JPH09500016A

JPH09500016A - 結合部位内の共有結合された化学的成分を伴うｓｂｐメンバー；その産生及び選択

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Publication number: JPH09500016A
Application number: JP7503366A
Authority: JP
Inventors: ステファンアンヌテレーズジェスパース，ローラン; ポールウィンター，グレゴリー; ピーターボナート，ティモシー; マルティンジーモン，トーマス
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1993-06-30
Filing date: 1994-06-30
Publication date: 1997-01-07
Also published as: EP0706569B1; AU691817B2; GB9313509D0; CA2163979A1; US6017732A; WO1995001438A1; DE69426649D1; DK0706569T3; EP0706569A1; DE69426649T2; AU7006894A; ES2156154T3; ATE199024T1

Abstract

(57)【要約】各々の第１の sbpメンバーが結合部位内で１つのアミノ酸残基にて共有結合された化学的成分を有している、第１の特異的結合対(sbp) メンバーのレパートリが作製され、これらはバクテリオファージといった生体の表面で表示されうる。このようなレパートリの作製方法には、選択的に又は優先的に修正可能なアミノ酸をコードするコドンが例えば突然変異又は遺伝子構築などによって、結合部位をコードする領域内に導入される、コードする核酸分子の集団の提供段階が関与しうる。結合部位内の化学的成分の存在下で第２の sbpメンバー（例えば抗原）に対する結合が増強されるか、又はこの化学的成分の存在にこの結合が依存している、第１の sbpメンバー（例えば抗体）を、レパートリの中から選択することができる。

Description

【発明の詳細な説明】結合部位内の共有結合された化学的成分を伴う sbpメンバー；その生産及び選択本発明は、相補的第２の sbpメンバーのための結合部位を含む特異的結合対(s bp) のメンバーに関する。より特定的に言うと、本発明は、化学的成分が結合部位内で１つのアミノ酸残基にて特異的に取込まれている sbpメンバー特にそのレパートリに関する。本発明は同様に、かかるレパートリの産生及びかかるレパートリの選択及び問題の第２の sbpメンバーについての結合特異性を伴う第１の s bpメンバーのレパートリからの選択にも関する。 sbpメンバーは、結合部位が免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変ドメインの領域を結合させることによって形成されている sbpメンバーであってよい。 WO92／01047 号では、抗体フラグメントを含む特異的結合対のメンバーであるポリペプチドが、バクテリオファージの表面上で表示され得ること及びこれらが例えば抗体の場合の抗原といったような特異的結合対の相補的メンバーを結合することになることが開示されていた。望ましい結合特性を伴う第１の sbpメンバーを、この特徴を用いて直接的に選択することが可能である。ここで記述されていた原則は、その後さらなる特許出願WO92／20791 ；WO93／06213；WO93／11236 及びWO93／19172 号の中で拡張されてきた。例えばヒト末梢血リンパ球及び免疫化された動物の脾臓からの抗体レパートリを表示するファージライブラリが調製され、特異的抗体が分離された。WO92／01047 では、バクテリオファージ上の表示のためのＶ遺伝子レパートリを、再配置されていないＶ遺伝子とＤ及びＪセグメントを組合せることによってインビトロで作製する方法について記されている。ファージ上で表示されたこのような人工的に再配置されたＶ遣伝子レパートリから、さまざまな抗原に対する抗体が選択されてきた。(H．R．H oogenboom & G．Winter．J．Mol．Biol．227 381−388 1992；及びWO93／06213 及びWO93／11236 内に開示されている通り)。しかしながらこれらのコードされたライブラリの化学的多様性は、天然のアミノ酸に制約されている。抗体といったような sbpメンバーの結合部位でその他の反応性基を取り込むことができることが望ましいと思われる。これには数多くの利用分野があるだろう。抗体をベースとしたバイオセンサーの開発（J.R.North，Trends Biotechnol． 3180−186，1985 により再検討されている）は、認識及びエフェクター機能を同じ分子内に組合わせる能力によって制限されてきた。抗原結合事象の形質導入は、螢光体、発光原子団又はレドックス（酸化還元）基といったような代替的手段によって媒介される必要がある。これらのリポータ基は理想的には、抗体結合部位の一部を成しており、かくして抗原結合は、基の微小環境変化及び螢光、発光又はレドックス電位の対応する変化を導くことになる。同様にして、触媒抗体の統計（R.A.Lerner et al.，Science 252 659−667，1 991 により再検討されているもの）は、数多くの酵素に共通の特長である金属イオン、ヘム及びフラビンといった求核性基及び非ペプチジル補因子を抗体結合部位内に取り込むことによって容易になる。これらの修正基は、理想的には抗原結合部位で共有結合により取り込まれ、かくしてパラトープの一部となる。このとき、このような化学的に修正された抗体を、時間分解された螢光免疫検定などのような免疫検定の利用分野における検出作用物質として直接、又は触媒作用の中で直接、使用することができる。この出願では、我々は、ファージ上で表示された sbpメンバーのレパートリ内に共有結合により化学基を取り込むことができること、そして、抗原結合部位に共有結合された基を伴った状態でこれらのレパートリから sbpメンバーを選択することができることを立証する。抗体分子の抗原結合部位での化学的成分の取込みの有用性は、特に触媒抗体の誘導について、これまでの研究者達によって認識されてきた。例えば軽鎖相補的決定領域で金属イオンを抗原結合部位へとキレート化するように金属配位部位が設計された合理的タンパク工学が使用されてきた。(V．A．Roberts et al，Proc ．Natl．Acad．Sci．87 6654−6658 1990 ； B．L．Iversen et al Science 249 659−662，1990 ； D．G．Gregory et al，タンパク工学6.29−35，1993) 。 R oberts et alは、触媒金属部位を含む特異的軽鎖又は重鎖と、潜在的基質又は遷移状態類似体にまで高められた相補的鎖のライブラリを組合わせることによって、望ましい活性及び特異性をもつ触媒抗体の分離が改善されるはずである、ということを示唆している。Gregory et al.は、亜鉛結合部位が設計により抗リゾチーム抗体HyHEL5の中に取り込まれ、抗原結合及び金属キレート化の両方が保持されたことを報告している。 C.F.Barbas et al（Proc Natl．Acad．Sci．USA90 6385〜6389，1993；1993年７月公開）は、触媒抗体の分離のための無作為突然変異誘発及び選択が関与する反復的戦略の使用を提案した。患者は、金属結合部位を作り出すための CDR突然変異誘発の後には、金属及びハプテンの両方を結合させる触媒金属抗体を生成するためのその他の CDRの突然変異誘発が続くということを提案している。 Barbas et alは、破傷風トキソイドに対する特異性をもつ、彼らが突然変異誘発させた既存の抗体の Fabフラグメントで出発し、金属に結合する Fabフラグメントをファージ上で表示しライブラリから選択した。次に、彼らは鎖組み替え又はもう１つの CDRの突然変異誘発によって、分離された金属結合 Fabフラグメントを多様化させ、次に基質に対する特異性を得るべく選択することを提案しているが、これを成功視に達成できるか否かについてはまだ報告していない。例2 では、ヒトＶ遺伝子から合成的に調製されたscFvフラグメントのライブラリの構築は、官能基を導入するように特異的に修正されうるアミノ酸残基が抗原結合部位に含まれている場合に行なうことができる、とうことを説明している。残基は、非タンパク質要素が抗原結合部位で取り込まれた状態で、抗原に結合する抗体フラグメントが同定されるように、全ての選択プロセスの前に特異的に化学的に誘導体化される。 