JPH09282A - モノオキシゲナーゼ活性の安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 芳香族化合物に酸素を付与する反応を触媒す
るモノオキシゲナーゼ活性を有する微生物を用いた物質
変換反応において生じるモノオキシゲナーゼ活性の経時
的な低下を効率よくかつ簡便に抑制するモノオキシゲナ
ーゼ活性の安定化方法を提供する。 【構成】 モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物を利
用した芳香族化合物の酸化反応系にＣ_3-10の脂肪族化合
物をモノオキシゲナーゼ活性の安定化剤として添加する
ことを特徴とする、モノオキシゲナーゼ活性の安定化方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、モノオキシゲナーゼ活
性の安定化方法に関するものである。さらに詳しく述べ
ると、本発明は、芳香族化合物に酸素を付与する反応を
触媒するモノオキシゲナーゼ活性を有する微生物を用い
た物質変換反応時に生じるモノオキシゲナーゼ活性の経
時的な低下を抑制する方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】モノオキシゲナーゼは、一原子酸素添加
酵素ともいい、代表的なものに水酸化酵素があるが、一
原子の分子状酸素を基質に導入する反応を触媒するオキ
シゲナーゼの一種であり、この活性を利用して種々の物
質変換による有用物質の生産が知られている。モノオキ
シゲナーゼ活性を有する微生物としてはメタン資化性細
菌が知られている（特開昭５４−１５７，８９５号公
報、特開昭５７−６５，１８７号公報、特開昭５８−４
７，４９６号公報、特開昭５８−１９３，６９１号公報
及び特公昭６２−４７，５１７号公報）。また、メタン
資化性細菌とは全く異なる菌学的性質を有し、炭素原子
が２個以上のアルカンを資化する微生物についても、種
々の化合物を酸化するモノオキシゲナーゼ活性を有する
ことが知られており（特開昭６０−２１０，９９１号公
報、特開昭６０−２１０，９９２号公報及び特開昭６３
−１３３，９８０号公報）、さらに、特開昭５９−１
７，９８０号公報ではエタン、プロパン及びブタンで生
育させた菌体を用いたアルケンのエポキシ化、アルカン
の酸化、脂環式化合物の酸化及び芳香族化合物の酸化が
記載されている。

【０００３】これらモノオキシゲナーゼ活性を有する菌
体を用いて、種々の化合物の酸化反応が可能である。と
ころが、酸化する化合物（反応基質）がモノオキシゲナ
ーゼの活性を誘導する効果を持たない場合には、先に列
挙したいずれの微生物を用いても、反応開始時から短時
間の間では、反応速度は一定であるものの、早い場合に
は１時間以内に反応速度が低下し始め、やがて反応が停
止してしまうというモノオキシゲナーゼの不安定さが問
題となっている。

【０００４】上記問題を解決するために、一旦活性が低
下した菌体を回収し、再度モノオキシゲナーゼ活性を誘
導しうる培地等に接種して、一定時間処理することで活
性を回復させる方法や、順次活性の高い菌体と交換して
いく方法などが考案されている。しかしながら、一旦失
われた活性を回復させる前者の方法では、菌体培養とほ
ぼ同等の培養が必要であること、操作が繁雑になり余分
な設備や労力を必要とするなどの問題が生じる。また、
順次活性の高い菌体と交換していく後者の方法では、反
応継続時間に比べて非常に長時間かけて調製した菌体を
短時間使用して廃棄することになり、経済的に不利であ
るという欠点がある。

【０００５】したがって、本課題は、菌体のモノオキシ
ゲナーゼ活性の低下を抑制し、反応継続時間を延長させ
る方法を開発することによってしか、抜本的に解決され
得ないと考えられる。このため、モノオキシゲナーゼ活
性の低下を抑制して、芳香族化合物を効率良く酸化でき
る方法は、いまだ提案されておらず、このような方法の
開発が依然として強く要望されている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明
は、芳香族化合物に酸素を付与する反応を触媒するモノ
オキシゲナーゼ活性を有する微生物を用いた物質変換反
応において生じるモノオキシゲナーゼ活性の経時的な活
性の低下を効率よくかつ簡便に抑制する方法を提供する
ことを目的とするものである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、芳香族化
合物をフェノール誘導体等へ変換する能力を有する新規
なマイコバクテリウム(Mycobacterium) 属に属する微生
物を発見した。この微生物は、従来知られているモノオ
キシゲナーゼ活性を有する微生物と同様、芳香族化合物
の酸化反応に供すると、初期反応速度が十数時間しか維
持されず、それ以降は徐々に反応速度が低下してしまう
という問題を生じた。そこで、本発明者らは、上記問題
を解決すべく、モノオキシゲナーゼによる反応を利用し
た芳香族化合物からフェノール誘導体などを得るための
変換反応の際に生じるモノオキシゲナーゼ活性の低下の
原因の解明および活性の安定性を向上させる方法の開発
に関して鋭意検討を行った。

