JPH09505732A

JPH09505732A - 新規セファロスポリンｃアシラーゼ

Info

Publication number: JPH09505732A
Application number: JP7513119A
Authority: JP
Inventors: 峰雄丹羽; 善正斎藤; 高穂藤村; 芳則石井; 祐嗣野口
Original assignee: 藤沢薬品工業株式会社
Priority date: 1993-11-01
Filing date: 1994-10-26
Publication date: 1997-06-10
Also published as: HU9601151D0; ES2170107T3; CN1150823A; US5804429A; EP0726958A1; CA2175338A1; WO1995012680A1; HUT76084A; EP0726958B1; DE69430067D1; DE69430067T2; KR960705932A; TW400384B; ATE214098T1

Abstract

(57)【要約】天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列のAla⁴⁹，Met¹⁶⁴，Ser¹⁶⁶，Met¹⁷⁴，Glu³⁵⁸，Met⁴⁶⁵，Met⁵⁰⁶又はMet⁷⁵⁰位において、少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸で置換された変異型ＣＣアシラーゼ、それをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された微生物、該形質転換体を培養することによる該ＣＣアシラーゼの製造方法、化合物製造のためのその利用。本発明の変異型ＣＣアシラーゼは酵素の能力、ｐＨプロファイルの変化、プロセッシング効率等の面で望ましい特性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】新規セファロスポリンＣアシラーゼ本発明は、新規セファロスポリンＣアシラーゼ（以下、「ＣＣアシラーゼ」と称する）に関する。より詳細には、本発明は、タンパク質工学により産生された新規変異型ＣＣアシラーゼ、それをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する発現ベクター、該発現ベクターで形質転換された微生物、及び該形質転換体を培養することによる該ＣＣアシラーゼの製造方法に関する。セファロスポリンＣアシラーゼとは、共通して、セファロスポリンＣを７−セファロスポラン酸（７−ＡＣＡ）に加水分解することができる酵素に対する一般的な用語である。これまで、ＣＣアシラーゼに分類される３つの酵素、即ち、セファロスポリンＣアシラーゼSE83，N176及びV22が見出されており、それらのアミノ酸配列は、J ournal of Fermentation and Bioengineering Vol．72，232-243(1991)に開示されている。この文献では、ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の番号付けはそのＮ末端部分のメチオニン基から始められている。しかしながら、本明細書においてはＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の番号付けを、そのＮ末端部分のメチオニン基の隣のスレオニン基から開始することにする。なぜなら、原核生物におけるＣＣアシラーゼ遺伝子の発現により得られる成熟ＣＣアシラーゼのα−サブユニットのＮ末端メチオニンは酵素（例えば、アミノペプチダーゼ）によって取り除かれ、Ｎ末端にスレオニン基を有する成熟ＣＣアシラーゼが得られるからである。組換えＤＮＡ技術による天然型ＣＣアシラーゼの生産もまた該文献に開示されており、発現したＣＣアシラーゼは細胞内でプロセッシングされてα−サブユニット及びβ−サブユニットからなる活性型を生じることが見出されている。しかしながら、大腸菌においては一般にプロセッシングの効率は低い。さらなる研究の結果、本発明者らは、高い酵素能力、ｐＨプロファイルの変化、高いプロセッシング効率等により特徴づけられるより望ましい特性を有する変異型ＣＣアシラーゼを製造することに成功した。本発明の新規変異型ＣＣアシラーゼは以下により特徴づけられる。天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列のAla⁴⁹，Met¹⁶⁴，Ser¹⁶⁶，Met¹⁷⁴，Glu³⁵⁸ ，Met⁴⁶⁵，Met⁵⁰⁶又はMet⁷⁵⁰位の少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸で置き換えられた変異型ＣＣアシラーゼ。 Met¹⁶⁴にかわる異なるアミノ酸としては、好ましくはグリシン、アラニン、ロイシン等のような中性アミノ酸が挙げられる。 Ser¹⁶⁶，Met¹⁷⁴，Met⁴⁶⁵，Met⁵⁰⁶及び／又はMet⁷⁵⁰にかわる異なるアミノ酸としては、好ましくはアラニン等のような中性アミノ酸が挙げられる。 G1u³⁵⁸にかわる異なるアミノ酸としては、好ましくは中性アミノ酸（例えば、イソロイシンなど）、塩基性アミノ酸（例えば、リジンなど）等が挙げられる。 Ala⁴⁹にかわる異なるアミノ酸としては、最も好ましくはロイシンである。また、本発明の変異型ＣＣアシラーゼは、さらに天然型のＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の別の位置の少なくとも１つアミノ酸を異なるアミノ酸に置換することにより、例えば、上記変異型ＣＣアシラーゼのMet²⁶⁹及び／又はCys³⁰⁵を異なるアミノ酸に置換することにより調製される変異型ＣＣアシラーゼであってもよい。該ＣＣアシラーゼは、好ましくはそのα−サブユニットとβ−サブユニットにプロセッシングされる前の前駆体として下式で表される。 A1-48-X1-A50-163-X2-Gly-X3-A167-173-X4-A175-357-X5-A359-464-X6-A466-505- X7-A507-749-X8-A751-773 式中、A1-48は天然型ＣＣアシラーゼのThr¹からGlu⁴⁸までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、 A50-163は天然型ＣＣアシラーゼのAsp⁵⁰からLeu¹⁶³までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、 A167-173は天然型ＣＣアシラーゼのVal¹⁶⁷からArg¹⁷³までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、 A175-357は天然型ＣＣアシラーゼのLeu¹⁷⁵からVal³⁵⁷までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、 A359-464は天然型ＣＣアシラーゼのThr³⁵⁹からAla⁴⁶⁴までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、 A466-505は天然型ＣＣアシラーゼのPro⁴⁶⁶からIle⁵⁰⁵までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、 A507-749は天然型ＣＣアシラーゼのLys⁵⁰⁷からAla⁷⁴⁹までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、 A751-773は天然型ＣＣアシラーゼのVal⁷⁵¹からAla⁷⁷³までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、 X1はAla又は他のアミノ酸、 X2,X4,X6,X7及びX8はそれぞれMet又は他のアミノ酸、 X3はSer又は他のアミノ酸、 X5はGlu又は他のアミノ酸であり、但し、上記式中Met²⁶⁹及び／又はCys³⁰⁵Sは他のアミノ酸で置換されていてもよく、X1がAlaの場合、X2,X4,X6,X7及びX8はそれぞれMet、X3はSerであり、X5は Glu以外のアミノ酸である。本明細書では、特定の変異型ＣＣアシラーゼの命名についてある命名法を便宜的に採用する。この命名法に従うと、例えば、天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の１６４位のメチオニン残基をロイシンで置換することによって調製される変異型ＣＣアシラーゼは変異型ＣＣアシラーゼM164Lと命名される。Ｍは置換されるメチオニン（アミノ酸）残基の１文字略号であり、１６４は天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の位置番号であり、Ｌはメチオニン（元のアミノ酸）残基を置換するのに使われるロイシン（異なるアミノ酸）の１文字略号である。一方、例えば変異型ＣＣアシラーゼM164L及びM164Aは、天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の１６４位のメチオニン残基をそれぞれロイシン及びアラニンで置換することにより調製される。変異型ＣＣアシラーゼM164L/M174A/M269Yは、天然型ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列の１６４位のメチオニン残基をロイシンで、同じく１７４位のメチオニン残基をアラニンで、同じく２６９位のメチオニン残基をチロシンで置換することによって調製される。本発明のＣＣアシラーゼは、組換えＤＮＡ技術、ポリペプチド合成等により調製することができる。即ち、該新規ＣＣアシラーゼは該新規ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培地中で培養し、その培養ブロスから該新規ＣＣアシラーゼを回収することにより調製することができる。以下に、この製法をより詳細に説明する。宿主としては、微生物〔細菌（例えば、大腸菌、枯草菌など）、酵母（例えば、麦酒酵母など）、動物細胞株および植物培養細胞〕が例示される。微生物として、好ましくは細菌、特にEscherichia属に属する菌株（例えば、E．coli JM109 ATCC53323，E．coli HB101 ATCC 33694，E．