Ward et al，Nature 341： 544−546，1989 は、VHドメインで基質を結合させ、Vkドメイン内の側鎖又は補欠分子族が遷移状態を安定化させるか又は基質を攻撃する。Fvフラグメントの概念を示唆した。この出願では、相補的 sbpメンバー（例えば抗原）に強く結合するのに誘導体化に依存している sbpメンバー（例えば抗体フラグメント）を得ることができる、ということが立証されている。金属抗体についての以前の研究では、金属は抗原の一次認識に関与しないということが考慮されていた（Roberts et al.，1990 、前出：Gregory et al．1993 前出）、抗原の認識が抗原結合部位における金属の存在に絶対的に依存しているような抗体フラグメントが他の研究者によって分離されたことは今だかつて一度もない。本発明は、先行技術に付随する問題又はむずかしさを改善する、第２の sbpメンバーのための結合部位を伴う第１の sbpメンバーの獲得に対する新しいアプローチを提供している。ここでは、前後関係がその他のことを必要としているのでないかぎり、「抗体」又は「抗体フラグメント」というのは、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH ）の結合領域を含む第１のポリペプチドドメイン及び免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VL）の結合領域を含む第２のポリペプチドドメインの結びつきによって形成されたその結合部位を有し、しかも、VL，VH，CL及びCH１ドメインから成る Fabフラグメント、単一の抗体のVL及びVHドメインから成るFvフラグメント、ペプチドリンカーによりリンケージされたVLドメイン及びVHドメインを含む一本鎖 Fv (scFv)， F(ab′)2フラグメント、２つのリンケージされた Fabフラグメントを含む２価のフラグメント、２重特異性体鎖Fvダイマー(PCT／US92／09965)及びダイアボデー(diabodies)、遺伝子融合により構築された２価の又は２重特異性フラグメント(P．Holliger et al、前出； PCT／GB93／02492)を含む第１の sbp メンバーのことを意味している。「レパートリ」という語は、多様性すなわち配列の多様性を表わすのに使用され、一般に、恐らくは約 100万といった数多くの異なる配列（例10⁷ −10⁹ −10¹² −10¹⁴）を暗に意味している。抗体又は抗体フラグメントのレパートリは、マウスやヒトなどの生体内で見出されるものを代表する多様性をもち得る。第１の sbpメンバーのレパートリから、各々さまざまな異なる第２の sbpメンバーの１つを結合させることのできる多数の異なる第１の sbpメンバーを分離できると予想される。本発明は、結合細胞内で単数又は複数のアミノ酸残基において共有結合した化学的成分を含む結合部位を各々有する第１の sbpメンバーの、遺伝的に多様なレパートリを提供する。化学的成分は、第１の sbpメンバーを発現するのに用いられる核酸によりコードされず、その代り、ポリペプチドの産生に続く共有結合形修正によって導入される。問題の第２の sbpメンバー（抗原）に対する結合特異性をもつ単数又は複数の第１の sbpメンバーを、例えば結合親和力を利用してレパートリから選択することができる。特に有利なのは問題の第２の sbpメンバーに対する結合が化学的成分の存在によって増強されるか又はさらにこの存在に全面的に依存しているような第１の sbpメンバーを選択する能力にある。化学的に修正された s bpメンバーは、同じ条件で結合を比較した場合、修正されていない遣伝的に同一の sbpメンバーよりもさらに大きい親和力で、問題の第２の sbpメンバーを結合させることができる。同様に、第１の sbpメンバーの結合部位内に化学的成分が共有結合されていないいくつかのケースにおいては、全く結合の無い場合もある。このとき、化学的成分は、高親和力の結合を得るため共に非共有結合を形成するべく第２の sbpメンバー（抗体の場合には抗原）にとって不可欠であって、結合部位の一部を成す。化学的成分は、特異的な化学的に修正を可能な単数又は複数の残基において導入される。化学的で修正可能なアミノ酸残基は、特定の条件下で選ばれた化学試薬を用いて修正可能なアミノ酸残基である。アミノ酸は、結合部位内で唯一のものであってもよいし、或いは又唯一修正可能であってもよいし、或いは又存在するその他のアミノ酸に対し選択的に又は優先的に修正可能であってよい。例えば、システイン残基が結合部位内に導入され、そのチオール基を介して化学的修正のために利用可能であってもよい。分子内には（例えばVHドメイン内）その他のシステインがあってもよいが、一般にこれらはジスルフィド架橋によって対合されることになり、そのため化学的修正のためには利用できないが、又は少なくとも結合部位内に導入され従って選択的又は優先的に修正可能であるものほどには利用可能でない。同様にアミノ酸を、例えば特定の特性をもつもう１つのアミノ酸に隣接する分子内に位置づけすることによりその環境を工学処理することによって sbpメンバーの中の同じタイプの他のアミノ酸と比べて優先的に修正可能なものにすることも可能である。例えば、カルボキシレート基の隣りのアミノ酸は、たとえ結合部位内で唯一のものでなくとも、より求核性でかつ選択的に修正可能なものにされることになる。レパートリは、各々の第１の sbpメンバーの中に唯一のアミノ酸、各々の第１の sbpメンバー内で唯一修正可能なアミノ酸、又は各々の第１の sbpメンバーの中の複数の優先的に修正可能なアミノ酸残基を含み得る。レパートリは、選択されたレパートリ及び１つのレパートリから選択されたクローンから発現されたポリペプチドについて複製可能な修正を行なうことができるように、単数又は複数の特異的アミノ酸残基において複製可能な形で修正可能であることが必要である。本発明には、先行技術と異なるいくつかの付加的な特徴がある。化学的成分は部位で共有結合によって取り込まれており、結合部位の重要な決定因子を形成しうる。この共通結合形修正によって、よりさまざまな成分、特に触媒作用のための補因子又はリポーター基を取り込むことが可能となる。本発明の一実施態様においては、特異的に修正可能である単数又は複数のアミノ酸が結合部位において取り込まれている。こうして、初めて、螢光リポータ基、７−ニトロベンズ−２ −オキサ−１，３−ジアゾール(NBD) などの大きな有機基の相互作用が可能となる。触媒作用のためのフラビン補因子、 FMN及び FADといったその他の大きい基も取り込むことができる。結合タンパク質のレパートリ全体が誘導体化され、結合剤が分離された例はこれまでに無い。重要なことに、初めて抗原に対する検出可能な結合を得るのに非タンパク質要素での誘導体化を必要とする scFvフラグメント (クローン SSL−34によりコードされたもの、例2)が分離されたのである。化学合成レパートリを生成するための共有結合形修正の取込みには、数多くの問題点が関与する。第１に誘導体化された抗体を得るため試薬で特異的に修正されうる結合部位内のアミノ酸残基が存在する必要がある。第２に、既存の結合タンパク質と共に抗体といった結合タンパク質の中に化学的半分を導入することは、結合特性の変化をひき起こす可能性がある。結合部位の外側の部位での修正は、導入された基をリポータ基又は触媒基としてはるかに有用性の低いものにする確率が高い。本発明は、結合部位内に導入された基が存在する場合に問題の第２の sbpメンバーを結合させることのできる結合タンパク質（「第１の sbpメンバー」）の選択を可能にすることによってこれらの問題点を克服する。結合タンパク質（例えば抗体１の多くは、問題の標的（例えば抗原）のみを結合するか、又は化学的に修正された場合には大幅に改善された結合を示す。これは、当初問題の抗原を結合するものとして知られていた単一の抗体の修正が関与する以前のアプローチとは異なっている。本発明では、結合部位内に化学的基が存在することから、その特性は抗原の結合により修正される確率がより高い。このためこの方法は、螢光基といったリポータ基が抗体の結合する部位の近くにある場合にその特性を変える確率がはるかに高いことから、免疫検定のためのこれらの基の取り込みにとって強力なものとなっている、触媒作用のための補因子も、触媒抗体の中で基質が結合する場所に近いところにある必要があるだろう。この１つの実施形態は、固定された軽鎖上に補因子を提供し、基質特異性を供給する重鎖を選択することである。抗原の高親和力結合に有利に作用するが又は例えば異なるサイズの抗原分子の間で弁別を行なうため結合の特定の選択性を促進するような基を、抗原結合部位にて取込むこともできる。結合分子のインビトロ生成により、非ペプチジル要素を内含するべくこれらの構造をインビトロで修正することが可能となる。