【０００８】検討の結果、活性が経時的に減少するの
は、従来報告されているような、反応基質や反応生成物
による酵素の失活作用ばかりではなく、菌体の生理作用
によって活性が失われるという現象によることを初めて
明らかにした。すなわち、活性の低下は、菌体のおかれ
ている環境中にモノオキシゲナーゼ活性を誘導しうる物
質であるところの誘導基質が消失するか、または、効果
を発揮するに足らない濃度にまで減少することによって
起こることをつきとめた。さらに、菌体によってモノオ
キシゲナーゼが分解されることが活性低下の一因である
可能性が強く示唆された。この際、モノオキシゲナーゼ
を分解するのは、タンパク質分解酵素であるプロテアー
ゼによると考えられるが、モノオキシゲナーゼの誘導基
質が十分量存在する環境下では活性の低下が起こらない
ことから、このプロテアーゼはモノオキシゲナーゼの誘
導基質の濃度が有効な濃度よりも低下した条件によって
生合成される誘導酵素であると考えられた。そこで、こ
の誘導基質を有効な濃度より高い濃度で反応系中に存在
させる手段を講じることによって、モノオキシゲナーゼ
活性の低下を抑制し、ゆえに活性が維持できると考え
た。

【０００９】これらの研究成果により、誘導基質として
モノオキシゲナーゼ活性を誘導する効果を有する３〜１
０の炭素数の脂肪族化合物を所定濃度以上添加すること
によってモノオキシゲナーゼ活性の低下を防止する方法
を考案するに至った。このようにして、モノオキシゲナ
ーゼ活性の低下が効果的に抑制できる方法を見出だし、
活性の安定性を向上させることに成功し、これにより、
本発明を完成した。

【００１０】すなわち、上記目的は、芳香族化合物に酸
素を付与する反応を触媒するモノオキシゲナーゼ活性を
有する微生物を利用した物質変換反応系において、モノ
オキシゲナーゼ活性を誘導する効果を有し炭素数が３か
ら１０である脂肪族化合物を添加して上記反応を行うこ
とを特徴とする、モノオキシゲナーゼ活性の安定化方法
によって達成される。

【００１１】本発明は、上記脂肪族化合物がプロパン、
ブタン、ペンタン、アセトン、メチルエチルケトン、メ
チルプロピルケトン、メチルブチルケトン、イソプロパ
ノール、２−ブタノールおよび２−ペンタノールからな
る群より選ばれた少なくとも１種であるモノオキシゲナ
ーゼ活性の安定化方法を示すものである。本発明はま
た、上記脂肪族化合物が、反応液中の芳香族化合物の初
期濃度に対して、１０重量％から２００重量％の範囲の
濃度で存在するモノオキシゲナーゼ活性の安定化方法を
示すものである。本発明はさらに、上記該芳香族化合物
に酸素を付与することによって生成する化合物が、芳香
族環に水酸基を有するフェノール誘導体、芳香族環にカ
ルボキシアルキル基を有する芳香族カルボン酸および芳
香族環にアルキルケトン基を有する芳香族ケトンからな
る群より選ばれたものであるモノオキシゲナーゼ活性の
安定化方法を示すものである。

【００１２】本発明はさらに、モノオキシゲナーゼ活性
を有する微生物がマイコバクテリウム(Mycobacterium)
属に属する微生物である上記いずれかに記載のモノオキ
シゲナーゼ活性の安定化方法である。

【００１３】

【作用】本発明のモノオキシゲナーゼ活性の安定化方法
は、芳香族化合物に酸素を付与する反応を触媒するモノ
オキシゲナーゼ活性を有する微生物の菌体を用いて、所
望の化合物の酸化反応を行う際、その反応系に、モノオ
キシゲナーゼ活性を誘導する効果を有し炭素数が３から
１０である脂肪族化合物を誘導基質として所定濃度以上
存在させて培養することを特徴とするものである。

【００１４】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１５】本発明によるモノオキシゲナーゼ活性の安
定化を計りながら芳香族化合物に酸素を付与する方法の
一実施態様を以下の通りに説明する。