coli HB101-16 FERM BP-1872，E． coli294 ATCC 31446など）、酵母、特にSaccharomyces属に属する菌株（例えば、Saccharomyces cerevisiae AH22）、動物細胞株〔例えば、マウスL929細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞など〕等が挙げられる。細菌、特に大腸菌を宿主細胞として用いる場合、発現ベクターはふつう少なくともプロモーターオペレーター領域、開始コドン、新規ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、終始コドン、ターミネーター領域及び複製可能単位から構成される。酵母又は動物細胞を宿主細胞として用いる場合、発現ベクターは、少なくともプロモーター、開始コドン、シグナルペプチド及び新規ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、及び終始コドンを含むことが好ましい。また、エンハンサー配列、新規ＣＣアシラーゼの5'-及び3'-非翻訳領域、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位及び複製可能単位を発現ベクターに挿入することもできる。プロモーター−オペレーター領域は、プロモーター、オペレーター及びシャイン−ダルガルノ（ＳＤ）配列（例えば、AAGGなど）を含む。好ましくは、プロモーター−オペレーター領域は慣用のプロモーター−オペレーター領域（例えば、大腸菌のＰＬ−プロモーターやｔｒｐ−プロモーター）及びＣＣアシラーゼN-17 6染色体遺伝子のプロモーターが挙げられる。酵母で新規ＣＣアシラーゼを発現させるためのプロモーターとしては、Ｓ．セレビシエ用のＴｒｐ１遺伝子、ＡＤＨＩもしくはＡＤＨＩＩ遺伝子及び酸性ホスファターゼ（ＰＨＯ５）遺伝子のプロモーターが挙げられ、哺乳動物細胞で新規ＣＣアシラーゼを発現させるためのプロモーターとしては、ＳＶ４０初期もしくは後期プロモーター、ＨＴＬＶ−ＬＴＲプロモーター、マウスメタロチオネインＩ（ＭＭＴ）プロモーター、ワクシニアプロモーター等が挙げられる。好適な開始コドンとしては、メチオニンコドン（ATG）が挙げられる。シグナルペブチドとしては、慣用の他の酵素のシグナルペプチド（天然型ｔ− ＰＡのシグナルペプチド、天然型プラスミノーゲンのシグナルペプチド）等が例示される。新規ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、慣用の方法を用いて調製することができる。例えば、ＤＮＡ合成機を用いた一部又は全部のＤＮＡ合成、及び／又は形質転換体〔例えば、E．coli JM109（pCCN176-2）FERM BP-30 47〕から得られる適切なベクター（例えば、pCCN176-2）に挿入された天然型ＣＣアシラーゼをコードする完全なＤＮＡ配列を適切な方法、例えば適切な酵素（例えば、制限酵素、アルカリホスファターゼ、ポリヌクレオチドキナーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼなど）での処理に加えて、常套の変異方法（例えば、カセット変異法〔徳永，Ｔら、Eur．J．Biochem．Vol.153，p445-449（19 85）参照〕、ＰＣＲ変異法〔樋口，Ｒら、Nucleic Acids Res．Vol.16，p7351-7 367(1988)参照〕、クンケル法〔Kunkel，T．Aら．，Methods Enzymol．Vol．154 ，p367（1987）など参照〕）のような適切な方法で処理することによって調製することができる。終止コドンとしては、常用の終止コドン（例えば、TAG，TGAなど）が含まれる。ターミネーター領域としては、天然または合成のターミネーター（例えば、合成ｆｄファージターミネーターなど）が含まれる。複製可能単位とは、宿主細胞中においてその全ＤＮＡ配列を複製することができる能力をもつＤＮＡ化合物をいい、天然のプラスミド、人工的に修飾されたプラスミド（例えば、天然のプラスミドから調製されたＤＮＡフラグメント）及び合成プラスミドが含まれる。好適なプラスミドとしては、E．coliではプラスミドpBR322やその人工的修飾物（pBR322を適当な制限酵素で処理して得られるＤＮＡフラグメント）が、酵母では酵母２μプラスミドや酵母染色体ＤＮＡが、また哺乳動物細胞ではプラスミドpRSVneo ATCC 37198，プラスミドpSV2dhfr ATCC 37 145，プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC 37224，プラスミドpSV2neo ATCC 37149などが挙げられる。エンハンサー配列としては、ＳＶ４０のエンハンサー配列（７２ｂｐ）が含まれる。ポリアデニレーション部位としては、ＳＶ４０のポリアデニレーション部位が含まれる。スプライシング接合部位としては、ＳＶ４０のスプライシング接合部位が含まれる。プロモーター、開始コドン、新規ＣＣアシラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミネーター領域は、連続的かつ環状に適当な複製可能単位（プラスミド）に連結させることができ、所望により、常法（例えば、制限酵素での消化、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いるライゲーション）で適当なＤＮＡフラグメント（例えば、リンカー、他の制限部位など）を用いることにより、発現ベクターが得られる。宿主細胞は、当該発現ベクターを用いて形質転換（形質移入）される。形質転換（形質移入）は従来の方法（例えば、E．coliはKushner法、哺乳動物細胞はリン酸カルシウム法、マイクロインジェクションなど）を用いて行うことができ、形質転換体（形質移入体）が得られる。本発明の工程で新規ＣＣアシラーゼを製造するために、かくして得られた上記発現ベクターを含む形質転換体は、栄養培養水溶液中で培養される。栄養培地は、炭素源（例えば、グルコース、グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクトースなど）及び無機もしくは有機窒素源（例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼインの加水分解物、酵母抽出物、ポリペプトン、バクトトリプトン、牛肉エキスなど）を含んでいてもよい。所望により、他の栄養源〔例えば、無機塩（例えば、二リン酸ナトリウムまたは二リン酸カリウム、リン酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、ビタミンＢ１）、抗生物質（例えば、アンピシリン、カナマイシン）など〕を培地中に添加してもよい。哺乳動物細胞を培養するために、胎児ウシ血清および抗生物質を補充したダルベッコ改変イーグル最少必須培地（ＤＭＥＭ）がしばしば用いられる。形質転換体（形質移入体を含む）の培養は、通常ｐＨ５．５〜８．５（好適にはｐＨ７〜７．５）、１８〜４０℃（好適には２０〜３０℃）で５〜５０時間実施される。かくして製造された新規ＣＣアシラーゼが培養液中に存在する場合は、その培養物を濾過または遠心することにより、培養濾液（上清）を得る。新規ＣＣアシラーゼは、該培養濾液から、天然または合成蛋白質を精製並びに単離するために一般に用いられる常法（例えば、透析、ゲル濾過、抗ＣＣアシラーゼモノクローナル抗体を用いたアフィニティーカラムクロマトグラフィー、適当な吸着材上でのカラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーなど）を用いて精製することができる。製造された新規ＣＣアシラーゼが、培養された形質転換体のペリプラズムおよび細胞質内に存在する場合は、細胞を濾過および遠心により集め、当該細胞の細胞壁及び／又は細胞膜を、例えば超音波及び／又はリゾチームで処理して、細胞破片及び／又は溶解物を得る。該細胞破片及び／又は溶解物を適当な水溶液（例えば、８Ｍ尿素水溶液、６Ｍグアニジウム塩水溶液）に溶解することができる。新規ＣＣアシラーゼは、該水溶液から先に例示したような慣用の方法により精製することができる。本発明は更に、式：（式中、Ｒ１はアセトキシ、ヒドロキシ又は水素であり、Ｒ２はカルボン酸アシルである。）で示される化合物またはその塩を、本発明の新規ＣＣアシラーゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換された微生物の培養物又はその処理物と接触させて、式：（式中、Ｒ１は前記と同意義である。）で示される化合物またはその塩の製造方法を提供するものである。Ｒ２で示されるカルボン酸アシルとしては、脂肪族、芳香族または複素環カルボン酸アシルが挙げられ、その適切な例としては、アミノ基、ヒドロキシ基、カルボキシ基、Ｃ１〜Ｃ６のアルカノイルアミノ基、ベンズアミド基およびチエニル基等からなる群から選択される１つもしくは２つの適当な置換基を有していてもよいＣ１〜Ｃ６のアルカノイルが挙げられる。化合物（Ｉ）および化合物（II）の適当な塩としては、アルカリ金属塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩）が挙げられる。ＣＣアシラーゼ活性が通常形質転換細胞内に存在するなら、培養物の処理物としては、以下のものが例示される。（１）生細胞：濾過または遠心等の常法にて培養物から分離される。（２）乾燥細胞：該生細胞を凍結乾燥または真空乾燥等の常法により乾燥させることにより得られる。（３）無細胞抽出物：該生細胞または乾燥細胞を常法（例えば、有機溶媒を用いた細胞の自己消化、アルミナ、海砂などを用いた細胞の磨砕、または超音波にて細胞を処理すること）により破壊することにより得られる。（４）酵素溶液：該無細胞抽出物を常法（例えば、カラムクロマトグラフィー）により精製または部分精製することによって得られる。（５）固定化細胞または酵素：該細胞または酵素を常法（例えば、アクリルアミド、ガラスビーズ、イオン交換樹脂などを用いた方法）により固定化することにより調製される。化合物（II）を酵素と接触させることからなる反応は、水または緩衝液のような水性媒質中で実施することができる。即ち、通常、化合物（II）を含む水または緩衝液のような水性媒質中に、培養物またはその処理物を溶解または懸濁することによって行われる。該反応混液の好適なｐＨ、化合物（II）の濃度、反応時間および反応温度は、用いられる培養物またはその処理物の性質によって変わり得る。