アクセス可能なあらゆる表面露呈システイン残基においてジスルフィド結合を介して合成半分を工学処理できるものの、抗原結合 CDR領域は、修正のための明白な標的である。軽鎖CDR3の修正は、結合部位の一部を成す合成要素を結果としてもたらし、しかもなお、優性重鎖CDR3により抗原接点が形成されることを可能にする。従って、抗体の多様性及び機能性は、これらのコードされていない要素の内含により既存の抗体ライブラリを用いて可能であるものを超えて、増大する可能性がある。本出願に記されている方法は、事実上全ての化学的成分を結合部位内に取り込ませ、効率の良い結合活性のための必須成分となるようにすることができる。レパートリ内の第１の sbpメンバーは、表面での表示のためあらゆる生体の表面成分に融合され得る。糸状バクテリオファージ上で表示された化学合成ライブラリにおいては、各クローンは、CPIVウィルス外被タンパク質といった表面成分についてコードする遺伝子の中に対応する遺伝子を挿入することによってファージ表面上の融合タンパク質として第１の sbpメンバーを発現する。生体の表面上に表示された結合タンパク質をコードする核酸は、問題の第２の sbpメンバーを結合させることのできる第１の sbpメンバーの選択の後の容易な回収のため、生体内にパッケージングされ得る。レパートリからの第１の sbpメンバーの選択は、好ましくは、問題の第２の s bpメンバーとの結合によるものである。第１の sbpメンバーをコードする核酸分子を含む生体の表面で表示された第１の sbpメンバーの選択の後、核酸を生体から回収し、問題の第２の sbpメンバーを結合させることのできる結合部位をもつ第１の sbp メンバーの産生において、これを使用するか又はその他の同じアミノ酸配列をコードする核酸分子又はその突然変異体又は誘導体をこれに使用することができる。例えば１つの抗原などに対する望ましい特異性をもつ個々の第１の sbpメンバーを、従来のスクリーニング技術（例えばHarlow，E.，及びLane，D.，1988、前出、Gherardi，E et al．1990，J.Immunol．meth．126 p61 〜68に記載のとおり）を用いて複合体ライブラリから分離することができる。選択は、往々にして、リガンドを用いた親和力マトリクスからの溶出となる。増大する濃度のリガンドでの溶出は、増大する親和力をもつ表示された結合分子を溶出するはずである。生体の表面上で表示された強力に結合した第１の sbpメンバーを保持した親和力マトリクスが、例えば DSD溶液中での煮沸により DNAを抽出する。抽出された DNAを次にE.coli宿主細胞を形質転換するのに直接使用することもできるし、或いは、代替低には例えば適当なプライマでの PCRを用いてコーディング配列を増幅させ、その後発現のためベクター内に挿入することもできる。リガンドに対する高い親和力をもつタンパク質分子を表示するファージの集団から選択を行ないたい場合、好ましい戦略は、ファージの集団を、少量のリガンドを含む親和力マトリクスに結合させることである。マトリクス上のリガンドに結合させるためには、高い親和力及び低い親和力のタンパク質を表示するファージ間での競合がある。高親和力タンパク質を表示するファージが優先的に結合され、低親和力タンパク質は洗い流される。次に、高親和力タンパク質は、リガンドで又は親和力マトリクスからファージを溶出するその他の手順によって溶出により回収される。このとき要するに、親和力階段からのパッケージングされた DNAの回収のためには、パッケージを単に溶出させることができ、これは、相補的 sbpメンバーへの結合のための前記パッケージと競合する相同な sbpメンバーの存在下で溶出され得る；これは煮沸によって除去でき、タンパク質のタンパク質分解分割によっても除去できる；又、例えば前記パッケージングされた DNAと sbpメンバーを放出するための基質と相補的 sbpメンバーの間のリンクを破壊することといったその他の方法も当業者にとっては明らかであろう。いずれにせよ、目的は、直接又は間接的に使用してそれがコードした sbpメンバーを発現させることができるように、パッケージから DNAを得ることにある。他の箇所で論述する通り、第２の sbpメンバーに対する選択された第１の sbp メンバーの結合は、結合部位内でアミノ酸（単数又は複数）において共有結合された化学的成分無しでの同じ第１の sbpメンバーの結合と比較すると、増強される可能性がある。本発明に従った第１の特異的結合対(sbp) メンバーの多様なレパートリを提供する方法には、各々の第１の sbpメンバーの結合部位内でアミノ酸残基に対し共有結合された化学的成分を導入するべく第１の sbpメンバーを化学的に修正する段階が含まれている。化学的修正段階の前の第１の sbpメンバーのレパートリの提供には、レパートリを集合的にコードする核酸分子の集団からの発現が含まれる可能性がある。核酸分子の集団の提供には、アミノ酸残基をコードするコードンを導入するべく、第１の sbpメンバー又はそのポリペプチド成分部分（例えば Fabフラグメントといたヘテロダイマー結合剤の１つのポリペプチド鎖）をコードする核酸の突然変異段階が含まれる可能性がある。同様に、例えば遺伝子フラグメントの組合せなどによる結合によって核酸を構築することもできる。これらは、 PCRを用いて行なうことができる。１つのアプローチは、各々の選択段階に先立つファージ結合タンパク質集団全体への合成成分の共有結合形取込みによるファージ上の半合成ライブラリの作成を目指すものである。結合活性を用いて分離された半合成ファージ−抗体は、その抗原結合部位内への合成基の存在を許容するか又さらには必要とさえすることが示されている。後者の場合、これらの抗体フラグメントは、単相免疫検定及び触媒作用の中で使用するための最良の候補者でありうる。例１では、可溶性タンパク質又は繊維状ファージに対する融合産物として発現されたscFvの軽鎖CDR3内の唯一のシステイン無しのチオール官能基の反応性を我々がいかに試験したかを報告している。半合成の特異性を評価した後、次に我々は例２において、ジスルフィド交換又はアルキル化反応を用いて、２つの異なる合成成分を伴うphOxに対する半合成scFvの活性を選択した。担体に対し接合されたハプテン２−フェニルオキサゾル−５−オン（phOx１に対する各々の選択段階の前にscFvライブラリについてのこの化学的修正を反復することによって、我々は、４回の選択の後に溶出されたいくつかのクローンが、抗原に対する強化 ELISAシグナルを産生するのに、共有結合された半分の存在を必要とする、ということを発見した。７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール(NBD) 螢光体で選択された１つのクローンがさらに特徴づけされた；すなわち螢光体が抗原結合部位内に取り込まれた場合、抗原を用いてはるかに高い ELISAシグナルが得られた。例では、重鎖レパートリと組合せた単一の化学的に修正された軽鎖の使用について記述されている。これは、ファージ上で表示された合成レパートリ内の異なる軽鎖又は重鎖のレパートリ内の基の取込みへと容易に拡張することができる。システインを取込むための最も単純な位置は重鎖又は軽鎖のCDR3であるが、これらのシステインは原則として、突然変異誘発又は遺伝子フラグメントの結合を用いて鎖の中のいかなる位置にでも取込むことができる。システインはVHドメインの中の他のどこにでも存在し得るものの、ジスルフィド結合を形成する可能性があり、化学的修正のためには利用できない。上述の基本系について改良を加えることが可能である。導入された基は、ジスルフィド結合又はビシナルジオールといった分割可能な基により表示された結合タンパク質にリンケージされ得る。結合部位における導入された基でのファージの選択の間、ファージは次に分割試薬を用いて相補的な第２の sbpメンバーから溶出されうる。結合が導入された基の存在に依存しているようなファージが優先的に溶出され、一方、結合が独立したものであるようなファージは保持されることになる。導入された基と結合部位の間のリンカー長は変動しうる。こうして、例えばリポータ基又は触媒基としての機能を遂行することを最もうまく可能にする導入された基の位置を、結合部位の空間の探究によって発見することが可能になっている。システイン基は、分子上の複数の部位例えば抗体又は抗体フラグメント内の異なる CDR残基において導入され得る。例えば２つの導入された基での誘導体化を可能にする重鎖及び軽鎖の両方についての修正を行なうことが可能である。例えば無作為オリゴヌクレオチド内の特定の位置で、コドンをコードするシステインを取込むことによって、変動する CDR内の特定の箇所でシステインを導入することができる。いくつかのフラグメントの中ではこれにより１つ以上の部位での誘導体化が導かれるとしても、抗原に対する結合による選択は、誘導体化が結合と相容性をもつようなフラグメントが選択されることを可能にすることになる。