【００１６】肉汁寒天培地に生育させたマイコバクテリ
ウム エスピー ＮＳ１２５２３株(Mycobacterium sp.
NS12523) 一白金耳を、表１に示される培地組成を有す
る培地（以下、Ａ培地と称する）に適当な炭素源を加え
た培地５ｍｌに接種、培養することによって、種培養液
を調製する。次いで、この種培養液を上記と同じ組成の
培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の坂口フラスコに
接種し、増殖が定常期に入るまで培養し、一定量の菌体
を含む培養液を調製する。このようにして調製された培
養液から遠心分離（１，０００〜１０，０００×ｇ、５
〜２０分）によって菌体を回収し、さらに、モノオキシ
ゲナーゼ活性を高める効果を有する炭素源を添加したＡ
培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の坂口フラスコに
菌体を接種、培養することによって、高いモノオキシゲ
ナーゼ活性を有する活性菌体を調製する。培養液を遠心
分離（１，０００〜１０，０００×ｇ、５〜２０分）す
ることによって培養液から活性菌体のみを回収し、必要
であれば、水、緩衝液または生理食塩水等で菌体を洗浄
する。このようにして回収された活性菌体をリン酸緩衝
液（０．２ｇ／リットルの硫酸マグネシウムを含む、５
０ｍＭ ＫＨ₂ ＰＯ₄ 溶液；水酸化ナトリウムにてｐＨ
を７に調整）中に菌体濃度が０．１〜５０ｇ湿重量／１
００ｍｌ、好ましくは０．５〜２０ｇ湿重量／１００ｍ
ｌになるように懸濁し、目的とする物質変換反応におけ
る触媒としての菌体懸濁液を調製する。この菌体懸濁液
５０ｍｌを５００ｍｌ容のフラスコに入れ、脂肪族化合
物を誘導基質として添加した後、基質およびエネルギー
源を添加し、２０〜３５℃で所望時間好気条件下で振盪
（５０〜３００ｒｐｍ）することによって、モノオキシ
ゲナーゼによる基質の酸化反応を行い、目的とする生成
物（フェノール誘導体、芳香族アルデヒド、芳香族アル
コール、芳香族カルボン酸及び芳香族ケトン等）を得
る。

【００１７】

【表１】

【００１８】本発明において、モノオキシゲナーゼによ
る酸化反応に使用される基質としては、目的とする生成
物質の種類によって異なるが、芳香族化合物が使用され
る。具体的には、フェノール、アセトアニリド、ベンゾ
ニトリル、フェニルアセトニトリル、フェニルアラニ
ン、サリチル酸、ｏ−クレゾール、トルエン、ベンジル
アルコール、ｐ−キシレン及びｐ−クレゾール等が挙げ
られる。なお、フェノール、アセトアニリド、ベンゾニ
トリル、フェニルアセトニトリル、フェニルアラニン、
サリチル酸、ｏ−クレゾール、トルエン、ベンジルアル
コール、ｐ−キシレン及びｐ−クレゾールを基質として
用いた場合、それぞれ、ハイドロキノン、ｐ−アセトア
ミノフェノール、ｐ−シアノフェノール、ｐ−ヒドロキ
シフェニルアセトニトリル、チロシン、ゲンチシン酸、
メチルハイドロキノン、安息香酸、安息香酸、ｐ−トル
イル酸及びｐ−ヒドロキシ安息香酸がモノオキシゲナー
ゼによる酸化反応によって生成する。また、上記基質の
添加濃度は、１００〜５０，０００ｐｐｍ、好ましくは
５００〜３０，０００ｐｐｍである。

【００１９】本発明における酸化反応をより効率的に行
うために、反応液にエネルギー源となる物質を添加する
ことが好ましい。該エネルギー源とは、酸化反応におい
て必要な補酵素であるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを供給する
のに利用される物質を示す。

【００２０】本発明において、上記酸化反応において必
要な還元型補酵素であるＮＡＤＨやＮＡＤＰＨを供給す
るためのエネルギー源の供給およびモノオキシゲナーゼ
の誘導基質でありかつモノオキシゲナーゼ活性の経時的
な活性低下を抑制する効果を有する物質の供給とを兼ね
て、炭素数が３から１０である脂肪族化合物を上記酸化
反応系に添加する。

【００２１】上記脂肪族化合物は、モノオキシゲナーゼ
活性を誘導する効果を有し、炭素数が３から１０である
化合物で、かつ微生物によってエネルギーを獲得するの
に利用されうるものあれば、特に制限されない。これら
の具体例としては、プロパン、ブタン及びペンタンなど
のアルカン類、アセトン、メチルエチルケトン、メチル
プロピルケトン及びメチルブチルケトンなどのケトン
類、およびイソプロパノール、２−ブタノール及び２−
ペンタノールなどのアルコール類等が挙げられ、これら
のうち、プロパン、ブタン、アセトン、メチルエチルケ
トンおよび２−ブタノールが好ましく使用される。これ
らの脂肪族化合物は、単独で使用されてもまたは２種以
上の混合物の形態で使用されてもよい。