一般に、該反応はｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜９、５〜４０℃、好ましくは５〜３７℃で０．５〜５０時間実施される。反応混液中、基質としての化合物（II）の濃度は、１〜１００ｍｇ／ｍｌの範囲で好適に選択することができる。このようにして製造された化合物（Ｉ）は、上記反応混液から慣用の方法で精製、単離される。変異型ＣＣアシラーゼの特異的活性は、以下に述べる手順に従って測定した。ｉ）ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ活性：３７℃で１０分間プレインキュベーションしたＧＬ−７ＡＣＡ溶液〔０．１５Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）中１０ｍｇ／ｍｌ］５００μｌに試料アシラーゼ２０μｌを加え、該混液を３７℃で５分間インキュベーションした。５％酢酸５５０μｌを加えて反応を停止させた。得られた混液を遠心（１０，０００ｒｐｍ，周囲の温度で５分間）後、上清を７ＡＣＡ形成のアッセイに用いた。ＨＰＬＣ条件：カラム：ＴＳＫゲルＯＤＳ−８０ＴＭＣＴＲ４．４ｍｍ ×１００ｍｍ（東ソー）；溶出液：１００ｍＭクエン酸，５．０ｍＭｎ−ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウムを含む１４．３％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル；流速：１．０ｍｌ／分；注入量：１０μｌ；検出器：２５４ｎｍ。３７℃で１分間にＧＬ−７ＡＣＡから１μモルの７ＡＣＡを合成し得る活性を１単位と定義した。 ii）ＣＣアシラーゼ活性：３７℃で１０分間プレインキュベーションしたＣＣ溶液〔１０ｍｇ／ｍｌのセファロスポリンＣナトリウム塩を含む０．１５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．７），ｐＨは１ＮＮａＯＨでｐＨ８．７に再調整した〕５００μｌに試料アシラーゼ２０μｌを加え、該混液を３７℃で１０分間インキュベーションした。５％酢酸５５０μｌを加えて反応を停止させた。得られた混液を遠心（１０，０００ｒｐｍ，周囲の温度で５分間）後、上清を７ＡＣＡ形成のアッセイに用いた。ＨＰＬＣ条件：カラム：ＴＳＫゲルＯＤＳ−８０ＴＭＣＴＲ４．４ｍｍ ×１００ｍｍ（東ソー）；溶出液：１００ｍＭクエン酸，５．０ｍＭｎ−ヘキサン−１−スルホン酸ナトリウムを含む１４．３％（Ｖ／Ｖ）アセトニトリル；流速：１．０ｍｌ／分；注入量：２０μｌ；検出器：２５４ｎｍ。３７℃で１分間にセファロスポリンＣナトリウム塩から１μモルの７ＡＣＡを合成し得る活性を１単位と定義した。添付の図面の簡単な説明は以下の通りである。図１は本明細書の実施例で使用したＤＮＡオリゴマーを示す。図２はpCC001Aの構築の模式図である。図３はpCC002Aの構築の模式図である。図４はpCK002の構築の模式図である。図５はpCC007A及びpCCNt013の構築の模式図である。図６はpCC013Aの構築の模式図である。図７はpΔN176及びpCK013の構築の模式図である。図８はmp18p181及びmp18p183の調製の模式図である。図９はmp18p181M164A，mp18p181M174A，pCKM174A及びpCKM164Aの調製の模式図である。図１０はpCKS166の調製の模式図である。図１１はpCKM164L及びpCKM164Gの調製の模式図である。図１２はmp19pfu62の構築の模式図である。図１３はＲＦＤＮＡ（mp19pfu62M465A，mp19pfu62M506A及びmp19pfu62M750A ）及び発現ベクター（pCKM465A，pCKM506A及びpCKM750A）の調製の模式図である。図１４はp269I358K，p269I358S及びp269I358Lの調製の模式図である。図１５はpCCE358R及びpCCE358Tの調製の模式図である。図１６はp164L269Y，p164L269F及びp164L269Y305Sの調製の模式図である。図１７はp164L174A及びp164A174Aの調製の模式図である。図１８はp164A269Y，p164L174A269Y，p164L174A269F及びp164A174A269Y305Sの調製の模式図である。図１９はp164L174A269Y305S750Aの調製の模式図である。図２０はpCKA49Lの調製の模式図である。図２１はp49L164L174A269Yの調製の模式図である。図２２は変異型ＣＣアシラーゼM164Aのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。図２３は変異型ＣＣアシラーゼS166Aのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。図２４は変異型ＣＣアシラーゼM269I/E358Kのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。図２５は変異型ＣＣアシラーゼM164L/M174A/M269Yのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。図２６は変異型ＣＣアシラーゼA49Lのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。以下の実施例において、いくつかのプラスミド、制限酵素のような酵素、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、及び他の物質は市販のものであり、供給元の指示に従って使用された。特に、実施例において出発材料として使用されたプラスミドpCCN17 6-2及びプラスミドpTQiΔtrpは、日本における国際寄託機関である工業技術院生命工学工業技術研究所に、それぞれ形質転換体E．coli JM109（pCCN176-2）FERM BP-3047及び形質転換体E．coli HB101-16（pTQiΔtrp）FERM BP-1870として寄託されており、米国特許第5,192,678号公報及び欧州特許出願公開明細書第30245 6号公報にもとづいて容易に入手できる。他のプラスミド等は本明細書の記載に従い、該pCCN176-2，pTQiΔtrp及び市販のプラスミドから容易に調製することができる。ＤＮＡのクローニング、宿主細胞の形質転換、形質転換体の培養、該培養物からのＣＣアシラーゼの回収などに用いられた操作は、当業者によく知られているものであるか、もしくは文献から適用できるものである。以下の実施例は、本発明を具体的に説明することを目的として挙げられているものであり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。実施例１（オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成）ＤＮＡオリゴマーSO-M164A〔図１（ａ）に記載〕を３８１ＡＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステムズ社）を用いて合成した。該ＤＮＡを２８％アンモニア水溶液でＣＰＧポリマー支持体（ＣＰＧ：制御孔ガラス）から遊離させ、次いで６０℃で９時間加熱し、すべての保護基を脱離させた。該反応混合物を真空下で蒸発させ、残渣をＴＥ緩衝液〔１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．４）−１ｍＭＥＤＴＡ〕２００μｌに溶解した。得られた粗ＤＮＡ溶液を逆相ＨＰＬＣ〔カラム；ＣＯＳＭＯＳＩＬＣ１８４．６ｍｍ×１５０ｍｍ（ナカライテスク），溶出液；Ａ：０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．２−７．４），Ｂ：アセトニトリル，グラジエント：開始Ａ（１００％），最終Ａ（６０％）＋Ｂ（４０％）で２５分間の直線グラジエント，流速：１．２ｍｌ／分〕にかけた。目的のＤＮＡオリゴマーを含む溶出液を回収し、真空下で蒸発させた。該精製ＤＮＡをＴＥ緩衝液２００μｌに溶解し、使用直前まで−２０℃で保存した。図１に記載の他のすべてのＤＮＡオリゴマーも上記と類似の方法により合成、精製された。実施例２（ｔｒｐプロモーター制御下にある天然型ＣＣアシラーゼN176の発現ベクターの調製）（１）天然型ＣＣアシラーゼN176のアンピシリン耐性発現ベクターであるpCC002 Aの構築：（ｉ）pCC002Aの構築：プラスミドpCCN176-3（１．０μｇ）〔JOURNAL OF FERME NTATION AND BIOENGINEERING，Vol．72，p235（1991）に、プラスミドpCCN176-2 （これは、常法により形質転換体E．coli JM109（pCCN176-2）FERM BP-3047から入手可能である）からこのプラスミドを調製する方法が記載されている〕を、EcoRI及びHindIIIで消化し、ＣＣアシラーゼN176のすべてのコード領域を担持する２．９ｋｂフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって単離した。一方、変異型ｔ−ＰＡの発現ベクターであるpTQiPAΔtrp（１．０μｇ）［これは、常法により形質転換体E．coli HB101-16（pTQiPAΔtrp）FERM BP-1870から得ることができる。その調製方法については、欧州特許出願公開明細書第3024 56号に記載されている〕をXmaI及びXhoIで消化し、大きい方のＤＮＡ（５１１３ｂｐ）を単離した。合成ＤＮＡオリゴマーＣＴ−１(5'-CCGGGTGTGTACACCAAGGTTA CCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA), ＣＴ−２(5'-AGCTTCACGGTCGCATGTTGTCACGAATCCAGTCTAGGTAGTTGGTAACCTTGGTGTACA CAC), ＴＲ−１(5'-AGCTTGTCCTCGAGATCAATTAAAGGCTCCTTTTGGAGCCTTTTTTTTTTG)及びＴＲ −２(5'-TCGACAAAAAAAAAAGGCTCCAAAAGGAGCATTTAATTGATCTCGAGGACA)をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼでリン酸化し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでライゲーションして XmaI/SalIＤＮＡフラグメント（１１４ｂｐ）を得た。