の反応式は、β−ハイドロキシステロイドデ
ヒドロゲナーゼ（β−ＨＳＤ）の存在下、ＮＡＤによ
り、３β−ハイドロキシバイル酸が３−オキソステロイ
ドになるとともに、前記ＮＡＤがＮＡＤＨとなる。すな
わち、この反応は、ＮＡＤを補酵素とするβ−ＨＳＤの
酵素反応である。したがって、この場合、本発明による
ＮＡＤＨの測定により、β−ＨＳＤ等の測定が可能とな
る。

【００３２】この他に、本発明の対象となるのは、例え
ば、α−ハイドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ、ア
ルコールデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナ
ーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、グルコースデヒド
ロゲナーゼなどである。

【００３３】つぎに、本発明の還元型ニコチンアミド補
酵素の測定用試験片に用いる担体としては、例えば、濾
紙、布、不織布、ポリエチレンテレフタレートフィル
ム、ポリエチレンフィルム、ガラス、セラミック等があ
げられ、測定用試験片の種類に応じ適宜選択される。例
えば、測定用試験片を本発明の測定用試薬を担体に含浸
して作製する場合は、吸収可能な担体として濾紙が好適
であり、また、一般的な担体としては、ポリエチレンテ
レフタートフィルムが好適である。

【００３４】この測定用試験片を用いた測定方法は、以
下のとおりである。すなわち、まず血液等の液状試料を
前記測定用試験片に付着させる。すると、この試験片が
褪色するので、この褪色程度を分光光度計若しくはデン
シトメーター等で測定することにより、液状試料中のＮ
ＡＤＨ等を測定することができる。

【００３５】

【実施例】つぎに、実施例について説明する。実施例に
用いるスチリル色素として、前記の式（化２）で表され
る２−［１−シアノ−４−（４−ジメチルアミノフェニ
ル）−１，３−ブタジエニル］−３−エチルベンゾチア
ゾリウム アイオダイドを用いた。以下に、反応液組成
および測定用検体（液状試料）を示す。なお、下記の反
応液および測定用検体の組成は、全て最終濃度を示す。

【００３６】（実施例１） 反応液組成 色素 ０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ ジアホラーゼ ０．８３ｍｋａｔ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ０．２０ ｍｏｌ／Ｌ 測定用検体 β−ＮＡＤＨ ０〜５０μｍｏｌ／Ｌ （実施例２） 反応液組成 色素 ０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ ジアホラーゼ ０．８３ｍｋａｔ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０） ０．２０ ｍｏｌ／Ｌ 測定用検体 β−ＮＡＤＨ ０〜５０μｍｏｌ／Ｌ アスコルビン酸 １．０ｇ／Ｌ つぎに、実施例１、２において、以下の手順で測定を行
い検量線を作成した。 （１）反応セルにＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を入れる。こ
の量は、実施例１では２．６５ｍｌであり、実施例２で
は２．５５ｍｌである。 （２）色素液０．１ｍｌ、ジアホラーゼ０．１５ｍｌを
反応セルに加えて攪拌した後、２５℃で５分インキュベ
ートする。 （３）各濃度の検体を、実施例１では０．１ｍｌ、実施
例２では０．２ｍｌ、反応セルに加え、攪拌後、直ちに
６４０ｎｍにおける吸光度を測定し、検量線を作成す
る。

【００３７】実施例１の検量線を図１のグラフに、実施
例２の検量線を図２のグラフに示す。このように、本発
明の実施例では、反応後、直ちに測定に供することがで
きるため、迅速な測定が可能であった。また、実施例２
の結果より、還元物質であるアスコルビン酸が共存して
いても、この影響を受けることなくＮＡＤＨの測定が可
能であるといえる。

【００３８】（実施例３）下記の組成の含浸液を調製
し、これを１０×１０ｃｍの濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社
製、３ＭＭ，Ｃｈｒ）に含浸し、ついで乾燥機（ＹＡＭ
ＡＴＯ社製、ＤＦ６２）を用い５０℃、１５分間の条件
で乾燥させた。そして、この濾紙を、幅５ｍｍに裁断
し、両面テープを用いてポリエチレンテレフタレートフ
ィルムに貼着し、さらにこれを５ｍｍに裁断し５×５ｍ
ｍの測定用試験片を作製した。