【００２２】また、上記脂肪族化合物の添加濃度は、モ
ノオキシゲナーゼ活性の安定性を向上するに足る濃度以
上である必要がある。さらに、本発明において使用され
る脂肪族化合物はモノオキシゲナーゼの基質でもあるた
め、あまり高濃度で添加すると、目的とする酸化反応を
阻害する恐れがあるので、反応に悪影響を及ぼさない範
囲で添加することが望ましい。従って、脂肪族化合物の
添加濃度は、例えば、通常、５０〜５，０００ｐｐｍの
範囲内でそれぞれの酸化反応系において最もよい結果を
得る濃度で添加することが好ましい。

【００２３】さらに、本発明において使用される脂肪族
化合物は、モノオキシゲナーゼ活性の安定性には影響し
ないが、菌体にエネルギー源として利用されうる物質と
して併用して使用してもよい。この際、脂肪族化合物の
添加濃度は、脂肪族化合物がモノオキシゲナーゼの基質
ともなるため酸化すべき基質と拮抗阻害を起こす可能性
があるので、拮抗阻害の起こらない濃度範囲でかつ活性
低下を抑制できる濃度範囲内であることが必要であり、
さらに、モノオキシゲナーゼの酸化すべき基質の種類及
び添加する脂肪族化合物に対する親和性によって添加量
は変わりうる。例えば、脂肪族化合物の添加濃度が、反
応液中の芳香族化合物の初期濃度に対して、１０重量％
以上、好ましくは１０〜２００重量％の範囲の濃度で存
在するように調節する。さらに詳しくは、脂肪族化合物
としてメチルエチルケトンを使用する場合には、メチル
エチルケトンの添加濃度は、反応液中の芳香族化合物の
初期濃度に対して、１０重量％以上、好ましくは１０〜
２００重量％、より好ましくは５０〜１５０重量％の範
囲の濃度で存在するように調節する。また、脂肪族化合
物としてアセトンを使用する場合には、アセトンのの添
加濃度は、反応液中の芳香族化合物の初期濃度に対し
て、１０重量％以上、好ましくは１０〜２００重量％、
より好ましくは５０〜１５０重量％の範囲の濃度で存在
するように設定する。

【００２４】本発明におけるモノオキシゲナーゼによる
酸化反応は、分子酸素が酸素供給源として必要である。
従って、菌体懸濁液、基質及びエネルギー源からなる反
応液中に過不足なく酸素を供給する必要がある。反応液
への酸素の供給方法としては、例えば、攪拌、振盪及び
通気攪拌槽における空気または酸素の通気及び攪拌操作
などが挙げられる。通気攪拌または振盪によって酸素を
供給する場合の条件は特に制限されず、用いる装置の大
きさ及び形状、および菌体懸濁液の量によって適宜決定
される。

【００２５】また、本発明におけるモノオキシゲナーゼ
による酸化反応は、基質及び生成する物質の性質に適し
たｐＨの範囲内で行われる。本発明において、上記ｐＨ
の範囲は、５〜９、好ましくは６〜８である。これか
ら、本発明において使用できる活性菌体を懸濁するため
の液は上記ｐＨの範囲内に入るものであれば使用できる
が、代表例としては、リン酸緩衝液、ジメチルグルタル
酸緩衝液及びトリス塩酸緩衝液等が挙げられる。また、
上記した緩衝液以外にも生理食塩水等の塩類溶液を使用
してもよい。さらに、反応の間にｐＨが大きく変動しな
い場合、あるいはｐＨをコントロールできる場合には、
緩衝液を必ずしも使用する必要はない。

【００２６】上記実施態様においては、菌体の分離を遠
心分離によって行ったが、菌体の分離は、この方法に制
限されず、瀘過及び沈降分離等、一般的な菌体の分離方
法によって行われる。

【００２７】また、上記実施態様においては、マイコバ
クテリウム エスピー ＮＳ１２５２３株(Mycobacteri
um sp. NS12523) を微生物として使用したが、本発明に
おいて使用できる微生物は上記微生物に限られるもので
はなく、モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物であれ
ば特に制限されないが、具体的には、メチロシヌス属(M
ethylosinus)、メチロコッカス属(Methylococcus) 、ロ
ドコッカス属(Rhodococcus) 、マイコバクテリウム属(M
ycobacterium) 、ノカルディア属(Nocardia)及びシュー
ドモナス属(Pseudomonas) 等に属する微生物が挙げられ
る。これらのうち、マイコバクテリウム属(Mycobacteri
um) 、ノカルディア属(Nocardia)及びロドコッカス属(R
hodococcus) に属する微生物が好ましく使用でき、より
好ましくはマイコバクテリウム エスピー ＮＳ１２５
２３株(Mycobacterium sp. NS12523) が使用される。な
お、マイコバクテリウム エスピー ＮＳ１２５２３株
(Mycobacterium sp. NS12523) は、本発明者らによって
発見された芳香族化合物を酸化しフェノール誘導体等へ
変換する能力を有するマイコバクテリウム属(Mycobacte
rium) に属する新規な微生物である。