同様に、同じ試薬又は２つ（又はそれ以上）の異なる試薬での修正のために２つ（又はそれ以上）の残基を取込む可能性もあるし、又より好ましくは、異なる化学的成分を結合部位内に取込むのに異なる試薬で異なる残基を修正することもできる。これは、例えば、フラビン及びヘムといったような２つの化学的成分の存在がレドックス反応の触媒作用を促進しうる触媒抗体のために有用である。もう１つの実施形態においては、例えばM．Figini et al.，J．Mol．Biol．23 9，68−78，1994によって記述された手順を用いて、溶解状態の軽鎖などのタンパク質鎖について修正を行なうことができる。このとき、軽鎖は、選択された結合剤及びファージ上の重鎖の集団と結びつけられうる。この結びつきは、ファージ集団と抗原を接触させる前に各選択毎に反復される。本発明は、特定の結合対の第１のメンバーの結合部位において金属イオンを導入する新しい方法を提供する。イミノジ酢酸といったキレート化基を例えばシステイン残基といった結合部位で取込むことができ、その後金属含有溶液を付加することができる。スペーサアームの使用は、その他の研究者(Roberts et al，19 90前出；Gregory et al，1993 ；Barbas et al，1993)が行なったようなキレート化のための直接的なアミノ酸残基の使用に比べて、触媒作用のための金属イオンの位置づけに関してさらに大きな柔軟性を与えることになる。ポリペプチドの結合部位を修正する方法として考えられるものが他にもある。特異的官能基を含む分子を用いて特異的に誘導体化されうるアミノ酸残基が数多く存在する。例えば、アミノ酸はＮ−ヒドロキシスクシニミドエステルで修正することができ、カルボキシル基はカルボジイミドで、ヒスチジン及びシステインはハロメチルケトンで、アルギニンはグリオキサルで修正することができる。（例えば、A．R ．Fersht、酵素の構造メカニズム第２版、1985 p248〜p251，W．H．Freeman，Ne w York を参照のこと）。これらの残基の修正に伴う問題は、これらが他の部位に存在する可能性もあることから、いかにして結合部位にあるものを修正するかということにある。数多くのケースにおいて、活性に影響を及ぼすことなく、結合部位にないものを修正することが可能であり得る。これは、どのアミノ酸残基が酵素の触媒部位にあるかを決定する一般的方法であった(Fershtet al，1985前出)が、それはこれらの部位の修正のみが活性に影響を及ぼすからである。特異的アミノ酸残基を修正するのに使用することのできるいくつかの試薬は、Ｔ．イモト及びＨ．ヤマダの「タンパク質機能：実践的アプローチ」p247〜p277 ，1989に記述されている。ポリペプチド内に特異的な官能基を導入するために、これらの試薬の反応基を修正用試薬の中で官能基と組合せることができる。例えば、螢光体７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸でタンパク質を修正することが望まれる場合には、アミノ基を修正するのに分子のＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステルを用いることができ、一方システイン基を修正するのにＮ−〔６−（−アミノ−４−メチルクマリン−３−アセタミド）ヘキシル〕−３′−（２′−ピリジルジチオ）プロピオンアミドを使用することができる。ライブラリを構築するためＶ遺伝子といった突然変異を受けた合成セグメントを用いることによって、リシン、グルタミン酸塩、ヒスチジン又はチロシンといったシステインよりもさらに一般的に見い出される残基の抗原結合部位における特異的修正を達成することができる。例えば、重鎖のCDR3内のリシンを特異的に修正することが望まれる場合には、アルギニンといったもう１つのアミノ酸へと全てのリシン残基が突然変異させられたVH及びVLドメインの遣伝子セグメントから、ライブラリを構築することができる。このとき、VHCDR3内のリジンを特異的に化学的に修正することができる。考えられるもう１つの方法は、グルタミン残基のガンマ−カルボキシアミド基と第１アミンの間のアシルトランスファ反応の触媒として作用するトランスグルタミナーゼを使用することにある（E．Bendixan et al，J．Biol．Chem．268219 62−21967，1993 ；K．N．Lee et al．Biochem．Biophys．Acta 1202 1−6 1993 ；T．Kanji et al J．Biol．Chem．268 11565−11572 1993）。従って、この酵素は、ペプチドからのアミノ酸残基をペプチドリシンイプシロンアミノ基を通して結合部位にてグルタミン残基へと、又、ペプチドグルタミン基を介して抗原結合部位にてリシン基内へと導入することができる。この酵素は同様に、第１アミンを用いた結合部位のグルタミン残基の誘導体化の触媒としても作用することができる。ここでも又、グルタミン残基及びリシン残基は抗体内で一般的であることから、修正が望まれたものについて以外、これらの残基がその他の残基に突然変異された遺伝子セグメントからライブラリを構築することが有利であろう。さらにもう１つのアプローチは、逆タンパク質分解又は化学的接合又はこの２つの組合せを用いて、ファージ上に表示されたポリペプチドのＮ又はＣ末端のいずれかへ化学的成分を導入することである。(I.Fisch et al，Bioconj，Chem．3 ，147−153，1992 ；H.F．Gaertner et al，Bioconjug，Chem．3，262−268，19 92 ；H.F．Gaertner et al，J．Biol．Chem．269，7224 −7230，1994；J.Bonge rs et al，Biochem．Biophys．Acta，50，S57−162，1991 ；R．Offord、タンパク工学、4，709−710，1991)。これらの方法は、タンパク質及びペプチド分子へ、コードされていない要素を導入するために使用されてきた。レパートリを誘導体化させるためにこれらの方法を使用することは化学的成分を用いて修正された場合にのみ基質又はレセプタを結合させる酵素及びレセプタ結合ペプチドの選択にとって、きわめて重要でありうる。導入されうる螢光体の例としては、フルオレセイン、フィコエリトン（紅藻系）、クマリン、NBD、テキサスレッド及びキレート化されたランタニドイオンがある。導入されうる触媒基の例としては、フラビンアデニンジヌクレオチド(FAD ) 、フラビンモノヌクレオチド(FMN) 、チトクローム及びキレート化金属イオン例えば亜鉛及び銅がある。本出願は、遺伝子コーディングによって得ることのできるものより上に表示されたライブラリの多様性を増大させるべく、ファージ上に表示されたライブラリ内に化学的要素を取込むことができるということを実証している。これは、抗体及び触媒作用を促進する非タンパク質基を取込むことのできる酵素といったその他のタンパク質又はレセプタ分子の両方のタンパク工学の範囲を拡張することができる。本発明のその他の態様及び変形形態は、当業者には明白となることだろう。本発明の実施形態について、ここで図面を参照しながら例示していく。図１は、修正されていないか又はNBD-1A又はF-IAで誘導体化されたライブラリ１からの個々のファージの ELISAシグナルを示す。図２は、修正されていないか又はNBD-1A又はF-IAで誘導体化されたライブラリ２からの個々のファージの ELISAシグナルを示す。図３は、修正されていないか又はNBD-1A又はF-IAで誘導体化されたライブラリ３からの個々のファージの ELISAシグナルを示す。図４は、２つのクローンSSL-32及びSSL-34について得られた ELI SAシグナルに対する可溶性scFvフラグメントのIA-NBDでの修正の効果を示している。可溶性一本鎖Fvフラグメントは、モノマーフラグメントを得るべくSuperdex 75上のFPLCゲルろ過により精製され、IA-NBD（黒色棒）で修正されるか又は修正されないままに残された（斜影棒）。図５は、得られた ELISAシグナルにより決定されるようなクローンSSL-34から誘導された可溶性scFvフラグメントの特異性を示す。可溶性scFvフラグメントはモノマーフラグメントを得るべくSuperdex75上のFPLCゲルろ過により精製され、 IA-NBDで修正されるか（左側プロット）又は修正されないままに残された（右側プロット）。抗原は、（左から右へ）phOx-BSA（黒色棒）、phOx-CSA，phOx-KLH 及びphOx−ポリリシン、 BSAである。本文中に言及されている文書は全て、参考として本書中に内含される。例１．