【００３９】 含浸液組成 色素 ０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ ジアフォラーゼ ０．８３ｍｋａｔ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．２） ０．２ｍｏｌ／Ｌ 他方、測定試料として、４種類の濃度のＮＡＤＨ水溶液
（濃度：０μｍｏｌ／Ｌ，２０μｍｏｌ／Ｌ，５０μｍ
ｏｌ／Ｌ，１００μｍｏｌ／Ｌ）を準備した。

【００４０】そして、前記試験片に点着量８μｌで上記
ＮＡＤＨ水溶液を点着し、色差計（Σ９０、日本電色社
製）を用い、測定時間１２０秒（エンドポイント）およ
び測定温度２５℃の条件で６４０ｎｍでの反射率を測定
した。この測定結果を、図３のグラフに示す。

【００４１】同図に示すように、ＮＡＤＨの濃度に対応
する検量線が得られた。また、この実施例は、乾式測定
の実施例であるが、測定において高い反応性を確認する
ことができた。

【００４２】

【発明の効果】以上のように、本発明の還元型ニコチン
アミド補酵素の測定用試薬は、前記の式［化１］で示さ
れるスチリル色素を含有する。この特殊なスチリル色素
は、電子伝達体の存在下で、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨ
の少なくとも一方と作用させると、高い選択性でＮＡＤ
Ｈ等を測定できる。しかも、この測定では、紫外部に蛍
光等を有する共存物質およびアスコルビン酸、ビリルビ
ン等の影響を受けない。このため、本発明の測定用試薬
を用いれば、前処理等をせずに、高い精度で簡単に試料
中のＮＡＤＨ等を測定できる。また、この特殊なスチリ
ル色素は、乾式測定に供しても高い反応性を失うことが
ないため、これを用いれば、測定用試験片を作成するこ
とが可能となる。この測定用試験片を用いることによ
り、ＮＡＤＨ等の測定がさらに容易となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例におけるＮＡＤＨの検量線を
示すグラフである。

【図２】本発明のその他の実施例におけるＮＡＤＨの検
量線を示すグラフである。

【図３】本発明のさらにその他の実施例におけるＮＡＤ
Ｈの検量線を示すグラフである。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の式［化１］で示されるスチリル色
   素を含有する還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試
   薬。 【化１】
2. 【請求項２】 電子伝達体を含有する請求項１記載の還
   元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬。
3. 【請求項３】 電子伝達体が、ジアホラーゼである請求
   項１または２記載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定
   用試薬。
4. 【請求項４】 還元型ニコチンアミド補酵素が、還元型
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型ニ
   コチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの少
   なくとも一方の補酵素である請求項１〜３のいずれか一
   項に記載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬。
5. 【請求項５】 電子伝達体の存在下、請求項１に記載の
   還元型ニコチンアミド補酵素の測定用試薬中のスチリル
   色素と液体試料に含まれる還元型ニコチンアミド補酵素
   とを反応させて前記スチリル色素を褪色させ、可視部の
   吸光度の変化を測定する還元型ニコチンアミド補酵素の
   測定方法。
6. 【請求項６】 液体試料が、血液、尿、骨髄液、リコー
   ル、胸水、腹水、汗、涙または唾液である請求項５に記
   載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定方法。
7. 【請求項７】 電子伝達体としてジアホラーゼを用いる
   請求項５または６記載の還元型ニコチンアミド補酵素の
   測定方法。
8. 【請求項８】 スチリル色素０．１〜１０．０ｍｏｌに
   対しジアホラーゼ０．１２〜１．２０ｍｋａｔの割合で
   ある請求項７記載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定
   方法。
9. 【請求項９】 還元型ニコチンアミド補酵素が、還元型
   ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドおよび還元型ニ
   コチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェートの少
   なくとも一方の補酵素である請求項５〜８のいずれか一
   項に記載の還元型ニコチンアミド補酵素の測定方法。
10. 【請求項１０】 請求項２に記載の還元型ニコチンアミ
    ド補酵素の測定用試薬を担体に付着させた還元型ニコチ
    ンアミド補酵素の測定用試験片。