【００２８】上記実施態様において使用されたマイコバ
クテリウム エスピー ＮＳ１２５２３株(Mycobacteri
um sp. NS12523) の菌学的性質を以下に示す。

【００２９】（ａ）形態的性質 細胞の形および大きさ： 不規則な形態を有する桿
菌で、大きさが約１μｍ×３〜６μｍである 細胞の多形性の有無： 培養時期によって、細胞の
長さが変化する 運動性の有無： なし 胞子の有無： なし 抗酸性： 陰性〜陽性（培養時期によって変化す
る） （ｂ）培養的性質 肉汁寒天平板培養（３０℃）： 周縁部が波状で乾
燥した白色のコロニーを形成する。コロニーの大きさ
は、３０℃で３日間培養した際、直径約３〜１０ｍｍで
ある。 肉汁液体培養： 表面にも生育する。直径０．３〜
１ｍｍ程度の細胞集塊を形成する。 肉汁ゼラチン穿刺培養： ゼラチンの液化なし リトマス・ミルク： アルカリ性 （ｃ）生理的性質 グラム染色性： 陽性 硝酸塩の還元： ＋ 脱窒反応： − ＭＲテスト： − ＶＰテスト： − インドールの生成： − 硫化水素の生成（ＴＳＩ培地）： − デンプンの加水分解： ＋ クエン酸の利用：シモンズ(Simmons) の培地： − クリステンセン(Christensen) の培地： ＋ 無機窒素源の利用： ＋ 色素の生成：キングＡ(King A)培地： − キングＢ(King B)培地： − ＳＣＤ寒天培地： − 肉汁寒天培地： − ウレアーゼ：クリステンセン(Christensen) の培地： ＋ オキシダーゼ： − カタラーゼ： ＋ 生育の範囲（ＳＣＤ培地）： 生育可能ｐＨが４．５〜８．９ 生育可能温度が１４．０〜４７．５℃ 酸素に対する態度： 好気性 Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法）： Ｆ型（反応は弱い） （ｄ）下記の糖類からの酸及びガスの生成の有無

【００３０】

【表２】

【００３１】（ｅ）その他の特徴的な生理的性質 サリチル酸の分解性： ＋ 安息香酸の分解性： ＋ ペニシリンＧの耐性： ＋ ミコール酸に関して、薄層クロマトグラフィーにより既
知の微生物であるマイコバクテリウム ヴァッカエ Ｉ
ＦＯ１４１１８株(Mycobacterium vaccae IFO14118) と
比較したところ、マイコバクテリウム ヴァッカエ Ｉ
ＦＯ１４１１８株とミコール酸スポットのＲｆ値と近似
する位置にミコール酸スポットが複数個認められた。

【００３２】本菌株について、バージーズ マニュアル
オブ システマティック バクテリオロジー、第二巻
(Bergey´s Manual of Systematic Bacteriology 2nd)
（１９８６年）を参考にして検索を行った結果、本菌株
はマイコバクテリウム属(Mycobacterium) 微生物のマイ
コバクテリウム スメグマティス(Mycobacterium smegm
atis) に類似する特徴を有していることがわかった。し
かし、タイプカルチャーである、マイコバクテリウム
スメグマティス ＩＦＯ３０８２、３１５３、３１５４
及び１３１６７株と本菌株を比較したところ、いずれの
タイプカルチャーもメチルエチルケトンを炭素源とする
完全合成培地でほとんど生育しなかった点で、本菌株と
は異なっていた。さらに、いずれのタイプカルチャーも
モノオキシゲナーゼ活性を有しないあるいは活性が非常
に低かった。これらの結果より、本菌株は従来知られる
菌種とは異なる性質を有することから、本菌株をマイコ
バクテリウム エスピー ＮＳ１２５２３株(Mycobacte
rium sp. NS12523) （以下、単に「ＮＳ１２５２３株」
と称する）と命名した。

【００３３】このＮＳ１２５２３株は、平成７年５月３
０日付で工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託さ
れ、その受託番号はＦＥＲＭ Ｐ−１４９５８号であ
る。

【００３４】本発明において、微生物の培養に使用する
培地は、固体または液体培地のいずれでもよく、また、
使用する菌株が資化しうる炭素源、適量の窒素源、無機
塩及びその他の栄養素を含有する培地であれば、合成培
地または天然培地のいずれでもよい。