抗−NIP 抗体の抗原結合部位におけるシステインチオールの導入及び修正この例で記述する研究は、システインチオールを抗体分子の結合部位で取り込ませ、化学的基を導入するべく特異的に修正させることができるということを示している。アミノ酸側鎮の中で、システイニルチオールは一般に最も求核性の基であり、従って、ジスルフィド交換を介してか又はアルキル化による弱部位特異性誘導体化のための貴重な候補である。変性剤が無い状態では、抗体フラグメントの内部システインは室温で20mMの DTTによる還元に対する耐性をもつジスルフィド架橋を形成する。従って、部位特異的突然変異誘発による表面アクセス可能なシステインの導入は、修正のための唯一のチオールを支持する抗体フラグメントを産生する確率が高い。我々は、内部システインが、反応せず又ひだ形成経路を混乱させないことを仮定した。主要な(major)外皮タンパク質 cpVIIIにはシステイニル残基が欠如しているが、scFvが遺伝的に融合されている副(minor) 外皮タンパク質cpIIIは、２つの仮説上のドメイン内に等分布した８つのシステインを含んでいる。これらのシステインがジスルフィド結合を形成することが期待されたが、それらが反応性をもつか又修正がファージの感染性を危険にさらすかについてはわからなかった。我々は、モデルとして NIP12scFvを用いて初期研究を行なうことを選んだ。使用した方法は、以下のとおりであった：・PHEN１−Ｖλの Cys含有バージョンの構築 pHEN１−Ｖλ３ベクター内でコードされたＶλ３軽鎖可変ドメインの Ser93残基を、プライマ−５′−ACC ACT GCT GTC CCG GCA GTT ACA GTC ATA GTC−3′を用いて、インビトロ突然変異誘発（Amersham International）により Cys残基へと変換した。この新しいベクターを pHEN１−Ｖλ−Ｃ93と呼んだ。・NIP12 scFvの Cys含有バージョンの構築３−ヨード−４−ヒドロキシ−５−ニトロフェニルアセテートハプテン(NIP) に対して親和力選択された対応するクローンからNcoI−XhoIフラグメントとして、 NIP12重鎖可変ドメインを切除した。この NIP12クローンは、49のヒトVH生殖細胞系配列がランダム化されたCDR3（長さ５〜８）の合成ライブラリに PCRによってリンケージされpHEN１−Ｖλファージミドベクター（Hoogenboom & Winter ，J．Mol．Biol．227 381−338 1992）内にクローニングされている、１つのライブラリから誘導される。このとき、 NIP12重鎖フラグメントは、Ｖλ３軽鎖内の位置93で工学処理されたシステイン残基を支持しているという点を除いて NIP 12scFvと同一であるタンパク質であるNIP12-C93scFv の可溶性発現のためpHEN１−Ｖλ３−Ｃ93の対応する部位の中に再度クローニングされた。 NIP12scFv及びそのシステイン突然変異体のファージ表示のために、我々は fd -Tet-SfiINotIファージベクターの対応する部位の中へSfiI−NotIフラグメントとして２つの遣伝子を別々に再クローニングした。我々は、ファージタンパク質のウエスタンブロット分析を容易にするため、一価表示pHEN１ファージミドではなくむしろ多価表示fdベクターを選択した。実際、cpIII−融合されたscFvの百分率は、fdベクターでは約90％まで上昇し、一方pHEN１ファージミドでは10％を超えない。 Hoogenboom & Winter（1992 ；前出）により記述されているように、 NIP結合抗体フラグメントを親和力切断により分離した。これは、インビトロで再配置されたヒト生殖細胞系VH遺伝子の合成レパートリに対する単一のヒトＶλ３軽鎖のリンケージによって組立てられたscFvライブラリに由来している。軽い可変ドメインはライブラリ中で一定に保たれていることから、このセグメント内にシステイニル残基が導入された。軽鎖のCDR3は通常抗原結合部位のCDR1及びCDR2よりも大きい部分を形成することから、我々はL-CDR3セリン93をシステインへと突然変異させることに決定した。Ｖλ３，Kolの両軽鎖のCDR3は10個の残基と包含していることから、我々はKolL-CDR3の空間コンホメーションをベースとして、残基9 3の側鎖が結合裂溝に対し垂直に存在し、溶剤アクセス可能であるという仮説を立てた。 NIP12及びその突然変異体 NIP12-C93scFvの両方を調製した。後者の遺伝子は、NcoI−XhoI消化によりpHEN１−Ｖλ３クローニングベクターから切除し、それをpHEN１−Ｖλ３−Ｃ93（部位特異的突然変異誘発により導入された軽鎖Ｖλ３内の Ser93から Cys93の突然変異を伴うpHEN１−Ｖλ３と同じベクター）の対応する部位内へ再度クローニングさせることによって組立てられた。精製されたタンパク質の収量は、Superd ex G−75カラム上でのその保持時間と同様２つのクローンについて同様であった（培養１リットルにつき約1.5mg）。 NIPコーティングされたプレート上の可溶性 ELISAシグナルは、 NIP12についてよりも突然変異体タンパク質についてわずかに強度の低いものであった。かくして、scFv内への５番目のシステインの導入が許容される。工学処理されたチオールの溶剤アクセス可能性を次に、ライブラリ内で使用されたものと類似の化学的修正によって試験した。70：１のモル比（ヨードアセタミド；scFv）での¹⁴Ｃ−ヨードアセタミドの大量余剰分を用いたインキュベーションに先行して、遮断されたシステイニル93残基の推定上の分画を放出するための DTTによる還元段階(DTT：scF モル比７：１）が行なわれた。NIP12-C93scFv は¹⁴Ｃ−ヨードアセタミドを取り込んだが、一方、対照タンパク質(NIP12) 内にはほぼ全く放射能が取り込まれなかった。フルオレセイン（IA-F）又は７−ニトロベンズ−２−オキサ−（１，３ −ジアゾール（IA-NBD）のいずれかを支持するより粗大なアルキル化試薬でも、類似の結果が得られた。修正の室層を評価するため、12％のポリアクリルアミド未変性get(35mM HEPES，43mMのイミダゾール、pH7.501 上で、IA-Fで修正された NIP12-C93scFvを分析した。フルオレセインはpH7.50で頁の電荷を１つ支持していることから、未修正及び修正タンパク質は陽極に向かって異なる速度で移動する。反応は２時間以内で完了に達する。ファージ上に表示された時点で、cpIIIで融合された NIP12及び NIP12-C93は、遺伝子IIIタンパク質に対する抗血清を用いたWesterブロット法により検出される通り同等に発現される。類似のファージ力価が観察されることから、我々は、ファージ表面上の余分なシステインの存在がその形態形成及び感染性に影響を及ぼさないという結論を下した。同様にファージ−ELISA シグナルは、上述の可溶性 ELISA結果に一致していた。より高い濃度でのその不溶性のため、ファージ粒子は通常１mlあたり10¹²TU（ fdベクターについて）から10¹³TU（ファージミドについて）を上回らない。修正のために用いられた可溶性scFv濃度に比較して（±５μｍ），CPIII−融合されたscFvはかくして著しく濃度が低い（ファージミドはCPIII−融合されたscFvのわずか10％しかパッケージングしないことからfdファージ及びファージミドの両方について±２nM）。従って我々は同様に、修正試薬の濃度を30μＭにまで下げることを決定した。これはな大幅に余剰（約1.5 ・10⁴ 倍）であるが、反応基（ヨードアセタミド及びジスルフィド交換体）がチオール特異的なものであるために、これによって我々は反応を２時間に制限することができた。ファージ−抗体に対する半合成のこの特異性は以下の実験において立証された：すなわち、 NIP 12scFv又は NIP12-C93のいずれかを表示する１mlのfdファージファージストックをまず還元性条件 (30分間１mMのDTT)下でインキュベートし、次に微量の DTTをことごとく除去するため２回沈降させ、最終的に４℃で２時間30μＭのヨードアセチル−LC−ビオチンと反応させた。ウエスタンブロット分析は、修正用試薬が cpIII融合された NIP12-C93タンパク質内に極立ってより多く取込まれたことを示したものの、反応の程度は精確に見積ることができなかった。同様に、反応条件がファージ感染性を変えないことも示され、これは、半合成ファージ−抗体選択に関して非常に主要な観察である（データは示さず）。例２．化学合成抗体レパートリの生成及び２−フェニルオキサゾール−５−オンに結合する抗体の選択この例にて記述する研究では、固定された軽鎖及び主鎖レパートリを用いて化学合成ライブラリが調製され、２−フェニルオキサゾール−５−オンに対し特異的な抗体が次に選択された。