得られたＤＮＡフラグメントを先のXmaI/XhoI ＤＮＡにライゲーションしてpTQiPAdtrpを得た。該pTQiPA dtrpをEcoRI及びHindIIIで消化した。その結果、ｔｒｐプロモーター、ｔ−ＰＡコード領域の一部分（Cys92からTrp113）、及びｆｄファージセントラルターミネーターの重複配列を担持する４．３ｋｂＤＮＡが単離された。５０ｍＭのトリス塩酸、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭジチオスレイトール及び１ｍＭＡＴＰからなるライゲーション緩衝液４０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００単位，宝酒造）の存在下、先に得られた２．９ｋｂのＤＮＡフラグメントと当該４．３ｋｂのＤＮＡフラグメントを混合して、１６℃、５時間かけてライゲーションさせた。該ライゲーション混液を用いて、E．coli JM109を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体の一つからpCC001Aと命名する所望のプラスミドを取得し、制限酵素マッピングにより、その特性を調べた。（ii）pCC002Aの構築：プラスミドpCC001Aは、ｔｒｐプロモーターとアシラーゼ遺伝子との間のｔ−ＰＡ遺伝子の一部分（Cys92からTrp113）を含む。この領域を除去するために、pCC001A（１．０μｇ）をClaI及びMluIで消化し、得られる６．１ｋｂのＤＮＡフラグメントを単離した。一方、pCCN176-3（１μｇ）をMlu I及びSau3AIで消化し、アシラーゼのAsp7からArg71をコードする１８９ｂｐのＤＮＡを単離した。合成ＤＮＡオリゴマー002a及び002b（各々０．５ｎｍｏｌ，下記表１）を、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１．５単位，宝酒造）を用いて、緩衝液（キネーション緩衝液；５０ｍＭトリス塩酸，１０ｍＭＭｇＣｌ₂，１０ｍＭＤＴＴ，１．０ｍＭＡＴＰ）１０μｌ中、３７℃、１時間でリン酸化し、該反応混合物を５５℃で２０分間加熱して酵素を不活性化させた。得られた混合物を、ライゲーション緩衝液２０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ存在下、１５℃で３時間、先の１８９ｂＰのSau3AI/MluI ＤＮＡフラグメントと混合して結合させた。得られたライゲーション混液に、６．１ｋｂのClaI/MluI ＤＮＡフラグメントを添加し、その混合物を更に追加したＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００単位）の存在下で４℃、１６時間インキュベーションした。得られたライゲーション混液を用いてE．coli JM109を形質転換させた。形質転換体の一つから、ＣＣアシラーゼN176の発現ベクターである所望のプラスミドpCC002Aを単離して、制限酵素マッピングによりその特性を調べた。（２）カナマイシン耐性ＣＣアシラーゼN176の発現ベクターであるpCK002の構築プラスミドpCC002AをDraI（東洋紡績）で消化した。得られた混合液をフェノール処理して酵素を除去し、エタノールで沈澱させた。回収されたＤＮＡをライゲーション緩衝液２０μｌに懸濁し、リン酸化されたEcoRIリンカー（２μｇ，ファルマシア）と混合してＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００単位）とともに４℃で１６時間インキュベーションした。該反応混合物をフェノールで抽出し、エタノールで沈澱させた。回収したＤＮＡをEcoRIで消化し、得られたアンピシリン耐性遺伝子を欠失した５．６ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって単離した。一方、プラスミドpA097［これは、形質転換体E.coli JM109（pA097）FERM B P-3772から得ることができる〕（１μｇ）をEcoRIで消化し、その結果カナマイシン耐性遺伝子である１．２ｋｂＤＮＡを単離した。ライゲーション緩衝液５０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００単位）を用いて、該１．２ｋｂのEcoR I ＤＮＡを１６℃で２時間反応させ、先の５．６ｋｂのEcoRI ＤＮＡに結合させた。該ライゲーション混合物を用いてE．coli JM109を形質転換し、抗生物質マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を担持する所望のプラスミドpCK002 を得た。実施例３（ＣＣアシラーゼN176の高発現ベクターであるｐＣＫ０１３の構築）（１）pCC013Aの構築：（ｉ）pCC007Aの構築：プラスミドpCC001AをEcoRI及びMluIで消化し、得られた６．４ｋｂのＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動により単離した。回収されたＤＮＡを、ライゲーション反応に先立って予めリン酸化しておいた合成ＤＮＡオリゴマー007a及び007b（各々０．５μｇ，表１）にＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００単位）を用いて１６℃で５時間処理し、結合させた。得られた混合物を用いてE．coli JM109を形質転換し、所望のプラスミドpCC007A得た。（ii）PCCNt013の構築：プラスミドpCC007A（１．０μｇ）をClaI及びBamHIで消化し、得られた６．１ｋｂのＤＮＡを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により単離した。該ＤＮＡを合成オリゴマー013a及び013b（各々０．５μｇ，それらは各々リン酸化されている。表１）に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００単位）を用いて結合した。該ライゲーション混合物を用いてE．coli JM109を形質転換し、所望のプラスミドpCCNt013をアンピシリン耐性形質転換体から単離した。（iii）pCC013の構築：プラスミドPCCNt013をBamHI及びMluIで消化し、その結果得られる６．１ｋｂのＤＮＡを単離した。一方でpCC002（１．０μｇ）をMluI及びSau3AIで消化して１８９ｂｐのＤＮＡフラグメントを取得した。得られたＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（３００単位）を用いて、６．１ｋｂのBamHI/MluI ＤＮＡフラグメントに結合し、該ライゲーション混合物を用いてE．coli JM109を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体の一つから、（天然型ＣＣアシラーゼN176のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列をコードする）ATに富んだＮＨ₂ 末端ＤＮＡ配列を有する所望のプラスミドpCC013Aを単離した。（２）天然型ＣＣアシラーゼN176のカナマイシン耐性発現ベクターであるpCK013 の構築：（ｉ）pΔN176の構築プラスミドpCK022（１．０μｇ）をAatII（東洋紡績）で消化し、得られたＤＮＡをセルフライゲーションさせる為にＴ４ＤＮＡリガーゼ（１５０単位）で処理した。かかるライゲーション混合物を用いてE．coli JM109を形質転換し、単一のAtaII制限酵素切断部位を担持する所望のプラスミドpΔN176を得た。（ii）pCK013の構築：プラスミドpΔN176（１．０μｇ）をAatIIで消化して直鎖状にしたＤＮＡを、細菌由来のアルカリホスファターゼ（１単位，宝酒造）で１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）中、４２℃で１時間処理した。該脱リン酸化されたＤＮＡを単離して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてpCC013A由来の２．５ｋｂのAaｔII ＤＮＡフラグメントに結合した。該ライゲーション混合物を用いてE．coli JM109を形質転換し、マーカーとしてカナマイシン耐性遺伝子を担持する所望のプラスミドpCK013を取得した。実施例４（ＣＣアシラーゼN176をコードするＤＮＡのクンケル法による点突然変異）（１）ＣＣアシラーゼN176をコードするＤＮＡのＭ１３ファージへのサブクローニング：（ｉ）mp18p181の調製：プラスミドpCC013A（アンピシリン耐性マーカーを担持する天然型ＣＣアシラーゼの発現ベクターであり、このプラスミドの構築は欧州特許出願明細書第558,241号、第８頁に開示されている）をHpaI及びSmaIで消化して、ＣＣアシラーゼN176のMet1からPro267をコードする８４２ｂｐのＤＮＡを単離した。該ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下、SmaIで消化された７２５０ｂｐのM13mp18にライゲーションし、得られたライゲーション混合物を用いてE.c oli JM109を形質転換した。プラークのうちの一つから、M13のプラスのoriと逆方向に該アシラーゼＤＮＡの一部が挿入された所望のＲＦＤＮＡ mp18p181を単離し、制限酵素マッピングによりその特性を調べた。ＲＦＤＮＡ mp18p181 を調製したファージ溶液は使用するまで４℃で保存した。ＲＦＤＮＡ mp18p183は、pCC013A由来のＣＣアシラーゼN176のMet1からAla4 14をコードする１１６２ｂｐのHpaI/Eco47III ＤＮＡ及びHincIIで消化された７２５０ｂｐのM13mp18から上記と類似の方法で調製した。（ii）一本鎖U-mp18p181-SSの調製（Kunkel，T.A．et al.，Methods Enzyml． 154，367参照）：E．coli CJ236（dut-，un9-，F'）（バイオ・ラッドラボラトリーズ）のシングルコロニーをクロラムフェニコール（３０μｇ／ｍｌ）を含有する２ＸＴＹブロス２ｍｌ中で３７℃、１６時間培養した。細胞（０．