【００３５】本発明の菌株の培養において使用できる炭
素源としては、本菌株が良好に生育し、モノオキシゲナ
ーゼ活性を発現しうるものであれば特に制限されず、グ
ルコース、プロパン、ブタン、ペンタン、アセトン、メ
チルエチルケトン、メチルプロピルケトン、メチルブチ
ルケトン、イソプロパノール、２−ブタノール、２−ペ
ンタノールプロパン、エタノール、プロパノール、１−
ブタノール、酢酸及びシュークロース等が挙げられる。
これらのうち、菌株の生育を考慮すると、グルコース、
シュークロース、酢酸、アセトン、メチルエチルケト
ン、エタノール、プロパノール、１−ブタノール及び２
−ブタノール等が炭素源として好ましく使用され、ま
た、モノオキシゲナーゼ活性を高めることを考慮する
と、プロパン、ブタン、アセトン、メチルエチルケトン
及び２−ブタノールなどが好ましく使用される。この
際、上記炭素源の添加量は、０．０１〜５重量％、好ま
しくは０．１〜３重量％である。これらの炭素源は、単
独あるいは２種以上の混合物の形態で使用できる。

【００３６】本発明の菌株の培養において使用できる窒
素源としては、肉エキス、ペプトン、バクトペプトン、
ポリペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、大豆粉
末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸及びコ
ーンスティープリカー等の有機窒素化合物、およびアン
モニア、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム及び塩化
アンモニウムなどのアンモニウム塩、硝酸カリウム及び
硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素等の無機窒素化合物
等が挙げられる。これらの窒素源も、単独あるいは２種
以上の混合物の形態で使用できる。

【００３７】本発明において使用できる無機塩として
は、一般的な細菌の培養に用いられるものが使用できる
が、例えば、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナ
トリウム、カリウム、銅、鉄及び亜鉛などのリン酸塩、
塩酸塩、硫酸塩及び酢酸塩等から選ばれた１種または２
種以上を使用することができる。これらのうち、高いモ
ノオキシゲナーゼ活性を得るためには鉄塩を無機塩とし
て比較的高濃度で添加することが好ましく、鉄塩の添加
濃度としては、鉄に換算して、１リットルの培養液中、
０．３〜６０ｍｇ、好ましくは１〜３０ｍｇである。

【００３８】ここで、本発明においてＮＳ１２５２３株
を使用する際に好ましく使用できるＡ培地以外の培地の
一組成例を以下の表３に示し、以下、この培地をＢ培地
と称する。これらのＡ培地およびＢ培地は、これらの培
地に上記したような所定の炭素源を添加して調製した培
地でＮＳ１２５２３株を培養すると、ＮＳ１２５２３株
は直径１ｍｍ以下の小さい集塊を形成しながら増殖し、
培養液を静置すると速やかに沈降し、容易に菌体のみを
回収できるため、本発明における微生物の培養に好まし
く使用できる。

【００３９】

【表３】

【００４０】本発明において高いモノオキシゲナーゼ活
性を得るための完全合成培地としてはＡ培地に誘導基質
としての上記したような炭素源を加えた培地が好ましく
使用され、増殖をさらに促進するための有機態窒素源培
地としてはＢ培地の組成に上記したような炭素源を加え
た培地が好ましく使用される。

【００４１】本発明において、微生物の培養は、上記実
施態様において詳細に記載した培養に限られるものでは
なく、使用する微生物が適切に培養できる公知の培養方
法によって行われる。一般的には、本発明による微生物
の培養は、好気的条件下で行われ、その際の培養条件
は、使用する微生物の種類、培地の組成や培養法によっ
て適宜選択され、使用する菌株が増殖しモノオキシゲナ
ーゼ活性が発現できる条件であれば特に制限されない。
通常は、培養温度が、２０〜４５℃、好ましくは３０〜
４０℃であり、また、培養に適当な培地のｐＨは、４．
５〜９、好ましくは６〜８である。

【００４２】また、本発明によると、誘導基質としての
炭素源が培地中で消失するとモノオキシゲナーゼ活性が
低下するため、高いモノオキシゲナーゼ活性を有する菌
体を得るためには、誘導基質としての炭素源が培地中に
残存している段階で微生物の培養を終了させることが重
要である。ただし、単に目的量の菌体を得る場合には、
モノオキシゲナーゼ活性の低下に関係なく、定常期に達
するまで菌体の増殖を継続してもよい。このため、上記
実施態様において示したように、一定量の菌体を得るた
めの培養段階及びこのような培養段階で得られた菌体に
誘導基質を添加して短時間培養を行うことによってモノ
オキシゲナーゼ活性の高い菌体を得ることを目的とした
培養段階に分けて、微生物の培養を行うことが好ましい
が、前述したような２段階からなる培養を行わずに、誘
導基質濃度を一定に制御することができる培養装置を用
いて菌体の増殖とモノオキシゲナーゼ活性の発現の両方
を一段階で行い、活性菌体を得てもよい。