ファージ上の化学的基の導入は部位特異的であることが立証されたことから、我々は、ファージ上に表示された結合活性がそのコード化されない化学的多様性に基づいて選択されうるか否かを試験した。この方法においては、各々の選択段階の前には、前回の選択の後に増幅されたファージ−抗体ライブラリ全体についての半合成が先行している。まず最初に、Hoogenboom & Winter（199；前出）により記述されているのと同じライブラリを、軽鎖Ｖλ３可変ドメイン内のセリン93からシステイン93への突然変異を除いて、構築した。簡単に言うと、我々は、NcoI−XhoI消化により、pH EN１−Ｖλ３内にクローニングされた合成VHライブラリを切除し、それをpHEN１ −Ｖλ３−Ｃ93の同じ部位内に再度クローニングした。連結された DNAでのE.co li TG1の電気穿孔法の後、83％以上のクローンがインサートを有している 2.6× 10⁷ のクローンのライブラリを得た。このセクションで使用した方法について以下で記述する。・シス含有合成ライブラリの構築 Hoogenboom及びWinter（1992；前出）の中で記述された２つの選択されていない合成ライブラリ（各々 1.0×10⁷ の組合せ）を混合し、CsC1−グレードのプラスミドDNA を調製した。NcoI−XhoI消化により、この DNAから合成重鎖ライブラリフラグメントを切除し、アガロースゲル上で精製し、予めNcoI及びXhoIで切断したpHEN１−Ｖλ３−Ｃ93発現ベクター内へと連結させた。次に連結した DNAを Gene Clean（Bio101）により精製し、E.coli TG1内に電気穿孔し。クローンの93 ％以上がインサートを有する 2.6・10⁷ のクローンのライブラリが得られた。・半合成ファージ−抗体の調製ａ．ファージ−抗体培養：50mlの2XTY-Amp-Glu １％の中で、VCSM13ヘルパーファージで30分間（細胞１つあたり20ファージ単位の比率で）37℃での重複感染により対数増殖中のライブラリから、ファージミド粒子を救出した。次に細胞を回転降下させ（４Krpmで15分間）、250mlの予め暖めた（37℃）2SXY-Amp-Kan培地内で再懸濁させた。振とうしながら37℃で１時間インキュベートした後、培養を振とうしながら30℃で16〜18時間成長させた。fdベクター内にクローニングされたscFvについては、 250mlの2XTY-Tetに 100μｌの一晩培養を接種し、これを30 ℃で約20時間成長させた。ｂ．ファージ−抗体精製：細胞の除去後（25分間７Krpm）、ファージ粒子を最初の PEG／NaCl沈降により濃縮させ（７Krpmで25分間）、５mlの新鮮で脱気された１mMの DTT溶液中で再懸濁させた。この段階は、SH含有分子によって遮断された全てのシステイン93がこのとき温度のために確実に放出されるようにしており、ファージは PEG／NaClで沈降され（４Krpmで15分間）、ファージペレットは、同じ緩衝液５ml内での再懸濁の前に１mlの脱気された反応緩衝液（10mMのリン酸塩、10mMのEDTA，pH7.80）で２度入念に洗浄された。残っている微量のDTTを除去するために三回目の PEG／NaCl沈降とそれに続く反応緩衝液での２回の洗浄を導入した。その後、脱気された反応緩衝席１〜２mlの中で、最終的ペレット（約1. 0〜3.0 10¹³TU）を再懸濁させた。ｃ．ファージ−抗体上の半合成：合成成分の 1.6mM溶液を、ヨードアセチル−LC −ビオチン（Pierce）、ヨードアセタミド−NBD(IA- NBD)及びヨードアセタミドフルオレセイン（IA-F）プローブ（分子プローブ）についてはジメチルホルムアミド中又は、２−ピリジル−ジチオ−エチレンアミン（PDEA）作用物質(Pharmacia Biosensor) については反応緩衝液の中で、新鮮に調製した。その後20μｌの合成半分を、１mlの濃度ファージ−抗体ストックと混合させ、反応混合物を２時間４℃で暗所に保った。その後、新鮮な 0.1Ｍの DTT 溶液を２μｌ付加することにより、室温で一時間反応を消光させた。選択又は E LISA試験の前に、ファージ粒子の PEG／NAC1沈降によって、余剰の消光済み反応物は除去されなかった。・半合成ファージ−抗体の選択選択のためには、免疫管(Nunc Maxisorp) をコーティングするために PBS中の 100μｇ／mlのphOx-BSA溶液が使用され全てのファージ−抗体インキュベーションが室温で暗所にて行なわれたという点を除いて、Marks et al(J．Mol．Biol． 222 581−597，1991)に記述されたプロトコルに従った。phOx−結合剤を惹起させるために４回の選択−救出を行なった。・半合成 scFvsの調製ａ．scFvの培養：Marks et al(1991；前出) に記述されているプロトコルに従った。ｂ．scFvの精製：精製すべき３つのscFvにはヒトVH３ドメイン(NIP12，NIP12-C9 3 及びOX₅₃₂)が含まれていることから、Hoogenboom & Winter(1992；前出) により記述されているプロトコルに従った。Superdex 75 カラム（(Pharmacia) 上でゲルろ過によりモノマーscFv分画を精子し、修正するまでPBS 0.02％NaN₃中で４ ℃にてこれを保存した。ｃ．scFvについての半合成：遮断されたシステイン93を還元することにより修正プロトルが開始した：scFv（脱気反応緩衝液 600ml中 100μｇ）を、脱気した反応緩衝液(DTT：scFvモル比７：１) 中の新鮮な 2.5mM の DTT溶液10.4μｌを用いてインキュベートさせた。反応混合物は、室温に保った。その間、修正用試薬の 3.5mM溶液を、¹⁴Ｃ−ヨードアセタミド14.3μＭ／ml ， 0.25mCi／ml，Amersham）については脱気した反応緩衝中で、又IA-NBD及びIA -F螢光リポータについては DMF中で、新たに調製した。1.5時間の還元の後、75 μｌのこれらの修正溶液（試薬：scFvのモル比70：１）を反応混合物に付加し、その後この混合物を暗所で２時間４℃でインキュベートした。その後、反応を 5 .2μｌの新鮮な0.25Ｍの DTT溶液(DTT：試薬モル比５：１） 5.2μｌで消光させた。反応の完了後（室温で±１時間）、溶出剤として９：１の CHCl₃：CH₃OH を用いた TLCを行なった。使用するまで、合成scFv溶液を暗所で４℃に保った。螢光分析のためには、消光された試薬の大部分を除去することが必要であった。従って反応混合物を、 PBSで平衡化されたＧ−25 Sephadex fine（９mlの層堆積）上でのゲルろ過により精製した。半合成scFvを２mlで収集し、螢光滴定のためにその状態のままで使用した。・半合成ファージ−抗体及びscFv ELISA Clackson et al (1991)により記述れている通り、 ELISA分析の前に、半合成ファージ−抗体ストックをまず 100倍に希釈した。Marks et al(1991：前出) に従って半合成scFv ELISAを行なった。修正されていないクローンについて、分析前に、余剰の DTT消光した反応物を、精製されたファージ粒子又はscFvと混合した。 ELISAプレートを、室温で一晩 PBS中の 100μｇ／mlのphOx-BSA溶液でコーティングした。特異性ELISA(BSA、オバルブミン、phOx-KLH，phOx-CSA，phOx−ポリリシン、キモトリプシンＡ、インシュリン及びニワトリ卵白リボチーム(HEL))については、３mg／mlでコーティングされた HELを除いて、同じ抗原濃度を用いた。ウエスタンブロット分析約10¹⁰TUのscFvfdファージ粒子又は１〜５μｇの精製されたscFvを用いてSDS- 10％ポリアクリルアミドミニゲルを走行させた。電気ブロッティングにより、タンパク質を Immobilon-P膜 (Millipore)へと移送した。次にブロットを30分間PB S ３％ BSAで遮断した。cpIII及びcpIIIで融合されたscFvの分析のためには、cp IIIタンパク質に対して生成されたウサギ抗血清とそれに続く、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(Sigma) に接合されたマウス抗ウサギ抗体を用いてブロットをインキュベートした。最後に、検出のための比色分析用基質として DABを用いた。化学合成によるビオチニル化されたcpIII融合されたscFvの検出のためには、ストレプタビジン−アルカリ性ホスファターゼを使用した。得られた結果を以下に記す。固定した軽鎖のCDR3にシステインを取込んでいる上述の化学合成ライブラリと共に、並行して、phOxに対する３つの異なる選択が行なわれた（１つは頁の対照ライブラリであり２つは半合成ライブラリ）。 