１ｍｌ）を３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含有する新鮮な２ＸＴＹブロス（５０ｍｌ）に移し、３７℃で培養を継続した。６００ｎｍでの吸光度が０．３に達した時、該培養物にmp18p181のファージ溶液（ＭＯＩ＜０．２）を添加し、さらに５時間培養を続けた。４℃、１７，０００×ｇで１５分間遠心した後、上清を再度遠心した。その結果得られた上清（３０ｍｌ）を室温下、３０分間ＲＮａｓｅ（１５０μｇ／ｍｌ，シグマ）で処理し、７．５ｍｌのＰＥＧ溶液（３．５ＭＮＨ₄ＯＡｃの２０％ポリエチレングリコール８，０００溶液）を添加した。遠心（１７，０００×ｇ，１５分，４℃）後、残渣を３００ｍＭＮａＣｌ，１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）及び０．１ｍＭＥＤＴＡからなる緩衝液２００μｌに懸濁した。得られた溶液をフェノール２００μｌおよびフェノール／ＣＨＣｌ₃（１：１）２００μｌで続けて抽出し、ＣＨＣｌ₃（２００μｌ）で２回洗浄した。該溶液に、７．５ＭＮＨ₄ＯＡｃ（１００μｌ）とエタノール（６００μｌ）を添加してファージＤＮＡを沈澱させた。該ＤＮＡを遠心により回収し、氷冷９０％エタノール７００μｌで洗浄し、真空下で乾燥させた。精製された１本鎖Ｕ−ＤＮＡ（U-mp18p181-SS）をＴＥ緩衝液２０μｌに懸濁し、使用するまで４℃で保存した。クンケル変異法のための他の一本鎖Ｕ−ＤＮＡは、上記と類似の方法によって調製した。（２）変異型ＣＣアシラーゼM164Aのためのmp18p181M164Aの調製：オリゴデオキシリボヌクレオチドSO-M164A（０．２ｎｍｏｌ）を１．３ｍＭＡＴＰ、１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０ｍＭトリス塩酸、６．６ｍＭの５％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６，０００からなる緩衝液１５μｌ中、Ｔ４ＤＮＡキナーゼ（１０単位）とともに３７℃、６０分間インキュベーションした。該リン酸化されたプライマー（１．５μｌ，２０ｐｍｏｌ）を１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、６ｍＭ及び４０ｍＭＮａＣｌからなる緩衝液２０μｌ中、mp18p181１μｌのＳＳ−Ｕ−ＤＮＡ（０．１ｐｍｏｌ）と混合した。該混合物を７５℃で５分間加熱し、４０分かけて室温まで冷却し、それから該混合物を０℃に置いた。該混合物にＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（１５単位）、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（６００単位）、１００ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ，６μｌ）、１０ｍＭＡＴＰ（２μｌ）及び５ｍＭｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ，２μｌ）を加えた。得られた混合物を室温で５分間、続けて３７℃で１．５時間インキュベーションした。反応混合物の一部（１．０μｌ）を重定の方法〔重定，Ｋ．（1983）細胞工学（日本語）2, 616-626〕により調製されたE．coli JM 109のコンピテント細胞（１００μｌ）に加えて、該細胞を湿氷上で３０分間インキュベーションした。該形質転換細胞にＬブロスで培養されたE．coli JM109（Ａ６００＝０．８，２００μｌ）を加え、該細胞混合物を５５℃で予備加温されたＨトップアガー（１％バクトトリプトン，０．８％ＮａＣｌ，０．８％寒天）３ｍｌに加えた。該混合物をＨプレート（１％バクトトリプトン，０．８％ＮａＣｌ，１．５％寒天）上に拡げ、該プレートを３７℃、１６時間インキュベーションした。プレート上のプラークから、所望のＲＦＤＮＡ（mp18p181M164A）を単離し、BamHIで消化してその特性を調べた。（３）変異型ＣＣアシラーゼM164AのためのpCKM164Aの調製： mp18p181M164AをMluI及びBstBIで消化し、アガロースゲル電気泳動により５８２ｂｐのＤＮＡフラグメントを単離した。また、pCK013（カナマイシン耐性マーカーを担持する天然型ＣＣアシラーゼN176の発現ベクターであり、このプラスミドの構築は欧州特許出願公開明細書第558,241号、第８頁に開示されている）をMlu I及びBstBIで消化して大きい方のＤＮＡフラグメントを単離した。得られたＤＮＡ（０．０３ｐｍｏｌ）をライゲーション緩衝液（６６ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、６．６ｍＭ、１０ｍＭ β−メルカプトエタノール、０．５ｍＭＡＴＰ）１０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００単位）を用いて室温下で５時間反応させ、５８２ｂｐのMluI/BstBI ＤＮＡ（０．１５ｐｍｏｌ）にライゲーションさせた。該ライゲーション混合物を用いてE．coli JM109を形質転換した。カナマイシン耐性形質転換体の１つから、所望のプラスミドpCKM164Aを単離し、制限酵素マッピングによってその特性を調べた。該形質転換体をE．coli JM109/ pCKM164Aと命名し、常法によりそのグリセロールストックを調製した。（４）変異型ＣＣアシラーゼM174Aのためのmp18p181M174Aの調製：上記と同様の方法により、mp18p181のＳＳ−Ｕ−ＤＮＡ及びＤＮＡオリゴマーSO -M174Aからmp18p181M174Aを調製した。（５）変異型ＣＣアシラーゼM174Aの発現ベクターpCKM174Aの調製：変異型ＣＣアシラーゼM174Aの発現ベクター及びその形質転換体を、上記と同様の方法により調製し、それぞれpCKM174A及びE．coli JM109/pCKM174Aと命名した。常法により、該形質転換体のグリセロールストックを調製した。（６）変異型ＣＣアシラーゼS166Aの発現ベクターpCKS166Aの調製： mp18p183及びＤＮＡオリゴマーSO-S166A（5'-CATCCGCCAAAGCTTGAACCACACCGCACCC ATAAG）から、上記と同様の方法により変異型ＣＣアシラーゼS166Aのためのmp18 p183S166Aを調製した。mp18p183S166AをMluI及びBstBIで消化した。小さい方のＤＮＡフラグメントを単離し、MluI及びBstBIで消化されたpCK013の大きい方のＤＮＡフラグメントと連結させてpCKS166Aを得た。E．coli JM109をpCKS166Aで形質転換して形質転換体E．coli JM109/pCKS166Aを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。実施例５（ＰＣＲ法によるＣＣアシラーゼN176をコードするＤＮＡの点変異）（１）変異型ＣＣアシラーゼM164Lの発現ベクターpCKM164Lの調製： pCK013（鋳型ＤＮＡ，０．５ｆｍｏｌ）、ＤＮＡオリゴマーSO-MluFor〔プライマー＃１，１２５ｐｍｏｌ，図１（ｂ）〕及びSO-M164L〔プライマー＃２，１２５ｐｍｏｌ，図１（ｂ）〕を１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ９．０）、５０ｍＭＫＣｌ、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、２．５ｍＭ及び０．２ｍＭｄＮＴＰからなる緩衝液１００μｌ中、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（倉敷紡績，１単位）と混合した。該混合液を鉱物油で覆い、ＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェーン・リアクション）を以下のように実施した。最初の変性（９６℃，０．５分間）の後、３０サイクルの増幅反応（９７℃で１．５分間，５０℃で２．５分間及び７２℃で２．５分間）を行い、最後に７２℃で７分間伸張させた。得られた混液をフェノールで抽出してエタノールで沈澱させ、BamHI及びMluIで消化した。該２８５ｂｐのBamHI/MluI ＤＮＡをBamHI及びMluIで消化されたpCKM164Aの大きい方のＤＮＡフラグメントに連結させた。該ライゲーション混合物を用いてE. coli JM109を形質転換した。カナマイシン耐性の形質転換体の１つから、所望のプラスミドpCKM164Lを単離し、制限酵素マッピングによりその特性を調べた。E. coli JM109をpCKM164Lで形質転換して形質転換体E．coli JM109/pCKM164Lを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。（２）変異型ＣＣアシラーゼM164Gの発現ベクターpCKM164Gの調製： pCK013（鋳型ＤＮＡ）とＤＮＡオリゴマーSO-MluFor〔プライマー＃１，図１（ｂ）〕及びSO-M164G〔図１（ｂ）〕を用いて、上記と同様の方法により変異型ＣＣアシラーゼM164GのＤＮＡフラグメントを変異及び増幅させた。その結果得られた２８５ｂｐのBamHI/MluI ＤＮＡをBamHI及びMluIで消化されたpCKM164Aの大きい方のＤＮＡフラグメントに連結させてpCKM164Gを得た。E．coli JM109をp CKM164Gで形質転換して形質転換体E．coli JM109/pCKM164Gを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。（３）他のM164変異型ＣＣアシラーゼの発現ベクター： M164X変異型ＣＣアシラーゼ（X=C,D,E,F,H,I,K,N,P,Q,R,S,T,V,W又はY）の発現ベクター及びその形質転換体を上記と同様の方法により調製した。実施例６（他の変異型ＣＣアシラーゼの発現ベクターの調製）（１）mp19pfu62の構築： M13mp19（１．０μｇ）をSmaI（５単位）及びHindIII（５単位）で消化し、得られた７．２ｋｂのＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により単離した。一方で、pC K002（このプラスミドの構築は欧州特許出願公開明細書第558,241号、第７頁に開示されている）をSmaI及びHindIIIで消化し、１．