【００４３】培養時間は、使用する微生物の種類、培養
温度及びｐＨや菌体の初期濃度等の培養条件および培養
方法によって異なるが、例えば、一定量の菌体を得るた
めの培養段階では、ＮＳ１２５２３株を一白金耳、１重
量％のメチルメチルケトンを炭素源として加えたＡ培地
５ｍｌに接種し３０℃で３日間培養して種培養液を調製
し、この種培養液を上記と同様の培地１００ｍｌを入れ
た５００ｍｌ容の坂口フラスコに接種し、３０℃で振盪
培養（１４０ｒｐｍ）を行った場合、２〜５日である。
また、活性菌体を得るための培養段階では、上述の培養
段階で得たモノオキシゲナーゼ活性の十分高くない菌体
を誘導基質としてメチルエチルケトンを１重量％添加し
た新鮮なＡ培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の坂口
フラスコに接種して３０℃で振盪培養（１４０ｒｐｍ）
を行った場合、６〜７２時間である。このような方法に
よって、目的とする酸化反応に供試できるモノオキシゲ
ナーゼ活性を有する菌体を調製することができる。

【００４４】このようにして得られた活性菌体を用い
て、所望の物質変換反応を行うことができる。

【００４５】

【実施例】以下、実施例を参照しながら本発明をさらに
具体的に説明する。

【００４６】実施例１ ＮＳ１２５２３株を炭素源として１％グルコースを加え
たＢ培地で３０℃で７２時間培養した。このようにして
培養された菌株は、ほとんどモノオキシゲナーゼ活性を
持たないため、この菌株を用いて以下の活性誘導効果の
比較検討を行った。

【００４７】上記条件で培養されたＮＳ１２５２３株を
５０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ：７．０）で洗浄し、同
リン酸緩衝液中に菌体濃度が５ｇ湿重量／１００ｍｌに
なるように懸濁した。次に、５００ｍｌ容の坂口フラス
コ中に、このようにして得られた２５ｍｌの懸濁液を表
４に示される誘導基質を同表に示される濃度（０．５％
または１％）で含む等容量の同リン酸緩衝液に加えるこ
とによって誘導処理を開始した。この際、３０℃で２４
時間振盪（１４０ｒｐｍ）することによって誘導処理を
行った。この際、比較対象として、誘導基質を含まない
５０ｍＭ リン酸緩衝液を用いた以外は同様の処理を行
った。

【００４８】所定時間誘導処理を行った後、遠心分離
（６，０００×ｇ、５分）によって培養液から菌体のみ
を回収し、各菌体を同リン酸緩衝液中に菌体濃度が５ｇ
湿重量／１００ｍｌになるように懸濁した。この菌体懸
濁液５０ｍｌづつを５００ｍｌ容のフラスコに入れ、基
質としてフェノール、エネルギー源としてグルコースを
それぞれ１，０００ｐｐｍになるように添加し、３０℃
で３時間往復振盪（６０ｒｐｍ）することによって酸化
反応を行った。所定時間経過した後、各フラスコから反
応液をサンプリングし、高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）分析によって生成したハイドロキノンの濃
度を測定した。さらに、乾燥菌体重量を測定し、単位菌
体重量当たりの酵素活性を算出して、酵素活性を比較し
た。結果を表４に示す。

【００４９】

【表４】

【００５０】表４から、モノオキシゲナーゼ活性の誘導
処理後の酵素活性は、アセトン、メチルエチルケトン及
び２−ブタノールを誘導基質として用いた場合、誘導基
質の濃度に関係なく、無添加時に比べて増大しており、
この結果より、アセトン、メチルエチルケトン及び２−
ブタノールのすべてに活性誘導効果があることが明らか
になった。また、使用した誘導基質のうち、特に、アセ
トンが活性の向上に好ましく用いられることが分かっ
た。

【００５１】実施例２ 肉汁寒天培地（ディフコ(Difco) 社製）に生育させたマ
イコバクテリウム エスピー ＮＳ１２５２３株(Mycob
acterium sp. NS12523) を一白金耳、炭素源としてメチ
ルエチルケトンを１重量％添加したＡ培地５ｍｌを入れ
た試験管に接種し、３０℃で３日間培養することによっ
て、種培養液を調製した。次いで、この種培養液を上記
と同様の組成の培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌ容の
坂口フラスコに接種し、さらに３０℃で３日間培養し、
培養液を調製した。このようにして得た培養液から遠心
分離（６，０００×ｇ、５分）によって菌体を回収し、
メチルエチルケトンを１重量％濃度で炭素源として加え
て新たに調製したＡ培地１００ｍｌを入れた５００ｍｌ
容の坂口フラスコに接種して３０℃でさらに２４時間培
養して、モノオキシゲナーゼ活性の高い活性菌体を調製
した。このようにして得られた培養液を遠心分離（６，
０００×ｇ、５分）することによって培養液から活性菌
体のみを回収し、菌体をリン酸緩衝液中に菌体濃度が５
ｇ湿重量／１００ｍｌになるように懸濁した。