DTTでの還元の後、第１のライブラリ（Lib1；頁の対照）をさらに修正し、一方第２のライブラリ（Lib2）は、アルキル化するIA-NBDリン光体と反応させ、第３のライブラリ（Lib3）は、ジスルフィド交換体２−ピリジル−ジチオエチレンアミン試薬（PDEA）と反応させた。リン光体での修正後、 Lib2のみが DTTで消光された。４回にわたり修正選択− 増幅を行なった。１回目と４回目の間で、ファージ粒子結合されたphOxコーティング済み免疫管の数は、Lib1については133，Lib２については 297そしてLib3については17の率で増大した。可溶性 Cys 93 scFv及びファージ表示された Cys 93 scFvのいずれも、粗培養上清の中で効率良く修正され得ない。従って、抗原結合が導入された化学半分に依存していた抗体の探究を加速するため、減少していくサイズ（最初は全ライブラリ、次に28から 210のクローンから成るミニライブラリ）のライブラリに由来する精製されたファージ粒子（10mlの培養）を用いて、ポリクローナルファージ−ELISA を行なった。結合活性に対する導入された半分の重要性を規定するため、もう１つの合成成分（通常はF-IA）で修正されていないか又は修正されていたポリクローナルファージ粒子を用いて、負の対照 ELISAを行なった。同様にして、見込みあるミニライブラリ（データ示さず）から選択された個々のクローンをさらにファージ−ELISA(図１〜３) により分析した（図１〜図３）。 Lib1のうち、16のクローン（図１）をphOxに対するその結合活性について分析した。そのうちの多く（14／16）が正の ELISAシグナルを与えた。予想した通り、大部分の未修正クローンは、それがIA-NBD又はLA-Fで修正された場合に比べ、修正無しでphOxにより良好に結合した。２つの ELISAパターンが現われた。すなわち、クローンが或る一定の程度まで化学的修正を許容する第１のグループ（８／14）と、（特にIA-NBD修正に関して）修正されないことに対すより強い優先性を示すクローンの第２のグループ（６／１４）である）。例えば、IA-NBD修正されたクローン９及び14の ELISAシグナルは、クローンが修正されなかった場合よりも約 2.3倍強度が低いものであった。図２に示されているように、Lib2からの12のクローンを分析した。ここでも又それらの大部分（16／20）がphOxに結合し、有利な結合特長をもつ２つのグループが検出された。まず第１に、１つのクローングループ（９／16）は、IA-NBDにより修正されることに対する優先性を示さなかった。これらは、修正されなかった又はIA-Fで修正されたファージ粒子と同等にうまくphOxに結合することができた。第２のグループにおいては（７／16）、全てのIA-NBD修正さたクローンは、phOxを結合させることに対するはるかに強い優先性を明らかにした。この傾向は、 2.3倍（クローン32）から 6.8倍（クローン36）という率まで上昇した。後者については、無修正又はIA-F修正は、背景レベルに至る ELISAシグナルの低下をひき起こした。従って、IA-NBDは、抗原結合部位の一部である。 12のLib3クローンのファージ−ELISA シグナルは図３に示されている。ここでも又クローンを２つのグループに分けることができた。クローン (10，12)(第１グループ) の大部分は、修正されること又はされないことに対する著しい優先性を全く示さなかった。第２のグループは、PDEAが結合特性に影響を与えたわずか２つのクローンしか含んでいなかった。すなわち、PDEA修正がその ELISAシグナルを最大 3.4倍の率で増強したのだった。IA− NBD−依存型クローン（43％）に比べて少ないクローン（16％）がPDEA依存型 ELISAシグナルを与えたという事実は、反応基（IA-NBDについてはアルキル化、PDEAについてはジスルフィド交換）のせいというよりもscFv（IA-NBDについては大きく、PDEAについては小さい）の中へと挿入された合成成分のサイズのせいであるとすることができる。 Lib1及びLib2クローンの ELISAシグナルは明らかに、いくつかのクローンについて、共有結合された合成成分が抗原結合部位の一部であるということを示していた。いくつかの抗体クローンにおいては、導入された化学的基の存在は、ハプテンの強い結合にとって必要不可欠ではないが、その他の抗体クローンにおいては強い結合が起こるために不可欠である。化学合成レパートリからのこのようなクローンは、例えばリポーター基が取り込まれる場合に特に貴重なものとなる。修正されないことに対する著しい ELISA優先性を示すいかなるクローンも、２つの半合成ライブラリ（Lib2及びLib3）内に発見されなかった。半合成ライブラリ選択はかくして、異なる結合特性及び修正に対する異なる許容度をもつファージ抗体を産生した（表１）。異なる ELISAプロフィールの個々のクローンを DNA配列決定のために選択し、VH−CDR3配列及びVH生殖細胞系遺伝子を決定した（表１）。修正の存在又はタイプには無関係なクローンのVH−CDR3 配列は、Hoogenboom & Winter(1992、前出) による合成レパートリから得られたものと強い類似性を示している。例えば、修正されていないライブラリからのクローンSSL-14とPDEAで修正されたライブラリ（LSGVRDFY）からのクローンSSL-41 のVHCDR3配列は、当初の研究からのαOX−18と同じである。同様に、 NBDで修正されたライブラリからのクローンSSL-18及びPDEAで修正さたライブラリ（SMGAKF DY）からのSSL-44は、αOX-1（SMGSKFDY）とほぼ同一である。これとは対照的に、修正に対する最大の優先性をもつクローン、 NBDで修正されたライブラリからのクローンSSL-34(GLLST) 及びPDEAで選択されたライブラリからのSSL-42(TRFAT DY) は、試料サイズが小さすぎていかなる確定的結論も下し得ないものの、当初の研究からのクローンといかなる類似性も共有していない。半合成クローンのさらなる分析は、修正に対する著しい優先性を示していたことからIA-NBDで選択されたライブラリからのクローンSSL-32及びSSL-34について行なわれた。クローンは、VH３を起源とし、タンパク質上で精製された。セファロースは可溶性scFvフラグメントを含む培養上清からのものである。精製された材料はIA＝NBD で修正され、カップリングされていない消光されたIA-NBDを除去することなく ELISAにより分析されるか、又はタンパク質は、カップリングされていないあらゆる汚染物質を含まないモノマーscFvフラグメントを得るべく Superdex 75を用いたFPLCゲルろ過によりサイズ分画化された。修正プロセスは、修正されていない及び修正されたタンパク質のFPLCトレースによって判断できるように（データ示さず）、抗体のマルティマー（多量体）化におけるいかなる変化も誘発しないと思われた。修正された及び修正されていないscFv材料の結合特異性は、phOx-BSA、いくつかの無関連抗原及びいくつかのその他のphOx−タンパク質接合体でコーティングされたマイクロタイタープレート上の ELISAによって決定された。可溶性SSL-32 scFvは、ファージ抗体と類似の程度まで、未修正scFvとしてphOx-BSAに結合することがわかっており、それ以上は特徴づけされなかった（図４）、phOx-BSAに対するSSL-34クローンの結合は、IA-NBDでの修正についての絶対的な必要条件を有していた（図４）。かくして、両方のケースにおいて、未修正及び NBD修正されたフラグメントについての結合特性は、ファージ抗体について示されたものを反映していた。 NBDで修正された場合の両方のクローンについての増大した ELISA シグナルは、FPLCゲルろ過分析によって明らかにされる通り、マルティマー化の増大の結果ではなかった。 NBD 修正についてのSSL-34クローンの絶対的必要条件をさらに詳細に分析した。いかなる無関連抗原上でも、又さらに有意なことにその他のいかなるphOx−タンパク質接合体上でも、IA-NBDで修正されたクローンについて検出可能な結合は全く発見されなかった（図５）。phOx−ポリ−Ｌ−リシン、phOx−KLH（キーホールリンペットヘモシアニン）及びphOx−CSA（ニワトリ血清アルブミン）に比べてphOx-BSAの結合についての弁別は、 NBDで修正されたSSL-34が BSAに唯一の単一のphOx誘導体化部位を認識していることを、強く表わている。従って、抗原結合部位の一部としてコード化された合成成分を含む抗体の半合成ライブラリの作製についてのこれらの結果は、新しい抗原結合必要条件をもつ抗体を分離できることそして、抗体結合部位の多様性が天然の抗体の場合に可能なものを超えて増大され得ること、を表わしている。ここで選択されている半合成クローンの多様性は、むしろ使いものであり、より長いVH−CDR3配列の内含、異なる軽鎖の使用及び異なる補因子又は化学的基の集団での光学的修正により、ライブラリ内の改善を行なうことが可能である。さらに、修正可能な（例えばシステイン）残基の場所及び数は、化学合成ライブラリの特性に対して有意な効果をもつ確率が高く、制御された形で変動させることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ボナート，ティモシーピーターアメリカ合衆国，ワシントン 98102，シアトル，サミットアベニュ 416 イー＃201 (72)発明者ジーモン，トーマスマルティンドイツ連邦共和国，デー―79189 バットクロツィンゲン―ハウゼン，シェーンツレベーク 22