６ｋｂのＤＮＡを単離した。得られたＤＮＡをライゲーション緩衝液２０μｌ中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（３００単位）を用いて１５℃で２時間反応させ、７．２ｋｂのSmaI/HindIII ＤＮＡに連結させた。該ライゲーション混合物を用いてE．coli JM109を形質転換し、所望のＲＦＤＮＡ、mp19pfu62を取得した。mp19pfu62の一本鎖Ｕ−ＤＮＡ（ＳＳ−Ｕ−ＤＮＡ）を実施例２（１）（ii）と同様の方法により調製した。（２）変異型ＣＣアシラーゼM465Aのためのmp19pfu62M465Aの調製： mp19pfu62のＳＳ−Ｕ−ＤＮＡ及びＤＮＡオリゴマーSO-M465A〔図１（ａ）〕から、上記と同様の方法によりmp19pfu62M465Aを調製した。（３）変異型ＣＣアシラーゼM506Aのためのmp19pfu62M506Aの調製： mp19pfu62のＳＳ−Ｕ−ＤＮＡ及びＤＮＡオリゴマーSO-M506A〔図１（ａ）〕から、上記と同様の方法によりmp19pfu62M506Aを調製した。（４）変異型ＣＣアシラーゼM750Aのためのmp19pfu62M750Aの調製： mp19pfu62のＳＳ−Ｕ−ＤＮＡ及びＤＮＡオリゴマーSO-M750A〔図１（ａ）〕から、上記と同様の方法によりmp19pfu62M750Aを調製した。（５）変異型ＣＣアシラーゼM465Aの発現ベクタ−pCKM465Aの調製： mp19pfu62M465AをPstI及びNcoIで消化し、小さい方のＤＮＡフラグメント（１２７１ｂｐ）をアガロースゲル電気泳動によって単離した。pCK013もまたPstI及び NcoIで消化した。大きい方のＤＮＡを単離し、５０ｍＭトリス塩酸、１０ｍＭ、１．０ｍＭＤＴＴ及び５％ＰＥＧ６，０００からなる緩衝液中、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて１２７１ｂＰのPstI/NcoI ＤＮＡに連結した。該ライゲーション混合物を用いてE．coli DH10Bを形質転換した。カナマイシン耐性の形質転換体の１つから所望のプラスミドpCKM465Aを単離し、制限酵素マッピングによりその特性を調べた。E．coli JM109をpCKM465Aで形質転換して形質転換体E．coli JM109/pCKM465Aを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。（６）変異型ＣＣアシラーゼM506Aの発現ベクターpCKM506Aの調製： pCK013及びmp19pfu62M506Aから上記と同様の方法によりpCKM506Aを構築した。E. coli JM109をpCKM506Aで形質転換して形質転換体E．coli JM109/pCKM506Aを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。（７）変異型ＣＣアシラーゼM750Aの発現ベクターpCKM750Aの調製： pCK013及びmp19pfu62M750Aから上記と同様の方法によりpCKM750Aを構築した。E. coli JM109をpCKM750Aで形質転換して形質転換体E．coli JM109/pCKM750Aを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。実施例７（E358変異型ＣＣアシラーゼの発現ベクターの調製）（１）M269I/E358変異型ＣＣアシラーゼの発現ベクターの調製：（ｉ）変異型ＣＣアシラーゼM269I/E358Kの発現ベクターp269I358Kの調製： HpaI及びMluIで消化されたpCK013の大きい方のＤＮＡフラグメント（０．５ｆｍｏｌ）、ＤＮＡオリゴマーSO-E358K〔5'-TAACCGGGCCATGGCGCGTCTTGACTATATCGAAC T，１２５ｐｍｏｌ，図１（ｂ）（ii）に記載〕及びSO-BstFor〔5'-ATCGCGTCTTC GAAATACCGGGCATC，１２５ｐｍｏｌ，図１（ｂ）（ii）に記載〕を、１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、０．１％ゼラチン、１．５ｍＭ及び０．２ｍＭｄＮＴＰからなる緩衝液１００μｌ中、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造，１単位）と混合した。該混合物を鉱物油で覆い、最初９６℃ で０．５分間変性させ、２５サイクルの増幅（９７℃で１．５分間，５０℃で２．５分間及び７２℃で２．５分間）を行い、最後に７２℃で７分間伸張させた。該反応混合物をフェノールで抽出してエタノールで沈澱させ、NcoI及びBstBIで消化した。その結果得られたＤＮＡ（２９０ｂｐ）を、NcoI及びBstBI で消化されたpCK013の大きい方のＤＮＡフラグメントに連結した。該ライゲーション混合物を用いてE．coli DH10B（ギブコ−ＢＲＬから購入）を形質転換した。カナマイシン耐性の形質転換体の１つから所望のプラスミドp269I358Kを単離し、制限酵素マッピングによりその特性を調べた。E．coli JM109をp269I358Kで形質転換して形質転換体E．coli JM109/p269I358Kを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。（ii）変異型ＣＣアシラーゼM269I/E358S及びM269I/E358Lのそれぞれの発現ベクターp269I358S及びp269I358Lの調製： pCK013とＤＮＡオリゴマーSO-BstFor及びSO-E358S〔又はSO-E358L、図１（ｂ）（ii）に記載〕から上記と同様の方法によりM269I/E358S（又はM269I/E358L）の発現ベクターを調製した。E．coli JM109をp269I358S（又はp269I358L）で形質転換して形質転換体E．coli JM109/p269I358S（又はE．coli JM109/p269I358L）を得、それらのグリセロールストックを常法により調製した。（２）他のE358変異型ＣＣアシラーゼの発現ベクターの調製：（ｉ）変異型ＣＣアシラーゼE358Rの発現ベクターpCCE358Rの調製： mp18p183及びＤＮＡオリゴマーSO-E358R〔図１（ｂ）（ii）〕から、実施例２に記載の方法と同様の方法により変異型ＣＣアシラーゼE358Rのためのmp18p183E35 8Rを調製した。MluI及びNcoIで消化されたmp18p183E358Rの小さい方のＤＮＡを、MluI及びNcoIで消化されたpCC013Aの大きい方のＤＮＡに連結してpCCE358Rを得た。E．coli JM109をpCCE358Rで形質転換して形質転換体E．coli JM109/pCCE3 58Rを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。（ii）変異型ＣＣアシラーゼE358Tの発現ベクターpCCE358Tの調製： mp18p183及びＤＮＡオリゴマーSO-E358T〔図１（ｂ）（ii）〕から、実施例２に記載の方法と同様の方法により変異型ＣＣアシラーゼE358Tのためのmp18p183E35 8Tを調製した。MluI及びNcoIで消化されたmp18p183E358Tの小さい方のＤＮＡを、MluI及びNcoIで消化されたpCC013Aの大きい方のＤＮＡに連結してpCCE358Tを得た。E．coli JM109をpCCE358Tで形質転換して形質転換体E．coli JM109/pCCE3 58T を得、そのグリセロールストックを常法により調製した。実施例８（複数変異型ＣＣアシラーゼの調製）（１）M164L又はM164Aと別の変異型ＣＣアシラーゼとの組み合わせ：（ｉ）変異型ＣＣアシラーゼM164L/M269Yの発現ベクターp164L269Yの調製： pCKM164LをMluI及びBstBIで消化し、小さい方のＤＮＡ（５８２ｂｐ）を単離した。一方で、pCKM269Y（このプラスミドの構築方法は欧州特許出願公開明細書第 558,241号、第１０頁に開示されている）をMluI及びBstBIで消化した。その結果得られたＤＮＡ（約６．２ｋｂ）を単離して５８２ｂＰのMluI/BstBI ＤＮＡに連結した。該ライゲーション混合物を用いてE．coli DH10Bを形質転換した。カナマイシン耐性の形質転換体の１つから所望のp164L269Yを単離し、制限酵素マッピングによりその特性を調べた。E．coli JM109をp164L269Yで形質転換して形質転換体E．coli JM109/p164L269Yを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。（ii）変異型ＣＣアシラーゼM164L/M269Fの発現ベクターp164L269Fの調製： pCKM164LをMluI及びBstBIで消化し、小さい方のＤＮＡ（５８２ｂｐ）を単離した。一方で、pCKM269F（このプラスミドの構築方法は欧州特許出願公開明細書第 558,241号、第１５〜１６頁に開示されている）をMluI及びBstBIで消化した。大きい方のＤＮＡ（約６．２ｋｂ）を単離して５８２ｂＰのMluI/BstBI ＤＮＡに連結した。該ライゲーション混合物を用いてE．coli DH10Bを形質転換した。カナマイシン耐性の形質転換体の１つから所望のp164L269Fを単離し、制限酵素マッピングによりその特性を調べた。E．coli JM109をp164L269Fで形質転換して形質転換体E．coli JM109/p164L269Fを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。（iii）変異型ＣＣアシラーゼM164L/M269Y/C3055の発現ベクターp164L269Y305S の調製： pCKM164L及びp269Y305S（このプラスミドの構築方法は欧州特許出願公開明細書第558,241号、第１０頁に開示されている）から、上記と同様の方法により、 p164L269Y305Sを調製した。E．coli JM109をp164L269Y305Sで形質転換して形質転換体E．coli JM109/p164L269Y305Sを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。（iv）変異型ＣＣアシラーゼM164L/M174Aの発現ベクターp164L174Aの調製： pCKM164L由来のHpaI/NcoI ＤＮＡ（１１２２ｂｐ，鋳型ＤＮＡ，０．