【００５２】この菌体懸濁液５０ｍｌを５００ｍｌ容の
フラスコ２本にそれぞれ分注し、一方のフラスコにはモ
ノオキシゲナーゼ活性の安定化物質として１，０００ｐ
ｐｍのアセトンを添加し、もう一方のフラスコにはモノ
オキシゲナーゼ活性の安定化物質を添加しなかった。次
に、基質としてフェノール、エネルギー源としてグルコ
ースをそれぞれ１，０００ｐｐｍになるように添加し、
３０℃で往復振盪（６０ｒｐｍ）することによって酸化
反応を行った。この際、酸化反応が進行するにつれて各
物質の濃度が低下するので、各物質の濃度を高速液体ク
ロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって適時測定
し、濃度が５００ｐｐｍを下回らないように、逐次各物
質を添加しながら反応を７０時間継続して行った。

【００５３】反応を開始してから終了するまで経時的
に、各フラスコから反応液をサンプリングし、ＨＰＬＣ
分析によって生成したハイドロキノンの濃度を定量し
た。結果を図１に示す。

【００５４】図１より、モノオキシゲナーゼ活性誘導効
果を有するアセトンを添加することにより、アセトンを
無添加で行った反応に比べて、反応継続時間が延長さ
れ、さらに反応生成物（ハイドロキノン）濃度の上昇が
顕著に認められた。この結果から、モノオキシゲナーゼ
活性の誘導基質を酸化反応系に添加することによって、
モノオキシゲナーゼ活性の安定性が顕著に向上すること
が示された。

【００５５】

【発明の効果】以上述べたように、本発明のモノオキシ
ゲナーゼ活性の安定化方法は、モノオキシゲナーゼ活性
を有する微生物を利用した芳香族化合物の酸化反応系に
モノオキシゲナーゼ活性を誘導する効果を有する炭素数
３から１０の脂肪族化合物を添加することを特徴とする
ものである。したがって、本発明の方法を用いることに
よって、モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物を用い
た物質変換反応において、反応系に誘導基質を一定量存
在させることによって、モノオキシゲナーゼ活性の経時
的な低下を効率よくしかも簡便に抑制でき、さらにはモ
ノオキシゲナーゼによる物質変換反応継続時間を顕著に
延長できるものである。

【００５６】また、本発明のモノオキシゲナーゼ活性の
安定化方法は、誘導基質を一定量存在させることによっ
て極めて簡便に行われる方法である。

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明による誘導基質を用いた酸化反応にお
ける反応時間に対するハイドロキノンの生成量の関係を
示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/38 Ｃ１２Ｒ 1:32） (72)発明者 阪野 公一 茨城県つくば市観音台１丁目25番地12 株 式会社日本触媒内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 芳香族化合物に酸素を付与する反応を触
   媒するモノオキシゲナーゼ活性を有する微生物を利用し
   た物質変換反応系において、モノオキシゲナーゼ活性を
   誘導する効果を有し炭素数が３から１０である脂肪族化
   合物を添加して該反応を行うことを特徴とする、モノオ
   キシゲナーゼ活性の安定化方法。
2. 【請求項２】 該脂肪族化合物がプロパン、ブタン、ペ
   ンタン、アセトン、メチルエチルケトン、メチルプロピ
   ルケトン、メチルブチルケトン、イソプロパノール、２
   −ブタノールおよび２−ペンタノールからなる群より選
   ばれた少なくとも１種である、請求項１に記載のモノオ
   キシゲナーゼ活性の安定化方法。
3. 【請求項３】 該脂肪族化合物が、反応液中の芳香族化
   合物の初期濃度に対して、１０重量％から２００重量％
   の範囲の濃度で存在する、請求項１または２に記載のモ
   ノオキシゲナーゼ活性の安定化方法。
4. 【請求項４】 該芳香族化合物に酸素を付与することに
   よって生成する化合物が、芳香族環に水酸基を有するフ
   ェノール誘導体、芳香族環にカルボキシアルキル基を有
   する芳香族カルボン酸および芳香族環にアルキルケトン
   基を有する芳香族ケトンからなる群より選ばれたもので
   ある、請求項１から３のいずれかに記載のモノオキシゲ
   ナーゼ活性の安定化方法。
5. 【請求項５】 モノオキシゲナーゼ活性を有する微生物
   がマイコバクテリウム(Mycobacterium) 属に属する微生
   物である、請求項１から４のいずれかに記載のモノオキ
   シゲナーゼ活性の安定化方法。