Claims

【特許請求の範囲】１．各々の結合部位には、結合部位内で１つのアミノ酸残基において共有結合した化学的成分が含まれていることを特徴とする、各々第２の sbpメンバーのための結合部位を有する第１の特異的結合部位(sbp) メンバーのさまざまなレパートリ。２．各々の第１の sbpメンバーが１つの生体の表面成分に融合されている、請求の範囲第１項に記載のレパートリ。３．生体がバクテリオファージである、請求の範囲第２項に記載のレパートリ。４．第１の sbpメンバーは、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH）の結合領域を含む第１のポリペプチドドメイン、及び免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ VL）の結合領域を含む第２のポリペプチドドメインを有しており、この第１及び第２のポリペプチドドメインが結合部位を形成している、請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項に記載のレパートリ。５．第１の特異的結合対(sbp) メンバーのさまざまなレパートリを提供する方法において、各々の第１の sbpメンバーの結合部位の中に１つのアミノ酸残基に共有結合した化学的成分を導入するべくレパートリ内の第１の sbpメンバーを化学的に修正する段階を特徴とする方法。６．化学的修正段階の前の第１の sbpメンバーのレパートリの提供には、そのレパートリを集合的にコードする核酸分子の集団からの発現が含まれている、請求の範囲第５項に記載の方法。７．核酸分子の集団の提供には、アミノ酸残基をコードするコドンを導入するべく第１の sbpメンバー又はそのポリペプチド成分部分をコードする核酸を突然変異させる段階が含まれている、請求の範囲第６項に記載の方法。８．アミノ酸残基が各々の第１の sbpメンバー内で選択的に修正される、請求の範囲第５項〜第７項のいずれか１項に記載の方法。９．核酸分子の集団が、遺伝子フラグメントを結合させることによって提供されている、請求の範囲第６項〜第８項のいずれか１項に記載の方法。 10．化学的修正がインビトロで行なわれる、請求の範囲第５項〜第９項のいずれか１項に記載の方法。 11．前記化学的修正の後に、問題の第２の sbpメンバーを結合することのできる結合部位を伴う第１の sbpメンバーの選択段階を含んで成る、請求の範囲第５項〜第10項のいずれか１項に記載の方法。 12．選択が、問題の第２の sbpメンバーを結合することによるものである、請求の範囲第11項に記載の方法。 13．問題の第２の sbpメンバーに対する選択された第１の sbpメンバーの結合が、前記化学的成分無しでのこの第１の sbpメンバーの結合と比較して増強されている、請求の範囲第11項又は第12項に記載の方法。 14．問題の第２の sbpメンバーに対する選択された第１の sbpメンバーの結合が、前記アミノ酸における共有結合された化学的成分の存在に依存している、請求の範囲第11項又は第12項に記載の方法。 15．前記第１の sbpメンバーは１つの生体の表面成分に融合された状態で発現され、かくしてその集団内の各生体がその表面で第１の sbpメンバーを表示するようになっており、その集団中の各々の生体が、表面で表示された第１の sbpメンバーをコードする核酸分子を含んでいる、請求の範囲第11項〜第14項のいずれか１項に記載の方法。 16．生体がバクテリオファージである、請求の範囲第15項に記載の方法。 17．問題の第２の sbpメンバーを結合することのできる結合部位を伴う第１の sbpメンバーの選択の後には、表面上でこの選択された第１の sbpメンバーを表示する生体からのヌクレオチド配列の回収が続いている、請求の範囲第16項に記載の方法。 18．ヌクレオチド配列は、問題の第２の sbpメンバーを結合することのできる結合部位を伴う第１の sbpメンバーの産生において使用される、請求の範囲第17 項に記載の方法。 19．第１の sbpメンバーは、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH）の結合領域を含む第１のポリペプチドドメイン及び免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VL ）の結合領域を含む第２のポリペプチドドメインを有しており、第１及び第２のポリペプチドドメインが結合部位を形成している、請求の範囲第５項〜第18項のいずれか１項に記載の方法。 20．相補的な第２の sbpメンバーのための結合部位をもつ第１の特異的結合対 (sbp) メンバーの遺伝的に多様なレパートリを提供する方法において、 −第１の sbpメンバーの遺伝的に多様なレパートリを集合的にコードする核酸分子の一集団を提供する段階であって、コードされた第１の sbpメンバーの結合部位が、結合部位内へ共有結合された化学的成分を導入するべく選択的に修正可能である１つのアミノ酸残基を各々有している段階、 −第１の sbpメンバーのレパートリを提供するための核酸からの発現段階、を含んで成る方法。 21．核酸分子の集団の提供には、アミノ酸残基をコードするコドンを導入するべく、第１の sbpメンバー又はそのポリペプチド成分部分をコードする核酸を突然変異させる段階が含まれている、請求の範囲第20項に記載の方法。 22．核酸分子の集団が、遺伝子フラグメントを結合させることによって提供される、請求の範囲第20項に記載の方法。 23．結合部位内へ共有結合された化学的成分を導入するべく前記アミノ酸残基にてそのレパートリ内で第１の sbpメンバーを化学的に修正する段階を含む、請求の範囲第20項〜第22項のいずれか１項に記載の方法。 24．前記化学的修正の後に、問題の第２の sbpメンバーを結合することのできる結合部位を伴う第１の sbpメンバーを選択する段階を含んで成る、請求の範囲第23項に記載の方法。 25．選択が、問題の第２の sbpメンバーとの結合によるものである、請求の範囲第24項に記載の方法。 26．問題の第２の sbpメンバーに対する選択された第１の sbpメンバーの結合は、前記化学的成分無しでこの第１の sbpメンバーの結合と比較して増強されている、請求の範囲第24項又は第25項に記載の方法。 27．問題の第２の sbpメンバーに対する選択された第１の sbpメンバーの結合が、アミノ酸における共有結合した化学的成分の存在に依存している、請求の範囲第24項又は第25項に記載の方法。 28．第１の sbpメンバーが１つの生体の表面成分に融合された状態で発現され、かくしてその集団内の各生体が第１の sbpメンバーをその表面において表示するようになっており、この集団内の各々の生体は、その表面にて表示された第１の sbpメンバーをコードする核酸分子を含んでいる、請求の範囲第24項〜第27項のいずれか１項に記載の方法。 29．生体がバクテリオファージである、請求の範囲第28項に記載の方法。 30．問題の第２の sbpメンバーを結合することのできる結合部位を伴う第１の sbpメンバーの選択の後には、選択された第１の sbpメンバーをその表面上で表示する生体からのヌクレオチド配列の回収が続いている、請求の範囲第29項に記載の方法。 31．ヌクレオチド配列は、問題の第２の sbpメンバーを結合することのできる結合部位を伴う第１の sbpメンバーの産生において使用される、請求の範囲第30 項に記載の方法。 32．第１の sbpメンバーは、免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（VH）の結合領域を含む第１のポリペプチドドメイン及び免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（VL ）の結合領域を含む第２のポリペプチドドメインを有しており、第１及び第２のポリペプチドドメインが結合部位を形成している、請求の範囲第20項〜第31項のいずれか１項に記載の方法。