５ｆｍｏｌ）、ＤＮＡオリゴマーSO-MluFor〔プライマー＃１，１２５ｐｍｏｌ，図１（ｂ）（ｉ）〕及びSO-M174A2（5'-GACCGGCAGCGCTAGCGCCCGCCAGAGCTTGA，プライマー＃２，１２５ｐｍｏｌ）を１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．３）、５０ｍＭＫＣｌ、０．１％ゼラチン、１．５ｍＭ及び０．２ｍＭｄＮＴＰからなる緩衝液１００μｌ中、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造，１単位）と混合した。該混合物を鉱物油で覆い、最初９６℃で０．５分間変性させ、２５サイクルの増幅（９７℃で１．５分間，５０℃で２．５分間，７２℃で２．５分間）を行い、最後に７２℃で７分間伸張させた。その結果得られた混合物をフェノールで抽出してエタノールで沈澱させ、MluI及びNheIで消化した。得られたＤＮＡをMluI及びNheIで消化されたpCKM174Aの大きい方のＤＮＡフラグメントに連結し、所望のプラスミドp164L174Aを得た。E．coli JM109をp164L174Aで形質転換して形質転換体E.coli JM109/p164L174Aを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。（ｖ）変異型ＣＣアシラーゼM164A/M174Aの発現ベクターp164A174Aの調製： pCKM164A（鋳型ＤＮＡ）、SO-MluFor〔プライマー＃１，図１（ｂ）（ｉ）〕、S O-M174A〔プライマー＃２，図１（ａ）〕及びpCKM174A（ベクターＤＮＡ）から、上記と同様の方法によりp164A174Aを調製した。E．coli JM109をp164A174Aで形質転換して形質転換体E．coli JM109/p164A174Aを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。（vi）変異型ＣＣアシラーゼM164A/M269Yの発現ベクターp164A269Yの調製： pCKM164AをMluI及びBstBIで消化して小さいＤＮＡ（５８２ｂｐ）を単離した。一方で、pCKM269YをMluI及びBstBIで消化した。その結果得られた大きい方のＤＮＡフラグメントを５８２ｂｐのMluI/BstBI ＤＮＡに連結し、そのライゲーション混合物を用いてE．coli DH10Bを形質転換した。カナマイシン耐性の形質転換体の１つから所望のプラスミドp164A269Yを単離し、制限酵素マッピングによりその特性を調べた。E．coli JM109をp164A269Yで形質転換して形質転換体E.co li JM109/p164A269Yを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。（vii）変異型ＣＣアシラーゼM164L/M174A/M269Y、M164L/M174A/M269F及びM164A /M174A/M269Y/C305Sの発現ベクターの調製： MluI及びBstBIで消化されたp164L174Aの小さい方のＤＮＡを、MluI及びBstBIで消化されたpCKM269Y（又はpCKM269F又はp269Y305S）の大きい方のＤＮＡフラグメントに連結し、所望のベクターp164L174A269Y（又はp164L174A269F又はp164A1 74A269Y305S）を得た。E．coli JM109を該p164L174A269Y（又はp164L174A269F又はp164A174A269Y305S）で形質転換して、形質転換体E．coli JM109/p164L174A26 9Y（又はE．coli JM109/p164L174A269F又はE．coli JM109/p164A174A269Y305S）を得、そのグリセロールストックを常法により調製した。（viii）変異型ＣＣアシラーゼM164L/M174A/M269Y/C305S/M750Aの発現ベクターp 164L174A269Y305S750Aの調製： pCKM750AをPstI及びNcoIで消化した。小さい方のＤＮＡを単離し、PstI及びNcoI で消化されたp164L174A269Y305Sの大きい方のＤＮＡに連結して所望のプラスミドを得た。E．coli JM109をp164L174A269Y305S750Aで形質転換して形質転換体E ．coli JM109/p164L174A269Y305S750Aを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。（２）A49Lと他の変異型ＣＣアシラーゼとの組み合わせ（ｉ）変異型ＣＣアシラーゼA49Lのためのmp18p181A49Lの調製： mp18p181のＳＳ−Ｕ−ＤＮＡ及びＤＮＡオリゴマーSO-A49Lから、実施例２記載の方法と同様の方法によりmp18p181A49Lを調製した。（ii）変異型ＣＣアシラーゼA49Lの発現ベクターpCKA49Lの調製： mp18p181A49LをClaI及びMluIで消化して２１８ｂｐのＤＮＡを単離した。一方で、pCC013AをClaI及びMluIで消化した。その結果得られた大きい方のＤＮＡを単離して、２１８ｂｐのClaI/MluI ＤＮＡに連結した。該ライゲーション混合物を用いてE．coli JM109を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体の１つから変異型ＣＣアシラーゼA49Lの発現ベクター（pCCA49Lと命名された）を単離し、制限酵素マッピングによってその特性を調べた。pCCA49L由来の２５０ｂｐ HpaI /MluI ＤＮＡフラグメントを、HpaI及びMluIで消化されたpCK013の大きい方のＤＮＡに連結してpCKA49Lを得た。（iii）天然型ＣＣアシラーゼと変異型ＣＣアシラーゼA49Lの発現の比較： E．coli JM109を常法に従ってプラスミドpCKA49L（又はpCK013）で形質転換することにより調製したE．coli JM109/pCKA49L（又はJM109/pCK013）のグリセロールストック溶液（１ｍｌ）を、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬブロス１００ｍｌに移し、該混合物を３０℃で８時間培養した。該培養物（３．７５ｍｌ）をカナマイシン２５μｇ／ｍｌを含むＮ−３ブロス〔成分：５％大豆ソース，１％グリセロール，１．２５％Ｋ₂ＨＰＯ₄，０．３８％ＫＨ₂ＰＯ₄，５０ μｇ／ｍｌチアミン塩酸，２ｍＭＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．２ｍＭＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ，０．０５ｍＭＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ〕２５ｍｌに加え、該混合物を２２．５℃で１６時間培養した。１６時間目に３−インドールアクリル酸（ＩＡＡ）を終濃度２０μｇ／ｍｌとなるように培養物に添加し、さらに５６時間培養を続けた。１４，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離して細胞を集め、ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）４０ｍｌ中に懸濁し、超音波処理によって破砕した。該破砕物を１４，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間遠心分離して上清（「スープ」画分と名付けた）を取得した。残渣を１００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭＥＤＴＡ及び８Ｍ尿素を含む緩衝液４０ｍｌ中に再懸濁し、超音波処理により破砕した。遠心分離して不溶性物質を除去した後、上清（「沈澱」画分と名付けた）を回収した。変異型ＣＣアシラーゼA49Lと天然型ＣＣアシラーゼN176 の「スープ」及び「沈澱」画分を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。細胞の不溶性前駆タンパク質は、天然型ＣＣアシラーゼから変異型ＣＣアシラーゼA49Lへの変異によって大きく減少した。本結果は逆相ＨＰＬＣによって調べられた「スープ」中の成熟アシラーゼ（天然型ＣＣアシラーゼ又は変異型ＣＣアシラーゼA49L）の量に対応していた（下表）。（iv）変異型ＣＣアシラーゼA49L/M164L/M174A/M269Yの発現ベクターp49L164L17 4A269Yの調製： p164L174A269Y由来の７７２ｂｐ MluI/NcoI ＤＮＡをMluI及びNcoIで消化されたpCKA49Lの大きい方のＤＮＡに連結し、所望のプラスミドp49L164L174A269Yを得た。E．coli JM109をp49L164L174A269Yで形質転換して形質転換体E．coli JM1 09/p49L164L174A269Yを得、そのグリセロールストックを常法により調製した。実施例９（変異型ＣＣアシラーゼの発現及び精製）（１）変異型ＣＣアシラーゼM164Aの発現： E．coli JM109/pCKM164Aのグリセロールストック（０．５ｍｌ）をカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬブロス５０ｍｌに加え、該混合物を３０℃で８時間培養した。該培養物（３．７５ｍｌ）を１．０％グリセロール及びカナマイシン１２．５μｇ／ｍｌを含むＮ−３ブロス（５．０％大豆ソース（大阪食品化学），０．６０８％Ｎａ₂ＨＰＯ₄，０．７％ＫＨ₂ＰＯ₄，０．７％Ｋ₂ＨＰＯ₄ ，０．１２％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄，０．０２％ＮＨ₄Ｃｌ，０．００１１％ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．００１１％ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ，０．０００２７６％ＭｎＳＯ₄・ｎＨ₂Ｏ，０．０００２７６％ＡｌＣｌ₃・６Ｈ₂Ｏ，０．０００１１％ＣｏＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ，０．００００５５２％ＺｎＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．００００５５２％ＮａＭｏＯ₄・２Ｈ₂Ｏ，０．００００２７６％ＣｕＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，０．００００１３８％Ｈ₃ＢＯ₄，５０μｇ／ｍｌビタミンＢ１，０．０４８％ＭｇＳＯ₄）２５ｍｌに移した。該混合物を２０〜２２ ℃で８８時間培養した。培養開始１６時間後にβ−インドールアクリル酸（終濃度２０μｇ／ｍｌ）を、１６及び２４時間後にグリセロール（終濃度１．０％）を添加した。遠心分離（８，０００ｒｐｍ，４℃で１０分間）により細胞を集め、ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）、１．０ｍＭＥＤＴＡ）１０ｍｌ中に懸濁し、超音波処理により細胞を破砕した。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，４℃で２０分間）した後、上清（粗破砕物）を使用するまで４℃で保存した。（２）M164Aの精製：粗破砕物（１．０ｍｌ）を０．４５μｍカラムガード（ミリポア）を用いて濾取し、ＴＳＫ−ゲルTM ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー、４．６×５０ｍｍ）高性能液体クロマトグラフィーカラムにかけた。溶出は、Ａ緩衝液〔２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）〕８０％＋Ｂ緩衝液〔０．５ＭＮａＣｌ−２５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）〕２０％からＡ緩衝液５０％＋Ｂ緩衝液５０％までの凹状曲線グラジエントで３０分間かけて流速１．０ｍｌ／分にて行った。２３０ｎｍにおける吸光度を用いて溶出液をモニタリングした。およそ０．１６ＭのＮａＣｌで溶出された最後の主ピークを回収して変異型ＣＣアシラーゼM164Aの精製標品を取得した。（３）他の変異型ＣＣアシラーゼの発現：上記と同様の方法により、別の発現ベクター（例えば、pCKM164L，pCKM164G，pC KM174A，pCKM465A，pCKM506A，pCKM750A，p164L/269Y，p164L/269Y/305S，p164L /174A/269Y/305S，p269I/358K，p269I/358S，p164L/269F，p164L/174A/269F，pC KS166A，p164L/174A/269Y/305S/750A，p164A/269Y，pCK49L及びp49L/164L/174A ）を担持するE．coli JM109を培養し、その粗破砕物を調製した。（４）他の変異型ＣＣアシラーゼの精製：上記と同様の方法により、各粗破砕物から他の変異型ＣＣアシラーゼ（例えば、 M164L，M164G，M174A，M465A，M506A，M750A，M164L/M269Y，M164L/M269Y/C305S ，M164L/M174A/M269Y/C305S，M269I/E358K，M269I/E358S，M164L/M269F，M164L/ M174A/H269F，S166A，M164L/M174A/M269Y/C305S/M750A，M164A/269Y，及びA49L/ M164L/M174A）を精製した。（５）変異型ＣＣアシラーゼの同定：精製された変異型ＣＣアシラーゼ、例えば、M164A，M164L，M164G，M174A，M465 A，M506A，M750A，M164L/M269Y，M164L/M269Y/C305S，M164L/M174A/M269Y/C305S ，M269I/E358K，M269I/E358S，M164L/M269F，M164L/M174A/M269F，S166A，M164L /M174A/M269Y/C305S/M750A，M164A/M269Y，及びA49L/M164L/M174Aの特性を１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及び逆相ＨＰＬＣによって解析した。β−メルカプトエタノール存在下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、各精製アシラーゼは２つの独立したサブユニット、即ちα及びβサブユニットにそれぞれ相当する２５．４ｋＤａ及び５８．４ｋＤａのペプチドからなることが確認された。これらの分子量はゲル電気泳動での移動度から算出された。ＨＰＬＣ分析では、各精製アシラーゼは２つの独立したペプチド、即ちα及びβサブユニットに解離した。それらは、それぞれ約８．７及び５．８分に溶出した〔ＨＰＬＣ条件，カラム：５Ｃ４−ＡＲ−３００，４．６×５０ｍｍ；溶出液：１０分間で０．０５％トリフルオロ酢酸を含む３５％から７０％までの水性アセトニトリルの直線グラジエント；検出：２１４ｎｍ〕。各変異型ＣＣアシラーゼの両方のサブユニットを逆相ＨＰＬＣで単離し、４７３Ａプロテインシーケンサー（アプライドバイオシステムズ）を用いたアミノ末端配列分析により同定すると、天然型アシラーゼの配列と同一であった。実施例１０（ＤＮＡ配列分析）変異型ＣＣアシラーゼ、例えば、M164A，M164L，M164G，M174A，M465A，M506A ，M750A，M164L/M269Y，M164L/M269Y/C305S，M164L/M174A/M269Y/C305S，H269I/ E358K，M269I/E358S，M164L/M269F，M164L/M174A/M269F，S166A，M164L/M174A/M 269Y/C305S/M750A，M164A/M269Y，及びA49L/M164L/M174AのためのベクターのＤＮＡ配列を３７３ＡＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシステムズ）によって決定し、予想されたものと同一であることを確認した。実施例１１（ＣＣアシラーゼ活性）表２に記載されるそれぞれの変異型アシラーゼのｐＨ８．７におけるＣＣアシラーゼ活性を上記と同じ方法で測定した。その結果を表２に示す。実施例１２（ＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ活性）表３に記載されるそれぞれの変異型アシラーゼのｐＨ７．５におけるＧＬ−７ＡＣＡアシラーゼ活性を上記と同じ方法で測定した。その結果を表３に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/14 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 35/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＣＮ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＲ，ＵＳ (72)発明者野口祐嗣大阪府大阪狭山市半田３―361―１―505

Claims

【特許請求の範囲】 Met⁴⁶⁵，Met⁵⁰⁶又はMet⁷⁵⁰位において、少なくとも１つのアミノ酸が異なるアミノ酸で置換された変異型ＣＣアシラーゼ。２．α−サブユニットとβ−サブユニットとにプロセッシングされる前の前駆体が下式で表される請求の範囲１記載の変異型セファロスポリンＣアシラーゼ。 A1-48-X1-A50-163-X2-Gly-X3-A167-173-X4-A175-357-X5-A359-464-X6-A466-505- X7-A507-749-X8-A751-773 式中、A1-48は天然型ＣＣアシラーゼのThr¹からGlu⁴⁸と同じアミノ酸配列、 A50-163は天然型ＣＣアシラーゼのAsp⁵⁰からLeu¹⁶³までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、 A167-173は天然型ＣＣアシラーゼのVal¹⁶⁷からArg¹⁷³までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、 A175-357は天然型ＣＣアシラーゼのLeu¹⁷⁵からVal³⁵⁷までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、 A359-464は天然型ＣＣアシラーゼのThr³⁵⁹からAla⁴⁶⁴までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、 A466-505は天然型ＣＣアシラーゼのPro⁴⁶⁶からIle⁵⁰⁵までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、 A507-749は天然型ＣＣアシラーゼのLys⁵⁰⁷からAla⁷⁴⁹までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、 A751-773は天然型ＣＣアシラーゼのVal⁷⁵¹からAla⁷⁷³までのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列、 X1はAla又は他のアミノ酸、 X2,X4,X6,X7及びX8はそれぞれMet又は他のアミノ酸、 X3はSer又は他のアミノ酸、 X5はGlu又は他のアミノ酸であり、但し、上記式中Met²⁶⁹及び／又はCys³⁰⁵は他のアミノ酸で置換されていてもよく、X1がAlaの場合、X2,X4,X6,X7及びX8はそれぞれMet、X3はSerであり、X5はGl u以外のアミノ酸である。３．X1がロイシン、X3がアラニンであり、且つMet²⁶⁹がチロシンで置換された請求の範囲２記載の変異型セファロスポリンＣアシラーゼ。４．請求の範囲１記載のセファロスポリンＣアシラーゼをコードするＤＮＡ。５．請求の範囲４記載のＤＮＡを含有する発現ベクター。６．請求の範囲５記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。７．請求の範囲６記載の宿主細胞を水性栄養培地中で培養し、その培養物から変異型セファロスポリンＣアシラーゼを回収することからなる請求の範囲１記載の変異型セファロスポリンＣアシラーゼの製造方法。８．式（II）：（式中、Ｒ１はアセトキシ、ヒドロキシ又は水素であり、Ｒ２はカルボン酸アシルである。）で示される化合物またはその塩を、請求の範囲６記載の形質転換体の培養物またはその処理物と接触させることからなる式（Ｉ）：（式中、Ｒ１は上記と同意義である。）で示される化合物またはその塩の調製方法。